เปรียบเทียบ แอสตาแซนธิน กับเบตาแคโรทีนในด้านประสิทธิภาพการเจริญเติบโต ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ และการแสดงออกของยีนของกุ้งกุลาดำภายใต้สภาวะปกติและสภาวะขาดออกซิเจน

มีการทดลองสองครั้งเพื่อตรวจสอบผลกระทบของแหล่งแคโรทีนอยด์สองแหล่งที่แตกต่างกันต่อกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon ประการแรกต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต และประการที่สองต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของกุ้งที่ศึกษาต่อความท้าทายทางอากาศ ในการทดลองที่ 1 P. monodon (น้ำหนักเปียกเริ่มต้นเฉลี่ยประมาณ 2.07 กรัม) ได้รับอาหาร 5 มื้อ แบ่งเป็น 3 ครั้ง อาหารพื้นฐาน (D1) ที่ไม่มีแคโรทีนอยด์ มีการคิดค้นอาหารสองชนิดเพื่อให้ได้ แอสตาแซนธิน (D2) 0.1% เพียงอย่างเดียว ซึ่งเป็นการรวมกันของ แอสตาแซนธิน 0.1% และคอเลสเตอรอล (D3) 1% อาหารที่มีเบต้าแคโรทีน (D4) เพียง 0.25% ร่วมกับเบต้าแคโรทีน 0.25% และคอเลสเตอรอล 1% (D5) ประสิทธิภาพการเจริญเติบโต (น้ำหนักสุดท้าย, FBW; การเพิ่มน้ำหนัก, WG; การเพิ่มชีวมวล, BG) และอัตราการรอดตายของกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 แสดงให้เห็นค่าสูงสุด ค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ชัดเจน (ADC) ของแคโรทีนอยด์ในอาหารที่มีการเสริมแคโรทีนอยด์ (D2–D5) อยู่ในระดับสูง (>90%) และการเสริมคอเลสเตอรอลไม่ได้ช่วยปรับปรุง ADC ของแคโรทีนอยด์ให้ดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญต่อไป อย่างไรก็ตาม การเสริมคอเลสเตอรอลช่วยเพิ่มการกักเก็บแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อได้อย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่เสริมด้วยแอสตาแซนธิน (D3 เทียบกับ D2) แต่ไม่ช่วยเพิ่มในผู้ป่วยที่เสริมด้วยเบตาแคโรทีน (D5 เทียบกับ D4) ระดับมาโลนไดอัลดีไฮด์ของตับและตับอ่อน (MDA) และเวลาการแข็งตัวของเลือดของกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ (D2-D5) ต่ำกว่า (P < 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมอาหารพื้นฐาน (D1) ในทางตรงกันข้าม จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดในกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน (D1) ต่ำกว่า (P < 0.05) เมื่อเทียบกับจำนวนเม็ดเลือดในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ (D2-D5) ไม่พบความแตกต่างที่สำคัญ (P > 0.05) ในโปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของโปรตีนช็อกความร้อน 70 (Hsp 70) และ mRNA ของปัจจัยชักนำภาวะขาดออกซิเจน-1α (HIF-1α) ในตับอ่อนของกุ้งในอาหารทุกประเภท ในการทดลองครั้งที่ 2 กุ้งถูกสัมผัสกับอากาศระหว่างการจำลองการขนส่งกุ้งมีชีวิตเป็นเวลา 36 ชั่วโมงหลังการทดลองครั้งที่ 1 ไม่มีการตายของกุ้งในอาหารทุกประเภทหลังจากการจำลองการขนส่งกุ้งมีชีวิตเป็นเวลา 36 ชั่วโมง จำนวนเม็ดเลือดรวมของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานและอาหารเสริมเบตาแคโรทีน (D1, D4 และ D5) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) หลังการทดลองครั้งที่ 2 ในขณะที่จำนวนเม็ดเลือดรวมในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D2 และ D3) ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ระยะเวลาการแข็งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน (D1) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) หลังการทดลองครั้งที่ 2 และยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ (D2-D5) ปริมาณ MDA และโปรตีนคาร์บอนิลในตับอ่อนของกุ้งในการทดลองที่ 2 มีค่าสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเทียบกับการทดลองที่ 1 โปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของ Hsp 70 และ mRNA ของ HIF-1α ในตับอ่อนของกุ้งที่กินอาหารพื้นฐานมีค่าต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่กินอาหารชนิดอื่น จากการสรุป ข้อมูลทั้งหมดชี้ให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน ดีกว่าเบตาแคโรทีนทั้งในฐานะของเม็ดสีและสารต้านอนุมูลอิสระในอาหารเชิงพาณิชย์ของกุ้งมังกร และการเสริมคอเลสเตอรอลสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของ แอสตาแซนธิน ได้ในเชิงบวก แต่ไม่สามารถเพิ่มเบตาแคโรทีนได้

NANOCMM TECHNOLOGY

1. บทนำ

การรักษาเม็ดสีผิวตามธรรมชาติมีความสำคัญอย่างยิ่งจากมุมมองเชิงพาณิชย์ โดยเกี่ยวข้องโดยตรงกับการยอมรับหรือปฏิเสธของผู้บริโภคและราคาตลาดของผลิตภัณฑ์ (Shahidi et al., 1988) ในสัตว์จำพวกกุ้ง สีสันจะได้มาจากแคโรทีนอยด์ โดยเม็ดสีหลักมักเป็น แอสตาแซนธิน ในรูปแบบอิสระหรือเอสเทอร์ไรด์ (Niu et al., 2012) ในโครงกระดูกภายนอกของสัตว์จำพวกกุ้งที่มีชีวิต สีส้มแดงของแอสตาแซนธิน (3,3′-dihydroxy-β,β-carotene4,4′-dione) อาจเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาล เขียว หรือน้ำเงินได้โดยการสร้างสารเชิงซ้อนแคโรทีนโปรตีน ซึ่งสีแดงจะปรากฏเมื่อปรุงอาหาร แคโรทีนอยด์สังเคราะห์จากเจอราเนียลเจอราเนียลไดฟอสเฟตโดยสิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์แสงทั้งหมด และในเส้นทางการสังเคราะห์ชีวภาพ ไลโคปีนจะถูกแปลงเป็นเบตาแคโรทีน ซึ่งจากนั้นจะถูกเผาผลาญต่อไปเป็น แอสตาแซนธิน (Giuliano et al., 2000) พืชสังเคราะห์แสงสามารถสังเคราะห์ไลโคปีนและเบตาแคโรทีนได้ ในขณะที่แอสตาแซนธินเป็นแคโรทีนอยด์ที่ไม่ใช่จากพืช Penaeus monodon ไม่สามารถสังเคราะห์แคโรทีนอยด์ใหม่ได้ แต่สามารถเปลี่ยนเบตาแคโรทีนและแคนทาแซนธินจากอาหารให้เป็น แอสตาแซนธิน ที่สะสมอยู่ในร่างกายได้ (Boonyarataplin et al., 2001) จะได้สีที่ต้องการได้โดยการเติมแอสตาแซนธินลงไปในอาหาร ซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์ที่พบได้ตามธรรมชาติซึ่งให้สีได้ ต้นทุนของ แอสตาแซนธิน สังเคราะห์สูงและเพิ่มต้นทุนอาหารสัตว์และการผลิตอย่างมาก ดังนั้น ปัจจุบันจึงมีความปรารถนาทางการค้าที่จะปรับปรุงประสิทธิภาพของแอสตาแซนธิน หรือระบุวิธีการทางเลือกที่คุ้มต้นทุนกว่าในการบรรลุสีที่ต้องการ Castillo (1980) แสดงให้เห็นว่าปูเสฉวน Clibanarius erythropus latreille (1818) มีความสามารถในการแปลงเบตาแคโรทีนในอาหารให้เป็นแอสตาแซนธิน บุญญารัตพลิน และคณะ (2001) และ Linan-Cabello และคณะ (2002) รายงานอีกว่า Penaeus monodon มีความสามารถในการแปลงเบตาแคโรทีนให้เป็น แอสตาแซนธิน เหลียวและคณะ (พ.ศ. 2536) รายงานว่าการเตรียมสาหร่ายสไปรูลินาซึ่งเป็นไซยาโนแบคทีเรียที่มีเบตาแคโรทีนเป็นแคโรทีนอยด์หลักโดยวิธีทางอาหารส่งผลให้มีการสร้างเม็ดสีบนกระดองอย่างมีประสิทธิภาพใน P. monodon

นอกจากนี้ ข้อมูลของเราที่ยังไม่ได้เผยแพร่ก่อนหน้านี้ยังแสดงให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน มีประสิทธิภาพการใช้แคโรทีนอยด์สูงกว่าเบตาแคโรทีนประมาณ 2.5 เท่าในการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของ P. monodon สิ่งนี้ทำให้เกิดความเป็นไปได้ว่าหากการแปลงมีประสิทธิภาพเพียงพอ การให้อาหารที่มีเบตาแคโรทีนหรือผลิตภัณฑ์ที่มีเบตาแคโรทีนสูงอาจเป็นวิธีทางเลือกและมีราคาถูกกว่าในการให้สัตว์จำพวกกุ้งมีสีตามต้องการ จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาใดที่ออกแบบมาเพื่อเปรียบเทียบผลกระทบของ แอสตาแซนธิน และเบตาแคโรทีนในอาหารต่อประสิทธิภาพการสร้างเม็ดสีใน P. monodon และการศึกษาที่ยังไม่ได้เผยแพร่ก่อนหน้านี้ของเราเพียงแค่เปรียบเทียบผลกระทบของแอสตาแซนธินกับเบตาแคโรทีนต่อการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของ P. monodon เท่านั้น

