แอสตาแซนธิน ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกัน ประสิทธิภาพการเจริญเติบโต และความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระในปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง
การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลของ แอสตาแซนธิน ต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต พารามิเตอร์ทางชีวเคมี การผลิต ROS และการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันของปลาปักเป้า (Takifugu obscurus) ภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง ให้อาหารพื้นฐานทดลองเสริมด้วย แอสตาแซนธิน ในอัตรา 0 (ควบคุม), 20, 40, 80, 160 และ 320 มก./กก. แก่ปลาเป็นเวลา 8 สัปดาห์ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าปลาที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 80, 160 และ 320 มก./กก. สามารถเพิ่มน้ำหนักและอัตราการเจริญเติบโตเฉพาะได้อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ปลาที่ได้รับแอสตาแซนธินในปริมาณปานกลางยังส่งผลให้กิจกรรมของฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ในพลาสมาเพิ่มขึ้น และกิจกรรมของแอสพาร์เตตอะมิโนทรานสเฟอเรสและอะลานีนอะมิโนทรานสเฟอเรสในพลาสมาลดลง หลังจากการทดลองให้อาหาร ปลาจะถูกทำให้เครียดด้วยอุณหภูมิสูงเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าแอสตาแซนธินสามารถป้องกันการผลิต ROS ที่เกิดจากความเครียดจากอุณหภูมิสูงได้ ขณะเดียวกัน เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่ม แอสตาแซนธิน จะเพิ่มระดับ mRNA ของ SOD, CAT และ HSP70 ภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอาหารพื้นฐานที่เสริมด้วย แอสตาแซนธิน 80–320 มก./กก. สามารถส่งเสริมการเจริญเติบโต การตอบสนองของภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะ และระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ รวมถึงปรับปรุงความต้านทานต่อความเครียดจากอุณหภูมิสูงในปลาปักเป้าได้
แนะนำ
ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ สัตว์น้ำมักเผชิญกับมลพิษทางสิ่งแวดล้อม อุณหภูมิของน้ำที่สูง การบุกรุกของแบคทีเรียและไวรัส และการแทรกแซงของมนุษย์ ปัจจัยสิ่งแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยทั้งหมดเหล่านี้สามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองต่อความเครียดในปลาได้ (Barton, 2002) อุณหภูมิของน้ำเป็นปัจจัยสิ่งแวดล้อมที่สำคัญในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ มีผลต่อการอยู่รอดและการพัฒนาของสิ่งมีชีวิต การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิของน้ำใดๆ อาจส่งผลต่อการอยู่รอด การทำงานทางสรีรวิทยา และการป้องกันภูมิคุ้มกันในปลากระดูกแข็ง (Bowden 2008; Lee et al. 2014)
นอกจากนี้ อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นยังช่วยส่งเสริมการเจริญเติบโตของปลาโดยเพิ่มกิจกรรมการเผาผลาญภายในช่วงที่กำหนด ในขณะที่อุณหภูมิที่สูงเกินไปอาจนำไปสู่ความผิดปกติทางสรีรวิทยา เพิ่มความไวต่อการติดเชื้อ และอาจถึงขั้นเสียชีวิตได้ (Verma et al. 2007) การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าความท้าทายที่อุณหภูมิสูงสามารถทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันในสิ่งมีชีวิตในน้ำได้ (Cheng et al. 2015) ROS ที่เกิดจากความเครียดมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด (Luo et al. 2014)
เพื่อต่อต้านความเครียดออกซิเดชันและรักษาสมดุลรีดอกซ์ของเซลล์ เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระภายในร่างกายถือเป็นแนวป้องกันเซลล์ด่านแรกเพื่อต่อต้านความเครียดออกซิเดชัน อย่างไรก็ตาม ระดับ ROS ที่มากเกินไปที่เกิดจากความเครียดอาจสร้างความเสียหายต่อไบโอโมเลกุลที่สำคัญ เช่น DNA โปรตีน และไขมัน และนำไปสู่การด้อยลงของการทำงานทางสรีรวิทยาในภายหลัง (Liu et al. 2014)
