แอสตาแซนธิน จะถูกแปลงชีวภาพจากแคโรทีนอยด์ (เบตาแคโรทีน ลูทีน แคนทาแซนธิน ซีแซนธิน) ผ่านทางอาหาร
แอสตาแซนธิน เป็นเม็ดสีแคโรทีนอยด์ส่วนใหญ่ที่พบในสัตว์จำพวกกุ้งทะเล Tigriopus californicus (เบเกอร์) ทำให้สัตว์เหล่านี้มีสีส้มอมแดง เช่นเดียวกับเมตาโซอานทั้งหมด T. californicus จะต้องเปลี่ยนแคโรทีนหรือไฮดรอกซีแคโรทีนอยด์ที่มีอยู่ในอาหารสาหร่ายให้เป็น แอสตาแซนธิน สัตว์จำพวกกุ้งที่มีเม็ดสีแอสตาแซนธินชนิดอื่นได้แสดงให้เห็นว่าใช้เส้นทางการแปลงชีวภาพเฉพาะของสารตั้งต้นของแอสตาแซนธิน วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือการแสดงให้เห็นว่า Californicus Bioconvert แคโรทีนอยด์ในอาหารให้เป็น แอสตาแซนธิน ก่อนการทดลอง โคพีพอดได้รับอาหารที่ไม่มีแคโรทีนอยด์ ส่งผลให้สีของแคโรทีนอยด์หายไปทั้งหมด จากนั้นโคพีพอดจะได้รับอาหารด้วยแคโรทีนอยด์ 4 ชนิด (เบตาแคโรทีน ลูทีน ซีแซนทีน หรือแคนทาซาทิน) ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเส้นทางการเปลี่ยนแปลงชีวภาพของแอสตาแซนธินเฉพาะ เราพบว่าสัตว์จำพวกกุ้งจากกลุ่มเม็ดสีตั้งต้นแต่ละกลุ่มสามารถผลิต แอสตาแซนธิน ได้ และปริมาณที่ผลิตได้นั้นขึ้นอยู่กับประเภทของแคโรทีนอยด์ที่ได้รับการเสริมเข้าไป นอกจากนี้เรายังอธิบายการกระจายตัวของ แอสตาแซนธิน ในถุงไข่ที่กำลังพัฒนา และแสดงให้เห็นว่าสีแดงของจุดตาของตัวอ่อนไม่ได้เกิดจาก แอสตาแซนธิน
แนะนำ
สัตว์ไม่สามารถสังเคราะห์แคโรทีนอยด์ใหม่จากสารตั้งต้นทางชีววิทยาที่เป็นเบสได้ ยกเว้นเพียงไม่กี่กรณี (Britton และ Goodwin, 1982) เพื่อใช้แคโรทีนอยด์เป็นสีภายนอก สัตว์ต่างๆ เช่น นกฟลามิงโกและกุ้งมังกร จะต้องดูดซับแคโรทีนอยด์จากอาหาร (Cianci et al., 2002; Fox and Hopkins, 1966) สัตว์สีแดงสามารถผลิตเม็ดสีแดงแคโรทีนอยด์ได้ 2 ทาง คือ พวกมันสามารถกินเม็ดสีเหลืองแล้วออกซิไดซ์เพื่อผลิตคีโตแคโรทีนอยด์สีแดง (รูปภาพที่ 1) หรือพวกมันสามารถกินเม็ดสีแดงโดยตรงได้ สำหรับเมตาโซอานส่วนใหญ่นั้น แคโรทีนอยด์สีเหลืองพบได้บ่อยกว่าในอาหาร และด้วยเหตุนี้ เมตาโซอานส่วนใหญ่จึงได้รับสีแดงผ่านการแปลงเม็ดสีเหลืองในอาหาร (Brush, 1990; Goodwin, 1984) แม้ว่าจะมีประวัติศาสตร์การวิจัยเกี่ยวกับวิวัฒนาการและการกระจายของสีแคโรทีนอยด์ในกลุ่มสัตว์ที่หลากหลาย เช่น นก ปลา และครัสเตเชียนมาอย่างยาวนาน แต่ระบบจำลองที่เหมาะสมในการศึกษาเกี่ยวกับกลไกทางพันธุกรรมและสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญแคโรทีนอยด์ในสัตว์ยังคงไม่มีอยู่
รูปที่ 1 เส้นทางการแปลงชีวภาพที่เสนอสำหรับการผลิต แอสตาแซนธิน ในสัตว์ดัดแปลงจาก Rhodes (2007) เส้นทางที่ 1 ถูกใช้โดยปลาบางชนิด รวมถึงปลาทอง ซึ่งใช้ลูทีนเป็นพื้นผิว – แสดงถึงการแปลง α เป็น β-doradexanthin Pathway II ใช้ β-แคโรทีนหรือซีแซนทีนเป็นสารตั้งต้นสำหรับแอสตาแซนธิน Pathway III เริ่มต้นด้วย β-แคโรทีนและประกอบด้วยแคนทาแซนธินเป็นสารตัวกลางของ แอสตาแซนธิน เอนไซม์ที่รับผิดชอบต่อการเปลี่ยนแปลงแต่ละครั้งจะมีตัวเอียง