สีของกล้ามเนื้อกุ้งเกิดจากการดูดซึม การสะสม และการเปลี่ยนแปลงทางการเผาผลาญของแคโรทีนอยด์ในอาหาร (Nickell และ Bromage, 1998) อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพของแคโรทีนอยด์ในการสร้างเม็ดสีของกล้ามเนื้อนั้นต่ำมาก โดยมีแคโรทีนอยด์ในอาหารเพียงประมาณ 5–15% เท่านั้นที่ใช้เพื่อสร้างเม็ดสีของกล้ามเนื้อ (Nickell และ Bromage, 1998) การใช้ประโยชน์ที่ต่ำอาจเป็นผลจากอัตราการดูดซึมที่ต่ำในทางเดินอาหาร การสะสมในอวัยวะอื่น และการแปลงทางเมตาบอลิซึมเป็นสารประกอบไม่มีสีที่อาจถูกขับออกมาในที่สุด (Niu et al., 2012) นอกจากนี้ แคโรทีนอยด์เป็นสารประกอบที่ละลายได้ในไขมัน ดังนั้น ปริมาณและชนิดของไขมันที่มีอยู่ในอาหารอาจส่งผลต่อการดูดซึมของแคโรทีนอยด์ได้ (Regost et al., 2004) การศึกษามากมายได้ประเมินความสำคัญของไขมันในอาหารเทียบกับการขาดไขมันโดยสิ้นเชิงในช่วงเวลาที่กินเบตาแคโรทีน (Dimitrov et al., 1988; Prince et al., 1991) Borel และคณะ (1998) รายงานว่าประเภทของไขมันที่มีอยู่ในอาหารยังส่งผลต่อการดูดซึมของแคโรทีนอยด์ด้วย ในฐานะของลิพิดเครือข่าย ไตรกลีเซอไรด์สายกลางและไตรกลีเซอไรด์สายยาวไม่สามารถปรับปรุงการดูดซึมของเบตาแคโรทีนได้ (Borel et al., 1998) อย่างไรก็ตาม Niu et al. (2012) ระบุว่าแอสตาแซนธินเหนือกว่าแคนทาแซนธินในฐานะแหล่งแคโรทีนอยด์ในอาหารเชิงพาณิชย์ของกุ้งมังกร และการเสริมคอเลสเตอรอลสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของแอสตาแซนธินและแคนทาแซนธินได้ในเชิงบวก การวัดการดูดซึมของระบบทางเดินอาหารที่ใช้กันทั่วไปคือค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ชัดเจน (ADC) ค่าทั่วไปของ ADC ของแอสตาแซนธินและแคนทาแซนธินสำหรับปลาแซลมอนอยู่ระหว่าง 30% ถึง 60% (Kiessling et al., 2003) แต่ค่าที่สูงกว่าหรือต่ำกว่านี้ก็อาจเป็นไปได้ พบว่าขึ้นอยู่กับปริมาณยาและเฉพาะสายพันธุ์ นิว และคณะ (2012) แสดงให้เห็นว่า ADC ของแอสตาแซนธินสำหรับ P. monodon ค่อนข้างสูง (N98%) การเพิ่มคอเลสเตอรอลในอาหารไม่สามารถปรับปรุง ADC ของแอสตาแซนธินเพิ่มเติมได้ อย่างไรก็ตาม การเสริมคอเลสเตอรอลในอาหารสามารถปรับปรุงการย่อยของแคนทาแซนทินได้อย่างมีนัยสำคัญจากร้อยละ 50 เป็นร้อยละ 77 สำหรับ P. monodon แอสตาแซนธินและแคนทาแซนธินเป็นสารประกอบที่มีขั้วมากกว่า ในขณะที่เบตาแคโรทีนจัดอยู่ในไฮโดรคาร์บอนแคโรทีนไม่มีขั้ว (Yeum และ Russell, 2002) ซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์สองกลุ่มย่อยที่แตกต่างกัน ไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับ ADC ของแอสตาแซนธินและเบตาแคโรทีนที่เปรียบเทียบในกุ้ง และยังไม่มีข้อมูลว่าการเสริมคอเลสเตอรอลในอาหารสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของเบตาแคโรทีนได้หรือไม่ นอกเหนือจากการสร้างเม็ดสี การเสริมสร้างการเจริญเติบโตหรือการปรับปรุงลักษณะผลผลิตของพ่อแม่พันธุ์ของแคโรทีนอยด์แล้ว ยังมีการให้ความสนใจเพิ่มมากขึ้นในการกำหนดหน้าที่ทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในสัตว์น้ำ Niu และคณะได้ชี้ให้เห็นถึงหน้าที่ทางชีวภาพของแคโรทีนอยด์ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ (2012) คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระอาจเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการต้านทานความเครียด การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าความต้านทานที่เพิ่มขึ้นต่อความเครียดจากการสูญเสียออกซิเจนที่ละลายอยู่ในน้ำ (Niu et al., 2009) ความเครียดจากความเค็มและความร้อน (Chien et al., 2003) แอมโมเนีย และความเครียดทางพยาธิวิทยา (Pan et al., 2003a,b) ในกุ้งแม่น้ำมีความเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของแคโรทีนอยด์ในอาหารและร่างกาย นอกจากนี้ การสัมผัสอากาศยังถูกใช้เป็นตัวก่อความเครียดที่พบบ่อยในการประเมินสุขภาพของปู (Cancer pagurus) (Lorenzon et al., 2008) กุ้งมังกร (Panulirus cygnus) (Fotedar et al., 2001) กุ้งก้ามกรามตะวันตก (Penaeus latisulcatus) และกุ้งลายเสือ (Penaeus esculentus) (Sang and Fotedar, 2005) อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของความเครียดนี้ต่อ P. monodon ยังไม่ได้รับการศึกษา การศึกษาครั้งนี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อประเมินผลของ แอสตาแซนธิน หรือเบตาแคโรทีนต่อการเจริญเติบโต การอยู่รอด การสร้างเม็ดสี ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ และการแสดงออกของยีนของ P. monodon และว่าการเสริมคอเลสเตอรอลในอาหารจะสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของ แอสตาแซนธิน และเบตาแคโรทีนในแง่ของการย่อยได้ ประสิทธิภาพการกักเก็บ และปริมาณแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อได้หรือไม่

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การจัดเตรียมอาหารและการรักษาอาหาร

ในการศึกษานี้มีการดำเนินการทดลอง 2 ครั้ง (การทดลองที่ 1 และการทดลองที่ 2) สูตรและองค์ประกอบโดยประมาณของอาหารทดลอง 5 ชนิด (D1: อาหารพื้นฐาน; D2: แอสตาแซนธิน 0.1%; D3: แอสตาแซนธิน 0.1% + คอเลสเตอรอล 1%; D4: เบต้าแคโรทีน 0.25%; D5: เบต้าแคโรทีน 0.25% + คอเลสเตอรอล 1%) พร้อมด้วยแหล่งแคโรทีนอยด์ต่างๆ (Carophyll® Pink, แอสตาแซนธิน 10% และเบต้าแคโรทีน 10%, DSM Nutritional Products France SAS) มีนำเสนอในตารางที่ 1 และ 2 วิธีการเตรียมอาหารนั้นเหมือนกับที่อธิบายไว้โดย Niu et al. (2555). โดยสรุป ส่วนผสมแห้งทั้งหมดของอาหารทดลองจะถูกชั่งน้ำหนัก ผสมเข้าด้วยกันและผสมให้เข้ากันในเครื่องผสมแบบโฮบาร์ต จากนั้นเติมน้ำมันลงไปแล้วผสมให้เข้ากันประมาณ 5 นาที เติมน้ำดีไอออนไนซ์ (40% ของส่วนผสมแห้ง) ลงไปแล้วผสมต่ออีก 5 นาที ส่วนผสมที่เป็นของเหลวถูกวางลงในเครื่องอัดรีดแบบสกรูตัวเดียว (สถาบันวิศวกรรมเคมี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีจีนตอนใต้ กว่างโจว สาธารณรัฐประชาชนจีน) และถูกอัดผ่านแม่พิมพ์ขนาด 1.2 มม. Y2O3 ถูกใช้เป็นสารติดตามเฉื่อยที่ความเข้มข้น 0.01% ในอาหาร เม็ดไม้ที่ได้จะถูกทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 25°C ด้วยความช่วยเหลือของเครื่องปรับอากาศและพัดลมไฟฟ้า ปันส่วนทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -20°C จนกว่าจะใช้งาน

ตารางที่ 1 ส่วนประกอบของอาหารหลัก

ตารางที่ 2 องค์ประกอบโดยประมาณและสูตรของแต่ละอัตราส่วน (% มวลแห้ง)

