การเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารจะช่วยเพิ่มอัตราการรอดชีวิต การเจริญเติบโต และความต้านทานต่อภาวะเครียดออกซิเจนละลายน้ำต่ำในกุ้งกุลาดำญี่ปุ่น
แคโรทีนอยด์ธรรมชาติจาก Haematococcus pluvialis (H) ที่ประกอบด้วย แอสตาแซนธิน และ Spirulina pacifica (S) ที่ปราศจาก แอสตาแซนธิน และ Carophyll Pink (A) แอสตาแซนธิน สังเคราะห์ได้รับการเสริมในอาหารด้วยความเข้มข้นสองระดับที่ 50 (I) และ 100 (II) มก./กก. ทำให้เกิดอาหารที่มีเม็ดสี 7 ชนิด ได้แก่ HI, SI, AI, HII, SII, AII และ HS (H-50 มก./กก. + S-50 มก./กก.) การควบคุมอาหารโดยการไม่เสริมแคโรทีนอยด์ (C) ลูกกุ้งกุลาดำญี่ปุ่นได้รับอาหารที่แตกต่างกันเป็นเวลา 9 สัปดาห์ ผลกระทบของแคโรทีนอยด์ในอาหารต่อการอยู่รอด การเจริญเติบโต และการสร้างเม็ดสี ได้รับการเปรียบเทียบโดยใช้การรักษาแบบรายบุคคลหรือร่วมกัน มีการท้าทายเรื่องออกซิเจนละลายต่ำ 2 สัปดาห์ต่อมา และมีการเปรียบเทียบอัตราการรอดชีวิตของกุ้งและการบริโภคออกซิเจนระหว่างการรักษาต่างๆ ด้วย หลังการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 9 สัปดาห์ กุ้งที่ได้รับอาหารควบคุม (C) มีอัตราการรอดชีวิตต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารที่มีสีอย่างมีนัยสำคัญ ไม่มีความแตกต่างกันในการเพิ่มน้ำหนักของกุ้งทั้งหมด กุ้งที่ได้รับอาหารกลุ่ม C จะมีปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเนื้อ (FA) น้อยกว่าร้อยละ 66.4 และมีปริมาณแอสตาแซนธินในเปลือก (SA) น้อยกว่าร้อยละ 75.5 เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเม็ดสี กุ้งที่ได้รับอาหาร I (AI, HI และ SI) มี FA น้อยกว่า 31.1% และ SA น้อยกว่า 29.6% เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร II (AII, HII, SII และ HS) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบระหว่างหมวดหมู่อื่น ๆ มีการอภิปรายเกี่ยวกับการใช้แหล่งแคโรทีนอยด์ทั้งสามนี้ในการสร้างเม็ดสีในสัตว์จำพวกกุ้ง ควบคู่ไปกับการแปลง การสะสม การย่อยได้ และการดูดซึมของแคโรทีนอยด์ เมื่อได้รับความเครียดจากออกซิเจนละลายน้ำต่ำ กุ้งที่ได้รับอาหาร C จะมีอัตราการบริโภคออกซิเจน (OCR) ที่สูงขึ้น และมีเวลารอดชีวิต (ST) ที่สั้นกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเม็ดสี ไม่พบความแตกต่างใน OCR หรือ ST เมื่อเปรียบเทียบระหว่างหมวดหมู่อื่น
1. บทนำ
แอสตาแซนธิน เป็นแคโรทีนอยด์หลักในพีเนอิด (Ishikawa et al., 1966; Katayama et al., 1971, 1972; Okada et al., 1994) เนื่องจากสัตว์จำพวกกุ้งไม่สามารถสังเคราะห์แคโรทีนอยด์ได้ใหม่ จึงจำเป็นต้องให้ แอสตาแซนธิน หรือสารตั้งต้นที่เหมาะสมไว้ในอาหาร (Meyers และ Latscha, 1997) การเสริมอาหารด้วย แอสตาแซนธิน หรือสารตั้งต้นช่วยปรับปรุงหรือปรับเปลี่ยนสีของกุ้งเพเนอิด (Chien and Jeng, 1992; Liao et al., 1993) โดยเฉพาะอย่างยิ่งกุ้งที่เลี้ยงแบบเข้มข้น เพื่อให้ได้ราคาตลาดที่ดีกว่า (Liao and Chien, 1994)
วัตถุดิบหลายชนิด เช่น ยีสต์ Phaffia rhodozyma สาหร่าย Dunaliella salina และสาหร่ายสีน้ำเงินแกมเขียว Spirulina maxima และแคโรทีนอยด์สังเคราะห์ แคนธาแซนธิน และ แอสตาแซนธิน ถูกนำมาใช้ในการสร้างเม็ดสีในกุ้ง (Yamada et al., 1990; Chien and Jeng, 1992; Mensaveta et al., 1993; NegreSadargues และคณะ 1993; Liao และคณะ 1993; การแปลงเม็ดสีอย่างมีประสิทธิผลจากแหล่งข้างต้นอาจเกิดจากชนิด องค์ประกอบ และความเข้มข้นของเม็ดสีที่บรรจุอยู่ (Yamada et al., 1990; Howell and Matthews, 