แอสตาแซนธิน รวมกับกรดฟอร์มิกช่วยเพิ่มความต้านทานต่อแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus ในกุ้งขาว

การทดลองให้อาหารเป็นเวลา 90 วันจัดขึ้นเพื่อประเมินผลของกรดฟอร์มิก (FA) และ แอสตาแซนธิน (AX) ต่อการเจริญเติบโต การอยู่รอด พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน และความต้านทานต่อการติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ในกุ้งขาวแปซิฟิก การศึกษาได้แบ่งออกเป็น 2 การทดลอง

ในการทดลองที่ 1 ตัวอ่อนโพสต์ลาร์วาอายุ 12 วันถูกแบ่งแบบสุ่มเป็น 6 กลุ่ม จากนั้นให้อาหาร 4 ครั้งต่อวันด้วยอาหารทดลอง 6 ชนิดที่มี FA 0.3%, FA 0.6%, AX 50 ppm, FA 0.3% + AX ​​50 ppm, FA 0.6% + AX ​​50 ppm และกลุ่มควบคุม (ไม่มีการเสริมอาหารใดๆ เหล่านี้) หลังจากทดลองให้อาหารเป็นเวลา 60 วัน น้ำหนักตัวของกลุ่มทดลองทุกกลุ่มไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากกลุ่มควบคุม แม้ว่ากุ้งที่ได้รับกรดฟอร์มิกจะมีน้ำหนักตัวต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับกรดฟอร์มิก 50 ppm อย่างมีนัยสำคัญก็ตาม อย่างไรก็ตาม กลุ่ม AX 0.6% FA + 50 ppm มีอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (82.33 ± 8.32%) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (64.33 ± 10.12%)

ในการทดลองครั้งที่ 2 จะเติม Vibrio parahaemolyticus ลงในแต่ละถังเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 104 CFU/mL กลุ่มการรักษาแต่ละกลุ่มได้รับอาหารดังกล่าวข้างต้นเป็นเวลาอีก 30 วัน เมื่อสิ้นสุดการทดลองนี้ ไม่มีความแตกต่างกันในการเพิ่มน้ำหนักระหว่างกลุ่มทดลองทั้งหมด อย่างไรก็ตาม อัตราการรอดตายของกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีกรดฟอร์มิก แอสตาแซนธิน และส่วนผสมดังกล่าว (ช่วง 45.83–67.50%) สูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (20.00 ± 17.32%) กุ้งที่ได้รับอาหาร FA ยังมีปริมาณแบคทีเรียและ Vibrio spp. ในลำไส้รวมลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน [จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมด (THC), กิจกรรมการจับกิน, กิจกรรมของฟีนอลออกซิเดส (PO) และกิจกรรมของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD)] ของกลุ่มที่ได้รับอาหาร AX ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มอื่น สรุปได้ว่ากรดฟอร์มิก แอสตาแซนธิน และการผสมผสานของทั้งสองมีประโยชน์ในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งเพื่อต้านทานเชื้อแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus

(NANOCMM TECHNOLOGY)

วิธี

การทดลองที่ 1 ผลของกรดฟอร์มิกและ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของกุ้งขาวแปซิฟิกในช่วงหลังตัวอ่อน

กุ้งและขั้นตอนการทดลอง

การทดลองดังกล่าวดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการศูนย์วิจัยธุรกิจการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ คณะประมง มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ประเทศไทย ตัวอ่อน Postlarvae-9 (PL-9) ของกุ้งขาวแปซิฟิกได้รับมาจากฟาร์มเพาะเลี้ยงในจังหวัดฉะเชิงเทรา ประเทศไทย หลังจากปรับตัวเป็นเวลา 3 วัน กุ้ง (PL-12) จะถูกสุ่มแบ่งกลุ่มในถังไฟเบอร์กลาสขนาด 500 ลิตร จำนวน 24 ถัง (ถังจำลอง 4 ถังต่อการบำบัด 1 ครั้ง) หนึ่งถังมีกุ้ง 75 ตัว กลุ่มการรักษาแต่ละกลุ่มได้รับอาหารหนึ่งในหกชนิด วันละสี่ครั้ง จนอิ่มเป็นเวลา 60 วัน ความเค็มตลอดการทดลองได้รับการรักษาไว้ที่ 25 ppt ปริมาณออกซิเจนที่ละลายอยู่ในน้ำสูงกว่า 4 ppm และอุณหภูมิของน้ำที่ 29 ± 1 °C เศษอาหารและอุจจาระที่เหลือจะถูกกำจัดออกทุกวัน และเปลี่ยนน้ำ 10% ทุกๆ 3 วัน บันทึกน้ำหนักตัวเฉลี่ยและอัตราการรอดตายของกุ้งหลังจากระยะเวลาทดลอง 60 วัน กุ้งสิบตัวจากแต่ละถังได้รับการเลือกแบบสุ่มและชั่งน้ำหนักทีละตัวโดยใช้มาตราส่วนสองทศนิยม