2.2. กุ้งและแบบจำลองการทดลอง 1

ในการทดลองครั้งที่ 1 ได้มีการนำกุ้ง P. monodon postlarvae จำนวน 30,000 ตัว ที่ได้จากฟาร์มเพาะเลี้ยงเชิงพาณิชย์ใกล้อ่าว Hongsha เมืองซานย่า มณฑลไหหลำ มาเลี้ยงในถังคอนกรีตในร่มขนาด 5 ตัน และให้อาหารเชิงพาณิชย์โดยไม่ได้เสริมแคโรทีนอยด์ 1–2 เดือน หรือจนกระทั่งน้ำหนักประมาณ 2 กรัม นอกจากนี้ กุ้งยังถูกปรับให้เข้ากับสภาพการทดลองและให้อาหารพื้นฐานปัจจุบันเป็นเวลาสองสัปดาห์ก่อนเริ่มการทดลอง กุ้งสุขภาพดีจำนวนทั้งหมด 600 ตัว โดยมีน้ำหนักตัวเริ่มต้น 2.08 กรัม ได้รับมอบหมายแบบสุ่มในถังไฟเบอร์กลาส 15 ถัง (น้ำหนัก 500 ลิตร อาหาร 3 ถัง ถังละ 40 ตัว) การเปลี่ยนน้ำในตู้ปลาแต่ละตู้ได้รับการปรับที่ประมาณ 1.0 ลิตร/นาทีโดยใช้ระบบกรองแบบไหลผ่าน แต่ละถังมีฝาปิดตาข่ายพลาสติกเพื่อป้องกันไม่ให้กุ้งกระโดดออกมา กุ้งถูกเลี้ยงไว้กลางแจ้งใต้หลังคาเหล็กและได้รับแสงธรรมชาติ (12 ชั่วโมงสว่าง/12 ชั่วโมงมืด) ในช่วงทดลอง อุณหภูมิของน้ำ ความเค็ม ออกซิเจนที่ละลายน้ำ และไนโตรเจนแอมโมเนียรวมอยู่ในช่วง 26.0 ถึง 28.0 °C, 29.0 ถึง 32.0 กรัม/ลิตร, 6.8 ถึง 7.5 มิลลิกรัม/ลิตร และ 0.22 ถึง 0.51 มิลลิกรัม/ลิตร ตามลำดับ

กุ้งทั้งหมดในแต่ละถังได้รับอาหารเริ่มต้น 6% ของน้ำหนักตัวทั้งหมดทุกวัน ตามข้อมูลของ Shiau et al. (1991). ความถี่ในการให้อาหารมี 3 ครั้งต่อวัน คือ เวลา 07.00 น. 13.00 น. และ 21.00 น. เป็นเวลา 74 วัน ในระหว่างการทดลองให้อาหาร ปริมาณอาหารที่ให้จะค่อยๆ เปลี่ยนแปลงและปรับตามความอยากอาหารของกุ้ง โดยตรวจสอบที่พื้นถังว่ามีอาหารส่วนเกินที่เหลืออยู่ 2 ชั่วโมงหลังจากให้อาหารหรือไม่ วิธีนี้จะลดการให้อาหารมากเกินไปให้เหลือน้อยที่สุด และให้กุ้งได้รับอาหารจนเกือบอิ่ม ทุกเช้าและบ่ายก่อนถึงเวลาให้อาหารทุกครั้ง จะมีการดูดอาหารที่เหลือหรือกินไม่หมด อุจจาระ กุ้งลอกคราบ และกุ้งตายออกจากตู้ ทุกๆ สองสัปดาห์ กุ้งจากแต่ละถังจะถูกชั่งน้ำหนักและนับจำนวนเพื่อประเมินการเจริญเติบโตและการอยู่รอด ในช่วง 14 วันสุดท้าย จะมีการดูดอุจจาระออกจากตู้ปลาแต่ละตู้วันละ 2 ครั้ง ในเวลา 08.00 น. และ 14.00 น. ภายใน 30 นาทีหลังการขับถ่าย หากมี เศษอาหารที่มีคราบแดงจะแยกออกจากอุจจาระได้อย่างง่ายดายและกำจัดออกไป จากนั้นล้างอุจจาระด้วยน้ำกลั่นสองครั้งเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของเกลือ และแช่แข็งที่ -20 °C ตัวอย่างถูกทำให้แห้งแบบแช่แข็งเพื่อรอการวิเคราะห์ (Merican และ Shim, 1995)

2.4. การสุ่มตัวอย่างและการเก็บรักษา

ก่อนการเลี้ยงกุ้งจะสุ่มเก็บจำนวนกุ้งที่เพียงพอเพื่อวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ทั้งตัว กล้ามเนื้อ และเปลือก เมื่อสิ้นสุดการทดลองการให้อาหาร จะเก็บกุ้งจำนวน 6 ตัวจากแต่ละถังแบบสุ่ม เพื่อเก็บตัวอย่างทั้งตัว กล้ามเนื้อ ผิวหนัง และเลือด ดู Barbosa et al. (1999) ระยะเวลาตั้งแต่รับประทานอาหารมื้อสุดท้ายจนถึงการเก็บตัวอย่างเลือดอยู่ภายใน 2 ชั่วโมง การดูดเลือดออกทำได้โดยการแทงเข็มเข้าไปในช่องเยื่อหุ้มหัวใจผ่านเยื่อหุ้มระหว่างเซฟาโลทอแรกซ์และช่องท้อง ตัวอย่างเลือดน้ำเหลืองถูกเตรียมโดยการผสมสารละลาย NaCl ไอโซโทนิก 400 μL ที่มี EDTA 0.94 m mol/L กับเลือดน้ำเหลือง 100 μL ทันทีหลังจากการแตกของเลือด จากนั้นแยกพลาสมาด้วยการหมุนเหวี่ยง (12,000 รอบต่อนาที Eppendorf 5810R) และวัดความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ทันที ตัวอย่างผิวหนัง ตับ ตับอ่อน และกล้ามเนื้อถูกผ่าออกและแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 °C เพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง

2.5. การวิเคราะห์ทางเคมี

2.5.1. การวิเคราะห์องค์ประกอบของตัวอย่างอาหารและกุ้ง

ตัวอย่างอาหารและอุจจาระถูกทำให้แห้งแบบแช่แข็ง (Advantage 2.0, VirTis, สหรัฐอเมริกา) จากนั้นจึงบด ความชื้น โปรตีนดิบ ไขมันดิบ และเถ้าดิบของอาหารและปุ๋ยคอกถูกกำหนดโดยใช้วิธีมาตรฐาน (AOAC, 2001) ความชื้นถูกกำหนดโดยการอบแห้งที่อุณหภูมิ 105°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และเถ้าถูกกำหนดในเตาเผาแบบปิดที่อุณหภูมิ 550°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โปรตีนดิบถูกวิเคราะห์โดยวิธี Kjeldahl หลังจากการย่อยด้วยกรด (1030-Auto-analyzer, Tecator, สวีเดน) ไขมันดิบถูกกำหนดโดยวิธีการสกัดอีเธอร์ของ Soxtec System HT (Soxtec System HT6, Tecator) พลังงานจากอาหารและอุจจาระถูกกำหนดโดยใช้เครื่องวัดปริมาณความร้อนแบบอะเดียแบติกแบบระเบิดขนาดเล็ก (เครื่องวัดปริมาณความร้อนแบบอะเดียแบติก HR-15A เมืองฉางซาน ประเทศจีน) อิตเทรียม (Y) ถูกวิเคราะห์โดยเครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลพลาสมาที่จับคู่แบบเหนี่ยวนำ (ICP; รุ่น: IRIS Advantage (HR), Thermo Jarrel Ash Corporation, บอสตัน, สหรัฐอเมริกา) ตามที่อธิบายโดย Refstie และคณะ (1997).

2.5.2. การวิเคราะห์มาโลนไดอัลดีไฮด์และโปรตีนคาร์บอนิล

เพื่อเป็นตัวบ่งชี้การเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน เราใช้การก่อตัวของ TBARS ในปฏิกิริยาการให้ความร้อนด้วยกรด ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ซึ่ง Draper และ Hadley (1990) เคยอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเทียบเท่ามาโลนไดอัลดีไฮด์ (MDA) (nmol/mg ของโปรตีน) ในการทำให้เกิดการคาร์บอนิลเลตโปรตีน จะต้องฟักส่วนที่เป็นของเหลวใสไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วย 2,4-ไดนิโตรฟีนิลไฮดราซีน (DNTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ที่ละลายใน HCl 2 โมลาร์เพื่อให้ DNTP จับกับกลุ่มคาร์บอนิลได้ (Levine et al., 1994)

ช่องว่างถูกรันด้วย HCl เท่านั้น จากนั้นจึงตกตะกอนโปรตีนด้วยกรดไตรคลอโรอะซิติก 6% (TCA) แล้วปั่นเป็นเวลา 10 นาทีที่ 11,000 g เม็ดโปรตีนถูกชะล้างด้วยเอธานอล/เอทิลอะซิเตท (1:1) สามครั้ง แล้วทำให้แขวนลอยอีกครั้งในกัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์ 6 M กรดฟอร์มิก 50% และฟักที่อุณหภูมิ 37°C จนกระทั่งแขวนลอยอีกครั้งอย่างสมบูรณ์ ปริมาณคาร์บอนิลถูกวัดโดยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก (Synergy HT, Bioteck) ในสารแขวนลอยที่เกิดขึ้นที่ 370 นาโนเมตร (ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์โมลาร์ 22,000 M−1 cm−1) ผลลัพธ์แสดงเป็นนาโนโมลของ DNPH ที่รวมโปรตีน−1 มก. ปริมาณโปรตีนทั้งหมดถูกกำหนดสำหรับแต่ละตัวอย่างตาม Lowry et al. (1951).

