บันทึก

NPs Ag/AgCl ที่สังเคราะห์ชีวภาพแสดงให้เห็นผลต้านเชื้อแบคทีเรียที่สำคัญในหลอดทดลองต่อ Vibrio parahaemolyticus สามสายพันธุ์ที่แยกได้จากกุ้งเลี้ยงที่ได้รับผลกระทบจากโรคเนื้อตายตับและตับอ่อนเฉียบพลัน (AHPND) ในบริเวณตะวันตกเฉียงเหนือของเม็กซิโก กุ้งแวนนาไมชนิด Litopenaeus ได้รับการให้อาหารที่เสริมด้วย Ag/AgCl NPs ที่ความเข้มข้น 10, 100, 1000 หรือ 10,000 ppm (ความเข้มข้นของอาหารเป็น นาโนซิลเวอร์) เป็นเวลา 7 วัน การเสริม NP ในอาหารไม่มีผลต่อการอยู่รอด การเจริญเติบโต หรืออัตราการเปลี่ยนอาหารเป็นอาหารของกุ้ง แต่ความเข้มข้นสูง (1,000 และ 10,000 ppm) จะทำให้ดัชนีตับและตับอ่อนลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

การบริโภค Ag/AgCl NPs ในระยะสั้นส่งผลให้มีการสะสมทางชีวภาพของ Ag ในตับอ่อนอย่างมีนัยสำคัญ และในชั้นหนังกำพร้าในระดับที่น้อยกว่า ในขณะที่การสะสมทางชีวภาพในกล้ามเนื้อไม่มีนัยสำคัญ การศึกษาการทำให้บริสุทธิ์ยืนยันการย่อย นาโนซิลเวอร์ ในตับอ่อนของกุ้งได้อย่างรวดเร็วและยังแสดงให้เห็นการสลายตัวอย่างรวดเร็วในตับอ่อนอีกด้วย.

ส่วนผสมและวิธีการทำ

สารเคมี น้ำกรองปลอดเชื้อ (W3500) ซิลเวอร์ไนเตรต (209139) เกลือโซเดียมเรซาซูรีน (R7017) และโซเดียมคลอไรด์ (V000106) มาจาก Sigma-Aldrich (สหรัฐอเมริกา) สื่อแบคทีเรีย Tryptic Soy Agar (TSA), Tryptic Soy Broth (TSB), Mueller Hinton Agar (MHA), Mueller Hinton Broth (MHB) และ Agar Agar (AA) ได้จาก Difco (USA), Ulva clathrata Seaweed (Roth)

สายพันธุ์แบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus ได้มาจากการเก็บตัวอย่างเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการที่ CIAD Mazatlan รัฐ Sinaloa ประเทศเม็กซิโก ตัวอย่างถูกแยกจากกระเพาะอาหารและตับอ่อนของกุ้งเพาะเลี้ยงที่ได้รับผลกระทบจาก AHPND ในเม็กซิโกตะวันตกเฉียงเหนือ สายพันธุ์ถูกเก็บรักษาไว้ในที่เย็น (−80 °C) จนกระทั่งถูกกระตุ้นใน TSB ที่เสริมด้วย NaCl 2%

การเตรียมและการวิเคราะห์สารพิษเฉียบพลัน

• เตรียมอาหารเสริม

  อาหารเม็ดเชิงพาณิชย์ที่มีโปรตีน 44% และไขมัน 8% (742 UANL, Nutrimar, Sinaloa, Mexico) ได้รับการเสริมด้วยการแช่ด้วยสารละลาย นาโนซิลเวอร์ Ag/AgCl เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของ Ag ที่ 0, 10, 100, 1000 และ 10,000 มก. ต่อกิโลกรัม สารละลายสต๊อก NP Ag/AgCl ที่แตกต่างกันจะถูกเจือจางหรือทำให้เข้มข้นในปริมาณสุดท้ายของน้ำกลั่นเดียวกัน (40 มล.) และฉีดพ่นลงบนอาหาร 100 กรัมที่ชั่งน้ำหนักไว้ก่อนหน้านี้แล้วและวางไว้ในถาดอลูมิเนียม ผสมอาหารเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเนียนเข้ากันสมบูรณ์ สุดท้ายอาหารถูกทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 50 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ความเข้มข้นสุดท้ายของ Ag ในอาหารเสริม NP/AgCl ถูกวัดปริมาณโดย AAS ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

