นาโนซิลเวอร์-สำหรับรักษาโรคจุดดำ (NHPB) ที่เกิดจากแบคทีเรียริกเก็ตเซีย
ผลการต่อต้านแบคทีเรียของอนุภาคนาโนเงินที่สังเคราะห์ทางชีวภาพต่อกุ้งขาวแปซิฟิก Litopenaeus vannamei (Boone) ที่ติดเชื้อโรคตับอ่อนอักเสบเน่าตาย (NHPB) หรือโรคจุดดำ
ภาพรวม
โรคตับอ่อนอักเสบแบบเน่าตายในกุ้งเกิดจากแบคทีเรียแกรมลบที่มีลักษณะคล้ายริกเก็ตเซีย หรือที่เรียกอีกอย่างว่าโรคจุดดำ เป็นที่ทราบกันดีว่าเงินเป็นสารต่อต้านแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพ แต่การทดลองกับสิ่งมีชีวิตในน้ำยังมีน้อย และยิ่งหายากยิ่งขึ้นในระดับอนุภาคนาโน วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของอนุภาคนาโนเงิน (AgNPs) ต่อโรคจุดดำในกุ้งขาวแปซิฟิก Litopenaeus vannamei ดังนั้น จึงใช้ AgNO3 เป็นแหล่งเงิน และสารสกัดใบแห้งของ Camellia sinensis และ Azadirachta indica ถูกใช้เป็นตัวรีดิวซ์ กุ้งที่ติดเชื้อแต่ละชุดได้รับการบำบัดด้วย AgNPs 0.5 และ 35 μg โดยการบังคับป้อนอาหาร ความแตกต่างระหว่างจำนวนของกลุ่มแบคทีเรียในตับอ่อนของกุ้งและอัตราการตายของกุ้งเมื่อเทียบกับปริมาณ AgNP พบว่ามีประสิทธิผลต่อเชื้อก่อโรคนี้
แนะนำการใช้งานบางส่วนของ นาโนซิลเวอร์
โรคหลายชนิดที่เกิดจากเชื้อก่อโรคต่างๆ เช่น ไวรัส เชื้อรา โปรโตซัว และแบคทีเรีย ส่งผลเสียต่อการผลิตกุ้งเลี้ยงในประเทศผู้ผลิตหลัก เช่น จีน ไทย ไต้หวัน และเอกวาดอร์ (Lightner & Pantoja, 2003) สภาพแวดล้อมในการทำฟาร์มแบบเข้มข้น ความหนาแน่นของสัตว์เลี้ยง หรือการใช้อาหารคุณภาพต่ำและไม่สมดุล อาจทำให้เกิดความเครียด ส่งผลให้มีจุลินทรีย์ก่อโรคบุกรุก ดังนั้นการวิจัยเพื่อพัฒนาวิธีการและวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการตรวจพบและควบคุมโรคได้ในระยะเริ่มต้นจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง การควบคุมโรคในฟาร์มพ่อแม่พันธุ์และตัวอ่อนมีประสิทธิผลมากกว่าในระยะอนุบาลซึ่งทำได้ยากกว่ามาก โรคเนื้อตายจากเชื้อแบคทีเรีย (จุดดำ) ซึ่งเป็นแบคทีเรียแกรมลบที่มีลักษณะคล้ายริกเก็ตเซียภายในเซลล์ กลายมาเป็นหนึ่งในโรคสำคัญที่ส่งผลต่ออุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงกุ้ง (Krol et al., 1991) ในระยะเฉียบพลันของโรค ตับอ่อนของกุ้งจะฝ่อลง ในขณะที่ระยะเรื้อรัง ตับอ่อนจะผิดรูป หลอดไตตาย และมีความผิดปกติอื่นๆ อีกมากมาย โรคนี้ทำให้เกิดอัตราการเสียชีวิตสูงถึง 40% และการวินิจฉัยจะอาศัยการใช้เครื่องมือทางเนื้อเยื่อวิทยาและโมเลกุล (Morales-Covarrubias, 2004; Avila-Villa et al., 2012; Nunan et al., 2013; Varela-Mejías & Peña-Navarro, 2016)
นาโนเทคโนโลยี ซึ่งเป็นวิศวกรรมของระบบการทำงานในระดับโมเลกุล มุ่งเน้นไปที่อุตสาหกรรมการผลิต แต่ยังมีการประยุกต์ใช้ในทางการแพทย์ เช่น การใช้เป็นตัวแทนตรวจจับในหลอดทดลอง การวินิจฉัยในร่างกาย การถ่ายภาพหลายโหมด การให้เคมีบำบัด การรักษาด้วยแสง และภูมิคุ้มกันบำบัด (Giasuddin et al., 2013; Lin, 2015) ยิ่งไปกว่านั้น จากการปฏิบัติทางการเกษตร พบว่าสารกำจัดศัตรูพืชชีวภาพในระดับนาโนมีประสิทธิภาพและคุ้มต้นทุนมากกว่าสารกำจัดศัตรูพืชแบบทั่วไป จึงถือเป็นทางเลือกที่เชื่อถือได้ (Huang et al., 2015) ในทางกลับกัน ในการประยุกต์ใช้นาโนวิทยาศาสตร์ในการผลิตเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ Khalafalla และคณะ (2011) รายงานว่าอนุภาคนาโนซีลีเนียมสามารถปรับปรุงการสืบพันธุ์ การเจริญเติบโต และการอยู่รอดของปลา Oreochromis niloticus (ปลานิล) ได้ นอกจากนี้ นาโนเทคโนโลยียังสามารถนำมาประยุกต์ใช้กับอาหารเพื่อป้องกันการปนเปื้อนหรือการย่อยสลายของจุลินทรีย์ได้ การประยุกต์ใช้อื่นๆ อีกหลายอย่างเช่น นาโนวีคเกอร์เป็นตัวพาสารอาหาร ยา เอนไซม์ หรือสารเติมแต่งอาหารและสารต้านจุลินทรีย์ (Can et al., 2011; Handy, 2012; Giasuddin et al., 2013) อนุภาคนาโนบางชนิดสามารถมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียและส่งผลต่อแบคทีเรียได้หลากหลายสายพันธุ์ (Lu et al., 2013; Huang et al., 2015; Bakare et al., 2016) ตัวอย่างเช่น อนุภาคนาโนทองแดงได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นสารต้านเชื้อแบคทีเรียที่มีแนวโน้มดีต่อแบคทีเรียในลำไส้ ได้แก่ Aeromonas hydrophila, Vibrio parahaemolyticus และ Pseudomonas fluorescens ในปลาตะเพียนเงินและปลาตะเพียนขาว (Huang et al., 2015) และ Kim et al. (2007) รายงานว่าการใช้อนุภาคนาโนเงิน (AgNPs) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของยีสต์ Escherichia coli (Escherich) และ Staphylococcus aureus (Rosenbach)
การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นถึงผลต้านเชื้อแบคทีเรียของนาโนซิลเวอร์ต่อแบคทีเรียก่อโรคทั่วไปที่แพร่เชื้อสู่สัตว์น้ำ ตัวอย่างเช่น ผลการต่อต้านเชื้อแบคทีเรียของ AgNP ที่สังเคราะห์โดยใช้สารสกัดจาก Prosopis chilensis ได้รับการทดสอบกับเชื้อรา Penaeus monodon ที่มีการติดเชื้อ Vibrio cholerae, V. harveyi และ V. parahaemolyticus (Kandasamy et al., 2013) นอกจากนี้ ยังมีการทดสอบผลของ AgNPs ที่สังเคราะห์โดยใช้สารสกัดจากชาเขียวกับเชื้อรา Fenneropenaeus indicus ที่ติดเชื้อ V. harveyi (Vaseeharan et al., 2010) เมื่อเร็วๆ นี้ Juárez-Moreno และคณะ (2017) สาธิตคุณสมบัติต้านไวรัสของ AgNPs ต่อไวรัสโรคจุดขาวที่ติดเชื้อ Litopenaeus vannamei ลูกเล็ก ดังนั้น การใช้อนุภาคนาโนเพื่อต่อต้านเชื้อโรคจึงเป็นสาขาที่มีแนวโน้มดีในด้านการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ (Can et al., 2011; Rather et al., 2011; Selvaraj et al., 2014) กลไกการออกฤทธิ์ฆ่าเชื้อแบคทีเรียของเงินดังกล่าวข้างต้นส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับกลุ่มซัลฟ์ไฮดริลของเอนไซม์และโปรตีน เช่น กลูโคส-6-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนสและกลูตาไธโอนรีดักเตส (Shukla & Chandra, 1977) โดยรบกวนการทำงานปกติของโปรตีน นอกจากนี้ เงินยังยับยั้งการจำลองของ DNA และในแบคทีเรีย ก็ทำให้เกิดภาวะเครียดออกซิเดชันในผนังเซลล์ ซึ่งเป็นที่ที่หน้าที่สำคัญของเซลล์เกิดขึ้น ส่งผลต่อการรักษาสมดุลของไอออนภายใน ด้วยวิธีนี้ แบคทีเรียที่สัมผัสกับเงินจะแสดงการยับยั้งการเจริญเติบโต การสูญเสียโพแทสเซียม และการยับยั้งการขนส่งทางเคมีจากผนังเซลล์ (Hwang et al., 2007; Luoma, 2008) เป็นที่ยอมรับกันดีว่าแบคทีเรียบางชนิดที่อาศัยอยู่ในช่องว่างหรือฟาโกโซม สามารถสังเคราะห์โปรตีนและสารพิษบางชนิดเพื่อสร้างรูพรุนในเยื่อหุ้มช่องว่างของโฮสต์เพื่อหนีจากออร์แกเนลล์เหล่านี้ได้ (Van der Meer-Janssen et al., 2010) เยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกทำลายอาจช่วยให้อนุภาคขนาดนาโนสามารถแทรกซึมเข้าไปในเซลล์โฮสต์ได้ และมีรายงานหลายฉบับที่แสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียแกรมลบมีความไวต่อ นาโนซิลเวอร์ มากขึ้น (Sondi & Salopek-Sondi, 2004; Radzig et al., 2013) ซึ่งทำให้ตัวพาเป็นตัวการที่เหมาะสมที่จะใช้เป็นสารต้านแบคทีเรีย NHPB ได้มีการสำรวจการประยุกต์ใช้อนุภาคนาโนเพื่อป้องกันการบุกรุกของแบคทีเรียในเซลล์มนุษย์แล้ว แต่ยังไม่มีรายงานความคืบหน้าใดๆ ต่อ NHPB ในสายพันธุ์สัตว์น้ำ แม้ว่าจะมีการพิสูจน์แล้วว่า AgNP มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพ แต่การทดลองกับสิ่งมีชีวิตในน้ำกลับมีน้อยมาก ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบผลต้านเชื้อแบคทีเรียของ AgNPs ต่อ NHPB ในกุ้งขาวแปซิฟิก Litopenaeus vannamei
