แอสตาแซนธิน ในอาหารส่งผลดีต่อลักษณะการสืบพันธุ์ของปลาเทราต์สายรุ้ง
ผลกระทบของการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อลักษณะการสืบพันธุ์ได้รับการศึกษาในพ่อแม่พันธุ์ปลา 5 กลุ่มที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 0.07, 12.46, 33.33, 65.06 และ 92.91 มก.*กก.-1 ตามลำดับ และในกลุ่มพ่อแม่พันธุ์ปลาเทราต์สายรุ้ง 2 กลุ่มที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 0.07 และ 33.33 มก./กก.-1 ตามลำดับ เป็นเวลา 6 เดือน ภายใต้แสงไฟเทียมจนกระทั่งถึงวัยเจริญพันธุ์ ไข่จากแต่ละกลุ่มพ่อแม่พันธุ์จะถูกแบ่งออกเป็น 2 ชุดเท่าๆ กัน หนึ่งชุดได้รับการผสมเทียมด้วยอสุจิที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันจากตัวผู้ 4 ตัวที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 0.07 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม-1 และส่วนที่เหลือด้วยอสุจิจากตัวผู้ 4 ตัวที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 33.3 มิลลิกรัม*ต่อกิโลกรัม-1 ตัวเมียผลิตไข่ที่มีความเข้มข้นของแอสตาแซนธินตั้งแต่ 2.03 ถึง 29.79 มิลลิกรัม/กิโลกรัม การเสริมแอสตาแซนธินในอาหารมีผลดีต่อคุณลักษณะการสืบพันธุ์ที่ศึกษา มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการปฏิสนธิ อัตราการเปิดไข่ อัตราการฟัก และอัตราการเปิดไข่ในแต่ละการทดลอง (P < 0.05) แต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการตายของไข่ก่อนการฟัก (P > 0.05) พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ในอัตราการปฏิสนธิในกลุ่มตัวผู้ที่ได้รับแอสตาแซนธิน 0.07 และ 33.3 มก./กก. ปริมาณแอสตาแซนธินในไข่ อัตราการปฏิสนธิ อัตราการตกไข่ และอัตราการฟักมีความสัมพันธ์กันอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) สรุปได้ว่าการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสืบพันธุ์ที่ดีที่สุดในปลาเทราต์สายรุ้ง
แนะนำ
แคโรทีนอยด์เป็นเม็ดสีที่ละลายในไขมัน ซึ่งเป็นสาเหตุของสีสัตว์หลายชนิดตั้งแต่สีเหลืองจนถึงสีแดง พืช แบคทีเรีย และเชื้อราบางชนิดสามารถสังเคราะห์ทางชีวภาพได้ แต่สัตว์ เช่น ปลา สามารถดูดซึมและเผาผลาญได้ (Schiedt, 1998) แอสตาแซนธิน (3,3¢-dihydroxy-b,b-carotene-4,4¢-dione) เป็นหนึ่งในแคโรทีนอยด์หลักในสัตว์น้ำ (Matsuno และ Hirao, 1989) รวมถึงปลาแซลมอน (Khareet al., 1973; Schiedt et al., 1981, 1986) อย่างไรก็ตาม ปลาและสัตว์อื่นๆ ไม่สามารถสังเคราะห์แคโรทีนอยด์ใหม่ได้และจะต้องได้รับจากอาหาร (ดู Davies, 1985) แอสตาแซนธิน และแคนทาแซนธิน (b,b-carotene-4,4¢-dione) เป็นแคโรทีนอยด์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในการสร้างเม็ดสีในปลาแซลมอนที่เลี้ยงไว้ในฟาร์ม แคโรทีนอยด์ที่ถูกกินเข้าไปจะถูกสะสมไว้ในกล้ามเนื้อ ตับ และผิวหนัง พร้อมกับเมแทบอไลต์ของแคโรทีนอยด์ (Torrissen et al., 1989; Store Bakken and No, 1992) ปลามีคุณสมบัติในการแปลงแคโรทีนอยด์บางชนิดให้เป็นวิตามินเอได้ (Morton และ Creed, 1939) ดังนั้น นอกเหนือจากการมีหน้าที่รับผิดชอบในลักษณะสีผสมพันธุ์ระหว่างการเจริญเติบโตทางเพศแล้ว 4-ketocarotenoids ยังทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นของเรตินอลและดีไฮโดรเรตินอล (วิตามิน A1 และ A2) ในปลาแซลมอนอีกด้วย (Schiedt et al., 1985; Al-Khalifa and Simpson, 1988; Whiteet al., 2003) ปลาแซลมอนที่โตเต็มวัยจะมีการกระจายแคโรทีนอยด์ในร่างกายโดยการถ่ายโอนแคโรทีนอยด์ในเนื้อโดยตรงไปที่ผิวหนังของตัวผู้แล้วจึงไปที่ต่อมเพศของตัวเมีย (Steven, 1949; Crozier, 1970; Ando and Hatano, 1987; Bjerkeng et al., 1992; Synowiecki et al., 1993; Hatlen et al., 1996) พร้อมกันกับการกระจายใหม่นี้ จะทำให้ร่างกายสูญเสียแคโรทีนอยด์ไปเป็นจำนวนมาก (Crozier, 1970; Bjerkeng et al., 