1991; Chien and Jeng, 1992; Menszveta et al., 1993; Petit et al., 1997) การย่อยได้ของวัตถุดิบ (Chien and Jeng, 1992) และอาจเป็นไปได้ว่ามีโคแฟกเตอร์อยู่ในวัตถุดิบที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการดูดซับและการสะสม (Shahidi et al., 1998) สาหร่ายน้ำจืดเซลล์เดียวสีเขียว Haematococcus pluvialis ซึ่งเป็นผู้ผลิตแอสตาแซนธินที่มีศักยภาพ (Czygan, 1968; Borowitzka et al., 1991; Boussiba และ Vonshak, 1991; Grung et al., 1992) ได้แสดงให้เห็นว่าช่วยเพิ่มการสร้างเม็ดสีของเรนโบว์เทราต์ได้ (Sommer et al., 1991; 1992; Choubert and Heinrich, 1993) ปลาทอง (Gomes et al., 2002) และปลาสวยงาม (Gouveia et al., 2003) แต่ไม่เคยถูกนำมาใช้กับสัตว์จำพวกกุ้งเพื่อสร้างเม็ดสี
นอกเหนือจากคุณสมบัติในการสร้างเม็ดสีของแคโรทีนอยด์แล้ว ยังมีการให้ความสนใจเพิ่มมากขึ้นในการพิจารณาหน้าที่ทางชีวภาพของแอสตาแซนธินในสัตว์น้ำ (Meyers และ Latscha, 1997) มีรายงานการเพิ่มประสิทธิภาพอัตราการรอดชีวิตของกุ้งกุลาดำ (Marsupenaeus japonicus) และกุ้งกุลาดำ (Penaeus monodon) โดยการเสริมแอสตาแซนธินในอาหาร การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่ามันช่วยเพิ่มความต้านทานต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจน (Chien et al., 1999) ความเครียดจากความเค็ม (Darachai et al., 1998; Mercchie et al., 1998; Chien et al., 2003) และความเครียดจากความร้อน (Chien et al., 2003) ภาษาไทย: (Pan et al., 2003), ความเครียดจากแอมโมเนีย (Pan et al., 2003a) และความเครียดทางพยาธิวิทยา (Pan et al., 2003b) ในตัวอ่อนระยะหลังของเพเนอิดมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของแอสตาแซนธินในอาหารและร่างกาย
ดังนั้น การศึกษานี้จึงได้รับการออกแบบมาเพื่อเปรียบเทียบแหล่งเม็ดสีที่แตกต่างกันอย่างเป็นระบบ (เม็ดสีธรรมชาติ [H. pluvialis และ Spirulina pacifica] เทียบกับเม็ดสีสังเคราะห์ [Carophyll Pink, Roche]; แอสตาแซนธิน [H. pluvialis และ Carophyll Pink] เทียบกับเม็ดสีที่ปราศจากแอสตาแซนธิน [(S. pacifica)] และอาหาร เกี่ยวกับผลกระทบที่มีต่อแอสตาแซนธินในร่างกาย การอยู่รอด และการเจริญเติบโตของกุ้งกุลาดำญี่ปุ่น นอกจากนี้ ยังมีการประเมินผลกระทบต่อระยะเวลาการอยู่รอดและอัตราการบริโภคออกซิเจนในการทดลองภายใต้แรงตึงของออกซิเจนต่ำอีกด้วย
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. การรับประทานอาหารแบบทดลอง
อาหารทดลองเจ็ดรายการได้รับการกำหนดสูตรและเสริมด้วยแคโรทีนอยด์จากสามแหล่ง ได้แก่ สาหร่าย H. pluvialis (H) และ S. pacifica (S) และแอสตาแซนธินสังเคราะห์ Carophyll Pink (A); แต่ละชนิดมีความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ในอาหารสองระดับ ได้แก่ 50 (I) และ 100 (II) มก./กก. (ตารางที่ 1) การควบคุมอาหารโดยการไม่เสริมแคโรทีนอยด์ (C) ยกเว้นความแตกต่างในแหล่งที่มาและความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ ส่วนประกอบอื่น ๆ ของอาหารทั้งแปดชนิดก็คล้ายคลึงกัน (ตารางที่ 1) ในบรรดาองค์ประกอบที่คล้ายคลึงกันที่ได้นั้น ปริมาณไขมันที่สูงกว่าในอาหาร HI, HII และ HS เป็นผลมาจากปริมาณไขมันที่สูงใน H. pluvialis ที่ 20%
2.2. การทดลองเลี้ยงกุ้งและการสร้างสี