วัสดุและวิธีการวิจัยประสิทธิภาพของ นาโนซิลเวอร์
การสังเคราะห์นาโนเงิน
ใบชาเขียวแห้ง (Camellia sinensis, Kuntze) และใบสะเดาสด (Azadirachta indica, Jussieu) ถูกนำมาใช้เป็นตัวรีดิวซ์เพื่อพิจารณาว่าสายพันธุ์ใดในสองสายพันธุ์นี้ต้องการผลิต AgNP แบบโมโนดิสเพิร์ส ใบสะเดาจะถูกทำให้แห้งในที่มืดที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ในถุงกระดาษเป็นเวลาสามวัน การสังเคราะห์อนุภาคนาโนดำเนินการโดยอาศัยวิธีการที่อธิบายโดย Vasseharan et al. (2010) โดยมีการปรับเปลี่ยนปริมาณและเวลาเล็กน้อยดังนี้ สำหรับพืชทั้งสองชนิด นำใบแห้ง 6 กรัมมาใส่ในน้ำเดือดที่ผ่านการดีไอออนไนซ์ 60 มิลลิลิตร นาน 2 นาที โดยคนเป็นครั้งคราว จากนั้นเมื่อผ่านไป 5 นาที จะกรองสารละลายผ่านตัวกรอง 4 μm สามครั้งเพื่อแยกของแข็งแขวนลอยออกจากกัน การแพร่กระจายถูกดำเนินการทันทีก่อนที่จะเริ่มต้นการสังเคราะห์อนุภาคนาโน ปฏิกิริยาถูกดำเนินการในหลอดทดลองขนาด 50 มล. โดยมีซิลเวอร์ไนเตรต 0.01 M จำนวน 1.0 มล. น้ำดีไอออนไนซ์ 3.0 มล. และสารละลายพืช 30 มล. ประเมินการดูดกลืนแสงของปฏิกิริยาในเครื่อง Shimadzu UV-2450 spectrophotometer ทุกๆ 5 นาทีเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อประเมินรูปร่างและการกระจายตัวของอนุภาคนาโน ตัวอย่างสารละลายปฏิกิริยา 3 μL ถูกวางและวิเคราะห์ในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEOL 2000 โดยใช้กริดทองแดง 200 เมช ที่ถูกทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6–12 ชั่วโมง ภาพถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ 1.44p (NIH)
ตัวอย่างแบคทีเรียจุดดำ (NHPB)
เพื่อบันทึกเนื้อเยื่อของกุ้งที่ติดเชื้อไวรัสจุดดำ (NHPB) ได้มีการเก็บตัวอย่างกุ้งมีชีวิตจำนวน 60 ตัวอย่างจากฟาร์มกุ้ง 2 แห่ง (ฟาร์มละ 30 ตัวอย่าง) ฟาร์มเหล่านี้ไม่เปิดเผยชื่อตามคำขอของเกษตรกร และระบุว่าเป็นฟาร์ม A และฟาร์ม B ตับอ่อนทั้งหมดของกุ้งแต่ละตัวถูกผ่าออกโดยใช้วัสดุผ่าตัดที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยเปลวไฟในห้องปฏิบัติการ และตับอ่อนถูกแบ่งออกเป็น 3 ส่วนโดยแบ่งตามนี้ ส่วนหนึ่งใส่ในหลอดขนาด 1.5 มล. ที่มีเอธานอลบริสุทธิ์สำหรับการวิเคราะห์ PCR เพิ่มเติมเพื่อยืนยันการมีอยู่ของแบคทีเรียและไวรัส WSSV ชิ้นส่วนอีกชิ้นหนึ่งถูกแช่ในสารละลายของเดวิดสันเพื่อการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา ตามที่ Gracia-Valenzuela และคณะ กล่าวไว้ว่า หากการวินิจฉัย PCR เป็นบวก ในการฉีดแบคทีเรียให้กับกุ้งที่แข็งแรง จะต้องย้ายชิ้นส่วนที่สามไปยังสารละลายป้องกันการแข็งตัว (กลีเซอรอล 50%) (2554). ตัวอย่างในแอลกอฮอล์และกลีเซอรอลถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 °C และตัวอย่างเดวิดสันถูกโอนไปยังเอธานอล 70% เพื่อวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา เพื่อยืนยันการติดเชื้อแบคทีเรีย จะมีการแยก DNA จากตับอ่อนที่ผ่าออกก่อนหน้านี้โดยใช้ QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การหาปริมาณ DNA และการตรวจสอบอัตราส่วน A260/A280 ดำเนินการในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 1000 ปฏิกิริยา PCR ดำเนินการโดยใช้ลูกปัด PCR Illustra PuRe Taq Ready-To-Go (GE Healthcare) ตามผลการตรวจวัดปริมาณ DNA พบว่าปฏิกิริยา PCR จะดำเนินการโดยใช้ DNA 1 µL หากความเข้มข้นมากกว่า 100 ng µL-1 และ 2 µL หากความเข้มข้นของ DNA น้อยกว่า 100 ng µL-1 Loy และคณะได้อธิบายโอลิโกนิวคลีโอไทด์หนึ่ง µL (1996) สำหรับการวินิจฉัยโรคจุดดำ – NHPB (pf-1: 5′-ACGTTGGAGGT TCGTCCTTCAG-3′ และ pr-1: 5′-TCACCCCCTTTGC TTCTCATTGT-3′) ถูกเติมลงในส่วนผสมปฏิกิริยา สภาวะวัฏจักรความร้อนที่อธิบายโดย Loy et al. (1996).