1992) และมีหลักฐานชี้ให้เห็นว่าการเคลื่อนย้ายและการเผาผลาญของแคโรทีนอยด์ได้รับอิทธิพลจากฮอร์โมนเพศสเตียรอยด์ 11-ketotestosterone และ 17b-estradiol (Bjerkeng et al., 1999) ดังนั้น ในระหว่างการกำเนิดไข่ แคโรทีนอยด์จะถูกเคลื่อนย้ายจากกล้ามเนื้อ รวมเข้าในรังไข่ที่กำลังพัฒนา และพบในรูปแบบที่ยังไม่ผ่านกระบวนการเอสเทอร์ในไข่ที่โตเต็มที่ (Steven, 1949; Kitahara, 1983, 1984) เนื่องจากแคโรทีนอยด์สะสมอยู่ในอวัยวะสืบพันธุ์ของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด จึงมีความเชื่อกันมานานแล้วว่ามีบทบาทสำคัญในการสืบพันธุ์ (Goodwin, 1950)
มีการเสนอหน้าที่หลายประการของแคโรทีนอยด์ในปลา นอกเหนือจากบทบาทในการเป็นสารตั้งต้นของวิตามินเอ (Tacon, 1981; Craik, 1985; Choubert, 1986; Torrissen, 1990) ดังนั้น การเติม แอสตาแซนธิน ในอาหารพ่อแม่พันธุ์จึงปรับปรุงคุณภาพของไข่ปลาหางเหลือง (Seriola quinqueradiata) (Vera-kunpiriya et al., 1997), ไข่ปลาไหล (Pseudocaranx dentex) (Vassallo-Agius et al., 2001), ไข่เม่นทะเล (Lytechinus variegatus) ไข่ (George et al., พ.ศ. 2544) และกุ้งน้ำจืด (Cherax quadrucarin-atus) นอกจากนี้ แคโรทีนอยด์ยังช่วยเพิ่มการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆ เช่น กุ้งลายเสือ (Pangantihon-Ku¨hlmann et al., 1998) และหอยเป๋าฮื้อญี่ปุ่น Haliotis (Tsushima and Matsuno, 1998) มีการเสนอว่าแคโรทีนอยด์ในไข่บ่งชี้คุณภาพของไข่ได้ (Hartmann et al., 1947) ฮาร์ทมันน์และคณะ (พ.ศ. 2490) แนะนำว่า แอสตาแซนธิน ทำหน้าที่เป็นฮอร์โมนการปฏิสนธิโดยกระตุ้นการดึงดูดอสุจิ ส่งผลให้มีอัตราการปฏิสนธิที่สูงขึ้น มีรายงานว่าปลาที่ได้รับอาหารที่มีแคโรทีนอยด์จะมีอัตราการปฏิสนธิ อัตราการเจริญพันธุ์ และอัตราการรอดตายที่สูงขึ้น (Hubbs และ Strawn, 1957; Hubbs และ Stavenhagen, 1958; Deufel, 1965; Georgev, 1971; Mikulin และ Soin, 1975; Craik, 1985) ในทางกลับกัน Quantz (1980), Torrissen (1984), Craik และ Harvey (1986), Tveranger (1986), Christiansen และ Torrissen (1997) ไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างแคโรทีนอยด์ในอาหารกับการตายของไข่ อัตราการฟัก และอัตราการรอดตายของปลาอะเลวิน และ Choubert et al. (1998). ตามที่ Harris (1984) กล่าวไว้ แคนทาแซนธินไม่ส่งผลต่อประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ของปลาเทราต์สายรุ้ง (Oncorhynchus mykiss) เมื่อพิจารณาถึงความแตกต่างอย่างมากในรายงานเกี่ยวกับหน้าที่ทางชีวภาพของ แอสตาแซนธิน ในระหว่างวงจรการสืบพันธุ์ของสายพันธุ์ปลาต่างชนิดกัน จุดประสงค์ของการศึกษานี้คือเพื่อศึกษาว่าลักษณะการสืบพันธุ์ เช่น อัตราการปฏิสนธิและการตายของไข่มีความสัมพันธ์กับความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหาร (0.07–92.9 มก./กก.) ในปลาเทราต์สายรุ้งตัวผู้และตัวเมียที่เพาะเลี้ยงหรือไม่
วัสดุและวิธีการ
สภาพการเลี้ยงปลา
ใช้พ่อแม่พันธุ์ปลาเทราต์สายรุ้งอายุ 2 ปีจากฟาร์มปลา Ghezel mahi (เมืองอูร์เมียห์ ประเทศอิหร่าน) ซึ่งมีน้ำหนักเฉลี่ย 846 ± 112 กรัม และความยาว 43 ± 8 ซม. เป็นพ่อแม่พันธุ์ ปลาถูกกระจายแบบสุ่มในถังคอนกรีตในร่มจำนวน 7 ถัง (8·1·1 ม.3) และควบคุมช่วงแสง ปลาเพศเมียทั้งหมด 85 ตัวได้รับการเลี้ยงในถังจำนวน 5 ถัง (ถังละ 17 ตัว) และเลี้ยงในถังจำนวน 2 ถัง ซึ่งมีปลาเพศผู้จำนวน 20 ตัว (ถังละ 10 ตัว) ปลาถูกเก็บไว้ในที่แสง 18 ชั่วโมงและมืด 6 ชั่วโมงเป็นระยะเวลา 3 เดือนโดยใช้ตัวตั้งเวลาอัตโนมัติ ความเข้มของแสงบนผิวน้ำวัดด้วยเครื่องวัดแสง และความเข้มของแสงเฉลี่ยตลอดช่วงเวลาคือ 76.5 ลักซ์ ถังได้รับน้ำจืดจากบ่อน้ำลึก เติมออกซิเจน และกรองผ่านตัวกรองทรายเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของแพลงก์ตอนสัตว์ซึ่งอาจเป็นแหล่งของ แอสตาแซนธิน อัตราการไหลของน้ำเฉลี่ย, ออกซิเจนที่ละลายน้ำ, ค่า