ในด้านเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ เพื่อบรรเทาผลกระทบเชิงลบจากความเครียดที่มากเกินไป ได้มีการพยายามมากมายในการลดความเครียดและเสริมสร้างภูมิคุ้มกันในสัตว์น้ำโดยใช้สารอาหารต่างๆ ในอาหาร ความต้องการทางโภชนาการถือเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการอยู่รอด การเจริญเติบโต และการเสริมสร้างภูมิคุ้มกันของปลาเชิงพาณิชย์ (Bricknell
และ Dalmo 2005; นายัก 2553). แอสตาแซนธินเป็นสารอาหารที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน เป็นคีโตออกซิแคโรทีนอยด์ที่พบมากในสัตว์จำพวกกุ้ง เนื้อปลาแซลมอน และสาหร่ายทะเล แอสตาแซนธินมีหน้าที่ทางชีวภาพที่สำคัญ เช่น ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ การควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน และการต้านทานโรค (Martin et al. 1999; Chew et al. 2011) มีรายงานว่ากิจกรรมต้านอนุมูลอิสระสูงกว่าเบต้าแคโรทีน ลูทีน และอัลฟาโทโคฟีรอล (Naguib 2000)
การศึกษาก่อนหน้านี้ยังรายงานอีกว่า แอสตาแซนธิน สามารถปรับปรุงการตอบสนองภูมิคุ้มกันแบบเซลล์และแบบฮิวมอรัลของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ (Park et al. 2011) ดังนั้น แอสตาแซนธินจึงถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงการเจริญเติบโต ประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ และระบบภูมิคุ้มกันในปลาและหอย (Li et al. 2014;
Jagruthi และคณะ (2557) ปลาปักเป้า (Takifugu obscurus) พบกระจายพันธุ์ในทะเลญี่ปุ่น ทะเลจีนตะวันออก และทะเลเหลือง ถือเป็นปลาน้ำที่มีความสำคัญทางการค้า ปริมาณปลาปักเป้าป่าลดลงอย่างมากเนื่องจากมลพิษทางน้ำและการทำประมงมากเกินไป ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ปลาชนิดนี้ได้กลายเป็นหนึ่งในปลาที่เลี้ยงใหม่ล่าสุดในจีนตอนใต้ เนื่องจากมีขนาดลำตัวที่ใหญ่ อัตราการเจริญเติบโตที่รวดเร็ว และมีมูลค่าตลาดที่สูง อย่างไรก็ตาม ปลาปักเป้าที่ถูกเลี้ยงไว้ในกรงต้องเผชิญกับปัญหาสุขภาพที่ร้ายแรงเนื่องจากยาและความเครียด โดยเฉพาะในฤดูร้อน อุณหภูมิของน้ำที่สูงมักคงอยู่เป็นเวลานาน ทำให้ค่า ROS และปฏิกิริยาความเครียดออกซิเดชันในปลาเพิ่มสูงขึ้นสูงสุด ส่งผลให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างมาก ดังนั้น เราจึงตรวจสอบผลของ แอสตาแซนธิน ต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและพารามิเตอร์ทางชีวเคมีหลังการเพาะเลี้ยงปลา ในการทดลองครั้งต่อไป ปลาที่ได้รับแอสตาแซนธินชนิดต่างๆ ถูกทดสอบที่อุณหภูมิสูง ตามด้วยการวัดการตอบสนองทางสรีรวิทยาและการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน ผลลัพธ์ของเราจะช่วยให้เข้าใจถึงการตอบสนองทางสรีรวิทยาและกลไกของโมเลกุลที่เป็นพื้นฐานของผลการป้องกันของแอสตาแซนธินต่อความเครียดจากอุณหภูมิสูงในปลาปักเป้า
วัสดุและวิธีการ
การรับประทานอาหารแบบทดลอง
สูตรและองค์ประกอบโดยประมาณของอาหารพื้นฐานแสดงอยู่ในตารางที่ 1 วัตถุดิบซื้อจากสถาบันสัตวศาสตร์ วิทยาลัยวิทยาศาสตร์การเกษตรกวางตุ้ง (กวางตุ้ง ประเทศจีน) อาหารพื้นฐานได้รับการเสริมด้วย แอสตาแซนธิน 6 ระดับ (0, 20, 40, 80, 160 และ 320 ม. กก.-1 อาหาร) โดยแลกกับเซลลูโลสในปริมาณเล็กน้อย ใช้อาหารพื้นฐานที่ไม่ได้เสริม แอสตาแซนธิน เป็นอาหารควบคุม วัตถุดิบทั้งหมดจะถูกบดให้เป็นผงละเอียดผ่านตาข่ายขนาด 60 มิลลิเมตร ผสมให้เข้ากันจนเป็นเนื้อเดียวกันในเครื่องผสมชนิดโฮบาร์ต จากนั้นเติมไขมันและน้ำลงไปแล้วผสมให้เข้ากัน แต่ละส่วนผสมถูกอัดเป็นเม็ด (เส้นผ่านศูนย์กลาง 2 มม.) โดยใช้เครื่องอัดเม็ดในห้องปฏิบัติการ (สถาบันวิศวกรรมเคมี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีจีนใต้ กว่างโจว ประเทศจีน) หลังจากตากให้แห้งแล้ว ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกปิดผนึกไว้ในถุงพลาสติกและจัดเก็บในช่องแช่แข็ง (-20 °C)
สัตว์ทดลอง