เมื่อไม่นานมานี้ เราได้เริ่มต้นศึกษาวิจัยศักยภาพของสัตว์จำพวกกุ้งทะเลสีแดง Tigriopus californicus (เบเกอร์) ในการทำหน้าที่เป็นระบบจำลองสำหรับการวิจัยสรีรวิทยาของแคโรทีนอยด์ ในช่วงสี่ทศวรรษที่ผ่านมา สัตว์จำพวกกุ้ง Tigriopus ได้กลายเป็นสิ่งมีชีวิตต้นแบบสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับพิษวิทยาต่อระบบนิเวศ (Raisuddin et al., 2007) ภูมิศาสตร์พืช (Edmands, 2001) การปรับตัวในท้องถิ่น (Pereira et al., 2016) และปฏิสัมพันธ์ระหว่างไมโตคอนเดรียกับนิวเคลียส (Ellison and Burton, 2008) ด้วยเหตุนี้ จึงมีข้อมูลทางสรีรวิทยาและพันธุกรรมจำนวนมากที่จะช่วยให้ศึกษาโดยละเอียดเกี่ยวกับกลไกของโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับสีของแคโรทีนอยด์ อย่างไรก็ตาม แง่มุมพื้นฐานของสรีรวิทยาของเม็ดสียังคงไม่ได้รับการสำรวจเป็นส่วนใหญ่
ในธรรมชาติ Tigriopus californicus และสายพันธุ์อื่นๆ ในสกุล Tigriopus มักมีสีส้มแดงสดใส (รูปที่ 2a,c) ซึ่งเกิดจากการสะสมของแอสตาแซนธินซึ่งเป็นคีโตแคโรทีนอยด์สีแดง (Davenport et al., 2004; Goodwin and Srisukh, 1949; Weaver et al., 2016) เช่นเดียวกับสัตว์อื่นๆ ที่มีเม็ดสีแคโรทีนอยด์ สัตว์จำพวกกุ้ง Tigriopus จะต้องกินแคโรทีนอยด์ในอาหารเพื่อใช้เป็นสารแต่งสี คำชี้แจงพื้นฐานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการสังเกตของ Davenport et al. (Davenport et al., 1997) พบว่าเมื่อสัตว์จำพวกกุ้ง Tigriopus ได้รับอาหารที่ขาดแคโรทีนอยด์ พวกมันจะสูญเสียสีแดงอันเป็นเอกลักษณ์และเปลี่ยนเป็นสีขาว อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน ความต้องการด้านอาหารและการแปลงทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในอาหารให้เป็นแอสตาแซนธินโดย Tigriopus californicus ยังไม่เป็นประเด็นของการศึกษาที่มีการควบคุมอย่างดี
รูปที่ 2 ลักษณะสีของ Tigriopus californicus เมื่อให้อาหาร (A,C) และยีสต์โภชนาการ (B) พบจุดตาของตัวอ่อนสีแดงในสัตว์จำพวกกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีทั้งแคโรทีนอยด์สูงและขาดแคโรทีนอยด์ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการผลิตเม็ดสีตาดังกล่าวไม่ขึ้นอยู่กับอาหาร (C) ตัวเมียมีถุงไข่ที่เปลี่ยนจากสีเทาเข้มไปเป็นสีแดงในขณะที่ตัวอ่อนกำลังพัฒนา
ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ตรวจสอบแหล่งที่มาของโมเลกุลของเม็ดสีใน T. californicus ขั้นแรก เราเปรียบเทียบสีลำตัวและกำหนดปริมาณแคโรทีนอยด์ในสัตว์ที่ได้รับอาหารสาหร่ายไมโครสดและอาหารยีสต์ที่ปราศจากแคโรทีนอยด์ จากนั้นเราใช้การทดลองการเสริมอาหารด้วยสารตั้งต้นแคโรทีนอยด์ที่ควบคุมอย่างระมัดระวังเพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของสารตั้งต้นแคโรทีนอยด์ในอาหารเป็นแอสตาแซนธินโดย T. californicus ในที่สุด เราได้ทดสอบว่าสีแดงของจุดตาของตัวอ่อน (รูปที่ 2) และสีของถุงไข่ของตัวเมียที่ตั้งครรภ์ (รูปที่ 2c) เกิดจากการมีอยู่ของแอสตาแซนธินหรือไม่