pH และอุณหภูมิของน้ำในถังทั้งหมดได้รับการวัดสามครั้งต่อสัปดาห์ และมีช่วงตั้งแต่ 0.8 ถึง 1.1 ลิตรต่อวินาที, 7.5 ถึง 7.8 มิลลิกรัมต่อลิตร, 7.5 ถึง 7.7 และ 11.6 ถึง 14.8 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ตลอดทั้งช่วงเวลา ผู้ผลิตอาหารสัตว์เชิงพาณิชย์แห่งหนึ่ง (บริษัท Behparvar Feed Manufacturing Company เตหะราน ประเทศอิหร่าน; ตารางที่ 1) ผลิตอาหารเม็ดแบบไอน้ำจำนวน 5 ชนิด อาหารสี่ชนิดได้รับการเสริมด้วย แอสตาแซนธิน ในระดับที่แตกต่างกัน (Carophyll Pink, แอสตาแซนธิน 8%; DSM, Basel, สวิตเซอร์แลนด์) การรับประทานอาหารที่ไม่เสริมที่มีส่วนประกอบคล้ายคลึงกันทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุม แม่พันธุ์ปลาพ่อแม่พันธุ์ทั้ง 5 กลุ่มได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 0.07, 12.5, 33.3, 65.1 หรือ 92.9 มิลลิกรัม/กิโลกรัม ตามลำดับ พ่อพันธุ์แม่พันธุ์ทั้ง 2 กลุ่มได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 0.07 หรือ 33.3 มิลลิกรัม/กก. ตามลำดับ ให้อาหารปลาวันละ 3 ครั้ง ในอัตรา 1% ของน้ำหนักตัว ในช่วงที่มีแสงสว่าง (09.00 น., 12.00 น. และ 15.00 น.) ตลอดทั้งช่วงเวลา
การสุ่มตัวอย่างและการเตรียมตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์แคโรทีนอยด์ ตัวอย่างไข่ถูกขนส่งไปยัง AKVAFORSK (Sunn-dalsøra, นอร์เวย์) ในถังไนโตรเจนเหลวเพื่อลดความเป็นไปได้ของการย่อยสลายของแคโรทีนอยด์ การกำหนดแอสตาแซนธินในอาหารขึ้นอยู่กับขั้นตอนการวิเคราะห์แอสตาแซนธินในอาหารปลาตามที่อธิบายโดย Weber (1990) ชั่งน้ำหนักตัวอย่างที่เป็นเนื้อเดียวกัน (ประมาณ 5 กรัม) อย่างแม่นยำ เจลาตินของไมโครแกรนูล Carophyll Pink ซึ่งประกอบด้วยเมทริกซ์เจลาติน คาร์โบไฮเดรต และสารต้านอนุมูลอิสระเคลือบแป้ง จะถูกย่อยสลายโดยการบำบัดด้วยเอนไซม์ด้วยโปรตีเอสแบคทีเรียในแคปซูล (30 มก.; Maxatase P, Genencor International BV, Delft, เนเธอร์แลนด์) ในน้ำกลั่น (10 มล.) ในอ่างน้ำอัลตราโซนิก (30 นาที 50 องศาเซลเซียส) เติมเอธานอล (100 มล.) ลงไป และเจือจางตัวอย่างเป็น 250 มล. ด้วยไดคลอโรมีเทน สารสกัดถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโทกราฟีคอลัมน์เปิดบนซิลิกาเจล 60 (Merck, Darmstadt, เยอรมนี; หมายเลข 7733) และสารละลายที่ถูกแยกออกถูกระเหย หลังจากละลายตัวอย่างใน n-hexane : acetone (86 : 14) แล้ว จะตรวจสอบปริมาณแอสตาแซนธินโดยใช้เครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง เติมตัวอย่างไข่ (1.8–4.2 กรัม) ลงในเมทานอล [2.0 มล. ซึ่งมีบิวทิลเลเต็ดไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT) 500 ppm เป็นสารต้านอนุมูลอิสระ] และน้ำดีไอออนไนซ์ (1.0 มล.) จากนั้นผสมตัวอย่าง (Whirlmixer, Fisons, ประเทศอังกฤษ) เป็นเวลา 20 วินาที เติมคลอร์ฟอร์ม (6 มล.) ลงไป และผสมตัวอย่างอีกครั้งเป็นเวลา 20 วินาที (ดู Bjerkeng et al., 1997; Wathne et al., 1998) หลังจากตกตะกอนเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกผสมอีกครั้งแล้วปั่น (ประมาณ 1,700 กรัม เป็นเวลา 10 นาที) ไฮโปเฟสปริมาณเล็กน้อย (2 มล.) ที่ประกอบด้วยแอสตาแซนธินที่ละลายในคลอโรฟอร์มถูกปิเปตลงในหลอดทดสอบ จากนั้นตัวทำละลายจะถูกระเหยในอ่างน้ำ (ประมาณ 40 องศาเซลเซียส) โดยใช้ไนโตรเจนที่ไหลอ่อนๆ หลังจากการระเหย ตัวอย่างจะละลายในอะซิโตน 20% ใน n-เฮกเซน (3 มล.) กรองสารละลาย (0.45 ลูเมน; Minisart SRP15, Sartorius, เยอรมนี) ลงในขวดตัวอย่างโดยตรงแล้วปิดผนึกทันที ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ด้วย HPLC ในวันเดียวกัน ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง โดยการบำบัดด้วยเอนไซม์ด้วยโปรตีเอสแบคทีเรียห่อหุ้ม (30 มก.; Maxatase P, Genencor International BV, Delft, เนเธอร์แลนด์) ในน้ำกลั่น (10 มล.) ในอ่างน้ำอัลตราโซนิก (30 นาที 