• การประเมินพิษเฉียบพลันในร่างกายและการกระจายตัวของอนุภาคนาโนเงินในเนื้อเยื่อ

  การทดลอง in vivo ครั้งแรกประเมินความเป็นพิษเฉียบพลันโดยอาศัยพารามิเตอร์การทำงานทางพฤติกรรม การอยู่รอดและการเจริญเติบโต และการวิเคราะห์การกระจายตัวของ นาโนซิลเวอร์ Ag/AgCl หลังจากรับประทานอาหาร 7 วัน โดยมีปริมาณ Ag ในระดับต่ำ (0, 10 และ 100 มก. Ag กก.-1) และระดับสูง (1,000, 10,000 มก. Ag กก.-1) ในการทดลองนี้ กุ้งวัยอ่อนจำนวน 150 ตัว [Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) จัดหาโดย FITMAR, Sinaloa, Mexico (น้ำหนักเริ่มต้น 0.400 ± 0.02)] ได้รับการแจกแบบสุ่มในถังไฟเบอร์กลาสทรงสี่เหลี่ยมขนาด 10 ลิตรจำนวน 15 ถัง (มีกุ้ง 10 ตัวต่อถัง ทำการทดลอง 5 ครั้ง และทำซ้ำ 3 ครั้ง) ถังทดลองมีการเติมอากาศอย่างต่อเนื่องเป็นรายบุคคล และมีการดูแลรักษาทุกวันโดยใช้การแลกเปลี่ยนน้ำทะเลเทียมด้วยมือ 100% (Pro Aquatics, Fritz Industrial Inc., Mesquite TX, USA) และสภาพแวดล้อมตามช่วงแสงธรรมชาติ มีการตรวจสอบอุณหภูมิของน้ำ ความเค็มและค่า pH แอมโมเนีย ไนไตรต์ และระดับออกซิเจนที่ละลายอยู่ในน้ำทุกวัน และรักษาให้อยู่ในขอบเขตที่เอื้อต่อการเจริญเติบโตของกุ้ง อัตราส่วนการให้อาหารรายวันคือ 5% ของชีวมวลทั้งหมดต่อถัง

• เนื้อหาการทดสอบการขับถ่าย นาโนซิลเวอร์ ในร่างกาย

  ได้ทำการทดลอง in vivo ครั้งที่สองเพื่อประเมินการสลายตัวของ Ag/AgCl NP โดยใช้อาหารเสริมที่ความเข้มข้นตามชื่อ 0 และ 100 มก. Ag/กก.-1 กุ้ง Litopaneis vannnamei ที่จัดหาโดย FITMAR, Sinaloa, Mexico (น้ำหนักเริ่มต้น 1.9 ± 0.20 กรัม) กระจายแบบสุ่มในถังไฟเบอร์กลาสทรงสี่เหลี่ยมผืนผ้าขนาด 10 ลิตร จำนวน 9 ถัง (กุ้ง 19 ตัวต่อถัง ทดลอง 2 ครั้ง และจำลอง 3 ครั้ง) สิ่งมีชีวิตได้รับการดูแลรักษาภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับการทดลองครั้งแรก ในระหว่างระยะการดูดซึม (7 วันแรก) สิ่งมีชีวิตจะได้รับอาหารทดสอบขนาดต่ำ ในขณะที่ระยะย่อยสลาย (14 วันถัดไป) เริ่มในวันที่ 8 ของการทดสอบโดยเปลี่ยนเป็นอาหารที่ไม่เสริม NP (0 มก. Ag/กก.) ระยะเวลาทดลองใช้ 21 วัน

ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของ นาโนซิลเวอร์

• การทดสอบการแพร่กระจายของแผ่นดิสก์

  การทดสอบต้านเชื้อแบคทีเรียที่ดำเนินการโดยการแพร่กระจายของแผ่นดิสก์แสดงให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนการยับยั้งการเจริญเติบโตระหว่างสายพันธุ์ V. parahaemolyticus ทั้งสามสายพันธุ์ (p = 0.001) สำหรับผลิตภัณฑ์ (p = 0.001) และในการโต้ตอบกัน (p = 0.001) กับ ANOVA สองทาง (รูปที่ 6) ดิสก์ที่ชุบ Ag/AgCl NP สร้าง IZ ขนาด 9.2 ± 0.2, 5.3 ± 0.1 และ 5.8 ± 0.2 มม. สำหรับสายพันธุ์ V.parahaemolyticus M5-28, M5-06 และ M9-04 ตามลำดับ สารละลาย AgNO3 ที่ทดสอบในความเข้มข้นเดียวกันให้ IZ ต่ำกว่า Ag/AgCl NPs โดยมีค่า 6.5 ± 0.6, 4.6 ± 0.1 และ 4.5 ​​± 0.2 มม. สำหรับทั้งสามสายพันธุ์ตามลำดับ ในทางตรงกันข้ามสารสกัดจากสาหร่ายทะเล (AEU) ไม่ก่อให้เกิดการยับยั้ง

• การทดสอบไมโครไดอะไลซิส

  การทดสอบต้านเชื้อแบคทีเรียที่ดำเนินการโดยการทดสอบการเจือจางแบบไมโครจะดำเนินการเฉพาะกับผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการทดสอบการแพร่กระจายของ IZ บนดิสก์เท่านั้น สารละลาย NP เงิน Ag/AgCl แสดงความเข้มข้นยับยั้งขั้นต่ำ (MIC) ที่ 3.2 มก./มล. สำหรับสายพันธุ์ที่ทดสอบทั้งหมด ในขณะที่สารละลาย AgNO3 แสดง MIC ที่ 1.6 ไมโครกรัม/มล. สำหรับสายพันธุ์ V. parahaemolyticus M5-28, M6-05 และ 3.2 ไมโครกรัม/มล. สำหรับ V. parahaemolyticus M9-04 สารละลาย NP Ag/AgCl แสดงความเข้มข้นในการฆ่าเชื้อขั้นต่ำ (MBC) ที่ 6.3 μg/mL สำหรับสายพันธุ์ 3 สายพันธุ์ ในขณะที่สารละลาย AgNO3 แสดง MIC ที่ 3.2 μg/mL สำหรับสายพันธุ์ M5-28 และ M6-05 และ 6.3 mg/mL สำหรับ M9-04 (ตารางที่ 1)

• การประเมินระยะสั้น การทดสอบในร่างกาย

  ความคงตัวของอนุภาคนาโนที่เสริมด้วย Ag ในอาหารทดสอบแสดงอยู่ในตารางที่ 2 อาหารที่ผ่านการทำให้แห้งจะมีปริมาณ Ag สูงกว่าอาหารเดิม และการสูญเสียอนุภาคนาโนเงินจากพื้นผิวอาหารลงไปในน้ำทะเลหลังจากผ่านไป 1 ชั่วโมงน้อยกว่า 5%

ผลการทดสอบ นาโนซิลเวอร์

• พิษเฉียบพลันระยะสั้นในร่างกายและการกวาดล้าง นาโนซิลเวอร์ ในเนื้อเยื่อ

  ในการทดลองการสัมผัสอาหารในระยะสั้นครั้งแรก สิ่งมีชีวิตไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมใดๆ และอัตราการรอดชีวิตอยู่ที่ 100% สำหรับการบำบัดทั้งหมด การบริโภคอาหารเสริมเป็นเวลา 7 วันไม่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการแปลงอาหาร แต่มีผลต่อการเพิ่มน้ำหนัก (%) ซึ่งดีขึ้นเล็กน้อยในกุ้งที่กินอาหารเสริมด้วยอาหาร 10 – 100 มก. Ag-1 กก. และลดลงเล็กน้อย (แต่ไม่สำคัญ) ในกุ้งที่กินอาหารที่มี 10,000 มก. Ag-1 กก. (ตารางที่ 3) ในทางตรงกันข้าม ดัชนีตับ (HPI) แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อบริโภคอาหารเสริมปริมาณสูง (1,000 และ 10,000 มก. Ag/กก.; รูปที่ 7ก)