ปลาปักเป้าได้มาจากฟาร์มปลาในเมือง Panyu (กวางตุ้ง ประเทศจีน) ก่อนที่จะเริ่มการทดลอง ปลาทดลองจะถูกปรับสภาพให้เข้ากับสภาพแวดล้อมในห้องปฏิบัติการเป็นเวลา 2 สัปดาห์ ปลาทั้งหมดได้รับอาหารพื้นฐานตลอดช่วงการทดลอง ในช่วงเริ่มการทดลอง ปลาจำนวน 540 ตัวที่มีน้ำหนักเฉลี่ย 8.3 ± 0.08 กรัม (ค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ได้รับการชั่งน้ำหนักและกระจายแบบสุ่มในถังน้ำหมุนเวียน 18 ถัง (ถังละ 500 ลิตร) โดยแต่ละถังมีปลาอยู่ 30 ตัว อาหารทดลองแต่ละชนิดได้รับมอบหมายแบบสุ่มให้กับถังสามถัง แต่ละถังได้รับน้ำไหลต่อเนื่อง (3 ลิตร/นาที) และการเติมอากาศอย่างต่อเนื่องด้วยหินอากาศเพื่อรักษาระดับออกซิเจนที่ละลายอยู่ที่หรือใกล้ระดับอิ่มตัว ให้อาหารปลาวันละ 2 ครั้ง (เวลา 08.00 น. และ 17.00 น.) ในอัตรา 4-6% ของน้ำหนักตัวเปียก การทดสอบการให้อาหารกินเวลานาน 8 สัปดาห์ มีการตรวจสอบคุณภาพน้ำสัปดาห์ละสองครั้งโดยการวิเคราะห์คุณภาพน้ำ ในระหว่างการทดลอง อุณหภูมิของน้ำจะอยู่ระหว่าง 25 ถึง 28 °C, ค่า pH อยู่ที่ 7.5–7.8, ปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำไม่น้อยกว่า 6.0 มิลลิกรัม/ลิตร และปริมาณไนโตรเจนแอมโมเนียน้อยกว่า 0.05 มิลลิกรัม/ลิตร
การเก็บตัวอย่าง
เมื่อสิ้นสุดการทดลองเลี้ยง ปลาจะถูกงดอาหารเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนทำการสุ่มตัวอย่าง จำนวนทั้งหมด น้ำหนักตัว ความยาวตัว น้ำหนักในช่องท้อง และน้ำหนักตับ ถูกกำหนดเพื่อให้สามารถวิเคราะห์ดัชนีการเจริญเติบโต เช่น อัตราการเพิ่มน้ำหนัก (WGR) อัตราการแปลงอาหาร (FCR) อัตราการเจริญเติบโตจำเพาะ (SGR) และค่าสัมประสิทธิ์สภาพร่างกาย (CF) ดัชนีตับ (HSI) และดัชนีอวัยวะภายใน (VSI) ปลา 6 ตัวจากแต่ละถังถูกวางยาสลบด้วยสารละลาย MS-222 เจือจาง (tricaine methanesulfonate, Sigma,
สหรัฐอเมริกา) ที่ความเข้มข้น 100 มก./ล. จากนั้นเก็บเลือดจากหลอดเลือดดำที่หางโดยใช้ไซริงค์ทางการแพทย์ขนาด 2 มล. แยกเลือดด้วยวิธีปั่นเหวี่ยง ส่วนที่เป็นของเหลวใสถูกนำออกและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C เพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง นอกจากนี้ ตับยังถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C เพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง
การทดสอบความเครียดจากความร้อน
เมื่อสิ้นสุดการทดลองเลี้ยง ปลาที่มีขนาดใกล้เคียงกันจะถูกสุ่มตัวอย่างจากแต่ละถังที่มีอุณหภูมิของน้ำ 25°C และย้ายไปยังถังที่เล็กกว่าที่มีอุณหภูมิของน้ำ 34°C เพื่อหลีกเลี่ยงความเครียดจากความร้อน อุณหภูมิของน้ำถูกควบคุมโดยห้องควบคุมสภาพอากาศเทียม (หนิงปัว ประเทศจีน) หลังจากได้รับแสงเป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ปลา 6 ตัวจากแต่ละกลุ่มจะถูกสุ่มเก็บตัวอย่างและผ่าออกหลังจากการวางยาสลบด้วย MS-222 เก็บตัวอย่างเลือดและตับเพื่อทดสอบการผลิต ROS และการแสดงออกของยีน
การวัดชีวเคมีในเลือด
พารามิเตอร์ทางชีวเคมีในเลือดถูกกำหนดตามวิธีที่อธิบายโดย Kikuchi et al. (1994). ระดับฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ (ALP), คอเลสเตอรอล (CHOL), อะลานีนอะมิโนทรานสเฟอเรส (ALT), แอสพาร์เทตอะมิโนทรานสเฟอเรส (AST), ไตรกลีเซอไรด์ (TG), ไลโปโปรตีนความหนาแน่นสูง (HDL) และไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ (LDL) จะถูกวัดโดยอัตโนมัติ เครื่องวิเคราะห์ชีวเคมี Beckman Cx-4 (Beckman Coulter, สหรัฐอเมริกา) ใช้ชุดทดสอบที่ซื้อจาก Shanghai Junshi Biotech Co., Ltd. ชุดทดสอบทั้งหมดได้รับการออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อตรวจจับปลา
การผลิต ROS
ในการตรวจสอบระดับ ROS เราใช้โพรบที่สามารถผ่านเซลล์ได้ 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA; Sigma) เจือจางเซลล์เม็ดเลือดแขวนลอยปริมาตร 200 µL ด้วยสารละลายป้องกันการแข็งตัวของเลือดเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 1 × 10^6 เซลล์/มล. DCFH-DA ถูกตั้งไว้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10 μM เป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นวิเคราะห์การเรืองแสงของเซลล์ที่แขวนลอยโดยใช้เครื่องไซโตมิเตอร์ไหล (Becton–Dickinson FACSCalibur)