2.5.3. การวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อ

การวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ดำเนินการสามครั้ง และแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังทั่วไปสำหรับการแยกและการจัดการแคโรทีนอยด์ ตามที่อธิบายโดย Barbosa et al. (1999) ได้มีการติดตามมา การสกัดแคโรทีนอยด์จากอาหารและอุจจาระดำเนินการตามวิธีของ Schierle และ Hardi (1994) การสกัดแคโรทีนอยด์จากตัวอย่างผิวหนังดำเนินการตามวิธีของ Schiedt et al. (1995). การสกัดแคโรทีนอยด์จากตัวอย่างกล้ามเนื้อดำเนินการตามวิธีของ Boonyarataplin et al. (2544). แคโรทีนอยด์ในพลาสมาถูกสกัดโดยใช้หัววัดโซนิกแบบพกพาตามวิธีของ Kiessling et al. (2546). ปริมาณรวมของแคโรทีนอยด์ที่มีอยู่ในเนื้อเยื่อ 100 กรัมคำนวณจากสมการต่อไปนี้ (McBeth, 1972):

แคโรทีนอยด์ มก./เนื้อเยื่อ 100 ก.

= (OD × vol × 10³)/(E× น้ำหนักของเนื้อเยื่อ (g))

โดยที่ E คือค่าสัมประสิทธิ์การดูดซับ เนื่องจากสารสกัดดิบมักมีแคโรทีนอยด์หลายชนิด จึงมักใช้ค่าสัมประสิทธิ์เฉลี่ย 2,500 ในการคำนวณ OD ความหนาแน่นแสงที่ λmax (476 นาโนเมตร) ปริมาตร, ปริมาตรรวมของสารละลาย (มล.)

2.5.4. จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมด (THC) และเวลาในการแข็งตัวของเลือด

การนับจำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมดดำเนินการตามขั้นตอนที่กำหนดสำหรับกุ้งมังกร (Fotedar et al., 2001) ทำความสะอาดบริเวณอกของกุ้งแต่ละตัวในแต่ละถังด้วยแอลกอฮอล์ 70% ดึงเฮโมไลเสตส่วนปริมาตร 0.2 มิลลิลิตรใส่ในกระบอกฉีดยาปลอดเชื้อขนาด 1 มิลลิลิตร ซึ่งบรรจุสารกันเลือดแข็ง 0.2 มิลลิลิตร (NaCl 450 มิลลิโมลาร์, KCl 100 มิลลิโมลาร์, EDTA-2Na 10 มิลลิโมลาร์, HEPES 10 มิลลิโมลาร์; pH7.45) แล้วบรรจุลงในหลอดทดลอง Eppendorf ที่ปิดสนิท บนน้ำแข็ง การนับจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดของกุ้งแต่ละตัวจะถูกประมาณโดยใช้เครื่องนับเม็ดเลือด (Neubauer, เยอรมนี) ภายใต้กำลังขยาย 100 เท่า จากส่วนผสมของสารกันเลือดแข็ง/สารทำให้เม็ดเลือดแดงแตก นับเซลล์ในทั้งสองตารางและใช้ค่าเฉลี่ยเป็นการนับเซลล์เม็ดเลือด จำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมดคำนวณโดยใช้ THC = (จำนวนเซลล์ที่นับ × ปัจจัยการเจือจาง × 1,000)/ปริมาตรของตาข่าย (0.1 มม.3)

เวลาในการแข็งตัวของเม็ดเลือดแตกจะถูกกำหนดตามขั้นตอนที่อธิบายโดย Fotedar et al. (2544) มีการแก้ไขบางส่วน นำฮีโมไลเสตออกมาใส่ในกระบอกฉีดยาที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว จากนั้นจึงฉีดเข้าไปในหลอดทดลอง Eppendorf สารละลายขนาด 30 มล. ถูกถ่ายโอนไปยังหลอดอื่นอย่างรวดเร็วและดึงเข้าไปในหลอดเส้นเลือดฝอย พลิกท่อหลายๆ ครั้งจนกระทั่งน้ำเหลืองหยุดเคลื่อนที่ และเวลาจะถูกบันทึกเป็นเวลาการแข็งตัวของเลือด

2.6. การสัมผัสอากาศระหว่างการจำลองการขนส่งสด-ทดสอบ 2

หลังจากเลี้ยงเป็นเวลา 60 วัน กุ้งก็ถูกขนส่งแบบสดๆ ในแบบจำลอง จากแต่ละกลุ่มอาหาร กุ้ง 18 ตัว (6 ตัวจากแต่ละการจำลอง) ถูกทำเครื่องหมายด้วยน้ำยาทาเล็บและใส่ไว้ในกล่องโพลีสไตรีน (60 × 40 × 30 ซม.) เป็นเวลา 36 ชั่วโมง ภายในกล่องมีเจลน้ำแข็ง 2 ชิ้นหุ้มด้วยโฟม วางกุ้งลงบนชั้นโฟมนี้แล้วปิดทับด้วยโฟมอีกชั้นหนึ่ง จากนั้นปิดฝากล่องแล้วปิดผนึก เมื่ออยู่ในกล่องเป็นเวลา 36 ชั่วโมงแล้ว ให้วางกุ้งกลับเข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นจึงตรวจสอบจำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมดและเวลาการแข็งตัวของเลือด

หลังจากการทดสอบความทนต่อความเครียดจากการสัมผัสกับอากาศแล้ว กุ้งที่รอดจะถูกเก็บรวบรวมและตัวอย่างต่อมย่อยอาหารก็ถูกนำออกจากกุ้งที่เก็บตัวอย่างด้วย และแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที จากนั้นจึงจัดเก็บที่อุณหภูมิ -70°C การกำหนดค่ามาโลนไดอัลดีไฮด์และโปรตีนคาร์บอนิลเป็นแบบเดียวกับที่กล่าวไว้ข้างต้น การกำหนดจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมด (THC) และเวลาการแข็งตัวของเลือดจะคล้ายกับที่อธิบายไว้ข้างต้น

2.7. การวิเคราะห์การแสดงออกของ mRNA ของ Hsp70 และ mRNA ของ HIF-1α

โปรตีนฮีตช็อค 70 (Hsp 70) เป็นโมเลกุลชาเปอโรนที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในวิวัฒนาการ ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของเครื่องจักรการพับโปรตีนในเซลล์ และช่วยปกป้องเซลล์จากความเครียด (Joly et al., 2010) เพื่อทำความเข้าใจกลไกโมเลกุลสารต้านอนุมูลอิสระของ แอสตาแซนธิน และเบตาแคโรทีน ในการศึกษานี้ ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp70 และปัจจัยชักนำภาวะขาดออกซิเจน 1α (HIF-1α) ได้รับการวัดด้วยวิธี PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ในกุ้งที่กินอาหารทดลอง 5 ชนิดที่แตกต่างกัน และได้รับการบำบัดด้วยการสัมผัสกับอากาศในระหว่างการขนส่งสดจำลอง RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RNeasy Mini Kit (QIAGEN Cat: no. 74104) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และได้รับการบำบัดด้วย DNase I (QIAGEN Cat: no. 79254) เพื่อกำจัด DNA ที่ปนเปื้อน จากนั้นจึงสังเคราะห์ cDNA สายแรกตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับ PrimeScript™ RT (Perfect Real-Time) Reagent Kit (TaKaRa DRR037S) โดยใช้ RNA ทั้งหมดเป็นเทมเพลต ส่วนผสม cDNA ถูกเจือจางในอัตราส่วน 1:5 และเก็บไว้ที่ -80 °C สำหรับการทำ RT-PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ในเวลาต่อมา ไพรเมอร์สำหรับแต่ละยีนได้รับการออกแบบโดยอิงตาม cDNA ที่เผยแพร่ของ P. monodon โดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer 3 (http://primer3.wi.mit.edu/) (ตารางที่ 3) ไพรเมอร์ทั้งหมดผลิตโดย Takara (Dalian) Biotechnology Co., Ltd. (Takara Dalian) และมีการปรับสภาวะปฏิกิริยาให้เหมาะสมด้วย ดำเนินการ RT-PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณในปริมาตรรวม 20 μL ที่ประกอบด้วย 2× SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TaKaRa DRR041A) จำนวน 10 μL, cDNA 1 μL, ไพรเมอร์แต่ละตัว 0.16 μM และน้ำกลั่นสองครั้ง 8.2 μL โปรแกรม RT-PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ประกอบด้วยขั้นตอนการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วยรอบการขยาย 40 รอบของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 วินาที การอบอ่อนที่อุณหภูมิ 58°C เป็นเวลา 15 วินาที และการยืดออกที่อุณหภูมิ 72°C เป็นเวลา 30 วินาที การอ่านค่าฟลูออเรสเซนต์จะทำในตอนท้ายของแต่ละรอบ เพื่อวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp70 จะใช้วิธี CT เปรียบเทียบ (วิธี 2-ΔΔCT) กำหนด CT สำหรับ Hsp70 ที่ขยายเป้าหมายและ CT สำหรับ β-actin ของการควบคุมภายในสำหรับแต่ละตัวอย่าง ความแตกต่างของ CT สำหรับเป้าหมายและการควบคุมภายใน เรียกว่า ΔCT ได้รับการคำนวณเพื่อทำให้ความแตกต่างของปริมาณทั้งหมดของ cDNA ที่เพิ่มลงในแต่ละปฏิกิริยา และประสิทธิภาพของ RT-PCR เป็นมาตรฐาน กลุ่มควบคุมที่ใช้เป็นตัวอย่างอ้างอิงเรียกว่าเครื่องสอบเทียบ นำ ΔCT ของแต่ละตัวอย่างลบออกจาก ΔCT ของเครื่องสอบเทียบ ความแตกต่างเรียกว่า ΔΔCT ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ PoGal สามารถคำนวณได้ดังนี้ 2 − ΔΔCT และค่าแสดงถึงความแตกต่าง n เท่าจากเครื่องสอบเทียบ