การทดลองที่ 2 ผลของกรดฟอร์มิกและ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโต การอยู่รอด แบคทีเรียในลำไส้ และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของกุ้งขาวแปซิฟิกที่ติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus

กุ้งและขั้นตอนการทดลอง

กุ้งจากแต่ละถังในทดลองที่ 1 ถูกสุ่มมอบหมายไปยังถังไฟเบอร์กลาสขนาด 24 × 500 ลิตรใหม่ (ถังจำลองสี่ถังต่อการบำบัด) ความหนาแน่นของการปล่อยคือ 30 ตัวต่อถัง ในช่วงเริ่มต้นของการทดลองนี้ (0 วัน) จะเติม Vibrio parahaemolyticus ลงในแต่ละถังเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10^4 หน่วยสร้างโคโลนี (CFU)/มล. ซึ่งเป็นความเข้มข้นของ Vibrio ปกติในน้ำเลี้ยงกุ้งตามที่ Sung และคณะได้อธิบายไว้ (2001) และ Lavilla-Pitogo และคณะ (1998). V. parahaemolyticus ที่ใช้สำหรับการทดสอบการแช่ในการศึกษานี้รวบรวมมาจากฟาร์ม EMS ในประเทศไทยโดยใช้วิธีที่ Joshi et al. อธิบาย ( 2014 ). กลุ่มการรักษาแต่ละกลุ่มได้รับอาหารเช่นเดียวกับในการทดลองที่ 1 สี่ครั้งต่อวันเป็นเวลาอีก 30 วัน ความเค็ม ออกซิเจนที่ละลายอยู่ในน้ำ และอุณหภูมิของน้ำ ได้รับการรักษาไว้เช่นเดียวกับการทดลองที่ 1 อาหารและอุจจาระที่ไม่ได้กินจะถูกนำออกทุก ๆ 2 วัน

การศึกษาการเจริญเติบโตและการอยู่รอด

น้ำหนักของกุ้งจากแต่ละการรักษาได้รับการวัด และบันทึกอัตราการรอดในวันที่ 30 หลังจากการทดสอบด้วย V. parahaemolyticus ที่ 10^4 CFU/mL

การวิจัยแบคทีเรียในลำไส้

กุ้ง 5 ตัวจากแต่ละกลุ่มได้รับการเลือกแบบสุ่มและเก็บลำไส้ในวันที่ 10, 20 และ 30 ลำไส้ของกุ้งแต่ละตัวถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและแพร่กระจายใน TCBS (อาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกสำหรับเพาะเลี้ยง Vibrio spp.) หรือ NA (อาหารเลี้ยงเชื้อทั่วไปสำหรับวัฒนธรรมแบคทีเรียส่วนใหญ่) โดยใช้เทคนิคแผ่นกระจาย ตามด้วยการฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในที่สุดจำนวนคอลอนีแบคทีเรียทั้งหมดจะถูกนับและคำนวณเป็น CFU/g

การศึกษาพารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน

วัดพารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันเมื่อสิ้นสุดการทดลองให้อาหาร กุ้งสิบตัวจากแต่ละการรักษาถูกนำมาใช้สำหรับการทดสอบภูมิคุ้มกัน ตัวอย่างน้ำเหลืองในเลือด 250 µL จากกุ้งแต่ละตัวถูกเก็บจากฐานของขาที่สามโดยใช้เข็มฉีดยาที่มีสารกันเลือดแข็งที่แช่เย็นไว้ล่วงหน้า (4°C) 750 µL (ไตรโซเดียมซิเตรต 0.114 M, NaCl 450 mM, KCl 10 mM, HEPES 10 mM ที่ pH 7.4) (Nonwachai et al. 2010) ส่วนผสมของสารป้องกันการแข็งตัวของเลือดและสารทำลายเม็ดเลือดแดงถูกใช้เพื่อวัดจำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมด (THC) กิจกรรมการจับกิน กิจกรรมของฟีนอลออกซิเดส (PO) กิจกรรมของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) และกิจกรรมการฆ่าเชื้อแบคทีเรีย

จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมด

หลังจากเก็บเลือดแล้ว จะนับเซลล์เม็ดเลือดโดยใช้เครื่องไซโตมิเตอร์เซลล์เม็ดเลือด และคำนวณจาก THC (เซลล์/มล.) = จำนวน × 104 × ปัจจัยการเจือจาง

กิจกรรมการจับกิน

กิจกรรมการจับกินถูกกำหนดตามวิธี Itami et al. (1994). นำเซลล์เม็ดเลือดกุ้งที่ได้ไปล้างด้วยน้ำเกลือกุ้ง (สารละลาย NaCl 28.4 กรัม, MgCl 2 ·6H 2O 1.0 กรัม, MgSO4·7H 2O 2.0 กรัม, CaCl 2 ·2H 2O 2.25 กรัม, KCl 0.7 กรัม, กลูโคส 1.0 กรัม และ HEPES 2.38 กรัม/ลิตร) และปรับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตเป็น 1 × 106 เซลล์/มิลลิลิตร เซลล์ที่แขวนลอย (200 µL) ถูกชุบลงบนสไลด์แก้ว หลังจากผ่านไป 20 นาที ให้เอาเซลล์ที่แขวนลอยออก แล้วล้างด้วยน้ำเกลือกุ้ง 3 ครั้ง เติมยีสต์ที่ผ่านความร้อนจนหมด (2 มล.) ลงไปแล้วฟักเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นนำยีสต์ที่เตรียมแล้วซึ่งฆ่าเชื้อด้วยความร้อนออก แล้วล้างเซลล์ที่แขวนลอยด้วยน้ำเกลือกุ้ง 5 ครั้ง เพื่อให้ได้ความเข้มข้น 5 × 10 8 เซลล์/มล. และตรึงด้วยเมทานอล 100% จากนั้นย้อมสไลด์ด้วยสีย้อม Giemsa แล้วยึดด้วยน้ำยายึด Permount นับเม็ดเลือดได้สองร้อยเซลล์ในแต่ละตัวอย่าง กิจกรรมการจับกิน หมายถึง อัตราการจับกินที่แสดงเป็น:

อัตราส่วนการจับกิน = (เซลล์เม็ดเลือดที่กิน/เซลล์เม็ดเลือดทั้งหมด) × 100

3. กิจกรรมฟีนอลออกซิเดส

   กิจกรรมของเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดสได้รับการวัดโดยสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยการบันทึกการก่อตัวของโดปาโครมที่สร้างจาก l-dihydroxyphenylalanine หลังจากปรับเปลี่ยนขั้นตอนที่เผยแพร่ (Supamattaya et al. 2000) ล้างส่วนผสมของน้ำเลือดและสารกันเลือดแข็งสามครั้งด้วยน้ำเกลือกุ้ง แล้วปั่นที่ความเร็ว 1,000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10 นาที ไลเสทของเซลล์เม็ดเลือดถูกเตรียมจากเซลล์เม็ดเลือดในบัฟเฟอร์คาโคไดเลต (pH 7.4; โซเดียมคาโคไดเลต 0.01 M โซเดียมคลอไรด์ 0.45 M แคลเซียมคลอไรด์ 0.01 M และแมกนีเซียมคลอไรด์ 0.26 M; pH 7.0) โดยการโซนิเคชั่นที่แอมพลิจูด 30 เป็นเวลา 5 วินาที จากนั้นจึงปั่นเหวี่ยงสารแขวนลอยที่ 10,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 20 นาที จากนั้นจึงเก็บส่วนที่เป็นของเหลวใส จากนั้น ผสมทริปซิน 0.25% จำนวน 200 µL ในบัฟเฟอร์คาโคไดเลตเข้ากับไลเสทเซลล์เม็ดเลือด 200 µL ตามด้วย l-dihydroxyphenylalanine จำนวน 200 µL ที่ 4 มก./มล. เป็นสารตั้งต้น กิจกรรมเอนไซม์วัดโดยการดูดกลืนแสงของโดปาโครมที่ 490 นาโนเมตร ปริมาณโปรตีนในไลเสทของเซลล์เม็ดเลือดถูกวัดตามขั้นตอนที่ตีพิมพ์ (Lowry et al. 1951) กิจกรรมของฟีนอลออกซิเดสถูกคำนวณเป็นการเพิ่มความหนาแน่นที่เหมาะสมที่สุดต่อนาทีต่อมิลลิกรัมของโปรตีน