เลี้ยงกุ้งกุลาดำญี่ปุ่น (M. japonicus) อายุ 6 วันในถังขนาด 20 ตันเป็นเวลา 2 เดือนจนกระทั่งมีน้ำหนักเฉลี่ย 0.4 กรัม จากนั้นปล่อยลงในถังกลางแจ้งจำนวน 24 ถัง โดยมีความหนาแน่นถังละ 40 ตัว ถังเป็นพลาสติกสีดำทรงกลม (200 ลิตร ลึก 65 ซม. สูง 65 ซม.) เพื่อกำจัดสิ่งรบกวนที่อาจเกิดขึ้นจากการที่กุ้งกินเม็ดสีที่มีอยู่ในสาหร่าย ไม่เพียงแต่ต้องกรองน้ำที่ใช้ผ่านตัวกรองขนาด 1 แอมแปร์และฆ่าเชื้อด้วยแสงอัลตราไวโอเลตเพื่อกำจัดสาหร่ายแพลงก์ตอนส่วนใหญ่ แต่ยังปิดถังด้วยพลาสติกสีดำเพื่อป้องกันการเจริญเติบโตของสาหร่ายอีกด้วย พื้นตู้ถูกปกคลุมด้วยชั้นทรายชายหาดหนา 3 ซม. เพื่อรองรับพฤติกรรมการขุดรูของกุ้งคุรุมะ ในช่วง 2 สัปดาห์แรกของการเพาะเลี้ยง กุ้งทั้งหมดได้รับอาหารควบคุมเพื่อรักษาเม็ดสีของร่างกายให้คงที่ เก็บตัวอย่างกุ้งแบบสุ่มสามตัวจากแต่ละถังเพื่อตรวจสอบน้ำหนักเริ่มต้นและวิเคราะห์แอสตาแซนธินในร่างกาย ความเข้มข้นเริ่มต้นเฉลี่ยของแอสตาแซนธินตามน้ำหนักแห้งคือ 161±32 มก./กก. และ 257±48 มก./กก. สำหรับเนื้อและเปลือก ตามลำดับ จากนั้นเป็นเวลาเก้าสัปดาห์ อาหารทดลองจะถูกป้อนให้กับถังสามถังที่ได้รับการสุ่มให้รับการบำบัดแต่ละประเภท ให้อาหารกุ้งด้วยอัตราชีวมวล 5% ในแต่ละถัง/วัน แบ่งเป็น 2 มื้อ เวลา 09.00 น. และ 18.00 น. ชีวมวลประเมินจากข้อมูลการเก็บกุ้งทั้งหมดเป็นรายสัปดาห์และบันทึกการตายรายวัน มีการเติมอากาศให้ตลอดเวลา เศษซากที่ก้นถัง รวมทั้งเศษอาหารที่ไม่ได้กิน จะถูกดูดออกทุกวัน และเปลี่ยนน้ำประมาณหนึ่งในสามทุกวัน เพื่อรักษาคุณภาพน้ำและตะกอนให้เหมาะสม สภาวะน้ำในการทดลอง ได้แก่ อุณหภูมิ 19–25 องศาเซลเซียส ความเค็ม 32–33 ‰ องศาเซลเซียส ค่า pH 8.2–8.3 และปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำ (DO) 5–7 ม./ลิตร ความเค็มวัดด้วยเครื่องวัดค่าหักเหแบบพกพา (S/mill-E, ATAGO, ญี่ปุ่น) ค่า pH วัดด้วยเครื่องวัด pH (S30, MTANA, Schwerzenbach, สวิตเซอร์แลนด์) และค่า DO วัดด้วยเครื่องวัด DO (YSI รุ่น 59, Yellow Spring, โอไฮโอ สหรัฐอเมริกา) เมื่อสิ้นสุดช่วงการเพาะเลี้ยง 9 สัปดาห์ กุ้ง 2 ตัวจะถูกสุ่มตัวอย่างจากแต่ละถัง และแช่แข็งในตู้เย็น 70°C ทันที เพื่อวิเคราะห์แอสตาแซนธินในร่างกาย
2.3. การทดลองความเครียดของออกซิเจนละลายต่ำ
การทดลองนี้ดำเนินการเพื่อศึกษาว่าความแตกต่างของปริมาณแอสตาแซนธินในร่างกายที่ได้รับอาหารเสริมจะส่งผลต่อระยะเวลาการอยู่รอดและอัตราการบริโภคออกซิเจน (ออกซิเจนที่บริโภคต่อน้ำหนักตัวหนึ่งหน่วยต่อหน่วยเวลา) ของกุ้งภายใต้สภาวะที่มีออกซิเจนละลายน้ำ (DO) ต่ำหรือไม่ เมื่อการทดลองเบื้องต้นเสร็จสิ้น กุ้งจะได้รับอาหารทดลองและอาหารควบคุมเป็นเวลาอีก 2 สัปดาห์ กุ้งสี่ตัวถูกสุ่มเก็บตัวอย่างจากแต่ละถัง สองในจำนวนนี้ถูกแช่แข็งทันทีเพื่อวิเคราะห์แอสตาแซนธินในร่างกาย ส่วนที่เหลืออีกสองอันใช้ในการทดสอบแรงดัน DO ต่ำ กุ้งแต่ละตัวจะปรับตัวในน้ำทะเลที่มีออกซิเจนอิ่มตัว (อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ความเค็ม 32 ‰, pH 8.3 ปริมาณออกซิเจน 4.8 มิลลิกรัมต่อลิตร แอมโมเนีย-ไนโตรเจนรวม 0.04 มิลลิลิตรต่อลิตร) เป็นเวลาขั้นต่ำ 4 ชั่วโมงในถังขนาด 4 ลิตร ขวดขนาด 300 มล. ที่บรรจุน้ำทะเลที่มีคุณภาพใกล้เคียงกันถูกกำจัดออกซิเจนด้วยก๊าซไนโตรเจนที่มีฟองอากาศจนกระทั่ง DO น้อยกว่า 0.5 มก./ล.
จากนั้นใส่กุ้งลงในขวดและปิดฝาให้แน่น กุ้งจะถือว่าตายเมื่อเหงือกไม่มีการเคลื่อนไหว บันทึกระยะเวลาการมีชีวิตรอด DO ในแต่ละขวดจะถูกกำหนดเมื่อกุ้งถูกใส่ลงในขวดและเมื่อกุ้งตาย การหายใจพื้นหลังไม่ได้รับการวัดและถือว่าไม่สำคัญเมื่อเทียบกับการหายใจของกุ้ง เนื่องจากน้ำทะเลที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการกรองผ่านตะแกรงขนาด 1 ไมโครเมตรและผ่านการฆ่าเชื้อด้วยแสง UV.