วิธีการวิจัย
(ก) การเพาะเลี้ยงสัตว์จำพวกกุ้ง
ครัสเตเชียน Tigriopus californicus ที่เก็บจากธรรมชาติในบริเวณใกล้เคียงเมืองซานดิเอโก รัฐแคลิฟอร์เนีย ได้รับการเลี้ยงดูในห้องปฏิบัติการของเราตั้งแต่ปี 2557 ในถังขนาด 10 ลิตรในน้ำทะเลเทียมที่ผ่านการกรอง (ASW, 32 psu) ที่อุณหภูมิ 24 องศาเซลเซียส ภายใต้รอบแสง-มืด 12 ชั่วโมง:แสง-มืด 12 ชั่วโมง และให้อาหารด้วยสาหร่ายขนาดเล็กที่มีชีวิต Tetraselmis chuii และ Synechococcus spp. อาหารนี้ประกอบด้วยแคโรทีนอยด์ที่ได้จากสาหร่าย ได้แก่ อัลฟาแคโรทีนและเบตาแคโรทีน ลูทีน และซีแซนทีน (Brown and Jeffrey, 1992 ; Guillard et al., 1985) ซึ่งสันนิษฐานว่าเป็นสารตั้งต้นสำหรับการแปลงทางชีวภาพเป็นแอสตาแซนธิน (รูปที่ 1) เราเรียกสัตว์จำพวกกุ้งที่ได้รับการเลี้ยงภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ว่า ‘ประชากรสำรอง’
(b) การตรวจสอบแหล่งที่มาของสีแดงในอาหารของ T. californicus
เพื่อทดสอบสมมติฐานที่ว่าสีแดงส้มอันเป็นเอกลักษณ์ของ T. californicus ขึ้นอยู่กับการมีแคโรทีนอยด์ในอาหาร ในปี 2558 เราได้ย้ายตัวอย่างประชากรโคพีพอดประมาณ 1,000 ตัวไปยังอาหารที่ไม่มีแคโรทีนอยด์ซึ่งมียีสต์ที่มีคุณค่าทางโภชนาการ (Bragg, Santa Barbara, CA) อาหารที่มียีสต์ที่มีคุณค่าทางโภชนาการประกอบด้วยยีสต์แห้งที่ไม่ทำงานและวิตามินรวมของวิตามินบี แต่ขาดแคโรทีนอยด์ เราเพาะเลี้ยงสัตว์จำพวกกุ้งเหล่านี้ในภาชนะขนาด 15 ลิตรที่มีผนังและฝาปิดทึบแสงเพื่อป้องกันการเจริญเติบโตของสาหร่ายภายใต้การเติมอากาศแบบเบาๆ เปลี่ยนน้ำและผสมสัตว์จำพวกกุ้งจากภาชนะแยกกันประมาณทุก ๆ สามเดือน เราเรียกสัตว์จำพวกกุ้งที่เติบโตภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ว่า ‘โคพีพอดที่กินยีสต์’ เราได้สุ่มตัวอย่างสัตว์จำพวกกุ้งที่โตเต็มวัย 10 ตัวจากประชากรเป็นจำนวน 3 ชุด และสัตว์จำพวกกุ้งที่เลี้ยงด้วยอาหารยีสต์ 10 ตัวเป็นจำนวน 3 ชุด จากนั้นจึงประเมินสีของสัตว์จำพวกกุ้งด้วยสายตาและทดสอบการมีอยู่ของแคโรทีนอยด์ในร่างกายตามที่ได้อธิบายไว้ในส่วน (f) ด้านล่าง
(c) การวิเคราะห์เชิงคุณภาพของแคโรทีนอยด์ในจุดตาแดง
เพื่อตรวจสอบว่าจุดตาสีแดงของตัวอ่อนมีพื้นฐานมาจากแคโรทีนอยด์หรือไม่ เราได้ผ่าเซฟาโลโซมที่มีจุดตาจากสัตว์จำพวกกุ้งที่โตเต็มวัยที่เลี้ยงด้วยยีสต์ 10 ตัว จุดตาที่ผ่าออกทั้งหมด 10 จุดถูกนำมารวมกันในหลอดเดียว และวัตถุทั้ง 10 ชิ้นที่สอดคล้องกันจะถูกนำมารวมกันในหลอดแยกต่างหาก จากนั้นจึงประมวลผลและวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
(d) การสะสมแอสตาแซนธินของมารดาเพื่อการพัฒนาตัวอ่อน
ในการทดลองแยกกัน เราพยายามค้นหาว่าสีแดงของถุงไข่ที่โตเต็มที่ที่เกี่ยวข้องกับตัวเมียที่ตั้งครรภ์ในอาณานิคมนั้นมีพื้นฐานมาจากแคโรทีนอยด์หรือไม่ เราได้นำถุงไข่สีแดงออกจากตัวเมียที่ตั้งครรภ์ 3 ตัวอย่างระมัดระวังโดยใช้เข็มขนาดเล็กภายใต้กล้องผ่าตัด และประมวลผลแต่ละครอกทีละตัวสำหรับการวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