4. กิจกรรมของเอนไซม์ซุปเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส

   กิจกรรมของ SOD ได้รับการวัดโดยความสามารถในการยับยั้งปฏิกิริยาที่ขึ้นอยู่กับอนุมูลซุปเปอร์ออกไซด์โดยใช้ Ransod Kit (Randox, Crumlin, UK) วิธีการนี้ใช้พื้นฐานการก่อตัวของฟอร์มาซานสีแดงในปฏิกิริยาของ 2-(4-ไอโอโดฟีนิล)-3-(4-ไนโตรฟีนอล)-5-ฟีนิลเตตระโซเลียมคลอไรด์ (INT) และซูเปอร์ออกไซด์เรดิคัล ซึ่งวิเคราะห์ในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 505 นาโนเมตร ส่วนผสมปฏิกิริยา (1.7 มล.) ประกอบด้วยแซนทีน 0.05 มิลลิโมลาร์และ INT 0.025 มิลลิโมลาร์ละลายใน CAPS 50 มิลลิโมลาร์ (pH 10.2) และ EDTA 0.94 มิลลิโมลาร์ ในสภาพที่มีแซนทีนออกซิเดส ซูเปอร์ออกไซด์และกรดยูริกจะถูกสร้างขึ้นจากแซนทีน จากนั้นอนุมูลซุปเปอร์ออกไซด์จะทำปฏิกิริยากับ INT เพื่อผลิตสีย้อมฟอร์มาซานสีแดง ผสมเฮโมไลเสท-สารกันเลือดแข็งถูกปั่นที่ 3,000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10 นาที พลาสมาถูกนำออกและสารตกค้างถูกทำให้แขวนลอยใหม่ด้วย NaCl 0.9% ปริมาตร 3 มิลลิลิตรและปั่นเหวี่ยงอีกครั้ง ส่วนที่เป็นของเหลวใสจะถูกทิ้งไป และส่วนที่เหลือจะถูกทำให้แขวนลอยใหม่ด้วยน้ำกลั่นสามครั้ง 2 มิลลิลิตร ที่อุณหภูมิ 4°C วางเซลล์เม็ดเลือดที่ถูกแขวนลอยใหม่ปริมาณ 50 µL ลงในแต่ละหลุมของเพลต 96 หลุม ซึ่งบรรจุส่วนผสมปฏิกิริยาปริมาณ 200 µL เติมสารละลายแซนทีนออกซิเดส 50 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 505 นาโนเมตรและ 37°C อัตราการเกิดปฏิกิริยาประมาณจากการอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 0.5 และ 3 นาทีหลังจากการเติมแซนทีนออกซิเดส มีมาตรฐานอ้างอิงของ SOD มาพร้อมกับชุด Ransod SOD หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณที่จำเป็นในการยับยั้งอัตราการลดลงของแซนทีนลง 50% กิจกรรมเฉพาะแสดงเป็นหน่วย SOD/mL

5. ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย

   กิจกรรมการฆ่าเชื้อแบคทีเรียได้รับการวัดตามที่อธิบายโดย Supamattaya และคณะ (2000). แยกซีรั่มออกจากเซลล์เม็ดเลือดของกุ้งแต่ละตัวอย่างก่อนเจือจางใน NaCl 2.6% ในอัตราส่วน 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 และ 1:32 จากนั้นใช้ซีรั่มเจือจางแต่ละชนิดปริมาณ 0.5 มิลลิลิตรสำหรับการทดสอบ สำหรับการควบคุมเชิงลบ จะใช้ NaCl 0.1 มล. ในการทดสอบ เติม Vibrio harveyi หนึ่งในสิบมิลลิลิตร (8.2 × 10 6 CFU/mL) ลงในการเจือจางซีรั่มแต่ละครั้งและการควบคุม การรักษาถูกฟักไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 ชั่วโมงก่อนการนับแบคทีเรีย ผลลัพธ์ได้มาจากการเจือจางที่สามารถลด V. harveyi ลงได้ 50% เมื่อเปรียบเทียบกับตัวควบคุม

   .

ผลลัพธ์

การทดลองที่ 1 ผลของกรดฟอร์มิกและ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโตและอัตราการรอดตายของกุ้งขาวแปซิฟิกในระยะหลังวัยอ่อน

หลังจากให้อาหารเป็นเวลา 60 วัน กุ้งที่ได้รับอาหาร AX 50 ppm มีน้ำหนักตัวเฉลี่ยสูงสุด (4.45 ± 0.45 กรัม) รองลงมาคือกุ้งที่ได้รับอาหาร FA 0.3% + AX ​​50 ppm (4.38 ± 0.37 กรัม) FA 0.6% + AX ​​50 ppm (4.05 ± 0.21 กรัม) และกลุ่มควบคุม (4.18 ± 0.05 กรัม) อย่างไรก็ตาม น้ำหนักตัวของกุ้งทั้งหมดที่ได้รับกรดฟอร์มิกและ แอสตาแซนธิน ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากกลุ่มควบคุม อัตราการรอดตายเฉลี่ยของกุ้งที่ได้รับอาหาร FA 0.6% + AX ​​50 ppm เท่ากับ 82.33 ± 8.32% ซึ่งสูงที่สุดในบรรดากลุ่มอื่นๆ และสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (64.33 ± 10.12%) (ข้อมูลเสริม 1: ตาราง S1)

การทดลองที่ 2 ผลของกรดฟอร์มิกและ แอสตาแซนธิน ต่อการเจริญเติบโต การอยู่รอด แบคทีเรียในลำไส้ และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของกุ้งขาวแปซิฟิกที่ติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus

เมื่อสิ้นสุดการทดลองให้อาหาร พบว่ากุ้งที่ได้รับ FA 0.3% + 50 ppm ที่ได้รับอาหาร AX มีอัตราเพิ่มน้ำหนักเฉลี่ยสูงที่สุดที่ 2.97 ± 0.83 กรัม อย่างไรก็ตาม ไม่มีการสังเกตความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มทดลองทั้ง 6 กลุ่ม อัตราการรอดตายโดยเฉลี่ยของกุ้งทั้งหมดที่ได้รับอาหาร FA และ AX สูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (20.00 ± 17.32%) และผลลัพธ์ที่ดีที่สุดได้มาจากกลุ่มที่ได้รับอาหาร FA 0.6% + AX ​​50 ppm (67.50 ± 3.33%) (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S2)