2.4. การวิเคราะห์แคโรทีนอยด์และแอสตาแซนธิน
วิเคราะห์ปริมาณแคโรทีนอยด์ของสาหร่าย H. pluvialis และ S. pacifica ตัวอย่างถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในเครื่องปั่น Waring เป็นเวลา 5 นาทีภายใต้ไนโตรเจนในที่มืด และสกัดด้วยอะซิโตนจนกระทั่งได้เม็ดสีเพิ่มเติม สารสกัดถูกกรองสูญญากาศผ่านกระดาษกรอง (5C, Toyo Roshi, Tokyo) จากนั้นเติม n-hexane ลงไป และถ่ายโอนเม็ดสีไปยังเอพิเฟสโดยการเติมน้ำกลั่นลงไป เอพิเฟสจะถูกชะล้างหลายครั้งเพื่อกำจัดอะซิโตน น้ำถูกกำจัดออกโดยการเติม Na2SO4 5–10 กรัมต่อ 100 มิลลิลิตร (Simpson et al., 1985; Chien และ Jeng, 1992) บันทึกปริมาตรของสารละลายและวัดความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์ด้วยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริกที่ค่าการดูดกลืนแสง 470 นาโนเมตร [E(1%, 1 ซม.)=2115] (Simpson et al., 1985)
ตัวอย่างกุ้งถูกชั่งน้ำหนักและผ่าออกเป็นเปลือก (รวมทั้งกระดอง กุ้งเทลสัน และกุ้งยูโรพอด) และเนื้อ (รวมทั้งเครื่องใน) ส่วนที่ผ่าออกได้รับการชั่งน้ำหนัก อบแห้งแบบแช่แข็ง และชั่งน้ำหนักอีกครั้งเพื่อตรวจสอบปริมาณความชื้น จากนั้นบดตัวอย่างแห้งด้วยครกและสากแล้วถ่ายโอนไปยังหลอดเหวี่ยงโพลีโพรพีลีนขนาด 50 มล. จากนั้นเติมอะซิโตน 20 มล. (บิวทิลเลเต็ดไฮดรอกซีโทลูอีน 0.05%, BHT) เป็นตัวทำละลาย (Schwartz และ Patroni-Killam, 1985; Barimalaa และ Gordon, 1988) และทำให้ส่วนผสมเป็นเนื้อเดียวกัน (Polytron PT-MR-3000) ที่ 8,000 รอบต่อนาที ใน 1 นาที นำเนื้อหาในแต่ละหลอดไปปั่น (Hitachi 18 PR-52) ภายใต้อุณหภูมิ 4 8C ที่อุณหภูมิ 12,700 ´g เป็นเวลา 15 นาที เม็ดสารเหล่านั้นจะถูกทำให้แขวนลอยอีกครั้งและปั่นด้วยอะซิโตนอีก 20 มล. จนกระทั่งสารสกัดอะซิโตนใส ถ่ายโอนสารสกัดอะซิโตนรวมไปยังกรวยแยกขนาด 250 มล. แบ่งด้วย n-hexane 30 มล. และล้างด้วย NaCl 10% สามครั้งเพื่อกำจัดอะซิโตนส่วนเกินออก ลดปริมาตรของสารสกัดลงเหลือ 10 มล. โดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน (Rotavapor-R114 Waterbath-B480, Buˆchi, Switzerland) จากนั้นกรองผ่านตัวกรอง Millipore 0.2-Am และเก็บไว้ในขวดสีน้ำตาลขนาด 4 มล. จำนวน 3 ขวด แอสตาแซนธินถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) โดยใช้ปั๊ม Hitachi L-6200, คอลัมน์ซิลิกา (คอลัมน์ Lichrosorb Si-60 5 micro ขนาด 2504.6 mm ID, E. Merck Company), ตัวตรวจจับ UV-VIS Hitachi L-4250 ที่ความยาวคลื่น 470 นาโนเมตร และเครื่องรวมโครมาโทกราฟ Hitachi D-2000 เงื่อนไขการใช้งาน ได้แก่ เฟสเคลื่อนที่ อะซิโตน 14% ในเฮกเซน อัตราการไหลของตัวทำละลาย 1.5 มล./นาที ปริมาตรการฉีด 100 µl; และโปรแกรมปั๊ม ลำดับคือ 0–20 นาที ส่วนผสม A (อะซิโตน: n-เฮกเซน 14:86) และ 20.5–40 นาที ส่วนผสม B (100% n-เฮปเทน) – ระบบได้รับการควบคุมโดยระบบข้อมูลโครมาโตกราฟี (Scientific Information Services Corporation) ซึ่งยังรวมพื้นที่ย่อยจุดสูงสุดไว้ด้วย มาตรฐานคือแอสตาแซนธินบริสุทธิ์ทางโครมาโตกราฟี (Hoffman La Roche Ltd., Basel, Switzerland)
2.5. การวิเคราะห์ทางสถิติ
ใช้ One-way ANOVA เพื่อทดสอบความสำคัญของผลการรักษาโดยรวมต่ออัตราการรอดชีวิต การเพิ่มน้ำหนัก และแอสตาแซนธินในร่างกายของกุ้งที่เลี้ยงเป็นเวลา 9 สัปดาห์ รวมไปถึงระยะเวลาการรอดชีวิต อัตราการบริโภคออกซิเจน
และแอสตาแซนธินในร่างกายกุ้งที่ใช้ในการทดลองความเครียด DO ต่ำ การทดสอบช่วงหลายช่วงของ Duncan (DMRT) ดำเนินการสำหรับการเปรียบเทียบแบบเป็นคู่หรือแบบรายบุคคล (แบบหนึ่งต่อหนึ่ง) นอกจาก DMRT แล้ว ยังมีการทำคอนทราสต์แบบตั้งฉาก 7 ครั้งสำหรับการเปรียบเทียบแบบเป็นระบบหรือแบบกลุ่ม (setto-set): (1) ไม่มีการเติมเม็ดสี (C) เทียบกับการเติมเม็ดสี (AI, HI, SI, AII, HII, SII และ HS); (2) การเสริม: 50 มก./กก. (AI, HI, SI) เทียบกับ 100 มก./กก. (AII, HII, SII และ HS)
(3) อาหารเสริม 50 มก./กก.
:เม็ดสีธรรมชาติ (HI และ SI) เทียบกับเม็ดสีสังเคราะห์ (AI) (4) ธรรมชาติ: H.
pluvialis (HI) กับ S. pacifica (SI); (5) อาหารเสริม 100 มก./กก.