เนื่องจากไวรัสโรคจุดขาว (WSSV) พบระบาดสูงในฟาร์มกุ้งทางตะวันตกเฉียงเหนือของเม็กซิโก จึงมีการทำการวิเคราะห์ PCR เพื่อแยกตัวอย่างที่ตรวจพบว่ามีไวรัสดังกล่าวออกมาเป็นบวก โมเลกุล WSSVVP28-F1: 5′-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3′ และ WSSVVP28-R1: 5′-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3′ ถูกรายงานโดย Ramos-Paredes และคณะ (2012) ถูกนำมาใช้ รวมถึงเงื่อนไขการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิที่ผู้เขียนเหล่านี้แนะนำ มีการใช้ตัวควบคุมเชิงลบที่ไม่มี DNA ในทุกกรณี เนื่องจากไวรัสโรคจุดขาว (WSSV) พบระบาดสูงในฟาร์มกุ้งทางตะวันตกเฉียงเหนือของเม็กซิโก จึงมีการทำการวิเคราะห์ PCR เพื่อแยกตัวอย่างที่ตรวจพบว่ามีไวรัสดังกล่าวออกมาเป็นบวก โมเลกุล WSSVVP28-F1: 5′-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3′ และ WSSVVP28-R1: 5′-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3′ ถูกรายงานโดย Ramos-Paredes และคณะ (2012) ถูกนำมาใช้ รวมถึงเงื่อนไขการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิที่ผู้เขียนเหล่านี้แนะนำ มีการใช้ตัวควบคุมเชิงลบที่ไม่มี DNA ในทุกกรณี
การฟื้นฟูการทำงานของเชื้อจุดดำ – NHPB
กุ้งมีชีวิต 10 ตัวจากการเลี้ยงทดลองที่โรงงาน Universidad de Sonora ใน Bahía de Kino รัฐโซโนรา ถูกขนส่งมายังห้องปฏิบัติการภายในบริษัทของเรา
ตัวอย่างเหล่านี้ถูกวางลงในถังที่มีน้ำทะเลกรอง 15 ลิตร และให้อาหารกุ้งเชิงพาณิชย์วันละ 2 ครั้งเป็นเวลา 5 วัน หลังจากนั้นไม่มีการให้อาหารใดๆ เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อทำความสะอาดลำไส้ และจากนั้นจึงบังคับให้สัตว์กินตับอ่อนที่เก็บมาจากกุ้งที่ผลตรวจ NHPB/WSSV เป็นลบจากธนาคารเนื้อเยื่อที่เก็บถาวรดังที่กล่าวไว้ข้างต้น โดยใช้สายสวนที่ดัดแปลงด้วยไมโครอิเพตต์ขนาด 20–100 µL และทำซ้ำขั้นตอนนี้ทุกๆ 3 วันเป็นเวลา 3 ครั้ง หลังจากผ่านไป 30 วัน ตับอ่อนทั้งหมดจะถูกผ่าออก โดยส่วนใหญ่จะเก็บรักษาไว้ในกลีเซอรอล และส่วนเล็กน้อยจะถูกนำไปใช้ในการสกัด DNA และวิเคราะห์ PCR เพื่อตรวจหาการมีอยู่ของ NHPB ตามวิธีการที่อธิบายไว้ข้างต้น จุลินทรีย์ที่ทดสอบ NHPB เป็นบวกถูกป้อนเข้าสู่ธนาคารเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อเพื่อการควบคุมการติดเชื้อและการบำบัดด้วยไบโอแอสเซย์ นาโนซิลเวอร์
การทดสอบทางชีวภาพการติดเชื้อ NHPB
หนึ่งสัปดาห์หลังจากเชื้อ NHPB ถูกกระตุ้นอีกครั้ง กุ้งมีชีวิตจำนวน 190 ตัวน้ำหนัก 6 กรัมจากโรงงานของเราใน Bahía de Kino รัฐโซโนรา ก็ถูกส่งไปที่โรงงานของเราภายในประเทศ การพิจารณาจำนวนกุ้งดังกล่าวเนื่องจากมีความเสี่ยงที่จะตายเนื่องจากการจัดการ ความเครียด การกินเนื้อกันเอง หรือโรค จึงรับประกันได้ว่าจะมีกุ้งที่รอดชีวิตเพียงพอที่จะดำเนินการทดสอบทางชีวภาพได้ เพื่อประเมินว่ากุ้งปราศจากการติดเชื้อ NHPB และ WSSV กุ้ง 11 ตัวได้รับการสุ่มเลือกและวิเคราะห์ด้วย PCR โดยใช้ DNA ที่สกัดจากกุ้ง 1 ตัว โดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กุ้งทั้งหมดถูกย้ายเข้าไปในถังเลี้ยง 16 ถัง (ถังละ 10 ถึง 12 ตัว) ซึ่งบรรจุน้ำทะเลที่กรองและฆ่าเชื้อด้วยแสง UV จำนวน 40 ลิตร และรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 28–29 °C กุ้งถูกตรวจสอบเป็นเวลาสามเดือนด้วยการเติมอากาศอย่างต่อเนื่องและให้อาหารเม็ดเชิงพาณิชย์ โดยให้วันละสองครั้ง ในปริมาณ 5% ของชีวมวลกุ้ง ในเวลานั้นกุ้งบางตัวก็ตายเนื่องจากบางตัวถูกกินเข้าไปหรือกระโดดออกจากตู้ แต่ไม่มีตัวไหนป่วยเลย เปลี่ยนน้ำ 80% ทุกๆ 3-4 วันด้วยน้ำทะเลที่กรองและฆ่าเชื้อด้วยแสง UV กุ้งที่กล่าวถึงในวรรคข้างต้น จำนวน 120 ตัว น้ำหนัก 16 กรัม ได้รับการปนเปื้อน NHPB โดยการบังคับให้อาหารโดยใช้สารติดเชื้อที่หาได้ก่อนหน้านี้ เพื่อให้แน่ใจว่าการติดเชื้อและการลุกลามของโรค กุ้งได้รับการดูแลเป็นเวลา 50 วัน ซึ่งทำเช่นนี้เพราะในการทดลองเพาะพันธุ์ครั้งก่อน พบอาการทางคลินิกของโรคในกุ้งหลังจากผ่านไป 50 วัน การบำบัดควบคุมประกอบด้วยกุ้งที่ไม่ได้รับการติดเชื้อ เพื่อตรวจหาการติดเชื้อ NHPB ในกุ้ง จะมีการเก็บอุจจาระทุกวัน โดยกุ้งในแต่ละถังจะถูกวางลงในตาข่ายทรงกระบอกแล้วทิ้งไว้ประมาณ 30 – 40 นาทีเพื่อให้มีเวลาเพียงพอในการตกตะกอนของอุจจาระ อุจจาระถูกเก็บรักษาในหลอดขนาด 1.5 มล. ด้วยเอธานอลมากกว่า 95% หลังจากการติดเชื้อ NHPB ในกุ้งทั้งหมด เราได้ใช้การบำบัดด้วย นาโนซิลเวอร์