50°C) เติมเอธานอล (100 มล.) ลงไป และเจือจางตัวอย่างเป็น 250 มล. ด้วยไดคลอโรมีเทน สารสกัดถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโทกราฟีคอลัมน์เปิดบนซิลิกาเจล 60 (Merck, Darmstadt, เยอรมนี; หมายเลข 7733) และสารละลายที่ถูกแยกออกถูกระเหย หลังจากละลายตัวอย่างใน n-hexane : acetone (86 : 14) แล้ว จะตรวจสอบปริมาณแอสตาแซนธินโดยใช้เครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง เติมตัวอย่างไข่ (1.8–4.2 กรัม) ลงในเมทานอล [2.0 มล. ซึ่งมีบิวทิลเลเต็ดไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT) 500 ppm เป็นสารต้านอนุมูลอิสระ] และน้ำดีไอออนไนซ์ (1.0 มล.) จากนั้นผสมตัวอย่าง (Whirlmixer, Fisons, UK) เป็นเวลา 20 วินาที เติมคลอร์ฟอร์ม (6 มล.) ลงไป และผสมตัวอย่างอีกครั้งเป็นเวลา 20 วินาที (ดู Bjerkeng et al., 1997; Wathne et al., 1998) หลังจากตกตะกอนเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกผสมอีกครั้งแล้วปั่น (ประมาณ 1,700 กรัม เป็นเวลา 10 นาที) ไฮโปเฟสปริมาณเล็กน้อย (2 มล.) ที่ประกอบด้วยแอสตาแซนธินที่ละลายในคลอโรฟอร์มถูกปิเปตลงในหลอดทดสอบ จากนั้นตัวทำละลายจะถูกระเหยในอ่างน้ำ (ประมาณ 40 องศาเซลเซียส) โดยใช้ไนโตรเจนที่ไหลอ่อนๆ หลังจากการระเหย ตัวอย่างจะละลายในอะซิโตน 20% ใน n-เฮกเซน (3 มล.) กรองสารละลาย (0.45 ลูเมน; Minisart SRP15, Sartorius, เยอรมนี) ลงในขวดตัวอย่างโดยตรงแล้วปิดผนึกทันที ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ด้วย HPLC ในวันเดียวกัน ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง
การวิเคราะห์ฟีดข้อมูล
องค์ประกอบโดยประมาณของอาหารสัตว์ได้รับการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการของบริษัท Behparvar Food Production ปริมาณไขมันดิบถูกกำหนดโดยการสกัดแบบ Soxhlet โดยใช้ไดเอทิลอีเธอร์เป็นตัวทำละลาย ปริมาณโปรตีนดิบ (N ·6.25) ถูกกำหนดโดยวิธี Kjeldahl ปริมาณวัตถุแห้งถูกกำหนดหลังจากการให้ความร้อนตัวอย่างถึง 105°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ปริมาณเถ้าถูกตรวจสอบภายหลังการเผาไหม้ที่อุณหภูมิ 550oC เป็นเวลา 12 ชั่วโมง องค์ประกอบโดยประมาณของอาหารถูกกำหนดสามครั้ง
การวิเคราะห์ HPLC
การวิเคราะห์ HPLC ดำเนินการบนเครื่องโครมาโตกราฟของเหลว Shimadzu LC-10ASLid ที่เชื่อมต่อกับเครื่องตรวจจับ UV-VIS อาร์เรย์โฟโตไดโอด Shimadzu SPD-M6A และโมดูลบัสการสื่อสาร Shimadzu CBM-10A และตั้งค่าความยาวคลื่นในการตรวจจับเป็น 470 นาโนเมตร ตัวอย่างการใช้งานดำเนินการโดยเครื่องฉีดอัตโนมัติ Shimadzu SIL-10 โครมาโทแกรมทั้งหมดได้รับการบูรณาการใหม่ (ซอฟต์แวร์ CLASS LC10; Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น) เพื่อการปรับพื้นฐาน ระบบ HPLC แบบไอโซเครติกสองระบบถูกนำมาใช้เพื่อแยกและหาปริมาณแคโรทีนอยด์ (ดู Bjerkeng et al., 2000) ระบบ I ประกอบด้วยคอลัมน์ไนไตรล์คอลัมน์ Spherisorb S5-CN (PhaseSep, Queensferry, Clywd, สหราชอาณาจักร ความยาว 250 มม., Ø 4.6 มม., ขนาดอนุภาค 5 ลูเมน) โดยใช้อะซิโตน 20% ในเฟสเคลื่อนที่ n-เฮกเซน ( อัตราการไหล 1.5 มล.-1 นาที ความดันประมาณ 52 บาร์) ระบบ II ประกอบด้วยคอลัมน์ซิลิกาเจลที่ปรับเปลี่ยนด้วย H3PO4 (Hibar, LiChrosorb Si 60, อนุภาคขนาด 5 ลูเมน, Ø 4.6 มม., ความยาว 125 มม.; Merck, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) ตามที่อธิบายโดย Vecchi และคณะ (1987). เฟสเคลื่อนที่มีอะซิโตน 14% ในเฮกเซน และอัตราการไหลคือ 1.2 มล. ต่อนาที (แรงดันประมาณ 36 บาร์) เฟสมือถือจะมีการต่ออายุทุกวัน ระบบ HPLC I ใช้ในการวัดปริมาณแคโรทีนอยด์ขั้วที่อาจรวมถึงไอโซเมอร์ไกลคอลิก 3¢,4¢-cis ถึง 3¢,4¢-trans ของไอโดแซนทิน (3,3¢,4¢-trihydroxy-b,b-carotene-4¢-one) มาตรฐานของไอโซเมอร์ไกลคอลิกไอโดแซนทิน (3¢,4¢)-cis และ -trans ได้รับการเตรียมตาม