:เม็ดสีธรรมชาติ (HII, SII และ HS) เทียบกับเม็ดสีสังเคราะห์ (AII) (6) ธรรมชาติ: สาหร่ายชนิดเดียว (HII และ SII) เทียบกับชนิดผสม (HS) และ (7) Monospecial: H. pluvialis (HII) กับ S. pacifica (SII) การวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นถูกนำมาใช้กับข้อมูลจากการทดลองความดัน DO ต่ำเพื่อระบุความสัมพันธ์ระหว่างเวลาการอยู่รอดหรืออัตราการบริโภคออกซิเจนและปริมาณแอสตาแซนธินในตัวอย่างเปลือกและเนื้อ ซอฟต์แวร์ SAS เวอร์ชัน 6.12 (SAS Institute, Inc., Cary, North Carolina, USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ
3. ผลลัพธ์
3.1. การเอาตัวรอดและการเพิ่มน้ำหนัก
ภายหลังการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 9 สัปดาห์ อัตราการรอดชีวิตของกุ้งที่ได้รับอาหาร C ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (pQ0.05) เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่น (ตารางที่ 2) เมื่อเปรียบเทียบโดยใช้คอนทราสต์มุมฉาก (ตารางที่ 3) อัตราการรอดตายเฉลี่ยของกุ้งที่ได้รับอาหาร C (37%) ต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารทดลองชนิดอื่นอย่างมีนัยสำคัญ (54%) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการเพิ่มน้ำหนักในหมู่กุ้งทั้งหมดเมื่อเปรียบเทียบทีละตัวหรือรวมกัน (ตารางที่ 2 และ 3)
3.2. ปริมาณ แอสตาแซนธิน ในร่างกาย
ภายหลังการเลี้ยงเป็นเวลา 9 สัปดาห์ พบว่าแอสตาแซนธินในเนื้อกุ้งที่ได้รับอาหาร C ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารทดลองชนิดอื่น ยกเว้นกุ้งที่ได้รับอาหาร SI (ตารางที่ 2) ปริมาณแอสตาแซนธินในเนื้อกุ้งที่ได้รับอาหาร SI น้อยกว่าปริมาณแอสตาแซนธินในเนื้อกุ้งที่ได้รับอาหาร HII-, AII- และ HS แต่ไม่แตกต่างจากปริมาณแอสตาแซนธินในเนื้อกุ้งที่ได้รับอาหาร SII เมื่อเปรียบเทียบโดยรวม (ตารางที่ 3) กุ้งที่ได้รับอาหาร C มีปริมาณแอสตาแซนธินในเนื้อน้อยกว่าค่าเฉลี่ยของแอสตาแซนธินในเนื้อกุ้งที่ได้รับอาหารชนิดอื่นถึง 66.4% ปริมาณแอสตาแซนธินในเนื้อเฉลี่ยของกุ้งที่ได้รับอาหารแอสตาแซนธิน 50 มก./กก. (AI, HI และ SI) ลดลง 31.1% เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารแอสตาแซนธิน 100 มก./กก. (AII, HII, SII และ HS) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในคอนทราสต์มุมฉากอื่น ๆ
ปริมาณแอสตาแซนธินในเปลือกกุ้งที่ได้รับอาหารวิตามินซีต่ำกว่าปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเปลือกกุ้งที่ได้รับอาหารทดลองชนิดอื่น กุ้งที่ได้รับอาหาร SI และ HI มี แอสตาแซนธิน เปลือกต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AII และ HS ไม่มีความแตกต่างกันในปริมาณแอสตาแซนธินจากเปลือกระหว่างกุ้งที่ได้รับอาหาร SI-, HI- และ AI เมื่อเปรียบเทียบโดยรวม (ตารางที่ 3) กุ้งที่ได้รับอาหาร C มีปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเปลือกน้อยกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารทดลองอื่นๆ ถึง 75.5% ปริมาณ แอสตาแซนธิน เปลือกโดยเฉลี่ยของกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแอสตาแซนธิน 50 มก./กก. (AI, HI และ SI) ลดลง 29.6% เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม 100 มก./กก. (AII, HII, SII และ HS) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในคอนทราสต์มุมฉากอื่น ๆ
3.3. แรงตึงของออกซิเจนที่ละลายต่ำ
เมื่อได้รับอาหารที่มีออกซิเจนละลายต่ำ กุ้งที่ได้รับอาหาร C จะมีอัตราการบริโภคออกซิเจน (OCR) ที่สูงขึ้น และมีเวลารอดชีวิตที่สั้นกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารทดลองชนิดอื่น (ตารางที่ 4 และ 5) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการเปรียบเทียบรายบุคคลหรือกลุ่มอื่น ๆ
4. การอภิปราย
4.1. ปริมาณ แอสตาแซนธิน ในร่างกาย