การบำบัดด้วย AgNPs
จากกุ้งที่ติดเชื้อ มีการคัดเลือก 45 ตัว และจัดกลุ่มเป็น 3 กลุ่ม โดยแต่ละกลุ่มมี 3 ถัง (n = 5) สำหรับการบำบัดด้วย AgNPs ตามที่อธิบายดังต่อไปนี้ AgNP ที่สังเคราะห์ด้วย A. indica ถูกนำมาใช้ในสองการบำบัดที่แตกต่างกัน คือ AgNPs 5 µg และ 35 µg ในสารละลายน้ำ และถูกบังคับให้ป้อนอาหารแก่กุ้ง 15 ตัวในแต่ละการบำบัด โดยแบ่งให้กุ้ง 5 ตัวในแต่ละถังเลี้ยง ทั้งนี้จะขึ้นอยู่กับความเข้มข้นสูงสุดที่ Vaseeharan et al. ใช้ (2010) ต่อต้าน Vibrio harveyi กลุ่มที่ 3 ของกุ้งที่ติดเชื้อได้รับการฉีดด้วยสารละลายน้ำที่ไม่มีอนุภาคนาโน กลุ่มที่ 4 จำนวน 15 ตัว ที่ไม่มีการติดเชื้อและไม่มีอนุภาคนาโนยังคงเป็นกลุ่มควบคุม จับกุ้งได้ 1 ตัวต่อถัง (3 ตัวต่อการบำบัด) ในวันที่ 12 และ 24 และทำการฆ่าโดยใช้อุณหภูมิร่างกายต่ำเพื่อลดการเผาผลาญ จากนั้นจึงนำไปแปรรูปทันที นำส่วนของเซฟาโลโธแรกซ์ (หนา 3-5 มม.) จากสิ่งมีชีวิตที่เก็บตัวอย่างมาใส่ไว้ในตลับเทปเพื่อตรวจสอบทางเนื้อเยื่อวิทยาในสารละลายของเดวิดสัน เก็บตับอ่อนส่วนเล็กๆ แล้วใส่ในหลอดขนาด 1.5 มล. ที่มีเอธานอลมากกว่า 95% เพื่อวิเคราะห์ PCR ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การติดเชื้อของเนื้อเยื่อตับและตับอ่อนได้รับการประเมินทางจุลพยาธิวิทยา โดยอ้างอิงจาก Lightner & Pantoja (2003) และ Del Río-Rodríguez et al. (2549).
การกำหนดเมตาบอไลต์ของตับและตับอ่อน กลูโคสของตับและตับอ่อน โปรตีนทั้งหมด ไกลโคเจน ไขมันทั้งหมด อะซิลกลีเซอไรด์ และสเตอรอลถูกสกัดและวัดตามวิธีของ Sánchez-Paz et al. (2007) ในเครื่องอ่านไมโครเพลท Synergy (BioTek Instruments) โดยใช้ชุดเชิงพาณิชย์ (Randox Laboratories) โดยย่อ ส่วนที่ชั่งน้ำหนักของตับอ่อนจะถูกบดกับบัฟเฟอร์ A หนึ่งปริมาตร (บัฟเฟอร์โพแทสเซียมฟอสเฟต 100 มิลลิโมลาร์, pH 7.2 และ EDTA 1.0 มิลลิโมลาร์, PMSF 10 ไมโครโมลาร์) และคลอโรฟอร์ม-เมทานอล-น้ำ 1 ปริมาตร (2:2:1) และปั่นเหวี่ยงที่ 15,000 × g เป็นเวลา 15 นาที เฟสน้ำใช้ในการวัดปริมาณกลูโคส โปรตีนทั้งหมด และไกลโคเจน การกำหนดไกลโคเจนทำได้โดยการไฮโดรไลซิสและวัดเป็นกลูโคสตาม Passonneau & Lauderdale (1974) รวบรวมเฟสตัวทำละลายที่ประกอบด้วยคลอโรฟอร์มและทำให้แห้งในอากาศเป็นเวลา 12 ชั่วโมงในความมืดสนิทที่อุณหภูมิห้อง (25 °C) จากนั้นทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยน้ำกลั่น และใช้เพื่อการวัดปริมาณไขมันทั้งหมด อะซิลกลีเซอไรด์ และสเตอรอล ข้อมูลเมตาบอไลต์ที่แสดงเป็นมิลลิกรัมต่อกรัมของตับอ่อน ได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวของ KruskalWallis พร้อมด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายตัวของ Dunn ในฐานะการวิเคราะห์ภายหลังโดยใช้ SigmaPlot v.12.0
ผลการวิจัยประสิทธิผลของนาโนเงิน
สมบัติของอนุภาคนาโน AgNPs
สารละลายปฏิกิริยาของ Azadirachta indica ที่สัมผัสกับ AgNO3 แสดงค่าพีคการดูดกลืนเพียงครั้งเดียวที่ 440 นาโนเมตร ในขณะที่สารละลายปฏิกิริยาของ Camelia sinensis แสดงค่าพีคการดูดกลืนที่เล็กน้อยที่ 390 นาโนเมตรและค่าพีคที่เด่นชัดกว่าที่ 440 นาโนเมตร สารละลายควบคุมของ AgNO3 ไม่มีค่าพีคการดูดกลืนในทั้งสองกรณี อนุภาคนาโนเงินที่สังเคราะห์โดยใช้ A. indica แสดงให้เห็นรูปร่างหลายเหลี่ยมและทรงครึ่งวงกลมแบนหลังจากเวลาปฏิกิริยา 120 นาที ขนาด AgNPs มีช่วงตั้งแต่ 5 ถึง 45 นาโนเมตร โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 14.84 ± 5.81 นาโนเมตร 84.65% ของอนุภาคนาโนพบในช่วง 5 ถึง 21 นาโนเมตร โดยมีค่าเฉลี่ย 13.01 ± 3.71 นาโนเมตร AgNPs ที่ได้จาก A. indica