Aas et al. (1997). ระบบ HPLC II ถูกนำมาใช้เพื่อวัดปริมาณไอโซเมอร์ E/Z ทั้งหมดของแอสตาแซนธิน แคโรทีนอยด์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณจากบริเวณโครมาโทแกรม HPLC และแก้ไขความแตกต่างของการดูดกลืนแสงของโมลาร์ (E1%, 1 ซม.) ที่ความยาวคลื่นในการตรวจจับ (470 นาโนเมตร) ค่า E1%, 1 ซม. ที่ใช้คือ 2100 สำหรับ all-E-astaxanthin (Britton, 1995) และ 1350 และ 1750 สำหรับ 13Z- และ 9Z-astaxanthin ตามลำดับ ค่า E1 ซม., 1% ของ 13Z และ 9Z-astaxanthin ประมาณขึ้นจากปัจจัยการตอบสนอง HPLC ที่เกี่ยวข้องกับ all-E-astaxanthin ที่รายงานโดย Schu¨ep และ Schierle (1995) มาตรฐานของความเข้มข้นที่ทราบถูกเตรียมจากผลึกแอสตาแซนธินอีทั้งหมด (Hoffmann-LaRoche Ltd, Basel, Switzerland) และมาตรฐานเหล่านี้จะถูกนำไปใช้ทุกครั้งที่มีการวิเคราะห์ตัวอย่าง ความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานวัดโดยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก (UV-260; Shimadzu) โดยใช้ E1%, 1 ซม. ¼ 2100 ที่ค่าการดูดกลืนแสงสูงสุด (kmax ¼ 472 นาโนเมตร)
วิธีการทางสถิติ
การออกแบบทางสถิติที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้เป็นการทดลองแบบปัจจัยในการออกแบบแบบสุ่มสมบูรณ์ ปัจจัยแรกคือการทดลองเลี้ยงพ่อแม่พันธุ์ที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 5 ระดับ (0.07, 12.46, 33.33, 65.06 และ 92.97 มก./กก.) จำนวนปลาที่จำลองนั้นไม่เท่ากันสำหรับการทดลองทั้งหมด เนื่องจากมีเพียงตัวเมียที่เป็นผู้ใหญ่ 3 ตัวในกลุ่มเท่านั้นที่ได้รับอาหารแอสตาแซนธิน 0.07 มก./กก.-1 ในช่วงการทดสอบการเจริญเติบโตทางเพศ ในแต่ละการรักษาใช้ปลาจากกลุ่มอื่นๆ จำนวน 5 ตัว คำนวณอัตราการปฏิสนธิ = 100 *ไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิ (ไข่ทั้งหมด – 1 ) และเปอร์เซ็นต์ของไข่ที่มีตา = 100 *ไข่ที่มีตา (จำนวนไข่ทั้งหมด -1 ฟอง) อัตราการตายจนถึงระยะตา = 100 *ไข่ตาย (จำนวนไข่ทั้งหมด -1 ฟอง) เปอร์เซ็นต์การฟักออก = 100 *ไข่ที่ฟักออก (จำนวนไข่ทั้งหมด -1 ฟอง) และอัตราการตายตั้งแต่ระยะตาจนถึงการฟัก = 100 *ไข่ตายตั้งแต่ระยะตาจนถึงการฟัก (จำนวนไข่ทั้งหมด -1 ฟอง) ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์แบบสุ่มอย่างสมบูรณ์โดยใช้วิธี GLM และประเมินการแจกแจงแบบปกติโดยใช้วิธี Kolmogorov–Smirnov (Minitab Statistical Package, Version 13.1, Minitab Inc., PA, USA) ข้อมูลมีการแจกแจงตามปกติและไม่มีการแปลงใดๆ เกิดขึ้น ข้อมูลถูกนำไปวิเคราะห์โดย ANOVA โดยใช้ซอฟต์แวร์ SAS (เวอร์ชัน 6.03) การทดสอบของ Duncan ใช้เพื่อจัดอันดับค่าเฉลี่ย ผลกระทบของความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในไข่ต่ออัตราการปฏิสนธิ อัตราการตกไข่ อัตราการฟัก และผลกระทบของความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหารต่อความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในไข่ ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้น (SPSS เวอร์ชัน 11, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ความแตกต่างถือว่ามีนัยสำคัญเมื่อ P < 0.05 ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SE
ผลลัพธ์
อาหารดังกล่าวมีปริมาณแอสตาแซนธินรวมของไอโซเมอร์เรขาคณิต E-, 9Z- และ 13Z โดยเฉลี่ยอยู่ที่ 81.3, 3.6 และ 15.0 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ พบองค์ประกอบไอโซเมอร์ที่คล้ายกันในไข่จากกลุ่มการรักษาทั้งหมด (ค่าเฉลี่ยของออลอี: แอสตาแซนธินรวม 84.3 ± 1.4% และค่าเฉลี่ยของไอโซเมอร์ Z: แอสตาแซนธินรวม 15.7 ± 1.4% ตามลำดับ) ตรวจพบ b-Adonixanthin (3,3¢-dihydroxy-b,b-carotene-4-one) ในไข่จากกลุ่มการรักษาทั้งหมด และประกอบด้วยค่าเฉลี่ย 18.2%, 5.7%, 3.5%, 2.5% และ 1.1% ของแคโรทีนอยด์ทั้งหมดในกลุ่มต่างๆ โดยการเพิ่มระดับแอสตาแซนธินในอาหาร ไอโดแซนทินมีปริมาณน้อยกว่า 0.2% ของแคโรทีนอยด์ทั้งหมดในไข่ พบว่ามีเพียงสามบุคคลที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 0.07 มก./กก. เท่านั้นที่มีวุฒิภาวะทางเพศ ปลาทั้งหมดในกลุ่มการรักษาอื่น ๆ มีการเจริญเติบโตทางเพศในช่วงระยะเวลาการตรวจสอบ 30 วันหลังจากได้รับการรักษาด้วยแสงเป็นระยะ ความเข้มข้นเฉลี่ยของแอสตาแซนธินในไข่มีช่วงระหว่าง 2.0 ± 0.4 และ 29.8 ± 4.8 มก./กก.