• สรุป

ในการทดลอง in vivo ครั้งแรก การบริโภคอาหารเสริมในความเข้มข้นต่ำ (10 และ 100 ppm) มีผลดีต่อการเจริญเติบโต ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับผลการอยู่รอดและการเจริญเติบโตที่รายงานโดย Sivaramasamy และ Zhiwei (2559) ซึ่งเลี้ยงกุ้งแวนนาไม (6.82 ± 2.16 กรัม) ด้วยเชื้อ AgNP สังเคราะห์ Bacillus subtilis ที่ความเข้มข้น 10,000 ppm เป็นเวลา 65 วัน

ในทางกลับกัน การเสริมด้วยความเข้มข้นสูง (1,000 และ 10,000 ppm) อาจส่งผลให้เกิดความเสียหายของตับในระดับปานกลาง (ไม่สามารถมองเห็นได้) ดังที่แสดงให้เห็นจากการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ HPI ผลกระทบเชิงลบต่อ HPI นี้ ตามมาด้วยความเสียหายทางเนื้อเยื่อวิทยา มีรายงานในปลาแซลมอนหลังจากได้รับแสงจากน้ำที่มี NPs ในความเข้มข้น 3,300 และ 1,000 มก. Ag L-1 เป็นเวลา 8 สัปดาห์ (Monfared และ Soltani 2556)

อย่างไรก็ตาม ไม่มีการศึกษาที่คล้ายคลึงกันในกุ้งที่สามารถเปรียบเทียบกับผลการลด HPI และความเป็นพิษของนาโนซิลเวอร์ในอาหารของเราได้ เมื่อพิจารณาจากการสะสมทางชีวภาพและการกระจายทางชีวภาพ ความเข้มข้นของ Ag สูงสุดที่พบในตับอ่อนนั้นไม่น่าแปลกใจ เนื่องจากตับอ่อนของสัตว์จำพวกกุ้งถือเป็นอวัยวะเป้าหมายสำหรับการสะสมสารหลายประเภท

ในทางตรงกันข้าม กล้ามเนื้อแทบจะไม่มีการสะสมทางชีวภาพเลย ซึ่งถือเป็นสิ่งที่พึงประสงค์ เนื่องจากกล้ามเนื้อถือเป็นส่วนที่กินได้ที่สุดของกุ้ง อย่างไรก็ตาม การสะสมทางชีวภาพในระดับปานกลางในหนังกำพร้าของเซฟาโลทอแรกซ์บ่งชี้ว่าหางกุ้งที่แกะเปลือกอาจมี Ag ตกค้างอยู่ในระดับหนึ่ง ในเรื่องนี้ การศึกษาหลายชิ้นพบว่าการกระจายทางชีวภาพและความเป็นพิษของอนุภาคนาโนได้รับอิทธิพลอย่างมากจากขนาดอนุภาค รูปร่าง ประจุพื้นผิว การเคลือบพื้นผิว และความสามารถในการละลาย (Sivaramasamy และ Zhiwei 2559)

พบครึ่งชีวิตของ นาโนซิลเวอร์ ในช่วง 4 ถึง 9 วันในเนื้อเยื่อที่เก็บตัวอย่างในการศึกษาการสลายตัว (ตับอ่อน เหงือก และกล้ามเนื้อ)

ซึ่งหมายความว่าการรออีกครึ่งชีวิตหนึ่งจะกำจัด Ag ที่เหลือ 50% ได้ ค่าเหล่านี้ต่ำกว่า (แต่ค่อนข้างสอดคล้องกัน) ค่าที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้โดย Metian et al. (2010) ซึ่งแสดงค่า t½ ที่ 10.8 ± 2 วันสำหรับการสลายตัวของ Litopenaeus stylirostris หลังจากได้รับ Ag+ ที่มีฉลากทางอาหาร. 

เอกสารอ้างอิง

Silver nanoparticles against acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp and their depuration kinetics
Maribel Maldonado-Muñiz 1 & Carlos Luna2 & Raquel Mendoza-Reséndez 2 & Enrique Díaz Barriga-Castro3 & Sonia Soto-Rodriguez4 & Denis Ricque-Marie1 & Lucia Elizabeth Cruz-Suarez1