มีลักษณะกระจายตัวเป็นเนื้อเดียวกันเนื่องจากมีอนุภาคขนาดเดียวกันในสัดส่วนที่สูง (รูปที่ 1a) และนี่คือเกณฑ์สำหรับการใช้ในการวิเคราะห์การฟื้นฟูทางชีวภาพ ในทางกลับกัน สำหรับ C. sinensis หลังจากเวลาทำปฏิกิริยา 120 นาที สังเกตเห็นรูปทรงหลายเหลี่ยม ทรงครึ่งวงกลม ทรงรี และรูปทรงเส้นลวดนาโนบางส่วน ขนาดมีช่วงตั้งแต่ 7.4 ถึง 68.8 นาโนเมตร โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 29.67 ± 14.17 นาโนเมตร โดยมี 29% อยู่ในช่วงตั้งแต่ 13.1 ถึง 20.8 นาโนเมตร โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 16.60 ± 2.02 นาโนเมตร และมี 20% อยู่ในช่วงตั้งแต่ 37.05 ถึง 44.03 นาโนเมตร โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 40.56 ± 1.88 นาโนเมตร (รูปที่ 1b) นี่เป็นเหตุผลเพียงพอที่จะไม่รวมอนุภาคนาโนเหล่านี้จากการทดสอบทางชีวภาพ
การตรวจหาเชื้อก่อโรค
สิ่งมีชีวิตจากฟาร์ม A แสดงให้เห็นว่า 17% มีผลเป็นบวกสำหรับ NHPB, 23% มีผลเป็นบวกสำหรับ WSSV, 3% สำหรับการติดเชื้อทั้งสองแบบ และ 57% ไม่มีเชื้อก่อโรคเหล่านี้
นอกจากนี้ ตัวอย่างจากฟาร์ม B ยังพบการติดเชื้อ WSSV ร้อยละ 63 การติดเชื้อร่วม 3% และไม่พบเชื้อก่อโรคเหล่านี้ในตัวอย่างร้อยละ 33 ลำดับ NHPB แสดงความเหมือนกัน 100% กับลำดับ GenBank ของ NHPB U65509 และได้รับการจดทะเบียนเพิ่มเติมด้วยหมายเลขเข้าถึง KM305771
การทดสอบทางชีวภาพของการติดเชื้อ NHPB ด้วยการทดลอง กุ้งที่ติดเชื้อ NHPB ด้วยการทดลองแสดงอาการทางคลินิกทั่วไปของโรค เช่น โครงกระดูกภายนอกที่อ่อนนุ่ม ตับอ่อนลดลง ว่ายน้ำไม่สม่ำเสมอ และซึม (Vincent et al., 2004) นอกจากนี้ผลดังกล่าวยังแสดงให้เห็นว่ากุ้งแต่ละตัวที่สัมผัสกับวัสดุติดเชื้อสามารถติดเชื้อได้สำเร็จ เนื่องจากการทดสอบวินิจฉัยให้ผลเป็นบวก 100% (รูปที่ 2)
ที่น่าสังเกต คือ อัตราการตายของกุ้งที่ติดเชื้อ NHPB ที่ได้รับ AgNPs 35 μg อยู่ที่ 0% ในขณะที่กุ้งที่ได้รับ AgNPs 5 μg มีอัตราการตายที่ 40% เมื่อสิ้นสุดการทดลอง สิ่งมีชีวิตที่ไม่มีอนุภาคนาโนแต่ได้รับเชื้อมีอัตราการตาย 41% หลังจากการรักษาเป็นเวลา 12 วัน พบว่ามีก้อนแบคทีเรียจำนวนมากในเนื้อเยื่อตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับ AgNPs 5 µg และหลอดไตมีการหดตัวเล็กน้อยและมีก้อนแบคทีเรียอยู่ (รูปที่ 3a) หลังจากผ่านไป 24 วัน ตับและตับอ่อนมีการขยายตัวอย่างรุนแรง และพบก้อนแบคทีเรียในเนื้อเยื่อบุผิวของหลอดตับและตับอ่อน (รูปที่ 3b) จากการทดลองด้วย AgNPs ความเข้มข้น 35 µg และหลังจากการทดลอง 12 และ 24 วัน ตับอ่อนของกุ้งแสดงสัญญาณของการติดเชื้อโดยมีตับอ่อนได้รับความเสียหายและมีเยื่อบุผิวที่มีช่องว่างอย่างรุนแรง (รูปที่ 3c-3d) เนื้อเยื่อตับอ่อนของกุ้งที่ติดเชื้อแต่ไม่มี นาโนซิลเวอร์ แสดงให้เห็นระดับการติดเชื้อรุนแรงอย่างเห็นได้ชัดตั้งแต่ตัวอย่างแรกในวันที่ 12 โดยมีก้อนแบคทีเรียจำนวนมากและท่อตับอ่อนฝ่ออย่างรุนแรง (รูปที่ 3e)
เมตาบอไลต์ของตับและตับอ่อน
การวิเคราะห์ทางสถิติของส่วนประกอบทางชีวเคมีที่วิเคราะห์ในวันที่ 12 และ 24 ของการท้าทายแบคทีเรียแสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในโปรตีนทั้งหมด (P = 0.225) อะซิลกลีเซอไรด์ (P = 0.174) ไขมันทั้งหมด (P = 0.166) กลูโคส (P = 0.225)
) และไกลโคเจน (P = 0.270) อย่างไรก็ตาม มีความแตกต่างในความเข้มข้นของสเตอรอล (P = 0.017) โดยมีค่าสูงกว่าในกุ้งที่ติดเชื้อที่ไม่ได้รับ AgNPs (รูปที่ 4)
หารือ