(e) การแปลงชีวภาพเป็นแอสตาแซนธินจากการเสริมแคโรทีนอยด์ในสัตว์จำพวกกุ้งที่เลี้ยงด้วยยีสต์
เพื่อทดสอบการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในอาหารเป็นแอสตาแซนธินโดย T. californicus อย่างชัดเจน ครัสเตเชียนที่ได้รับอาหารจากยีสต์ได้รับอาหารเสริมด้วยเบตาแคโรทีน ลูทีน ซีแซนธิน และแคนทาแซนธิน เราเลือกสารตั้งต้นแคโรทีนอยด์ทั้งสี่นี้สำหรับการทดลองการให้อาหารเนื่องจากสารเหล่านี้ครอบครองตำแหน่งที่แตกต่างกันในเส้นทางที่คาดว่าสัตว์จำพวกกุ้งใช้ในการผลิตแอสตาแซนธิน (รูปที่ 1) สารละลายสต็อกของ β-แคโรทีน ลูทีน ซีแซนทีน และแคนทาแซนทีน ถูกเตรียมจากแกรนูลแคโรทีนอยด์ที่ละลายน้ำได้ (DSM, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) ใน ASW และเจือจางจนมีความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ที่ใช้งานได้ 2 μg/mL อาหารเสริมแคโรทีนอยด์แต่ละชนิดประกอบด้วยเฉพาะแคโรทีนอยด์ตามรายการเท่านั้น ยกเว้นอาหารเสริมลูทีน จากปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งหมด 90.6% เป็นลูทีนบริสุทธิ์ แต่ซีแซนทีนมีสัดส่วนเพียง 7.8% ดังนั้นอาหารเสริม “ลูทีน” จึงมีลูทีน 1.984 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และซีแซนทีน 0.016 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สำหรับกลุ่มเสริมแคโรทีนอยด์แต่ละกลุ่ม ครัสเตเชียนที่โตเต็มวัย 10 ตัวถูกวางลงในสารละลายแคโรทีนอยด์ 5 มิลลิลิตรในแต่ละหลุมของจาน 6 หลุม (n = 6 สำหรับแต่ละกลุ่มเสริม) โดยมียีสต์โภชนาการ 0.75 มิลลิกรัมเป็นอาหารเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงประมวลผลสำหรับการวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ (ดูด้านล่าง)
(f) การวิเคราะห์แคโรทีน
หลังการทดลองแต่ละครั้ง สัตว์จำพวกกุ้งจะถูกวางลงใน ASW สดเพื่อทำความสะอาดเนื้อหาในลำไส้ จากนั้นล้างด้วยน้ำที่ผ่านการดีไอออนไนซ์ ทำให้แห้ง และสำหรับการทดลองการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ ชั่งน้ำหนักให้ใกล้เคียงที่สุดเป็น 0.01 มก. มวลของตัวอย่างหนึ่งจากกลุ่มที่เสริมด้วยเบตาแคโรทีนไม่ได้รับการบันทึก และตัวอย่างหนึ่งจากกลุ่มที่เสริมด้วยซีแซนทีนได้ถูกทำลายก่อนการวิเคราะห์แคโรทีนอยด์
แคโรทีนอยด์ถูกสกัดจากโคพีพอดด้วยวิธีโซนิเคชั่นในอะซิโตนเกรด HPLC 500 μL ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ 1.7 มล. เป็นเวลา 10 วินาที ที่ 10 วัตต์ จากนั้นเราจึงปิดหลอดด้วยก๊าซไนโตรเจนและฟักไว้ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในที่มืด ตัวอย่างถูกปั่นที่ 3,000 g เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นนำส่วนที่เป็นของเหลวใสออกมาใส่ในหลอดใหม่ แล้วระเหยจนแห้งที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ภายใต้สุญญากาศ จากนั้นจึงนำไปแขวนลอยใหม่ในอะซิโตน 