ไฟสองดวงที่กระจัดกระจาย
พารามิเตอร์ของเครื่องไซโตมิเตอร์แบบไหล (การกระเจิงไปข้างหน้าและการกระเจิงด้านข้าง) ถูกใช้เพื่อกำหนดเกตที่ไม่รวมเศษซากและมวลรวมจากการวิเคราะห์การเรืองแสงทั้งหมด โดยทั่วไปจะมีการวิเคราะห์เซลล์ 10,000 เซลล์เพื่อหาสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ 2 สัญญาณ การผลิต ROS แสดงเป็นค่าการเรืองแสงเฉลี่ยของ DCF
เรียลไทม์ PCR
แยก RNA ทั้งหมดจากเนื้อเยื่อตับโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นละลายในน้ำที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC จากนั้นปริมาณของ RNA ที่แยกออกมาจะถูกกำหนดโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 และ 280 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies, สหรัฐอเมริกา) และตรวจสอบความสมบูรณ์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส 1.2% DNA เสริมแบบสายเดี่ยว (cDNA) ได้รับการสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมด 1 μg โดยใช้ PrimeScript RT Reagent Kit พร้อม gDNA Eraser (TaKaRa, ต้าเหลียน, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นตัวอย่าง cDNA จะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C เพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง ไพรเมอร์เฉพาะยีนได้รับการออกแบบโดยใช้ Primer Premier 5 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) ตามเอกสาร mRNA ของปลาปักเป้าที่ตีพิมพ์ (ตารางที่ 2) PCR แบบเรียลไทม์ได้รับการขยายในเครื่อง ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้ SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, ต้าเหลียน, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ส่วนผสมปฏิกิริยามีปริมาตร 20 μL ซึ่งประกอบไปด้วยเทมเพลต cDNA 2 μL, ROX 0.4 μL, 2× SYBR Premix Ex Taq 10 μL, ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับ 10 mM 0.4 μL และ dH2O 6.8 μL สภาวะ PCR แบบเรียลไทม์มีดังนี้: 94 °C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นทำ 45 รอบ ที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นเวลา 30 วินาที 60 °C เป็นเวลา 30 วินาที และ 72 °C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย 10 นาที ที่อุณหภูมิ 72°C ตัวอย่างทั้งหมดถูกดำเนินการซ้ำสามครั้ง และทดสอบแต่ละครั้งซ้ำสามครั้ง หลังจากโปรแกรมสิ้นสุดลง จะได้ค่ารอบเกณฑ์ (Ct) จากแต่ละตัวอย่าง ระดับการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์กันได้รับการประเมินโดยใช้วิธี 2−ΔΔCT (Livak และ Schmittgen 2001)
การวิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ความแตกต่างที่สำคัญได้รับการประเมินโดย ANOVA ทางเดียว ตามด้วยการทดสอบช่วงหลายช่วงของ Duncan การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ค่า P ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ
ผลลัพธ์
ผลของ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโตของปลาปักเป้า
ผลกระทบของ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโตของปลาปักเป้าแสดงอยู่ในตารางที่ 3 อัตราการรอดตาย (SR) ไม่แตกต่างกันในแต่ละกลุ่มทดลอง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 80, 160 และ 320 มก./กก. พบว่าอัตราการเพิ่มขึ้นของน้ำหนักและอัตราการเจริญเติบโตเฉพาะดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม ไม่มีการสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใน FCR, CF, VSI และ HSI ระหว่างกลุ่มการให้อาหารที่แตกต่างกัน
ผลของแอสตาแซนธินต่อพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในพลาสมาของปลาปักเป้า
ผลกระทบของ แอสตาแซนธิน ต่อพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในพลาสมาของปลาปักเป้าแสดงอยู่ในตารางที่ 4 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่ากิจกรรม ALP สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 40-320 มก./กก. กิจกรรม AST ในพลาสมาของปลาที่ได้รับ แอสตาแซนธิน 320 มก./กก. ต่ำกว่ากลุ่มอื่นอย่างมีนัยสำคัญ กิจกรรม ALT ในพลาสมาต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 20–320 มก./กก. เมื่อเทียบกับปลาที่ได้รับอาหารควบคุม (P < 0.05) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญใน CHOL, TG, HDL และ LDL ระหว่างอาหาร
ผลของ แอสตาแซนธินต่อระดับสัมพันธ์ของยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง ดังแสดงในรูปที่ 1 ระดับการแสดงออกของ Mn-SOD mRNA ในทุกกลุ่มมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นภายใต้ความเครียดจากความร้อน ก่อนเกิดความเครียด ระดับการถอดรหัสของ Mn-SOD ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 40–320 มก./กก. สูงกว่ากลุ่มอื่นอย่างมีนัยสำคัญ ภายหลังจากความเครียดจากความร้อน ระดับการแสดงออกของ Mn-SOD mRNA ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 160 และ 320 มก./กก. สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 และ 48 ชั่วโมงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม
รูปที่ 1 ผลของระดับแอสตาแซนธินในอาหารที่แตกต่างกันต่อระดับการแสดงออกของ Mn-SOD ในปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง โปรดทราบว่าข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n = 6) ตัวอักษรขนาดเล็กที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ในกลุ่มต่างๆ ในเวลาเดียวกันในการทดสอบ Duncan ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระหว่างค่าที่ได้ก่อนและหลังความเครียดจะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจันในการทดสอบ t
ในขณะเดียวกัน ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ Mn-SOD ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 40 มก./กก. สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดจากความร้อนเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับการแสดงออกของ CAT mRNA ในทุกกลุ่มยังดูเหมือนจะเพิ่มขึ้นด้วย (รูปที่ 2) ก่อนเกิดความเครียด ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ CAT ในปลาที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 40, 80, 160 และ 320 มก./กก. สูงกว่ากลุ่มอื่น ภายหลังความเครียด ระดับการแสดงออกของ CAT mRNA ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 40, 80, 160 และ 320 มก./กก. สูงกว่าระดับในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 และ 48 ชั่วโมง
รูปที่ 2 ผลของระดับแอสตาแซนธินในอาหารที่แตกต่างกันต่อระดับการแสดงออกที่สัมพันธ์กันของ CAT ในปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดที่อุณหภูมิสูง โปรดทราบว่าข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n = 6) ตัวอักษรขนาดเล็กที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ในกลุ่มต่างๆ ในเวลาเดียวกันในการทดสอบ Duncan ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระหว่างค่าที่ได้ก่อนและหลังความเครียดจะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจันในการทดสอบ t
ในขณะเดียวกัน ระดับการแสดงออกของ CAT mRNA ในปลาที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 20 มก./กก. สูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ 48 ชั่วโมง ผลของแอสตาแซนธินต่อระดับ HSP70 สัมพันธ์ในปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดจากอุณหภูมิสูง ผลกระทบของแอสตาแซนธินต่อระดับ HSP70 สัมพันธ์กันในปลาปักเป้าแสดงอยู่ในรูปที่ 3 ก่อนเกิดความเครียด กลุ่มทดลองที่ได้รับการรักษาไม่แสดงผลต่อระดับ HSP70 สัมพันธ์กันเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม เมื่อเปรียบเทียบกับระดับความเครียดก่อนความร้อน ระดับสัมพันธ์ของ HSP70 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกกลุ่มที่ 24 และ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดจากความร้อน นอกจากนี้ ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 ในปลาที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 80, 160 และ 320 มก./กก. สูงกว่าระดับในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 และ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดจากความร้อน