การเพิ่มขึ้นของขนาดสัตว์อันเนื่องมาจากการเจริญเติบโตทำให้ความเข้มข้นของแคโรทีนอยด์เจือจางลง เนื่องจากน้ำหนักและพื้นที่ผิวเพิ่มขึ้นเร็วกว่าอัตราการดูดซึมแคโรทีนอยด์ (Meyers และ Latscha, 1997) สังเกตพบผลกระทบจากการเจือจางในระหว่างการพัฒนาจากรังไข่ไปเป็นโปรโตซัว I ของ Penaeus semiculcatus (Dall, 1995) ในระหว่างการพัฒนาตัวอ่อน (Mantiri et al., 1995) และในระยะหลังตัวอ่อนตอนต้น (ระยะที่ IV) (McKay, 1987) ของกุ้งมังกรยุโรป Homarus gamarus เช่นเดียวกับในกุ้งมังกรวัยเยาว์ (Pan et al., 1999) และตัวเต็มวัยของ P. monodon (Mensaveta et al., 1993) โดยถือว่าไม่มีแคโรทีนอยด์อยู่ในอาหารเพื่อการดูดซึม ปัจจัยการเจือจางจะเป็นฟังก์ชันผกผันของอัตราส่วนของน้ำหนักสุดท้ายต่อน้ำหนักเริ่มต้นหรือพื้นที่ผิว ในการศึกษานี้ กุ้งที่ได้รับอาหารที่มีวิตามินซีมีน้ำหนักเพิ่มขึ้น 281% ปัจจัยการเจือจางแคโรทีนอยด์ในร่างกายจะอยู่ที่ 26% (1/(100%+281%)) ซึ่งถือว่าค่อนข้างใกล้เคียงกับอัตราส่วนระหว่าง แอสตาแซนธิน ในเนื้อสัตว์ขั้นสุดท้ายและเนื้อสัตว์เริ่มต้น (34%) หากแคโรทีนอยด์ที่มีอยู่ในอาหารที่มีวิตามินซี (3.2 มก./กก.) ถูกดูดซึมได้อย่างมีประสิทธิภาพ
แม้ว่าจะมีการเสริมแคโรทีนอยด์ในอาหาร แต่การรักษาเม็ดสีเดิมของร่างกายก็ยังทำได้ยาก ใน P. monodon แม้จะได้รับการเสริมด้วย แอสตาแซนธิน 50 มก./กก. (Mensaveta et al., 1993) หรือ 80 มก./กก. (Pan et al., 2001, 2003a) แต่ระดับแอสตาแซนธินในร่างกายกลับลดลง ในการศึกษาครั้งนี้ ตราบใดที่กุ้งได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ 50 หรือ 100 มก./กก. ปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเปลือกสุดท้ายจะเพิ่มขึ้นตั้งแต่ 30% ถึง 137% อย่างไรก็ตาม ปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเนื้อสัตว์ไม่ได้เพิ่มขึ้นในอาหารกุ้งที่เสริมด้วยแคโรทีนอยด์ 50 มก./กก. แต่เพิ่มขึ้น 8–24% ในอาหารกุ้งที่เสริมด้วยแคโรทีนอยด์ 100 มก./กก. ดังนั้น ระดับของแคโรทีนอยด์ในอาหารที่จำเป็นเพื่อรักษา แอสตาแซนธิน ในร่างกายจึงแตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับเนื้อเยื่อเป้าหมาย เมื่อเปรียบเทียบการเพิ่มขึ้นของ แอสตาแซนธิน ในเปลือก (190%) กับในเนื้อสัตว์ (90%) จะเห็นได้ว่าการสะสม แอสตาแซนธิน ในเปลือกมีความไวต่อการเสริมแคโรทีนอยด์ในอาหารมากกว่าในเนื้อสัตว์ คาดว่ากุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน สังเคราะห์ (อาหาร A) จะมีเม็ดสีที่ดีกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารเสริมจากธรรมชาติ (อาหาร H และ S) ในระดับการเสริมแคโรทีนอยด์ทั้งสองระดับ เนื่องจากแหล่งเม็ดสีในอาหาร A สามารถสะสมเม็ดสีได้ในปริมาณที่สูงขึ้นได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าอาหาร H และ S
Carophyll Pink ในอาหาร A ซึ่งส่วนใหญ่ประกอบด้วยแอสตาแซนธินอิสระ สามารถสะสมโดยตรงในเนื้อเยื่อของกุ้งคุรุมะ (Yamada et al., 1990) อย่างไรก็ตาม ใน Hdiet นั้น H. pluvialis มีแคโรทีนอยด์ที่ซับซ้อนนอกเหนือไปจาก แอสตาแซนธิน ที่ผ่านการเอสเทอร์ ได้แก่ แคนทาแซนธิน เอช-แคโรทีน ลูทีน และเอคิเนโนน (Czygan, 1968; Choubert และ Heinrich, 1993) แคโรทีนอยด์เหล่านี้จำเป็นต้องผ่านกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพหลายครั้งเพื่อเป็น แอสตาแซนธิน (Simpson, 1982) ก่อนที่จะถูกสะสมไว้ในเนื้อเยื่อกุ้ง ในอาหารประเภท S นั้น S. pacifica จะประกอบด้วยซีแซนทีนและเอช-แคโรทีนเป็นหลัก (Soejima et al., 1980; Liao et al., 1993) ซึ่งต้องมีการแปลงทางชีวสังเคราะห์ก่อนการสะสมด้วย การแปลงเป็นเม็ดสีแคโรทีนอยด์ตัวกลางในสาหร่ายจะช้ากว่าการสะสมโดยตรงของแอสตาแซนธินสังเคราะห์ พบว่าแอสตาแซนธินที่ไม่ได้รับเอสเทอร์เป็นเม็ดสีที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการเพิ่มเม็ดสีในกุ้งเพเนอิด (Chien and Jeng, 1992; Negre-Sadargues et al., 1993; Mensaveta et al., 1993) ชาฮิดี และคณะ (พ.ศ. 2541) สรุปได้ว่าการสร้างเม็ดสีของสัตว์จำพวกกุ้งสามารถทำได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น เมื่อมีการจัดหาสารตัวกลางทางชีวสังเคราะห์ของสารที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกับรูปแบบการสะสมของเม็ดสีในอาหารของสัตว์จำพวกกุ้ง
พบว่าแอสตาแซนธินที่ผ่านการเอสเทอร์ไรเซชันจะถูกสะสมในปลาแซลมอนอย่างมีประสิทธิภาพน้อยกว่า แอสตาแซนธิน ที่ผ่านการเอสเทอร์ไรเซชัน (Storebakken et al., 1987) Choubert และ Heinrich (1993) ระบุว่าการแตกตัวของเอสเทอร์แอสตาแซนธินอาจเป็นขั้นตอนที่จำกัดสำหรับการสร้างเม็ดสี ส่งผลให้การกักเก็บแคโรทีนอยด์ในปลาเทราต์สายรุ้งโดย H. pluvialis ต่ำกว่า แอสตาแซนธิน สังเคราะห์ (Sommer et al., 1991) นอกจากนี้ ผนังเซลล์ที่หนาของสาหร่ายอาจขัดขวางการย่อยอาหารและขัดขวางการดูดซึมเม็ดสีโดยปลาได้ (Johnson และ An, 1991) การสร้างเม็ดสีของปลาเทราต์สายรุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเซลล์ที่ถูกทำลาย (ผนังเซลล์แตกร้าว) ของ H. pluvialis ดีกว่าการสร้างเม็ดสีของปลาเทราต์สายรุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเซลล์ที่สมบูรณ์จาก H. pluvialis (Sommer et al., 1991)
ผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้เมื่อยีสต์ Phaffia rhodozyma ที่ถูกรบกวนและไม่รบกวนถูกป้อนให้กับปลาแซลมอนแอตแลนติก (Tangeraas et al., 1989) Gouveia และคณะ (2003) รายงานว่าประสิทธิภาพการย้อมสีของปลาสวยงาม Cyprinus carpio และ Carassius auratus ด้วย Chlorella vulgaris (ที่มีผนังเซลล์บาง) ดีกว่า H. pluvialis (ที่มีผนังซีสต์หนา) เนื่องมาจากปลาสวยงามมีการย่อยได้สูง อย่างไรก็ตามผลการศึกษาในครั้งนี้กลับไม่เป็นไปตามที่คาดหวัง ไม่พบความแตกต่างในเปลือกและเนื้อแอสตาแซนธินในกุ้งที่ได้รับอาหาร A, H และ S
อาจเป็นเพราะมีเวลาเพียงพอในการแปลงแคโรทีนอยด์ที่ไม่ใช่ปลายใน H. pluvialis และ S. pacifica ให้เป็นแคโรทีนอยด์ปลายหรือแคโรทีนอยด์สะสม ในสัตว์จำพวกกุ้ง แคโรทีนอยด์ที่เก็บสะสมได้ ได้แก่ แอสตาแซนธินอิสระ แอสตาแซนธินเอสเทอร์ไรซ์ และแคโรทีโนโปรตีน (Castillo et al., 1982; Meyers and Latscha, 1997) ตัวอย่างเช่น ซีแซนทีน ซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์หลักชนิดหนึ่งในสาหร่ายสไปรูลิน่า สามารถแปลงเป็นแอสตาแซนธินได้อย่างรวดเร็วผ่าน 4-คีโตซีแซนทีนใน P. monodon (Liao et al., 1993) แม้ว่าประสิทธิภาพของการสร้างเม็ดสีในสัตว์จำพวกกุ้งจะเกี่ยวข้องเป็นอย่างมากกับความใกล้ชิดของแคโรทีนอยด์ในอาหารกับแอสตาแซนธินในเส้นทางเมตาบอลิซึมเพื่อการสังเคราะห์ แต่ไม่เคยมีการกำหนดหรือบันทึกเวลาที่จำเป็นสำหรับการแปลงแต่ละขั้นตอน
ประการที่สอง แอสตาแซนธิน ที่ผ่านการเอสเทอร์ไรซ์สามารถสะสมในเนื้อเยื่อครัสเตเชียนได้อย่างมีประสิทธิภาพเท่ากับ แอสตาแซนธิน ที่ไม่ผ่านการเอสเทอร์ไรซ์ สิ่งนี้ได้รับการพิสูจน์จากความโดดเด่นของ แอสตาแซนธิน เอสเทอร์ในเนื้อเยื่อหนังกำพร้า เช่นเดียวกับแคโรทีโนโปรตีนที่ซับซ้อนและแคโรทีโนโอลิโปโปรตีนในโครงกระดูกภายนอก (Milicua et al., 1990; Meyers and Latscha, 1997)
ประการที่สาม การย่อยได้ของผนังเซลล์ของสาหร่ายอาจไม่ส่งผลเสียที่มีนัยสำคัญต่อสัตว์จำพวกกุ้ง เช่น ปลาแซลมอน (Sommer et al., 1991, 1992; Choubert and Heinrich, 1993) ปลาทอง (Gouveia et al., 2002; Gomes et al., 2002) และปลาสวยงาม (Gouveia et al., 2003) สาหร่ายเป็นส่วนหนึ่งของอาหารตามธรรมชาติของสัตว์จำพวกกุ้งและเป็นแหล่งโภชนาการหลักในระยะตัวอ่อน (Smith et al., 1993) ในที่สุด ปริมาณกรดไขมันไม่อิ่มตัวสูงของ H. pluvialis และ S. pacifica อาจเอื้อต่อการดูดซึมแคโรทีนอยด์ แคโรทีนอยด์เป็นเม็ดสีที่ละลายในไขมัน (Fox และ Vevers, 1960) ดังนั้นการดูดซึมและการเผาผลาญจึงอาจเกี่ยวข้องกับไขมันด้วย จากการสังเกตพบว่าการสังเคราะห์หรือการสะสมแคโรทีนอยด์อาจได้รับผลกระทบในเชิงลบจากโภชนาการของไขมันที่ไม่ดี (Meyers และ Latscha, 1997) ในสัตว์จำพวกกุ้ง แคโรทีนอยด์ที่ไม่ถูกเอสเทอร์หรือถูกเอสเทอร์สามารถสะสมเป็นสารกระจายตัวของไขมันในเม็ดสี (Fingerman, 1965) ซึ่งเกี่ยวข้องกับไคตินในกระดอง (Ghidalia, 1985) การศึกษาวิจัยแสดงให้เห็นว่ากรดไอโคซาเพนทาอีโนอิก (EPA) และกรดโดโคซาเฮกซาอีโนอิก (DHA) เป็นกรดไขมันหลักที่เอสเทอร์ไรซ์กับกลุ่ม แอสตาแซนธิน ที่จับกับไคตินในเปลือกกุ้ง (Meyers และ Latscha, 1997) ปัจจัยทั้งหมดที่กล่าวมาข้างต้นอาจทำให้เกิดความซับซ้อนและความแตกต่างในเม็ดสี และทำให้ความแตกต่างของเปลือกและเนื้อ แอสตาแซนธิน ในกุ้งที่ได้รับอาหาร A, H และ S ไม่มีนัยสำคัญ
4.2. การเอาตัวรอดและการเพิ่มน้ำหนัก
อัตราการรอดชีวิตที่ต่ำกว่าของกุ้งที่ได้รับอาหาร C เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเม็ดสี แสดงให้เห็นว่าแคโรทีนอยด์ 3.2 มก./กก. 1 อาหารไม่เพียงพอที่จะรักษาอัตราการรอดชีวิตของกุ้งได้ อัตราการรอดชีวิตที่คล้ายคลึงกันระหว่างกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีเม็ดสีในความเข้มข้นต่างกัน แสดงให้เห็นว่าการเสริมแคโรทีนอยด์ 100 มก./กก. ไม่มีประโยชน์เพิ่มเติมต่อการอยู่รอดของกุ้งเมื่อเทียบกับ 50 มก./กก.