อนุภาคนาโนเงินจากชาเขียวและสารสกัดใบสะเดาได้รับการสังเคราะห์ได้สำเร็จในรูปแบบที่รวดเร็ว ใช้งานได้จริง และประหยัดเมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคทางเคมีและฟิสิกส์อื่นๆ (Poole & Owens, 2007; Guzmán et al., 2009) อย่างไรก็ตาม ความแตกต่างในรูปร่างและการกระจายตัวของอนุภาคนาโนเมื่อเปรียบเทียบกับ Vaseeharan et al. (2010) และ Gavhane et al. (2555). สารสกัดชาเขียวในฐานะตัวรีดิวซ์แสดงจุดสูงสุด 2 จุดในสเปกตรัมการดูดกลืน ซึ่งบ่งบอกถึงการเพิ่มขึ้นของการกระจายตัวจำนวนมาก (Hsu & Wu, 2010; Kamal et al., 2010) ซึ่งได้รับการยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน ซึ่งพบว่าขนาดของอนุภาคนาโนเงินมีการกระจายตัวอย่างกว้างขวาง ในการศึกษาครั้งนี้ สังเกตเห็นอนุภาคนาโนที่มีรูปร่างแตกต่างกัน แม้ว่าจะยังไม่ชัดเจนว่าฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียขึ้นอยู่กับรูปร่างของอนุภาคนาโนหรือไม่ แต่ดูเหมือนว่าจะค่อนข้างแน่นอนว่ารูปร่างทั้งหมดที่พบสามารถนำไปสู่ผลต้านเชื้อแบคทีเรียได้ อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อยืนยันว่าทั้งรูปแบบและขนาดของอนุภาคนาโนไม่เหมาะสมสำหรับการใช้เพื่อการรักษา
ผลการตรวจทางเนื้อเยื่อวิทยาของกุ้งที่ติดเชื้อ NHPB สอดคล้องกับผลการรายงานของ Del RíoRodríguez และคณะ (2549). กุ้งที่ได้รับ AgNPs 5 µg แสดงให้เห็นความเสียหายของเนื้อเยื่อในลักษณะเดียวกับกุ้งที่ติดเชื้อโดยไม่ได้รับอนุภาคนาโน โดยยังมีเนื้อเยื่อตายและมีปุ่มแบคทีเรียและการแทรกซึมของเซลล์เม็ดเลือดด้วย นอกจากนี้ ในขณะที่กุ้งที่ได้รับการบำบัดด้วย AgNPs 35 µg พบว่าเนื้อเยื่อบางส่วนได้รับความเสียหาย แต่ไม่พบแบคทีเรียหรือการแทรกซึมของเซลล์เม็ดเลือดเป็นหลักฐานของ NHPB นอกจากนี้ เยื่อบุผิวของหลอดจะบางลงเล็กน้อย และความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อก็เปลี่ยนไป ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าการรักษาด้วย AgNP สามารถกำจัดหรือลด NHPB ในเซลล์กุ้งได้อย่างมีนัยสำคัญ ในกรณีนี้ การวิเคราะห์ PCR ในเชิงบวกจะบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของแบคทีเรีย อาจมีอยู่ในจำนวนน้อย แต่ไม่ปรากฏชัดเจนในการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ หรืออาจมี DNA ของแบคทีเรียที่เหลือจากแบคทีเรียที่ตายแล้วที่เหลืออยู่ในกุ้ง ความเป็นไปได้ที่ นาโนซิลเวอร์ จะคงอยู่ในเนื้อเยื่อมีสูง Bianchini และคณะ (2007) รายงานว่าใน Penaeus duorarum (Burkenroad) การสะสมของเงินเกิดขึ้นส่วนใหญ่ในตับอ่อน ตามด้วยเลือด อย่างไรก็ตาม มีการสะสมของเงินเพียงเล็กน้อยในเหงือก กล้ามเนื้อ และดวงตา บางทีอาจเป็นประโยชน์อย่างมากที่เงินจะสะสมอยู่ในตับอ่อน เนื่องจากเป็นอวัยวะเป้าหมายของ NHPB (Lightner et al., 1992) ดังนั้น เงินส่วนใหญ่จึงสามารถใช้เป็นสารต่อต้านแบคทีเรียได้ นอกจากนี้ เมื่อพิจารณาถึงความกังวลอย่างมากเกี่ยวกับผลกระทบของ AgNP ต่อสุขภาพของมนุษย์ (Korani et al., 2015) และเมื่อพิจารณาว่าตลาดผู้บริโภคพิจารณาส่วนท้องเป็นหลักมากกว่าส่วนอก ดังนั้น ความจริงที่ว่ากล้ามเนื้อกุ้งสะสมอนุภาคระดับนาโนน้อยลงจึงถือเป็นข้อดี
ตามรายงานของ Vincent et al. (2004) การดำเนินของโรค NHPB แสดงให้เห็นว่าในช่วง 20 วันแรก โรคอยู่ในระยะการพัฒนา หลังจากนั้นโรคจะเข้าสู่ระยะเฉียบพลันและเริ่มเสียชีวิต และหลังจากติดเชื้อได้ 35 วันก็จะเข้าสู่ระยะเรื้อรัง ในการศึกษานี้พบพฤติกรรมปกติและอาการทางคลินิกในกุ้งที่อายุไม่เกิน 20 วัน ในขณะที่กุ้งตายเกิดขึ้นในช่วงระยะเวลาทดลอง อย่างไรก็ตาม ระยะเรื้อรังเริ่มต้นขึ้นในช่วง 56 วันของการท้าทาย หลังจากสิ้นสุดการทดลองของเรา ความแตกต่างนี้กับ Vincent et al. (2004) จำเป็นต้องมีการประเมินการศึกษาเพื่อค้นหารูปแบบทางพันธุกรรมของ NHPB หรือสถานะสุขภาพภูมิคุ้มกันของกุ้ง ความแตกต่างเล็กน้อยในอัตราการเสียชีวิตระหว่างการบำบัดด้วย AgNPs 0 µg และ 5 µg อาจบ่งชี้ว่าความเข้มข้นของอนุภาคนาโนเงินไม่เพียงพอที่จะต่อสู้กับเชื้อก่อโรค ซึ่งสอดคล้องกับผลการค้นพบในการวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยา นอกจากนี้ สิ่งมีชีวิตที่ได้รับ AgNPs 35 µg มีอัตราการรอดชีวิต 100% และแม้ว่าผลการวิเคราะห์ทางโมเลกุลจะให้ผลเป็นบวกเมื่อสิ้นสุดการทดลอง แต่เนื้อเยื่อก็เกือบจะฟื้นฟูทางกายวิภาคแล้วเมื่อเทียบกับตัวอย่างแรก โมราเลส โควาร์รูเบียส และคณะ (2012) ทดสอบฟลอร์เฟนิคอลและออกซิเตตราไซคลินในกุ้งที่ติดเชื้อ NHPB และพบอัตราการรอดชีวิตตั้งแต่ 56 ถึง 83% โดยมีสารปฏิชีวนะตกค้างนานถึง 10 วันในกล้ามเนื้อกุ้ง