รูปที่ 3 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน ในอาหารที่แตกต่างกันต่อระดับการแสดงออกสัมพันธ์ของ HSP70 ของปลาปักเป้าภายใต้ความเครียดที่อุณหภูมิสูง โปรดทราบว่าข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n = 6) ตัวอักษรขนาดเล็กที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ในกลุ่มต่างๆ ในเวลาเดียวกันในการทดสอบ Duncan ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระหว่างค่าที่ได้ก่อนและหลังความเครียดจะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจันในการทดสอบ t
ผลกระทบของ แอสตาแซนธิน ต่อการผลิต ROS ในปลาปักเป้าแสดงอยู่ในรูปที่ 4 โดยการผลิต ROS ในทุกกลุ่มยังเพิ่มขึ้นภายใต้ความเครียดจากความร้อนอีกด้วย ก่อนเกิดความเครียด ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณการผลิต ROS ระหว่างกลุ่มต่างๆ ทั้งสิ้น ภายหลังจากเกิดความเครียด เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่าการผลิต ROS ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 160 และ 320 มก./กก. ลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 และ 48 ชั่วโมง นอกจากนี้ การผลิต ROS ในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 20, 40 และ 80 มิลลิกรัม/กิโลกรัม ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 48 ชั่วโมง ในขณะที่ความแตกต่างระหว่างการบำบัดอื่นๆ ไม่มีนัยสำคัญ
การอภิปราย
ในการศึกษานี้ ปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 80–320 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม พบว่ามีน้ำหนักเพิ่มขึ้นและมีอัตราการเจริญเติบโตเฉพาะที่ดีขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าแอสตาแซนธินในอาหารมีผลดีต่อการเจริญเติบโตของปลาปักเป้า ในทำนองเดียวกัน Li et al. (2014) ระบุว่าการเสริมอาหารด้วย แอสตาแซนธิน อาจ
ช่วยปรับปรุงน้ำหนักตัวของปลาทรายแดง Jagruthi และคณะ (2014) รายงานว่าการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหาร (25, 50 และ 100 มก./กก.) ช่วยเพิ่มอัตราการเติบโตของปลาคาร์ปได้อย่างมีนัยสำคัญ หลิว และคณะ (2016) รายงานว่าการเสริมอาหารด้วยแอสตาแซนธินอาจช่วยเพิ่มการใช้สารอาหารและปรับปรุงการเจริญเติบโตของปลาดุกเหลืองได้ในที่สุด อย่างไรก็ตาม การศึกษาบางกรณีแสดงให้เห็นว่าแอสตาแซนธินไม่มีผลต่อการเพิ่มน้ำหนักเฉพาะและอัตราการเจริญเติบโตของปลา (Mansour et al. 2006; Sawanboonchun et al. 2008) ความแตกต่างเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน ขนาดของปลา และพฤติกรรมการกินอาหาร
พารามิเตอร์ของเลือดสามารถนำมาใช้ในการประเมินสุขภาพ สถานะทางสรีรวิทยา และสถานะโภชนาการของปลาได้ งานวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการเสริมแอสตาแซนธินในอาหารสามารถปรับปรุงสถานะสุขภาพเลือดของปลาได้ (Rehulka 2000) ALT และ AS เป็นเอนไซม์ถ่ายโอนอะมิโนทั่วไปในไมโตคอนเดรียของปลา และสามารถปล่อยเข้าสู่พลาสมาได้หลังจากที่เนื้อเยื่อได้รับความเสียหายและทำงานผิดปกติ (Ozaki1978) หลิว และคณะ (2559) พบว่ากิจกรรม AST และ ALT ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในปลาดุกเหลืองที่ได้รับ แอสตาแซนธิน 0.08% เมื่อเทียบกับปลากลุ่มควบคุม ในการศึกษาของเรา พบว่ากิจกรรม AST และ ALT ในพลาสมาลดลงอย่างมีนัยสำคัญจากการเสริมแอสตาแซนธินในปริมาณที่เหมาะสม ซึ่งบ่งชี้ว่าแอสตาแซนธินมีศักยภาพในการปรับปรุงสุขภาพของปลา