2.8. การคำนวณและวิเคราะห์ทางสถิติ

พารามิเตอร์ทางชีวภาพที่ใช้ในการประเมินคุณภาพอาหารคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:

น้ำหนักที่เพิ่มขึ้น (WG) % = 100 × (น้ำหนักเฉลี่ยสุดท้าย−น้ำหนักเฉลี่ยเริ่มต้น)/น้ำหนักเฉลี่ยเริ่มต้น

อัตราการเพิ่มของชีวมวล (BG) (g) = ชีวมวลสุดท้าย−ชีวมวลเริ่มต้น

อัตราการรอด (%) = 100 × จำนวนกุ้งสุดท้าย / จำนวนกุ้งเริ่มต้น ;

อัตราการแปลงอาหาร (FCR) = ปริมาณอาหารที่กิน / น้ำหนักที่เพิ่มขึ้นเมื่อเป็นเปียก

ประสิทธิภาพการกักเก็บแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อ (%) = 100 × (ปริมาณแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อสุดท้าย-ปริมาณแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อเริ่มต้น) / ปริมาณแคโรทีนอยด์ที่ดูดซึม

มิลลิกรัมแคโรทีนอยด์=100 กรัม เนื้อเยื่อ =(OD×ปริมาตร ×103) / E ×น้ำหนักของเนื้อเยื่อ (กรัม)

โดยที่ E คือค่าสัมประสิทธิ์การดูดซับ เนื่องจากสารสกัดดิบมักมีแคโรทีนอยด์หลายชนิด ค่าสัมประสิทธิ์เฉลี่ยจึงเท่ากับ 2500

นิยมใช้ในการคำนวณ

OD ความหนาแน่นแสงที่ λmax (476nm)

ปริมาตร, ปริมาตรรวมของสารละลาย (มล.);

ADC = [1-(y_i / y_f) × (n_f / n_i)]

ตารางที่ 3 ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการศึกษา PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ

โดยที่ yi คือปริมาณของอิตเทรียมไตรออกไซด์ในอาหาร yf คือปริมาณของอิตเทรียมไตรออกไซด์ในปุ๋ยคอก ni คือปริมาณสารอาหารในอาหารและ nf คือปริมาณสารอาหารในปุ๋ยคอก ข้อมูลทั้งหมดจากถังสามถังของแต่ละอาหารได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวและการทดสอบช่วงหลายช่วงของ Duncan ใช้ขั้นตอนแบบจำลองเชิงเส้นทั่วไป (GLM) เพื่อเปรียบเทียบการรักษาด้วยอาหารเดี่ยวในด้านองค์ประกอบของเนื้อเยื่อ พารามิเตอร์ความเครียดออกซิเดชัน จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมด (THC) และเวลาการแข็งตัวของเลือด ระดับ mRNA ของ Hsp 70 และ HIF-1α ระหว่างการทดลองสองครั้ง ซอฟต์แวร์นี้คือ SPSS (เวอร์ชัน 16.0) ความแตกต่างถือว่ามีนัยสำคัญที่ P < 0.05

3. ผลลัพธ์

3.1. ทดสอบ 1

3.1.1. ประสิทธิภาพทางชีวภาพ

ประสิทธิภาพทางชีวภาพของกุ้งแสดงไว้ในตารางที่ 4 ประสิทธิภาพการเจริญเติบโต (FBW; WG; BG) และอัตราการรอดตายของกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 และ D1 แสดงค่าสูงสุดและต่ำสุดตามลำดับ และมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าทั้งสอง (P < 0.05) อัตราการแลกเนื้อ (FCR) ของกุ้งที่ได้รับอาหาร D2, D3 และ D5 ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร D1 แต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P>0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร D4

ตารางที่ 4 ผลของอาหารทดลอง 7 ชนิดต่อสมรรถภาพทางชีวภาพของกุ้งกุลาดำวัยอ่อน

3.1.2. ส่วนประกอบของร่างกายและกล้ามเนื้อทั้งหมด

องค์ประกอบของร่างกายและกล้ามเนื้อทั้งหมดของกุ้งแสดงอยู่ในตารางที่ 5 ในการทดลองที่ 1 ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความชื้นของร่างกายและกล้ามเนื้อทั้งหมดและปริมาณเถ้าในอาหารทุกประเภท (P N 0.05) ปริมาณโปรตีนในร่างกายทั้งหมดของกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร D1 และ D4 แต่ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากกุ้งที่ได้รับอาหาร D2 และ D5 (P > 0.05) ปริมาณไขมันทั้งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหาร D4 และ D5 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่นอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) ปริมาณโปรตีนในกล้ามเนื้อของกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 และ D5 สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร D1 และ D4 แต่ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากกุ้งที่ได้รับอาหาร D2 (P > 0.05) ปริมาณไขมันในกล้ามเนื้อของกุ้งมีแนวโน้มเดียวกันกับปริมาณไขมันในร่างกายทั้งหมดของกุ้ง

ตารางที่ 5 องค์ประกอบของร่างกายและกล้ามเนื้อทั้งหมด (% มวลแห้ง) ของกุ้งกุลาดำวัยอ่อนก่อนและหลังการจำลองการขนส่งแบบมีชีวิต

3.1.3. ปริมาณแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อและคะแนนสีลำตัว

ปริมาณแคโรทีนอยด์ในร่างกายทั้งหมด กล้ามเนื้อ ผิวหนัง และพลาสมาของกุ้ง

แสดงในตารางที่ 6 กุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D2–D3) มีความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ในร่างกาย กล้ามเนื้อ ผิวหนัง และพลาสมาสูงกว่า (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมพื้นฐานและเบต้าแคโรทีน (D1 และ D4–D5) – นอกจากนี้ การเสริมคอเลสเตอรอลยังช่วยเพิ่มความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์อย่างมีนัยสำคัญ (Pb 0.05) ในร่างกายทั้งหมด กล้ามเนื้อ เปลือก และพลาสมาของกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D3 เทียบกับ D2) อย่างไรก็ตาม การเสริมคอเลสเตอรอลสามารถเพิ่มความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ (P b 0.05) ในพลาสมาได้อย่างมีนัยสำคัญเท่านั้น แต่ไม่เพิ่มในร่างกายทั้งหมด กล้ามเนื้อ และเปลือกกุ้งในอาหารที่ได้รับการเสริมด้วยเบตาแคโรทีน (D5 เทียบกับ D4) เมื่อสิ้นสุดการทดลองให้อาหาร สีแดงของกุ้งต้มในกลุ่มการทดลอง D3 สูงกว่ากลุ่มการทดลองอื่น และสังเกตเห็นสีเหลืองอ่อนในกลุ่มการทดลองด้วยอาหารพื้นฐาน (D1) (ตารางที่ 7)

ตารางที่ 6 ปริมาณแคโรทีนอยด์รวมของร่างกายทั้งหมด (มก./ก.) กล้ามเนื้อ (มก./ก.) เปลือก (มก./ก.) และพลาสมา (มก./มล.) จากกุ้งที่ให้อาหารทดลอง 5 ชนิด

ตารางที่ 7 สีที่สังเกตและคะแนนสี (SalmoFan™)a สำหรับกุ้งมังกร P. วัยอ่อนที่ได้รับอาหารทดลอง 5 ชนิด

3.1.4. ค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ของส่วนผสมอาหารและพลังงาน

ค่า ADC ของวัตถุแห้ง โปรตีน ไขมัน แคโรทีนอยด์ และพลังงานของอาหารทดลองสำหรับปลา P. monodon วัยอ่อนแสดงอยู่ในตารางที่ 8 ไม่พบความแตกต่างกันในค่า ADC ของวัตถุแห้ง โปรตีน พลังงาน และแคโรทีนอยด์ในอาหารทดลองสำหรับปลา P. monodon วัยอ่อน (PN 0.05) ADC ของแคโรทีนอยด์ในอาหารที่เสริมด้วยแคโรทีนอยด์ (D2–D5) อยู่ในระดับสูง (N90%) และการเสริมคอเลสเตอรอลไม่ได้ช่วยปรับปรุง ADC ของแคโรทีนอยด์อย่างมีนัยสำคัญอีกต่อไป ADC ของไขมันในอาหารพื้นฐานต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับไขมันในอาหารชนิดอื่น การเสริมคอเลสเตอรอลช่วยปรับปรุง ADC ของไขมันในผู้ป่วยที่เสริมเบต้าแคโรทีน (D4 เทียบกับ D5) แต่ไม่ปรับปรุงในผู้ป่วยที่เสริม แอสตาแซนธิน (D3 เทียบกับ D2)

ตารางที่ 8 ค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ที่ปรากฏ (ADC, %) ของอาหารทดลอง 5 ชนิดสำหรับวัตถุแห้ง โปรตีนดิบ ไขมัน แคโรทีนอยด์ทั้งหมด และพลังงาน