ยามาดะและคณะ (1990) รายงานอีกว่า M. japonicus ที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน (50~400 มก./กก.) มีอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่ากลุ่มที่ได้รับอาหารควบคุม Chien และ Jeng (1992) พบความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างอัตราการรอดชีวิตและความเข้มข้นของเม็ดสีที่เหมาะสมในเนื้อเยื่อกุ้ง และแนะนำว่าเม็ดสีอาจมีบทบาทในการปรับปรุงอัตราการรอดชีวิตของกุ้ง Borderner และคณะ (1986) ในทางกลับกันแสดงให้เห็นว่าไม่ว่าจะมีความเข้มข้นเท่าใด ตราบใดที่มีการเสริมแคโรทีนอยด์ในอาหาร การอยู่รอดของสัตว์จำพวกกุ้งก็จะไม่ได้รับผลกระทบ โดยทั่วไปแล้วไม่พบผลเชิงบวกใดๆ ต่อการเจริญเติบโตของกุ้งเพเนอิดที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์ (Yamada et al., 1990; Chien and Jeng, 1992; Negre-Sadargues et al., 1993; Liao et al., 1993; Mensaveta et al., 1993; Pan et al., 2001) ผลการศึกษานี้ได้รับเหมือนกัน ในการศึกษาของ Thongrod และคณะ อย่างไรก็ตาม (1995) พบว่ามีการเจริญเติบโตที่เพิ่มขึ้นใน P. monodon ที่ให้อาหารในระดับที่เพิ่มขึ้น (5~300 มก./กก.) เป็นเวลา 30 วัน Petit et al. (1997) ยังพบว่า แอสตาแซนธิน ในอาหารช่วยเพิ่มอัตราการเจริญเติบโตและลดวงจรการลอกคราบของตัวอ่อนหลังการเจริญของ M. japonicus ในระยะเวลาการเพาะเลี้ยง 20 วัน
4.3. ความเครียดจาก DO ต่ำ
กุ้งที่ได้รับอาหารที่มีวิตามินซีไม่เพียงแต่ทนต่อความเครียดที่มี DO ต่ำได้น้อยกว่าเท่านั้น แต่ยังบริโภคออกซิเจนได้มากกว่าภายใต้เงื่อนไขของเราเมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแคโรทีนอยด์อีกด้วย Chien et al. รายงานผลลัพธ์ที่คล้ายกัน (1999) ในกุ้งมังกร P. วัยอ่อนที่ได้รับอาหารที่ไม่ได้เสริมแอสตาแซนธินเมื่อเปรียบเทียบกับปลาที่ได้รับ แอสตาแซนธิน 360 มก./กก. 1 ตัวเป็นเวลา 1 สัปดาห์ มีความเป็นไปได้ที่แคโรทีนอยด์ที่มีออกซิเจน เช่น แอสตาแซนธิน และลูทีน (Soin, 1954; Czeczuga, 1979) ซึ่งออกซิเจนจะถูกจับอยู่ที่ศูนย์กลางของห่วงโซ่ไฮโดรคาร์บอน (Karnaukhov, 1979) อาจทำหน้าที่เป็นแหล่งสำรองออกซิเจนภายในเซลล์สำหรับการหายใจในร่างกาย ความเครียดจากออกซิเจนในไข่ปลาแซลมอนได้รับการยอมรับ (Craik, 1985)
แหล่งสำรองออกซิเจนภายในเซลล์ดังกล่าว (Ghidalia, 1985; Latscha, 1990; Oshima et al., 1993) หรือตัวรับอิเล็กตรอนที่เทียบเท่า (Ghidalia, 1985) อาจช่วยให้สัตว์จำพวกกุ้งสามารถรอดชีวิตจากสภาวะไร้ออกซิเจนที่พบได้ทั่วไปในสภาพแวดล้อมการเพาะเลี้ยงในบ่อน้ำได้เช่นกัน (Chien and Jeng, 1992) ปริมาณ แอสตาแซนธิน ที่สูงในกุ้งคุรุมะ ประมาณร้อยละ 90 ของเม็ดสีทั้งหมด (Ishikawa et al., 1966) อาจมีส่วนช่วยให้กุ้งทนต่อ DO ต่ำและความต้องการออกซิเจนที่ต่ำได้ สิ่งนี้ได้รับการพิสูจน์จากข้อเท็จจริงที่ว่ากุ้งคุรุมะเป็นกุ้งเพเนอิดชนิดหนึ่งในไม่กี่สายพันธุ์ที่สามารถเคลื่อนย้ายได้โดยมีชีวิตโดยไม่ต้องใช้น้ำ และจากข้อเท็จจริงที่ว่าในระหว่างวันกุ้งจะขุดรูลงในตะกอนที่มักจะมีภาวะขาดออกซิเจน (Bailey-Brock และ Moss, 1992)
นอกเหนือจากการทำหน้าที่ในการขนส่งแคลเซียมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และทำหน้าที่เป็นแหล่งกักเก็บออกซิเจนในห่วงโซ่การหายใจของเซลล์ประสาทแล้ว แคโรทีนอยด์ยังช่วยปกป้องเนื้อเยื่อที่อ่อนไหวและสารที่มีปฏิกิริยาต่อปฏิกิริยาจากความเสียหายจากออกซิเดชันอีกด้วย (Oshima et al., 1993) มีรายงานหลายฉบับที่แสดงให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน ทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพสำหรับกุ้งต่อความเครียดทางกายภาพ (Darachai et al., 1998; Mercie et al., 1998; Chien et al., 2003) ความเครียดทางเคมี (Pan et al., 2003a) และความเครียดทางพยาธิวิทยา (Merchie et al., 1998; Pan et al., 2003b)
Yew-Hu Chien, Wen-Chung Shiau