มีรายงานว่า ALP มีส่วนเกี่ยวข้องกับกลไกการป้องกันภูมิคุ้มกันและมีความสัมพันธ์กับความสามารถทางภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ ALP ยังสามารถปรับปรุงการจดจำและการจับกินของเชื้อก่อโรคได้โดยการเปลี่ยนโครงสร้างพื้นผิวของเชื้อก่อโรคและเพิ่มความต้านทานโรค ในปลากะพงทะเลหวู่ชาง พบว่ากิจกรรมของ ALP ลดลงภายใต้ความเครียดจากความร้อน (Ming et al. 2012)
ในการศึกษานี้ พบว่ากิจกรรมของ ALP สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในปลาที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 40–320 มก./กก. ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแอสตาแซนธินสามารถเพิ่มระดับ ALP ในซีรั่มและต่อต้านผลกระทบจากความเครียดจากสิ่งแวดล้อมได้ เป็นที่ทราบกันดีว่าความเครียดจากความร้อนถือเป็นภัยคุกคามที่ร้ายแรงที่สุดต่อการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ ส่งผลให้ภูมิคุ้มกันและการต้านทานโรคลดลง
การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าความเครียดออกซิเดชันเป็นกลไกสำคัญของความเครียดจากอุณหภูมิสูง ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงของการทำงานทางสรีรวิทยา (Cheng et al. 2015) ROS ที่เกิดจากความเครียดจากสิ่งแวดล้อมสามารถกระตุ้นการแสดงออกของไซโตไคน์ ทำให้เกิดการสะสมของ ROS และความเสียหายของเซลล์ (Luo et al.2014) อย่างไรก็ตาม ภายใต้ความเครียดจากสิ่งแวดล้อม ความสมดุลระหว่างการผลิต ROS และกลไกการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระจะถูกรบกวน
ในขณะเดียวกัน เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในร่างกายสามารถถูกกระตุ้นเพื่อลด ROS ที่เกิดจากสิ่งแวดล้อม ซึ่งขึ้นอยู่กับความสามารถในการซื้อของระบบต้านอนุมูลอิสระ ในการศึกษานี้ พบว่าการผลิต ROS สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกกลุ่มที่ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดจากอุณหภูมิสูง อย่างไรก็ตาม การผลิต ROS ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มการรักษาด้วย แอสตาแซนธิน ทั้งหมดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดที่อุณหภูมิสูง ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าผลกระทบที่เป็นอันตรายจากความเครียดจากอุณหภูมิสูงต่อปลาปักเป้าสามารถบรรเทาได้ด้วย แอสตาแซนธิน
ผลประโยชน์ของ แอสตาแซนธิน ในฐานะสารต้านอนุมูลอิสระนี้เชื่อกันว่าเกิดจากความสามารถในการกำจัด ROS โดยตรง (Naguib 2000) ระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระถือเป็นกลไกการป้องกันเซลล์แรกต่อความเครียดจากออกซิเดชัน ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของปลามีทั้งกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระทั้งแบบใช้เอนไซม์และแบบไม่ใช้เอนไซม์ นอกจากนี้ ความสามารถในการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระในปลายังขึ้นอยู่กับปัจจัยทางโภชนาการเป็นส่วนหนึ่ง (Zhou et al. 2014) SOD และ CAT สามารถกำจัดอนุมูลอิสระที่มากเกินไป ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันต่อสารก่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม รวมถึงมลพิษทางเคมีและการติดเชื้อที่ทำให้เกิดโรค (Lortz et al. 2000)
SOD เป็นส่วนหนึ่งของระบบเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระที่สำคัญ ซึ่งสามารถแปลงอนุมูลอิสระออกซิเจนภายในเซลล์ (O2-) ให้เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) และออกซิเจนโมเลกุล (O2) ได้ นอกจากนี้ SOD ยังมีบทบาทสำคัญในการเสริมสร้างการทำงานของภูมิคุ้มกันของเซลล์ฟาโกไซต์และทั่วร่างกายอีกด้วย การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าแอสตาแซนธินช่วยเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของสัตว์น้ำและป้องกันผลเสียจากความเครียด (Liu et al. 2016) ในการศึกษาของเรา ระดับการแสดงออกของ SOD mRNA ในทุกกลุ่มมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นที่อุณหภูมิสูงเป็นเวลา 48 ชั่วโมง การเพิ่มขึ้นของกิจกรรม SOD ดูเหมือนจะเป็นการตอบสนองแบบปรับตัวต่อการเกิด ROS ที่เพิ่มขึ้นซึ่งเกิดจากความเครียดจากอุณหภูมิสูง นอกจากนี้ ทั้งก่อนและหลังความเครียด ระดับการแสดงออกของ SOD mRNA ในกลุ่มแอสตาแซนธินสูงกว่ากลุ่มควบคุม – ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเสริมแอสตาแซนธินในอาหารสามารถปรับปรุงระดับการแสดงออกของ mRNA ของ SOD เพื่อลดการผลิต ROS ที่เกิดจากความเครียดจากอุณหภูมิสูง