3.1.5. มีประสิทธิภาพในการรักษาเนื้อเยื่อแคโรทีนอยด์

ตารางที่ 9 แสดงประสิทธิภาพการกักเก็บแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อ (ทั้งตัว กล้ามเนื้อ และเปลือก) โดยพบประสิทธิภาพการกักเก็บแคโรทีนอยด์สูงสุดในเนื้อเยื่อในกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 ซึ่งแตกต่างจากกุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่น (P < 0.05) รองลงมาคือกุ้งที่ได้รับอาหาร D2 การเสริมคอเลสเตอรอลช่วยปรับปรุงการกักเก็บแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อในผู้ป่วยที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D3 เทียบกับ D2) แต่ไม่ช่วยในผู้ป่วยที่ได้รับอาหารเสริมเบตาแคโรทีน (D4 เทียบกับ D5)

ตารางที่ 9 ประสิทธิภาพการกักเก็บแคโรทีนอยด์ (%) ในร่างกายทั้งหมด กล้ามเนื้อ และเปลือกของกุ้งที่ให้อาหารทดลอง 7 ชนิด

3.1.6. พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน

ตารางที่ 10 แสดงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ (จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดและเวลาการแข็งตัวของน้ำเหลือง) พารามิเตอร์ความเครียดออกซิเดชัน (ปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์และโปรตีนคาร์บอนิลของต่อมย่อยอาหาร) และการแสดงออกของยีน (ระดับ mRNA ของ Hsp 70 และ mRNA ของ HIF-1α ของต่อมย่อยอาหาร) ของกุ้ง ในการทดลองที่ 1 จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น ในทางตรงกันข้าม เวลาในการแข็งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานจะสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น ในการทดลองครั้งที่ 1 พบว่าปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์ในต่อมย่อยอาหารของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานมีค่าสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่น นอกจากนี้ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (PN 0.05) ในปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์ในต่อมย่อยอาหาร กุ้งในการรักษา D2–D5 ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (PN 0.05) ในปริมาณโปรตีนคาร์บอนิลในต่อมย่อยของกุ้งในอาหารทุกประเภท ในการทดลองครั้งที่ 1 ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P N 0.05) ในการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp 70 และ mRNA ของ HIF-1α ในต่อมย่อยอาหารของกุ้งในอาหารทั้งหมด

ตารางที่ 10 พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันของกุ้งที่ติดเชื้อก่อนและหลังการจำลองการขนส่งสัตว์มีชีวิต

3.2. ทดสอบ 2

3.2.1. อัตราการรอดตายของกุ้งในการทดสอบความเครียดจากการสัมผัสอากาศ

หลังจากการจำลองการขนส่งสัตว์มีชีวิตเป็นเวลา 36 ชั่วโมง ไม่พบอัตราการตายของกุ้งในกลุ่มอาหารใดๆ

3.2.2. ส่วนประกอบของร่างกายและกล้ามเนื้อทั้งหมด

องค์ประกอบของร่างกายทั้งหมดและกล้ามเนื้อของกุ้งแสดงอยู่ในตารางที่ 5 ในการทดลองที่ 2 ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความชื้นของร่างกายทั้งหมดและกล้ามเนื้อและปริมาณเถ้าในอาหารทุกประเภท (P N 0.05) ปริมาณโปรตีนในร่างกายทั้งหมดของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน (D1) ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร D3 แต่ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากกุ้งที่ได้รับอาหาร D2, D4 และ D5 (P N 0.05) ปริมาณไขมันทั้งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหาร D4 และ D5 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่นอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) ปริมาณโปรตีนในกล้ามเนื้อของกุ้งที่ได้รับอาหาร D2 และ D3 สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่น (P N 0.05) ปริมาณไขมันในกล้ามเนื้อของกุ้งมีแนวโน้มเดียวกันกับปริมาณไขมันในร่างกายทั้งหมดของกุ้ง

3.2.3. พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน

ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ (จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดและการแข็งตัวของเลือด) เวลาการแตกตัวของเม็ดเลือด พารามิเตอร์ความเครียดออกซิเดชัน (ปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์และโปรตีนคาร์บอนิลของต่อมย่อยอาหาร) และการแสดงออกของยีน (ระดับ mRNA ของ Hsp 70 และ mRNA ของ HIF-1α ของต่อมย่อยอาหาร) ของกุ้งแสดงอยู่ในตารางที่ 10 ในการทดลองที่ 2 จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดของกุ้งที่ได้รับอาหาร

จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดในกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น นอกจากนี้ จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D2 และ D3) ก็สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน การเสริมอาหารด้วยเบต้าแคโรทีน (D4 และ D5) ในทางตรงกันข้าม เวลาในการแข็งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานจะสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น

ในการทดลองครั้งที่ 2 พบว่าปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์และโปรตีนคาร์บอนิลในต่อมย่อยอาหารของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานมีค่าสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น นอกจากนี้ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P N 0.05) ระหว่างมาโลนไดอัลดีไฮด์และคาร์บอนิล ปริมาณโปรตีนในระบบย่อยอาหารของกุ้งในการทดลอง D2–D5

ในการทดลองครั้งที่ 2 พบว่าการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp 70 ของต่อมย่อยอาหารของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานนั้นสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น นอกจากนี้ ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P N 0.05) ในการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp 70 ของต่อมย่อยอาหารของกุ้งในกลุ่มการทดลอง D2–D5 โปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของ HIF-1α ของต่อมย่อยอาหารของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานนั้นต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น นอกจากนี้ การเสริมคอเลสเตอรอลยังช่วยปรับปรุงระดับ mRNA ของ HIF-1α ของต่อมย่อยอาหารอย่างมีนัยสำคัญในการทดลองที่เสริม แอสตาแซนธินและเบตาแคโรทีน (D3 เทียบกับ D2; D5 เทียบกับ D4)

4. การอภิปราย

4.1. ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของกุ้ง

ในการศึกษาครั้งนี้ ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของ P. monodon ได้รับผลกระทบจากอาหารทดลองที่แตกต่างกัน (ตารางที่ 4) เซกเนอร์และคณะ (1989) แนะนำว่าแคโรทีนอยด์มีบทบาทเชิงบวกในกระบวนการเผาผลาญกลางและมีผลดีต่อการเจริญเติบโตของสัตว์น้ำ ในทำนองเดียวกัน Amar et al. (2001) และ Niu et al. (2009) รายงานว่าแคโรทีนอยด์ในอาหาร ซึ่งทำหน้าที่เป็นแหล่งเม็ดสี สามารถช่วยเพิ่มการใช้สารอาหาร และอาจช่วยปรับปรุงการเจริญเติบโตของกุ้งได้ในที่สุด แหล่งแคโรทีนอยด์ในอาหารที่แตกต่างกันมีผลต่อการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของกุ้งแตกต่างกัน ในงานของ Yamada et al. (1990) มีรายงานว่า แอสตาแซนธิน มีประสิทธิภาพมากกว่าเบตาแคโรทีนหรือแคนทาแซนธินในการสร้างเม็ดสีใน Penaeus japonicus นอกจากนี้ Chien และ Jeng (1992) ยังรายงานอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่าในกุ้งที่กินอาหารเสริม แอสตาแซนธิน เมื่อเทียบกับกุ้งที่กินอาหารเสริมเบตาแคโรทีนหรือสาหร่ายด้วย P. japonicus ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ปัจจุบัน

4.2. องค์ประกอบเนื้อเยื่อของกุ้ง

ในการทดลองปัจจุบัน การวิเคราะห์ทางเคมีแสดงให้เห็นว่าโปรตีนทั้งร่างกายและกล้ามเนื้อเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยเนื่องมาจากการได้รับ แอสตาแซนธิน หรือเบตาแคโรทีนในอาหาร ในขณะที่ปริมาณไขมันทั้งร่างกายและกล้ามเนื้อของกุ้งจากการทดลองที่ 2 (การทดสอบความทนต่อความเครียดจากการสัมผัสอากาศ) แสดงให้เห็นว่าลดลง (P b 0.05) ) เมื่อเทียบกับกุ้งในการทดลองที่ 1 (ระยะเวลาการเลี้ยงปกติ) (ตารางที่ 5) นอกจากนี้ ปริมาณไขมันจะสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเบตาแคโรทีน (D4 และ D5) เมื่อเปรียบเทียบกับอาหารพื้นฐานและอาหารที่มี แอสตาแซนธิน (D1, D2 และ D3) วิตามินเอมีส่วนเกี่ยวข้องอย่างมากในกระบวนการทางชีวเคมีต่างๆ ในร่างกาย และเบตาแคโรทีนสามารถเปลี่ยนเป็นวิตามินเอซึ่งเป็นแหล่งวิตามินเอที่สำคัญได้ (Ong และ Chytil, 1975) ในการศึกษาของ Yang et al. (2550) แสดงให้เห็นว่าปริมาณไขมันและโปรตีนทั้งตัวของกุ้งแวนนาไม Litopenaeus ได้รับผลกระทบในเชิงบวกจากการเสริมวิตามินเอในอาหาร สิงห์ และคณะ (พ.ศ. 2512) พบว่ากรดไขมันอิสระในพลาสมาเพิ่มขึ้นและไขมันในตับเพิ่มขึ้นในหนูที่ได้รับวิตามินเอ และแนะนำว่าการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เกิดจากการเคลื่อนตัวของกรดไขมันจากเนื้อเยื่อไขมัน จากการศึกษาของ Shiau และ Chen (2000) พบว่ากุ้งที่ได้รับอาหารที่มีวิตามินเอสูงมีไขมันในร่างกายสูงและไตรกลีเซอไรด์ในเลือดลดลง อย่างไรก็ตาม มีรายงานปรากฏการณ์ตรงกันข้ามในปลาและเปอร์เซ็นต์ไขมันในร่างกายลดลงในปลาแซลมอนที่ได้รับอาหารที่มีวิตามินเอสูง (Poston, 1970) กลไกของแคโรทีนอยด์ในอาหารต่อโภชนาการของไขมันในสัตว์จำพวกกุ้งจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม

4.3. การดูดซึมของแอสตาแซนธินและเบต้าแคโรทีน

ในการทดลองปัจจุบัน ADC ที่สูงและประสิทธิภาพการกักเก็บที่ต่ำของแคโรทีนอยด์หมายความว่า แอสตาแซนธิน ในอาหารสามารถย่อยได้อย่างมีประสิทธิภาพในทางเดินอาหารของ P. monodon แต่ไม่สามารถสะสมในเนื้อเยื่อเป็นเม็ดสีได้ ซึ่งอาจเกิดจากการรวมตัวของแคโรทีนอยด์เข้าไปในไคลโลไมครอนในปริมาณต่ำ การขับถ่ายแคโรทีนอยด์และเมตาบอไลต์ที่เกี่ยวข้องกับไคลโลไมครอนเข้าไปในน้ำเหลืองในปริมาณต่ำ หรือการแปลงเมตาบอลิซึมเป็นสารประกอบไม่มีสีซึ่งอาจถูกขับออกมาในที่สุด (Van Het Hof et al., 2000) เมื่อพิจารณาถึงกลไกที่การเสริมคอเลสเตอรอลในอาหารอาจมีผลต่อการเพิ่มการดูดซึมของ แอสตาแซนธิน ในกุ้งนั้น สามารถสรุปได้ว่า ประการแรก การมีคอเลสเตอรอลในอาหารในลำไส้จะกระตุ้นการปล่อยกรดน้ำดี (Horton et al., 1995) การรวมกรดน้ำดีไว้ในอาหารของสัตว์จำพวกเฟอร์เรต (Lakshman et al., 1996) และหนู (Schweigert et al., 2002) จะทำให้การดูดซึมและการสะสมของแคโรทีนอยด์ในเนื้อเยื่อเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ลักษณะแอมฟิฟิลิกของกรดน้ำดีมีความสำคัญในลูเมนลำไส้เพื่อการสร้างไมเซลล์และไลโปโซมแบบผสมในระหว่างการอิมัลชันและการย่อยของไขมันและสารประกอบที่ละลายในไขมัน เช่น แอสตาแซนธิน (Ódoherty et al., 1973) นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาวิจัยที่รายงานเมื่อเร็วๆ นี้โดย Tyssandier et al. (2001) ชี้ให้เห็นว่าไขมันน้ำดีถือเป็นไขมันชนิดเดียวที่สามารถละลายแคโรทีนอยด์ได้ในระยะน้ำของลำไส้ ซึ่งอาจส่งผลต่อการขนส่งแคโรทีนอยด์ ประการที่สอง คอเลสเตอรอลในอาหารอาจส่งเสริมการขนส่งแคโรทีนอยด์โดยการเพิ่มการสร้างไลโปโปรตีน ในเซลล์ลำไส้ แคโรทีนอยด์จะถูกรวมเข้าไปในไคลโลไมครอน ซึ่งในที่สุดจะถูกปล่อยเข้าสู่เลือด และแคโรทีนอยด์จะถูกขนส่งโดยไลโปโปรตีนเป็นหลัก โดยเฉพาะไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำมาก (VLDL) ในเลือด (Deming และ Erdman, 1999; Herbeth et al., 2007) นอกจากนี้ อะพอลิโพโปรตีนบียังเป็นโปรตีนโครงสร้างหลักของ VLDL และไคลโลไมครอน และคอเลสเตอรอลยังเป็นตัวกำหนดสำคัญของการสังเคราะห์อะพอลิโพโปรตีนบี (Kumar et al., 1992) นอกจากนี้ คอเลสเตอรอลในอาหารที่เพิ่มขึ้นอาจส่งผลต่อการรีไซเคิลไลโปโปรตีนในตับโดยการลดการทำงานของตัวรับ LDL ในตับ (Karnaukhov, 1979)

อย่างไรก็ตาม การศึกษานี้ไม่พบผลเชิงบวกของคอเลสเตอรอลในอาหารต่อเบตาแคโรทีน ความแตกต่างระหว่างแอสตาแซนธินและเบตาแคโรทีน อาจเกิดจาก แอสตาแซนธิน และเบตาแคโรทีนมีกลุ่มย่อยต่างกัน แอสตาแซนธินเป็นสารประกอบที่มีขั้วมากกว่า และเบตาแคโรทีนจัดอยู่ในกลุ่มแคโรทีนอยด์ไฮโดรคาร์บอนที่ไม่มีขั้ว (Yeum และ Russell, 2002) เป็นไปได้ที่แคโรทีนอยด์ที่มีขั้วน้อยกว่า ซึ่งส่วนใหญ่อยู่ที่พื้นผิวไลโปโปรตีนของหยดไขมัน จะถูกขนส่งได้ง่ายกว่าแคโรทีนอยด์ที่มีขั้วน้อยกว่า ซึ่งส่วนใหญ่อยู่ที่แกนไลโปโปรตีนของหยดไขมัน (Tyssandier et al., 2001) Van Het Hof และคณะ (2000) ระบุว่าการสลายตัวของโครงสร้างอาหารและการปลดปล่อยแคโรทีนอยด์เป็นขั้นตอนแรกในการดูดซึมแคโรทีนอยด์ และขั้นตอนที่สองในการดูดซึมแคโรทีนอยด์ที่อาจส่งผลต่อการดูดซึมทางชีวภาพนั้นเกี่ยวข้องกับการรวมแคโรทีนอยด์ที่ถูกปลดปล่อยเข้าไปในไมเซลล์แบบผสม เนื่องจากเป็นสารที่ละลายได้ในไขมัน การบริโภคไขมันร่วมกับแคโรทีนอยด์จึงถือว่ามีความสำคัญ ไขมันแคโรทีนอยด์สูงที่เสริมด้วยอาหารมื้อหนึ่ง (ไขมัน 3 กรัมต่อมื้อ) มีประสิทธิภาพเท่ากับอาหารเสริมไขมันแคโรทีนอยด์ต่ำ (ไขมัน 35 กรัมต่อมื้อ) ในการเพิ่มความเข้มข้นของอัลฟาแคโรทีนและเบตาแคโรทีนในพลาสมา อย่างไรก็ตาม สำหรับสารประกอบขั้วของลูทีนที่เติมลงไปเป็นเอสเทอร์ลูทีน การตอบสนองของพลาสมาจะสูงขึ้น 100% หลังจากการบริโภคไขมันทั้งหมด (Van Het Hof et al., 2000) ดังนั้น ปริมาณคอเลสเตอรอลในอาหารที่จำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าจะดูดซึมแคโรทีนอยด์ได้นั้นดูเหมือนจะขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของแคโรทีนอยด์ที่กินเข้าไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเบตาแคโรทีนในปัจจุบันซึ่งไม่ให้ความสามารถในการดูดซึมทางชีวภาพเช่นเดียวกับที่สังเกตได้ในแอสตาแซนธินในปัจจุบัน ยิ่งไปกว่านั้น การดูดซึมของแคโรทีนอยด์กลุ่มย่อยต่างๆ เกิดขึ้นได้จากเส้นทางที่แตกต่างกัน เช่น ตัวขนส่งที่แตกต่างกัน เช่น ในมนุษย์ การดูดซึมเบตาแคโรทีนจะถูกจำกัดโดยไลโซฟอสฟาติดิลโคลีน มากกว่าโดยคอเลสเตอรอล (During et al., 2005) ประการที่สอง เนื่องจากเราทราบว่าเบตาแคโรทีนเป็นสารตั้งต้นทางโภชนาการของวิตามินเอ เบตาแคโรทีนจึงสามารถแยกออกเพื่อผลิตวิตามินเอ (เรตินอล) สองโมเลกุลในลำไส้ได้ (Wolf, 1984) เบต้าแคโรทีนที่บริโภคเข้าไปส่วนใหญ่จะถูกดูดซึมโดยไม่เปลี่ยนแปลง แปลงเป็นวิตามินเอ หรือขับออกมา (Parker, 1996)

4.4. ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของแอสตาแซนธินและเบต้าแคโรทีน