50 μL แคโรทีนอยด์ถูกแยกโดยใช้ระบบ Shimadzu HPLC จากปั๊ม 40 µL ลงบนคอลัมน์ Sonoma C18 (10 µm, 250 x 4.6 มม., ES Technologies) ที่ติดตั้งตลับป้องกัน C18 เราใช้เฟสเคลื่อนที่ A) 80:20, เมทานอล: แอมโมเนียมอะซิเตท 0.5 M, B) 90:10, อะซีโตไนไตรล์: H 2 O และ C) เอทิลอะซิเตทในระดับความชันเชิงเส้นลำดับที่สามดังนี้: 100% A ถึง 100% B ในเวลา 4 นาที จากนั้นเป็น 80% C: 20% B ในเวลา 14 นาที กลับมาเป็น 100% B ในเวลา 3 นาที และกลับมาเป็น 100% A ในเวลา 5 นาที และคงไว้เป็นเวลา 6 นาที (Wright et al., 1991) ระยะเวลาการทำงานทั้งหมดคือ 32 นาทีที่อัตราการไหล 1 มล./นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องตรวจจับ UV/VIS แคโรทีนอยด์ได้รับการระบุและวัดปริมาณโดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานที่แท้จริง (ของบริษัท) ความเข้มข้นของแอสตาแซนธินได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานตามน้ำหนักแห้งของสัตว์จำพวกกุ้ง
(ก) การวิเคราะห์ทางสถิติ
เราได้ทดสอบความแตกต่างในปริมาณแอสตาแซนธินที่ผลิตโดยสัตว์จำพวกกุ้งจากแต่ละกลุ่มโดยใช้ ANOVA และประเมินการเปรียบเทียบแบบเป็นคู่ระหว่างกลุ่มโดยใช้การทดสอบหลังการทดลอง Tukey HSD
รูปที่ 3 ปริมาณแอสตาแซนธินใน T. californicus Copepoda หลังจากการเสริมแอสตาแซนธินซึ่งเป็นสารตั้งต้นแคโรทีนอยด์ต้นทางเป็นเวลา 48 ชั่วโมง แสดงค่าเฉลี่ยกำลังสองน้อยสุดและแถบข้อผิดพลาดมาตรฐาน และค่าเฉลี่ยที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจะระบุด้วยตัวอักษรแยกกัน
ผลลัพธ์
แหล่งกำเนิดอาหารสีแดงของ T. californicus
แคโรทีนอยด์หลักที่พบในประชากรโคพีพอดคือแอสตาแซนธินอิสระ (ค่าเฉลี่ย ± ค่าเฉลี่ย; โคพีพอด 49.38 นาโนกรัม -1 ± 2.19) ตรวจพบแอสตาแซนธินโมโนและไดเอสเทอร์ไรซ์ปริมาณเล็กน้อย คิดเป็น 3.22% และ 8.83% ของปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งหมดตามลำดับ เราพบว่าเมื่อประชากรครัสเตเชียนถูกถ่ายโอนไปสู่อาหารที่ไม่มีแคโรทีนอยด์และยีสต์ พวกมันจะสูญเสียสีแดงส้มอันเป็นเอกลักษณ์และดูโปร่งใส ( รูปที่ 2b ) การวิเคราะห์ทางชีวเคมีแสดงให้เห็นว่าตรวจพบแอสตาแซนธินในปริมาณเล็กน้อยที่วัดได้ในครัสเตเชียนที่กินยีสต์เป็นอาหาร (ค่าเฉลี่ย ± ค่าเฉลี่ย; โคพีพอด 0.54 นาโนกรัม -1 ± 0.016)
การวิเคราะห์แอสตาแซนธินในจุดตาแดง
เราตรวจไม่พบแคโรทีนอยด์ในเศษส่วนของยีสต์ที่เลี้ยงด้วยอาหาร Tigriopus californicus ที่มีจุดตาแดงเข้มข้น การวิเคราะห์ส่วนของร่างกายที่เกี่ยวข้องแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของแอสตาแซนธินใกล้เคียงกับครัสเตเชียนที่เลี้ยงด้วยอาหารยีสต์ในทดลองครั้งก่อน (โคพีพอด -1 0.3 นาโนกรัม)
การวิเคราะห์แอสตาแซนธินในถุงไข่แดง
เราพบว่าถุงไข่สีแดงของประชากรหญิงที่ตั้งครรภ์มีแอสตาแซนธิน (ค่าเฉลี่ย ± จำนวน; 10.53 นาโนกรัมของถุงไข่ -1 ± 3.31)
การเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในอาหาร
เราพบว่าโคพีพอด T. californicus จากกลุ่มอาหารเสริมแคโรทีนอยด์แต่ละกลุ่มมีการสะสมแอสตาแซนธินหลังจาก 48 ชั่วโมงเมื่อไม่มีสารใด ๆ อยู่ในอาหาร (รูปที่ 3) ปริมาณแอสตาแซนธินที่ถูกเผาผลาญขึ้นอยู่กับแคโรทีนอยด์เฉพาะที่เสริมเข้าไป (เช่น แอสตาแซนธิน ในมวลแห้งของสัตว์จำพวกครัสเตเชียน μg/mg ± se) ซีแซนทีน (0.99 ± 0.11) > แคนทาแซนทีน (0.90 ± 0.12) > เบต้าแคโรทีน (0.38 ± 0.06) > ลูทีน (0.21 ± 0.02) อย่างไรก็ตาม ปริมาณ แอสตาแซนธิน ที่ผลิตได้ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มซีแซนธินและแคนทาแซนธิน (ความแตกต่าง 95% CI: −0.09 μg/mg, −0.41 ถึง 0.23, p = 0.91) หรือระหว่างกลุ่มเบตาแคโรทีนและลูทีน (ความแตกต่าง 95% CI: −0.17 μg/mg, −0.5 ถึง 0.14, p = 0.49) การเปรียบเทียบแบบเป็นคู่หลังการทดลองแสดงให้เห็นว่าสัตว์จำพวกกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมซีแซนทีนและแคนทาแซนทีนผลิตแอสตาแซนทีนได้มากกว่าสัตว์จำพวกกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมเบตาแคโรทีนหรือลูทีนอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) ในกลุ่มอาหารเสริมแต่ละกลุ่มตรวจพบเฉพาะ แอสตาแซนธิน อิสระและแคโรทีนอยด์เสริมเท่านั้น เป็นไปได้ว่าตัวอย่างมีแคโรทีนอยด์ระดับกลางจำนวนมากแต่ระบบของเราไม่ตรวจพบ
การอภิปราย
ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ดำเนินการทดสอบสารตั้งต้น/ผลิตภัณฑ์ที่ควบคุมอย่างระมัดระวังเพื่อบันทึกการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในอาหารเป็น แอสตาแซนธิน คีโตคาโรทีนอยด์สีแดงในสัตว์จำพวกกุ้งทะเล T. californicus เมื่อพวกมันได้รับอาหารยีสต์ที่ไม่ได้รับแคโรทีนอยด์ สัตว์จำพวกกุ้งก็จะกลายเป็นตัวโปร่งใสและไม่มีสีแดงหรือสีเหลือง การวิเคราะห์ทางชีวเคมียืนยันว่าสัตว์เหล่านี้ขาดแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่ออย่างมาก เมื่อเราเสริมเบต้าแคโรทีน ลูทีน ซีแซนทีน หรือแคนทาแซนทีนให้กับครัสเตเชียนที่ปราศจากแคโรทีนอยด์ที่ได้รับอาหารยีสต์เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เราสังเกตเห็นการผลิตแอสตาแซนทีนอย่างมีนัยสำคัญ ( รูปที่ 3 ) การทดลองเหล่านี้ยืนยันว่า T. californicus ต้องการอาหารที่มีแคโรทีนอยด์สูงเพื่อให้ได้สีส้มแดงอันเป็นเอกลักษณ์ และพวกมันจะแปลงสารตั้งต้นของแคโรทีนอยด์จากอาหารให้เป็น แอสตาแซนธิน
ปริมาณแอสตาแซนธินที่ผลิตขึ้นอยู่กับว่าแคโรทีนอยด์ชนิดใดเป็นสารตั้งต้นสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ ( รูปที่ 3 ) โคพีพอดที่ได้รับอาหารที่มีซีแซนทีนและแคนทาแซนทีนผลิตแอสตาแซนทีนได้มากกว่าสัตว์ครัสเตเชียนที่ได้รับอาหารที่มีเบตาแคโรทีนหรือลูทีนภายในเวลา 48 ชั่วโมง แบบจำลองนี้แสดงให้เห็นว่าจำนวนปฏิกิริยาออกซิเดชันที่จำเป็นในการแปลงสารตั้งต้นแคโรทีนอยด์เสริมให้เป็นแอสตาแซนธินอาจช่วยควบคุมอัตราการผลิตแอสตาแซนธินในสปีชีส์นี้ได้ แคนทาแซนธินและซีแซนธินต้องอาศัยปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชัน 2 ปฏิกิริยา หรือปฏิกิริยาคีโตเลชัน 2 ปฏิกิริยา ตามลำดับ เพื่อสร้างแอสตาแซนธิน ในขณะเดียวกัน β-แคโรทีนต้องการปฏิกิริยา 4–7 ครั้ง และลูทีนต้องการปฏิกิริยา 3 ครั้ง และจะถูกแปลงจากอัลฟา-โดราเด็กซ์แซนทินเป็น β-โดราเด็กซ์แซนทิน ( รูปที่ 1 ) ที่น่าสนใจ คือ มีการสังเกตพบผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันของการเสริมซีแซนทีนเมื่อเทียบกับลูทีนในการศึกษากับนก American Goldfinches ซึ่งแปลงแคโรทีนอยด์ในอาหารเป็นแซนโทฟิลล์ A และ B ของนก Canary และนก Northern Cardinals ซึ่งแปลงเม็ดสีในอาหารเป็นแอสตาแซนธิน ทั้งนกโกลด์ฟินช์และนกคาร์ดินัลสร้างเม็ดสีออกซิเดชันและมีพื้นผิวผิวหนังที่มีสีสันมากขึ้นเมื่อได้รับอาหารซีแซนทีนมากกว่าเมื่อได้รับอาหารลูทีน (Mcraw et al., 2014)
ในธรรมชาติ สัตว์จำพวกกุ้งที่กินสาหร่ายขนาดเล็กและสาหร่ายขนาดใหญ่จะกินเบต้าแคโรทีน ซีแซนทีน และลูทีนในปริมาณที่ค่อนข้างมาก (Brown and Jeffrey, 1992 ; Buffan-dubau et al., 1996 ; Sigaud-Kutner et al., 2005 ; Takaichi, 2011 ; Wang et al., 2015 ) การแปลงทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในอาหารให้เป็น แอสตาแซนธิน ได้รับการบันทึกไว้ในสัตว์จำพวกกุ้งชนิดอื่นๆ (Caramujo et al., 2012; Rhodes, 2007) สัตว์จำพวกกุ้ง (Hsu et al., 1970; Tanaka et al., 1976) และปลา (Hsu et al., 1972) และผู้เขียนเหล่านี้สรุปว่าเส้นทางนี้เริ่มต้นด้วยเบตาแคโรทีน อย่างไรก็ตาม นอกเหนือจากการใช้เป็นเม็ดสีแล้ว เบต้าแคโรทีนยังเป็นสารตั้งต้นสำคัญสำหรับการสังเคราะห์วิตามินเอในสัตว์อีกด้วย (Parker, 1996) ซึ่งอาจทำให้เกิดการแลกเปลี่ยนระหว่างการผลิตวิตามินเอและสี (Hill และ Johnson, 2012) นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเรายังบ่งชี้ว่า T. californicus สามารถใช้แคโรทีนอยด์หลายชนิดเป็นสารตั้งต้นในการแปลงทางชีวภาพไปเป็นแอสตาแซนธินได้ ขึ้นอยู่กับว่ามีแคโรทีนอยด์ใดบ้างที่มีอยู่ในอาหารและ/หรือความต้องการวิตามินเอของร่างกาย ซีแซนทีนไม่สามารถให้วิตามินเอได้ และเราพบว่าโคพีพอดที่ได้รับอาหารที่มีสารตั้งต้นนี้สามารถผลิตแอสตาแซนทีนได้มากกว่าครัสเตเชียนที่ได้รับอาหารเสริมเบตาแคโรทีนอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าเราจะไม่ตรวจพบสารตัวกลางใดๆ ตามเส้นทางการแปลงชีวภาพที่เสนอ แต่ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า T. californicus ใช้ซีแซนทีนเป็นสารตั้งต้นสำหรับการผลิตแอสตาแซนทีน เป็นไปได้ว่าซีแซนทีนเป็นจุดเริ่มต้นของเส้นทางการแปลงชีวภาพที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นสำหรับการผลิตแอสตาแซนทีนใน T. californicus การทดลองในอนาคตที่วิเคราะห์จำนวนสัตว์จำพวกกุ้งที่มากขึ้นในระยะเวลาการสุ่มตัวอย่างที่สั้นลงอาจระบุสารตัวกลางแคโรทีนอยด์ได้ และช่วยระบุว่า T. californicus ใช้เส้นทางการแปลงชีวภาพ แอสตาแซนธิน เส้นทางใด