เป็นที่ทราบกันดีว่า CAT สามารถสลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ให้เป็นน้ำและออกซิเจนโมเลกุลได้ ดังนั้น กิจกรรม CAT อาจสะท้อนถึงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระและเกี่ยวข้องกับสถานะสุขภาพ ในการศึกษาปัจจุบัน ทั้งก่อนและหลังความเครียด ระดับการแสดงออกของ CAT mRNA ในกลุ่มแอสตาแซนธินสูงกว่ากลุ่มควบคุม หลิว และคณะ (2016) รายงานว่าแอสตาแซนธินมีคุณสมบัติในการดับออกซิเจนเดี่ยวที่ดีซึ่งประกอบด้วยกรดไขมันไม่อิ่มตัวเพื่อดับอนุมูลอิสระ และสามารถทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระในระบบได้ ในการศึกษาของเรา ปลาที่ได้รับอาหารพื้นฐานที่เสริมด้วยแอสตาแซนธินจะช่วยเพิ่มการทำงานของระบบเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและยับยั้งการผลิต ROS ที่เกิดจากความเครียดจากอุณหภูมิสูง ดังนั้น การวิจัยปัจจุบันชี้ให้เห็นว่าการเสริมแอสตาแซนธินอาจช่วยเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ ส่งผลให้ต้านทานความเครียดได้ดีขึ้น เนื่องจากเป็นโปรตีนที่ตอบสนองต่อความเครียด HSP70 อาจเกี่ยวข้องกับการป้องกันความเครียด การขนส่งภายในเซลล์ แอนติไซโตไคน์ การประมวลผลแอนติเจน และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน (Pelham 1986) การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าความเครียดจากอุณหภูมิที่สูงสามารถนำไปสู่การเหนี่ยวนำโปรตีนที่เกิดจากความร้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองของเซลล์ (Cheng et al. 2015) การเพิ่มการผลิต HSP70 ในร่างกายอาจช่วยเพิ่มความต้านทานของเซลล์ต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม Fish Physiol Biochem (Pelham 1986) ในการทดลองนี้ ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 ของกลุ่มทั้งหมดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้ความเครียดจากความร้อน ระดับ HSP70 ที่เพิ่มขึ้นอาจมีความสำคัญในการปกป้องความเสียหายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากอุณหภูมิสูง (Pörtner 2002) นอกจากนี้ การศึกษามากมายยังแสดงให้เห็นว่าสารอาหารต่างๆ ในอาหารสามารถเพิ่มการแสดงออกของ HSP70 ในปลาได้ (Zhou et al. 2014) ในการศึกษาของเรา ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 ในปลาที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 80, 160 และ 320 มก./กก. สูงกว่าระดับในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 และ 48 ชั่วโมงหลังจากความเครียดจากความร้อน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเสริมอาหารพื้นฐานด้วยแอสตาแซนธินร่วมกับการรับประทานอาหารปริมาณปานกลางสามารถเพิ่มระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการปกป้องเซลล์
สรุป
ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของปลาปักเป้าได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหาร การเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารอาจช่วยให้เลือดของปลามีสุขภาพดีขึ้น นอกจากนี้การเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารสามารถเพิ่มการแสดงออกของยีน SOD, CAT และ HSP70 ในตับ และระงับการผลิต ROS ที่เกิดจากอุณหภูมิสูง เมื่อนำผลการศึกษาทั้งหมดของเรามาใช้ แสดงให้เห็นว่าการเสริมอาหารด้วย แอสตาแซนธิน 80–320 มก./กก. สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโต ภูมิคุ้มกัน และความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ และเสริมความต้านทานต่อความเครียดจากอุณหภูมิสูงในปลาปักเป้าได้
Chang-Hong Cheng, Zhi-Xun Guo, Chao-Xia Ye, An-Li Wang