-1 แอสตาแซนธิน (ตารางที่ 2) ความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหารและไข่มีความสัมพันธ์กันอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05, R2 = 0.78; รูปที่ 1a) อัตราการปฏิสนธิและความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหารมีความสัมพันธ์กันอย่างมีนัยสำคัญในกราฟ (P < 0.05, R2¼0.35; รูปที่ 1b) และอัตราการปฏิสนธิแสดงให้เห็นค่าสูงสุดของไข่ของตัวเมียที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 65.1 มก.*กก.-1 อัตราการปฏิสนธิต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญในไข่จากตัวเมียที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 0.07 มก./กก. เมื่อเทียบกับการรักษาแบบอื่น (P < 0.05) ในทำนองเดียวกัน เปอร์เซ็นต์ของไข่ที่มีตาเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหารที่เพิ่มขึ้น (P < 0.05) – ตารางที่ 3) ความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณแอสตาแซนธินในไข่และเปอร์เซ็นต์ของไข่ที่มีตาเป็นสิ่งสำคัญ (P < 0.05; รูปที่ 1c) อัตราการฟักไข่ยังเพิ่มขึ้นตามปริมาณแอสตาแซนธินในอาหารที่เพิ่มขึ้น (P < 0.05) การวิเคราะห์การถดถอยแสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในไข่และอัตราการฟัก (P < 0.05; รูปที่ 1d) ไข่จากตัวเมียที่ได้รับอาหารแอสตาแซนธิน 0.07 มก.*กก.-1 มีอัตราการเสียชีวิตสูงกว่าไข่จากตัวเมียที่ได้รับอาหารประเภทอื่นอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05; ตารางที่ 3) อัตราการปฏิสนธิสูงขึ้นร้อยละ 2.5 ในไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิด้วยอสุจิจากตัวผู้ที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 33.3 มก.*กก.-1 เมื่อเทียบกับไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิด้วยอสุจิจากตัวผู้ที่ได้รับอาหารที่มีแอสตาแซนธิน 0.07 มก./กก.1 (ค่า P < 0.05; ตารางที่ 4) อย่างไรก็ตาม ไข่ที่มีตา อัตราการตายจากการปฏิสนธิในระยะที่มีตา และอัตราการฟักของไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิด้วยอสุจิจากตัวผู้ที่ได้รับอาหารเสริมแอสตาแซนธินในระดับต่างกัน ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอาหาร (P > 0.05; ตารางที่ 4)
การอภิปราย
ปริมาณและองค์ประกอบของแคโรทีนอยด์
ความแตกต่างในปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งในกล้ามเนื้อและไข่มีมากระหว่างปลาแซลมอนแต่ละตัวและระหว่างสายพันธุ์ (Craik, 1985) แอสตาแซนธิน ส่วนใหญ่ที่สะสมอยู่ในไข่ปลาแซลมอนป่าเป็นสารที่ไม่มีเอสเทอร์ไรเซชัน (Glover et al., 1951; Craik, 1985; Craik and Harvey, 1986) การศึกษาครั้งนี้ตรวจพบเฉพาะแคโรทีนอยด์ที่ไม่ได้รับเอสเทอริฟายด์เท่านั้น และความเข้มข้นทั้งหมดอยู่ในช่วง 2.0 ถึง 29.8 มก./กก. น้ำหนักเปียก โดยพิจารณาตามขนาดยา ไข่ปลาแซลมอนแอตแลนติกที่เลี้ยงตามธรรมชาติ (Salmo salar) มี แอสตาแซนธิน ประมาณ 6.4 ± 1.75 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม (Craik, 1985) แต่มีรายงานว่าไข่จากปลาแซลมอนแอตแลนติกที่เลี้ยงไว้ในอาหารที่มีแคนทาแซนธินในปริมาณสูงถึง 21.2 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม (Craik and Harvey, 1986) มีรายงานความเข้มข้นของ แอสตาแซนธิน ตั้งแต่ 0 ถึง 14.7 มิลลิกรัม/กิโลกรัมน้ำหนักเปียกในไข่ปลาแซลมอนแอตแลนติกที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน 0–100 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (Christiansen และ Torrissen, 1997) การใช้แอสตาแซนธินที่น้อยลงในปลาแซลมอนแอตแลนติกเมื่อเทียบกับปลาเทราต์สายรุ้ง (ดู Storebakken et al., 1986) ยังสะท้อนให้เห็นจากความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ที่สูงขึ้นในไข่ของปลาเทราต์สายพันธุ์หลังอีกด้วย มีการใช้แอสตาแซนธินไอโซเมอร์เรขาคณิต E/Z ที่แตกต่างกันในปลาเทราต์สายรุ้ง ดังนั้นค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ที่ปรากฏ (ADC) ของออล-อี-แอสตาแซนธิน จึงสูงกว่าค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ที่ชัดเจนของ แอสตาแซนธิน 9Z และ 13Z และค่า ADC ของแอสตาแซนธิน 13Z ก็สูงกว่าค่าสัมประสิทธิ์การย่อยได้ที่ชัดเจนของแอสตาแซนธิน 9Z อย่างมีนัยสำคัญ (Bjerkenget al., 1997) นอกจากนี้ แอสตาแซนธิน อีทั้งหมดจะสะสมอยู่ในพลาสมาและกล้ามเนื้อ (>92% ของแอสตาแซนธินทั้งหมด โดยไม่คำนึงถึงองค์ประกอบในอาหาร) ในขณะที่ แอสตาแซนธิน 13Z จะสะสมอยู่ในตับ (Østerlie et al., 1999) ดังนั้น ไข่ในการทดลองปัจจุบันจึงดูเหมือนว่าจะมีความสัมพันธ์กับไอโซเมอร์ แอสตาแซนธิน Z สูงกว่าพลาสมาและเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อเล็กน้อย แต่เหตุผลยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้น ความเข้มข้นของแอสตาแซนธินมากกว่าองค์ประกอบไอโซเมอริกจึงดูเหมือนจะอธิบายผลการรักษาที่สังเกตได้ แอสตาแซนธิน ถูกเปลี่ยนแปลงอย่างมากในปลาเทราต์สายรุ้ง และมีเมตาบอไลต์บางส่วนอยู่ในผิวหนัง (Schiedt et al., 1985) การมีอยู่ของ b-adonixanthin และ dodoxanthin ปริมาณเล็กน้อยในไข่บ่งบอกว่าเนื้อเยื่อนี้ยังมีความสัมพันธ์บางอย่างกับเมแทบอไลต์ของแอสตาแซนธินอีกด้วย ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในรูปแบบการกระจายตัวของเมตาบอไลต์แอสตาแซนธินสามารถพบได้ในไข่ของปลาแซลมอนสายพันธุ์ต่าง ๆ (Miki et al., 1982) แม้ว่าไอโดแซนทินและครูแซนทิน (3,4,3¢4¢-เตตระไฮดรอกซี-บี,บี-แคโรทีน) จะประกอบมากกว่าร้อยละ 70 ของแคโรทีนอยด์ทั้งหมดในไข่ของ Salvelinusalpinus arcticus (Bjerkeng et al., 2000) แต่ไอโดแซนทินประกอบน้อยกว่าร้อยละ 0.2 ของแคโรทีนอยด์ทั้งหมด และไม่พบรัสตาแซนทินในงานวิจัยนี้
การสืบพันธุ์
แคโรทีนอยด์อาจมีบทบาทสำคัญหลายประการในการเจริญเติบโตและการสืบพันธุ์ของสัตว์จำพวกกุ้ง (ทบทวนโดย Lin˜a´n-Cabello et al., 2002) และปรับปรุงการฟักไข่ ป้องกันความผิดปกติ และเพิ่มอัตราการรอดชีวิตในเม่นทะเล Pseudocentrotus depressus (Tsushima et al., 1997; Kawakami et al., 1998) และปรับปรุงการเจริญเติบโตและผลลัพธ์การสืบพันธุ์ในปลาหางนกยูง Poecilia reticulata (Karino and Haijima, 2004) สอดคล้องกับสิ่งนี้ เราพบผลเชิงบวกของความเข้มข้นของไข่และอาหารต่ออัตราการปฏิสนธิ เปอร์เซ็นต์ของไข่ที่เปิดและไข่ที่ฟัก และอัตราการตายของไข่ที่เปิดของปลาเทราต์สายรุ้ง นอกจากนี้ ในมิงค์ Mustela vison แอสตาแซนธินยังช่วยลดอัตราการคลอดตาย (Hansen et al., 2001) แอสตาแซนธินอาจทำหน้าที่เป็นฮอร์โมนการปฏิสนธิ โดยเพิ่มอัตราการปฏิสนธิโดยการกระตุ้นและดึงดูดอสุจิ (Hartmann et al., 1947) มีการดำเนินการศึกษาวิจัยหลายครั้งเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ แต่ผลลัพธ์จากการศึกษาวิจัยเหล่านี้ขัดแย้งกัน (Christiansen และ Torrissen, 1997) ความเข้มข้นสูงของ แอสตาแซนธิน และแคนทาแซนธินในไข่ช่วยเพิ่มอัตราการปฏิสนธิในปลาเทราต์สายรุ้ง (Deufel, 1975; Craik, 1985) ตามที่ Mikulin และ Soin (1975) กล่าวไว้ แอสตาแซนธินอาจปรับปรุงคุณภาพของไข่ได้ผ่านบทบาทในกระบวนการเผาผลาญระหว่างการพัฒนาตัวอ่อน อย่างไรก็ตาม Quantz (1980) และ Christiansen และ Torrissen (1997) ไม่พบความแตกต่างในอัตราการผสมพันธุ์ของไข่จากปลาเทราต์สายรุ้งที่ได้รับอาหารที่มีแคนทาแซนธินและแอสตาแซนธินในระดับต่างกันก่อนวางไข่ ในทำนองเดียวกัน ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการปฏิสนธิของไข่จากปลาเทราต์สายรุ้งที่ได้รับอาหารคริลล์บด 10% เป็นแหล่งของแอสตาแซนธิน และกลุ่มควบคุมที่ได้รับอาหารเป็นศูนย์ (Tveranger, 1986) อย่างไรก็ตาม ระดับแอสตาแซนธินในอาหารยังต่ำ ความแตกต่างของอัตราการปฏิสนธิระหว่างไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิด้วยอสุจิของหนูตัวผู้ที่ได้รับแอสตาแซนธินกับไข่จากหนูตัวเมียตัวเดียวกันที่ได้รับการปฏิสนธิด้วยอสุจิของหนูตัวผู้ที่ได้รับอาหารควบคุมที่ไม่ได้เสริมอาหาร แสดงให้เห็นว่าแอสตาแซนธินอาจมีผลในเชิงบวกต่อคุณภาพอสุจิของหนูตัวผู้พ่อแม่ โดยพบว่าเบตาแคโรทีนสามารถปรับปรุงคุณภาพน้ำอสุจิของหนูตัวผู้ได้โดยลดการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน (El-Demerdash et al., 2004) ยังคงต้องศึกษากันต่อไปว่าผลดีของแอสตาแซนธินอาจเกิดจากการลดลงของออกซิเดชันของไขมันในปลาเทราต์สายรุ้งตัวผู้หรือไม่
ไข่ขนาดใหญ่ของสายพันธุ์ต่าง ๆ ต้องการปริมาณแคโรทีนอยด์ที่สูงกว่าไข่ขนาดเล็กสำหรับกระบวนการเผาผลาญในระยะเอ็มบริโอ และมีความสัมพันธ์ระหว่างระยะเวลาในการพัฒนาเอ็มบริโอและปริมาณแคโรทีนอยด์ในไข่ในแต่ละสายพันธุ์ (Mikulin, 2003) หากใช้แอสตาแซนธินในระหว่างการพัฒนาตัวอ่อน ความเข้มข้นของแอสตาแซนธินจะลดลงตั้งแต่ระยะฟักตัวจนถึงระยะให้อาหาร พบว่าผลเชิงบวกของปริมาณแคโรทีนอยด์ในไข่และอัตราการรอดในระหว่างการพัฒนาตัวอ่อน Hubbs และ Strawn (1957) พบว่าอัตราการรอดชีวิตเพิ่มขึ้นของไข่ที่มีเม็ดสีของ Etheostoma lepidum เมื่อเทียบกับไข่สีซีดของสายพันธุ์นี้ อย่างไรก็ตาม ความแตกต่างที่มากในอัตราการรอดชีวิตของไข่ที่มีปริมาณแอสตาแซนธินต่ำอาจเกิดจากปัจจัยเฉพาะของฟาร์ม (Craik, 1985) ดังนั้น Craik (1985) แนะนำว่าระดับวิกฤตของแคโรทีนอยด์อยู่ระหว่าง 1 ถึง 3 มก./กก. ซึ่งหากต่ำกว่านี้ อัตราการฟักอาจลดลงได้ เราพบว่าปริมาณแอสตาแซนธินในไข่และอัตราการรอดชีวิตตั้งแต่ระยะฟักจนถึงฟักออกมีความสัมพันธ์กัน โดยมีอัตราการมีตาของไข่และการฟักที่สูงขึ้น และอัตราการตายจนถึงระยะตาที่ลดลงในลูกไก่จากพ่อแม่ที่ได้รับ แอสตาแซนธิน เสริมในอาหาร ความเข้มข้นเฉลี่ยของแอสตาแซนธินในไข่ของกลุ่มควบคุม (2.0 ± 0.4 มก./กก.) อยู่ในช่วงที่ระบุโดย Craik (1985) และอัตราการปฏิสนธิ เปอร์เซ็นต์ของไข่ที่มีตา และอัตราการรอดชีวิตจนฟักออกในกลุ่มนี้ต่ำกว่าในกลุ่มการรักษาที่มีระดับแอสตาแซนธินสูงสุด สรุปได้ว่าการเสริมแอสตาแซนธินในอาหารช่วยเพิ่มความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในไข่ และดูเหมือนว่าจะเป็นปัจจัยที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงคุณภาพของไข่ อัตราการรอดชีวิต และการลดอัตราการตายในระหว่างการพัฒนาตัวอ่อน แม้ว่าความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในอวัยวะสืบพันธุ์เพศผู้จะต่ำ แต่ผลลัพธ์ปัจจุบันบ่งชี้ว่าการเสริมแอสตาแซนธินในอาหารมีผลดีต่อความสามารถในการสืบพันธุ์และสนับสนุนคำแนะนำของ Torrissen และ Christiansen (1995) ในการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารในระดับสูงกว่า 10 มก./กก. เพื่อให้แน่ใจว่าปลาจะมีสุขภาพแข็งแรง
อ้างอิง:
By M. R. Ahmadi1, A. A. Bazyar2,S.Safi3, T. Ytrestøyl4and B. Bjerkeng41Department of Health and Aquatic Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Tehran University, Tehran, Iran;2Department ofFisheries and Environmental Sciences, Faculty of Natural Resources, Tehran University, Karaj, Iran;3Department of ClinicalPathology, Faculty of Veterinary Specialized Sciences, Science and Research Campus, Islamic Azad University, Tehran, Iran;4AKVAFORSK, Institute of Aquaculture Research AS, Sunndalsøra, Norway