จากการศึกษาครั้งนี้ยังไม่ชัดเจนว่า T. californicus ใช้ลูทีนเป็นสารตั้งต้นในการผลิต แอสตาแซนธิน หรือไม่ เนื่องจากอาหารเสริมลูทีนยังมีซีแซนธินในปริมาณเล็กน้อยด้วย ลูทีนยังแพร่หลายในแพลงก์ตอนพืชในทะเล และเชื่อกันว่าสัตว์ทะเลบางชนิดใช้ลูทีนเป็นสารตั้งต้นในการแปลงชีวภาพเป็นแอสตาแซนธินและคีโตคาโรทีนอยด์อื่นๆ โดยเฉพาะ Hsu (Hsu et al., 1972) และ Katayama (Katayama et al., 1973) แสดงให้เห็นว่าปลาทอง (Carassius auratus) สามารถใช้ลูทีนเป็นสารตั้งต้นของแอสตาแซนธินได้ อย่างไรก็ตาม เส้นทางการแปลงชีวภาพนี้ต้องการกระบวนการไอโซเมอไรเซชันของ α-doradexanthin ไปเป็น β-doradexanthin ซึ่งเป็นกระบวนการเปลี่ยนรูปที่พบว่าเกิดขึ้นได้ยากในเชื้อรา พืช และสัตว์ทะเลอื่นๆ (Matsuno et al., 1999 ; Ohkubo et al., 1999 ) –
สีแดงของจุดตาไม่ได้ขึ้นอยู่กับอาหาร ครัสเตเชียน Tigriopus ที่กินสาหร่ายหรือยีสต์ทั้งหมดมีดวงตาสีแดง ( รูปที่ 2 ) เราพบว่าจุดสีแดงสดของดวงตาใน T. californicus ไม่ได้มาจากแอสตาแซนธินหรือแคโรทีนอยด์อื่นๆ ที่เราตรวจพบ และพบว่าแอสตาแซนธินในปริมาณเล็กน้อยในครัสเตเชียนที่เลี้ยงด้วยอาหารยีสต์ไม่ได้อยู่ในดวงตา ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นชัดเจนว่าสีตาแดงนั้นไม่ได้เกิดจากแอสตาแซนธิน แต่เกิดจากเม็ดสีการมองเห็นโรดอปซินที่สามารถใช้ 3-ไฮดรอกซีเรตินัลเป็นโครโมโฟร์ได้ (Vogt, 1983, 1984; Cronin, 1986)
เราพบว่าตัวเมียจะสะสมแอสตาแซนธินไว้ในตัวอ่อนที่กำลังพัฒนา ซึ่งสนับสนุนรายงานก่อนหน้านี้ที่ระบุว่าคีโตคาโรทีนอยด์ชนิดนี้ปรากฏในถุงไข่ของแมลง Tigriopus สายพันธุ์อื่นๆ (Goodwin และ Srisukh, 1949) มีการเสนอว่าการสะสมแอสตาแซนธินในไข่ที่กำลังพัฒนาจะช่วยปกป้องตัวอ่อนจากรังสีอัลตราไวโอเลตจากดวงอาทิตย์ (Dethier, 1980) ธังและพวกพ้อง (2014) แสดงให้เห็นว่าการได้รับรังสี UV ในเชิงทดลองลดความสำเร็จในการฟักไข่ของตัวอ่อน Paracyclopina nana แม้ว่าบทบาทเฉพาะที่แคโรทีนอยด์อาจมีต่อการอยู่รอดหลังจากได้รับรังสี UV ยังคงไม่ชัดเจน
การศึกษาโครงสร้างทางพันธุกรรมและกลไกทางสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญแคโรทีนอยด์ในสัตว์เพิ่งเริ่มต้นขึ้นเมื่อไม่นานนี้ ยีนที่รับผิดชอบต่อการคีโตเลชั่นของแคโรทีนอยด์สีเหลืองในอาหารของนก ซึ่งเรียกว่ายีนสีแดง ได้รับการค้นพบโดยอิสระโดย Lopes et al (2016) และ Mundy et al (2016) ยีนนี้เข้ารหัสเอนไซม์ไซโตโครม P450 ออกซิโดเรดักเตส CYP2J ซึ่งมีโมทิฟลำดับที่บ่งชี้ถึงตำแหน่งย่อยในไมโตคอนเดรีย ยีนสีแดงในนกมีแนวโน้มที่จะได้รับการอนุรักษ์ไว้ในสัตว์ทั้งหมดที่ผลิตแคโรทีนอยด์สีแดงจากแคโรทีนอยด์สีเหลือง (Lopes et al., 2016) การกำหนดกลไกทางสรีรวิทยาและตำแหน่งเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการไฮดรอกซิเลชันและคีโตเลชันของแคโรทีนอยด์ในสัตว์จำพวกกุ้งกำลังรอการวิจัยในอนาคต
View ORCID ProfileRyan J. Weaver, Paul A. Cobine, Geoffrey E. Hill