สำหรับการศึกษาแบคทีเรียในลำไส้ ทั้ง Vibrio spp. จำนวนและจำนวนแบคทีเรียทั้งหมดของกลุ่มที่ได้รับอาหาร FA ทั้ง 4 กลุ่ม (ได้แก่ FA 0.3%, FA 0.6%, AX 50 ppm + FA 0.3% และ AX 50 ppm + FA 0.6%) ต่ำกว่าจำนวนแบคทีเรียของกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับอาหาร 50 ppm อย่างมีนัยสำคัญ กลุ่มต่างๆ ได้รับอาหาร AX ตลอดช่วงการทดลองให้อาหาร พบจำนวนแบคทีเรียในลำไส้ต่ำที่สุดในกลุ่มกุ้งที่ได้รับอาหารที่มี FA ในปริมาณสูง (เช่น FA 0.6%) วันที่ 30 ของการทดลอง มี Vibrio spp. จำนวน 2 ตัว ตัวเลขดังกล่าวถูกสังเกตใน 50 ppm AX + 0.6 % FA และ 0.6 % FA (1.30 ± 0.58 และ 1.60 ± 0.70 × 10 6 CFU/g ตามลำดับ) ในขณะที่ตัวเลขสูงสุดอยู่ในกลุ่มควบคุม (47.20 ± 25.40 × 10 6 CFU/g) ในทำนองเดียวกัน จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดต่ำที่สุดสองกลุ่มอยู่ในกลุ่ม FA 0.6% และ AX + 0.6% FA 50 ppm (2.80 ± 1.30 และ 3.10 ± 0.70 × 10 6 CFU/g ตามลำดับ) ในขณะที่จำนวนแบคทีเรียสูงสุดอยู่ในกลุ่มควบคุม (45.00 ± 27.40 × 10 6 CFU/g) (รูปที่ 1,​22)

รูปที่ 1 ปริมาณ Vibrio spp. ทั้งหมด (106 CFU/g) ในลำไส้ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 5) หลังจากท้าทายด้วย V. parahaemolyticus ที่ 104 CFU/ml ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

รูปที่ 2 จำนวนแบคทีเรียทั้งหมด (106 CFU/g) ในลำไส้ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 5) หลังจากการติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ที่ความเข้มข้น 104 CFU/mL ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันของกุ้งได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจาก AX ในอาหารกุ้ง กุ้งที่ได้รับอาหารที่มี AX (โดยเฉพาะ AX 50 ppm + FA 0.3%, AX 50 ppm + FA 0.6% และ AX 50 ppm) มีจำนวนเม็ดเลือดแดงรวม (THC) สูงกว่า (รูปที่ 2) 3) กิจกรรมการจับกิน (รูปที่ 2) 4) และกิจกรรมของฟีนอลออกซิเดส (PO) (รูปที่ 2) 5) สูงกว่ากลุ่มควบคุมและกลุ่ม FA อย่างมีนัยสำคัญ กิจกรรมของเอนไซม์ซุปเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) (รูปที่ 2) 6) กุ้งที่ได้รับอาหาร AX 50 ppm แต่ไม่ใช่กลุ่มที่ได้รับอาหาร AX + 0.3 % FA และกลุ่มที่ได้รับอาหาร AX + 0.6 % FA 50 ppm แสดงให้เห็นว่ามีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกุ้งที่ไม่ได้รับอาหาร AX อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์ฆ่าเชื้อแบคทีเรียของซีรั่มกุ้งในทุกกลุ่มที่การเจือจางซีรั่มแบบเดียวกันคือ 1:4 (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S3)

รูปที่ 3 จำนวนเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมด (105 เซลล์/มล.) ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 10) หลังจากทดสอบด้วย Vibrio parahaemolyticus ที่ 104 CFU/มล. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

รูปที่ 4 กิจกรรมการจับกิน (%) ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 10) หลังจากการติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ที่ความเข้มข้น 10^4 CFU/mL ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

รูปที่ 5 กิจกรรมฟีนอลออกซิเดส (หน่วยต่อนาทีต่อมก. โปรตีน) ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 10) หลังจากทดสอบด้วย Vibrio parahaemolyticus ที่ 10^4 CFU/มล. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

รูปที่ 6 กิจกรรมของเอนไซม์ Superoxide dismutase (หน่วย SOD/มล.) ของกุ้งขาวแปซิฟิก (n = 10) หลังจากทดสอบด้วย Vibrio parahaemolyticus ที่ความเข้มข้น 10^4 CFU/มล. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ตัวอักษรที่แตกต่างกันเหนือแถบบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ (p < 0.05)