พบว่าการต้านทานที่เพิ่มขึ้นของกุ้งเพนาเอิดต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจน (Chien et al., 1999; Niu et al., 2009), ความเครียดจากความเค็ม (Chien et al., 2003), ความเครียดจากแอมโมเนีย (Pan et al., 2003a) และการสัมผัสอากาศในระหว่างการขนส่งสัตว์มีชีวิตจำลองในการศึกษาปัจจุบันของเรา มีความเกี่ยวข้องกับแคโรทีนอยด์ในอาหาร ไม่ว่าจะในการทดลองครั้งที่ 1 หรือครั้งที่ 2 MDA ในฐานะดัชนีของลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีแคโรทีนอยด์ (D2–D5) ต่ำกว่าในกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน (D1) อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ปริมาณ MDA และโปรตีนคาร์บอนิลในระบบย่อยอาหารของกุ้งจากการทดลองที่ 2 ยังสูงขึ้น (P b 0.05) (ตารางที่ 10) แคโรทีนอยด์มีคุณสมบัติในการดับออกซิเจนแบบซิงเกิลที่ดีและสามารถทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระในระบบที่มีกรดไขมันไม่อิ่มตัวได้โดยการดับอนุมูลอิสระ (Martin et al., 1993) ข้อมูลดังกล่าวบ่งชี้ว่าแคโรทีนอยด์อาจทำหน้าที่ปกป้องกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อนของเนื้อเยื่อจากผลเสียของออกซิเดชัน โดยเฉพาะในกุ้งที่ขาดออกซิเจน การใช้โปรตีนคาร์บอนิลเป็นไบโอมาร์กเกอร์วัดความเสียหายจากออกซิเดชันของโปรตีนในปลาเป็นเรื่องค่อนข้างใหม่ (Parvez และ Raisuddin, 2005) และไม่ค่อยได้ใช้กับกุ้ง อย่างไรก็ตาม การดัดแปลงออกซิเดชันของโปรตีนเป็นผลที่ตามมาประการหนึ่งจากหลายๆ ประการของความเครียดออกซิเดชัน (Stadtman, 1986) และการทดสอบกลุ่มคาร์บอนิลในโปรตีนเป็นเทคนิคที่สะดวกในการตรวจจับและวัดปริมาณความเครียดออกซิเดชัน (Levine et al., 1994) โดยรวมแล้ว สิ่งเหล่านี้ทั้งหมดสนับสนุนระดับความเครียดออกซิเดชันที่ลดลงในกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีแคโรทีนอยด์ (D2-D5) เมื่อเปรียบเทียบกับอาหารพื้นฐาน (D1) จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดและเวลาในการแข็งตัวของเลือดยังใช้เป็นตัวบ่งชี้สุขภาพของสัตว์จำพวกกุ้งด้วย (Fotedar et al., 2001) มีรายงานว่าเวลาในการแตกตัวของเม็ดเลือดและเซลล์เม็ดเลือดที่หมุนเวียนเปลี่ยนแปลงไปในสัตว์จำพวกกุ้งเนื่องมาจากเวลาในการจัดเก็บในถังจัดเก็บและการขนส่งสัตว์มีชีวิต (Fotedar et al., 2006; Le Moullac and Haffner, 2000) จำนวนเม็ดเลือดรวมของกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมพื้นฐานและอาหารที่มีเบต้าแคโรทีนเสริม (D1, D4 และ D5) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) หลังจากการจำลองการขนส่งสัตว์มีชีวิตเป็นเวลา 36 ชั่วโมง ในขณะที่จำนวนเม็ดเลือดยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (D2 และ D3) เวลาในการแข็งตัวของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐาน (D1) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P b 0.05) หลังจากจำลองการขนส่งสัตว์มีชีวิต และยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ (D2-D5) (ตารางที่ 10) การลดลงของจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดหลังจากสัมผัสกับอากาศระหว่างการจำลองการขนส่งมีชีวิตอาจเกี่ยวข้องกับการแตกของเม็ดเลือดเนื่องจากกิจกรรมการป้องกัน (Van de Braak et al., 2002) สำหรับจำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมดของกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน (D2 และ D3) พบว่าไม่มีการลดลงหลังจากการจำลองการขนส่งสัตว์มีชีวิต Sequeira และคณะ (1996) แสดงให้เห็นว่าเซลล์เม็ดเลือดของ P. japonicus สามารถขยายพันธุ์ได้ และอัตราการขยายพันธุ์สามารถเพิ่มขึ้นได้สามเท่าเมื่อกุ้งได้รับสารกระตุ้นภูมิคุ้มกัน ในการศึกษาปัจจุบัน การรวมแอสตาแซนธินในอาหารอาจกระตุ้นและเร่งการขยายตัวของเซลล์เม็ดเลือดของกุ้งเพื่อชดเชยการสูญเสียเซลล์เม็ดเลือดอันเนื่องมาจากการสัมผัสอากาศในระหว่างการขนส่งสัตว์มีชีวิตจำลอง ส่งผลให้มีอัตราส่วนจำนวนเซลล์เม็ดเลือดรวมคงที่ การสัมผัสอากาศได้รับการพิสูจน์แล้วว่าลดสถานะสุขภาพของกุ้งมังกร (Panucilus lygnus) (Fotedar et al., 2001) การทดลองครั้งที่ 2 แสดงให้เห็นว่ากุ้งที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน (D2 และ D3) มีสุขภาพดีกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารประเภทอื่น ตามที่บ่งชี้โดยจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดที่สูงขึ้น และเวลาในการแข็งตัวของฮีโมโกลบินที่ลดลงหลังจากการขนส่งสัตว์มีชีวิตจำลองเป็นเวลา 36 ชั่วโมง

4.5. การแสดงออกของยีน Hsp 70 และ HIF-1α

Hsp 70 เป็นโมเลกุลชาเปอโรนที่มีการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในวิวัฒนาการ ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของเครื่องจักรการพับโปรตีนในเซลล์ ซึ่งสามารถช่วยในการซ่อมแซมและปกป้องโปรตีนในเซลล์จากความเสียหายที่เกิดจากความเครียด และลดการรวมตัวของโปรตีนให้เหลือน้อยที่สุด (Franzellitti และ Fabbri, 2005) วู และคณะ (2011) และ Xu et al. (2011) แสดงให้เห็นว่าภาวะขาดออกซิเจนแสดงถึงความเครียดในระดับสูงซึ่งอาจนำไปสู่การเหนี่ยวนำยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของเซลล์ เช่น โปรตีนที่เกิดจากความร้อน ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ Hsp 70 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะการขาดออกซิเจนเมื่อเทียบกับสภาวะปกติในกุ้งที่ได้รับอาหารทดลองทุกชนิด อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของ mRNA Hsp 70 ของกุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานนั้นสูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารที่มีแคโรทีนอยด์ (D2–D5) อย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะที่ขาดออกซิเจน ซึ่งบ่งชี้ว่า แอสตาแซนธิน หรือเบตาแคโรทีนในอาหารอาจบรรเทาการตอบสนองต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจนได้บางส่วน มีความรู้เพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการมีอยู่และบทบาทของ HIF-1 ภายใต้สภาวะที่ขาดออกซิเจนในสัตว์จำพวกกุ้ง Heidbreder และคณะ (2003) แนะนำว่า HIF-1α อาจมีส่วนช่วยในการป้องกันในช่วงภาวะขาดออกซิเจนระยะเริ่มต้นและ/หรือปานกลาง หรือต่อภาวะขาดออกซิเจนรุนแรงและ/หรือยาวนาน Treinin และคณะ (2003) แสดงให้เห็นว่า HIF-1α เป็นปัจจัยถอดรหัสที่ควบคุมยีนหลายสิบตัวที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจน การตอบสนองของโมเลกุลเหล่านี้ก่อให้เกิดการปรับเปลี่ยนทางชีวเคมีและสรีรวิทยาชุดหนึ่ง ช่วยให้สัตว์มีชีวิตรอดได้ดีขึ้นภายใต้สภาวะที่ขาดออกซิเจน ในการทดลองปัจจุบัน ระดับการแสดงออกของ HIF-1α mRNA ของกุ้งลดลงอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะการขาดออกซิเจนเมื่อเทียบกับภาวะปกติในกุ้งที่ได้รับอาหารทดลองทั้งหมด อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของ HIF-1α mRNA ของกุ้งที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน หรือเบตาแคโรทีนจะสูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารพื้นฐานภายใต้สภาวะการขาดออกซิเจน ซึ่งยังบ่งชี้ว่าแอสตาแซนธินหรือเบตาแคโรทีนในอาหารสามารถบรรเทาการตอบสนองต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจนได้บางส่วนใน P. monodon โดยเพิ่มประสิทธิภาพหรือประโยชน์ของการขนส่งออกซิเจน

5. บทสรุป

สรุป จากการทดสอบการเจริญเติบโตและข้อมูลการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันพบว่า แอสตาแซนธิน มีประสิทธิภาพเหนือกว่าเบตาแคโรทีนในการปรับปรุงประสิทธิภาพการเจริญเติบโต สถานะสุขภาพ และการป้องกันความเครียดจากอากาศ การทดแทนการรักษาด้วย แอสตาแซนธิน ด้วยยาปฏิชีวนะอาจนำมาซึ่งเทคนิคการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำในฟาร์มที่มีคุณค่า ปลอดภัย และมีประสิทธิผลในอนาคตอันใกล้นี้ นอกจากนี้ การเสริมคอเลสเตอรอลอาจช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของแอสตาแซนธินในเชิงบวก แต่ไม่สามารถเพิ่มเบตาแคโรทีนได้

แหล่งที่มา:Comparison effect of dietary astaxanthin and β-carotene in the presence and absence of cholesterol supplementation on growth performance, antioxidant capacity and gene expression of Penaeus monodon under normoxia and hypoxia condition
Jin Niu a,⁎, Hua Wen c, Chun-Hou Li a, Yong-Jian Liu b, Li-Xia Tian b, Xu Chen a, Zhong Huang a, Hei-Zhao Lin