สิ่งสำคัญที่ต้องทราบคือการใช้ยาปฏิชีวนะในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเกี่ยวข้องกับการพัฒนาของแบคทีเรียที่ดื้อยา แบคทีเรียสามารถทนต่อความเข้มข้นของเงินในระดับหนึ่งได้ และสามารถลดปริมาณเงินดังกล่าวจนสร้างเป็นนาโนคริสตัลในช่องว่างนอกเซลล์เพื่อเป็นมาตรการป้องกัน (Klaus-Joerger et al., 2001) อย่างไรก็ตาม แบคทีเรียก่อโรคส่วนใหญ่ไม่ต้านทานต่อ AgNP (Parameswari et al., 2010; Saxena et al., 2010; Vaseeharan et al., 2010) นอกจากนี้ ยังพบว่าจุลินทรีย์ที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะมีความอ่อนไหวต่อ AgNPs เท่ากันเมื่อเทียบกับจุลินทรีย์ที่ไม่ดื้อยา เช่น Lara et al. (2010) พบว่าเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) ที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะมีความไวต่อ นาโนซิลเวอร์
การประยุกต์ใช้ของอนุภาคนาโนเงินที่สังเคราะห์โดยใช้สารสกัดจากชาประกอบด้วยวัตถุดิบราคาถูกและหาได้ง่ายเมื่อเปรียบเทียบกับสารรีดิวซ์อื่นๆ ซึ่งหมายความว่าสามารถลดต้นทุนได้อย่างมาก รวมทั้งยังใช้วิธีการที่เรียบง่ายด้วย นอกจากนี้ ข้อดีของการนำอนุภาคนาโนที่สังเคราะห์ด้วยวิธีที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมและปริมาตรปริมาณต่ำมาใช้ อาจเป็นตัวเลือกที่ยอดเยี่ยมสำหรับใช้เป็นสารต้านจุลินทรีย์ในอุตสาหกรรมการเลี้ยงกุ้งบางประเภท เช่น ในการดูแลรักษาพ่อแม่พันธุ์กุ้ง แม้ว่าจะพบว่าอนุภาคนาโนมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในเซลล์ที่ทำให้เกิด NHPB แต่จำเป็นต้องทำความเข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของอนุภาคนาโนเหล่านี้ต่อแบคทีเรียเหล่านี้ การขาดความแตกต่างทางสถิติในส่วนประกอบทางชีวเคมีทั้ง 5 ชนิดที่วิเคราะห์บ่งชี้ว่าไม่มีหลักฐานเพียงพอที่จะแสดงให้เห็นว่าระดับของส่วนประกอบเหล่านั้นได้รับผลกระทบจากการติดเชื้อและความเข้มข้นที่แตกต่างกันของอนุภาคนาโนในกุ้งที่ติดเชื้อและมีสุขภาพดี การศึกษาในอนาคตควรพิจารณาขนาดตัวอย่างที่ใหญ่ขึ้นเพื่อหลีกเลี่ยงค่าการกระจายขนาดใหญ่ตามที่สังเกตพบในการวิเคราะห์เมตาบอไลต์ เนื่องจากค่าการกระจายที่สูงจะบดบังความแตกต่างที่อาจเกิดขึ้นได้ การทดสอบความเข้มข้นของอนุภาคนาโนในช่วงที่กว้างขึ้นและตรวจสอบความเป็นไปได้ของการนำอนุภาคนาโนไปใช้ในระบบการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำขนาดใหญ่ และอาจใช้เสริมอนุภาคนาโนเป็นสารเติมแต่งอาหารก็มีความสำคัญเช่นกัน เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการแสดงผลข้างเคียงของ AgNPs ต่อสิ่งมีชีวิตชายฝั่ง (Burić et al., 2015; Degger et al., 2015; Gambardella et al., 2015; Rocha et al., 2015) แต่โชคดีที่Juárez-Moreno et al. (2017) แสดงให้เห็นว่า นาโนซิลเวอร์ ในปริมาณที่ใช้ในการรักษาไม่เป็นพิษและไม่มีผลต่ออัตราการเผาผลาญหรือจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดในกุ้งขาว Litopenaeus วัยอ่อน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีการใช้โลหะและธาตุกึ่งโลหะหลากหลายชนิดเป็นอนุภาคนาโน จึงมีความสำคัญที่จะต้องศึกษาผลกระทบของการใช้วัสดุเหล่านี้ต่อสายพันธุ์สัตว์น้ำที่เพาะเลี้ยง สุขภาพของมนุษย์ และสิ่งแวดล้อมชายฝั่ง เพื่อนำกลยุทธ์ในอนาคตสำหรับการพัฒนาการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำที่ยั่งยืนและรับผิดชอบไปปฏิบัติ
Martín Rodrigo Acedo-Valdez, José Manuel Grijalva-Chon, Eduardo Larios-Rodríguez, Amir Darío Maldonado-Arce, Fernando Mendoza-Cano, José Arturo Sánchez-Paz & Reina Castro-Longoria, Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Ingeniería Química y Metalurgia, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Física, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Laboratorio de Referencia, Análisis y Diagnóstico en Sanidad Acuícola, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C., Hermosillo, Sonora, México