การอภิปราย

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของแคโรทีนอยด์อาจเกี่ยวข้องกับผลในการปรับภูมิคุ้มกัน โดยการดับออกซิเจนซิงเกิลและอนุมูลอิสระ แคโรทีนอยด์อาจปกป้องเม็ดเลือดขาวจากความเสียหายจากออกซิเดชัน (Bendich 1989) Superoxide dismutase (SOD) เป็นเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระที่ปกป้องเซลล์จากความเครียดออกซิเดชันโดยการกำจัดซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน (O 2 −) และใช้เป็นดัชนีการตอบสนองภูมิคุ้มกัน (Campa-Córdova et al. 2002a, 2002b) เนื่องจากแอสตาแซนธินมีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระด้วย นั่นจึงชี้ให้เห็นว่ากลไกดังกล่าวต้องมีส่วนเกี่ยวข้องกับการปรับภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ ยังมีการบันทึกผลของแคโรทีนอยด์ในการส่งเสริมการตอบสนองภูมิคุ้มกันแบบเซลล์และแบบฮิวมอรัลของสัตว์มีกระดูกสันหลังด้วย (Bendich 1989; Chew and Park 2004) การศึกษามากมายรายงานว่าแคโรทีนอยด์ในอาหารสามารถเพิ่มพารามิเตอร์ภูมิคุ้มกัน เพิ่มอัตราการรอดชีวิต หรือทำหน้าที่เป็นสารป้องกันเชื้อโรคสำหรับสัตว์น้ำหลายชนิด เช่น ปลาคาร์ป (Anbazahan et al. 2014; Sowmya และ Sachindra 2015) ปลาเทราต์สายรุ้ง (Amar) et al. 2544) กุ้งขาวแปซิฟิก (Flores et al. 2007; Niu et al. 2009) กุ้งกุลาดำ (Supamattaya et al. 2005) กุ้งคุรุมะ (Chien and Shiau 2005) และกุ้งน้ำจืดขนาดใหญ่ (Angeles et al. 2009) ผลลัพธ์ของเราค่อนข้างคล้ายกับการศึกษาเหล่านี้

แม้ว่ากรดฟอร์มิกและแอสตาแซนธินจะมีกลไกการออกฤทธิ์ที่แตกต่างกันกับกุ้ง แต่ทั้งสองอย่างก็มีผลดีต่อความสามารถในการต้านทานแบคทีเรีย ในขณะเดียวกัน ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการใช้กรดฟอร์มิกร่วมกับ แอสตาแซนธิน ไม่ได้ผลดีไปกว่าการใช้เพียงตัวเดียวหรือการใช้ร่วมกัน ข้อยกเว้นประการเดียวคือกุ้งที่ไม่ได้รับเชื้อซึ่งได้รับ FA 0.6% + AX ​​50 ppm มีอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ โดยรวมแล้วกรดฟอร์มิก (0.3 และ 0.6% FA) และ แอสตาแซนธิน (50 ppm AX) มีประสิทธิภาพเท่าเทียมกันในการป้องกันการติดเชื้อ V. parahaemolyticus ในกุ้งขาวแปซิฟิก เนื่องจากกรดฟอร์มิกมีราคาถูกกว่า แอสตาแซนธิน การใช้กรดฟอร์มิกเป็นสารเติมแต่งอาหารในการเลี้ยงกุ้งจึงถือว่ามีมูลค่าทางเศรษฐกิจมากกว่า

บทสรุป

สามารถใช้แอสตาแซนธิน (50 ppm AX) เป็นสารกระตุ้นการเจริญเติบโตในกุ้งขาวแปซิฟิกที่ไม่ได้รับการติดเชื้อ ในขณะที่กรดฟอร์มิก (0.3 และ 0.6% FA) และ AX สามารถเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของกุ้งที่ติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ได้ในสภาวะห้องปฏิบัติการ นอกจากนี้กุ้งที่ได้รับอาหาร FA ยังมี Vibrio spp. และจำนวนแบคทีเรียทั้งหมด ในขณะที่กุ้งที่ได้รับอาหาร AX แสดงให้เห็นถึงการปรับปรุงในพารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันหลายประการ ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการใช้ FA, AX และการผสมผสานกันเป็นสารเติมแต่งอาหารสามารถป้องกันการติดเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ในกุ้งได้

อ้างอิง:

Effect of dietary formic acid and astaxanthin on the survival and growth of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) and their resistance to Vibrio parahaemolyticus

Niti Chuchird, Phitsanu Rorkwiree, and Tirawat Rairat