แอสตาแซนธิน ปกป้องตับอ่อนจากความเครียดออกซิเดชันในกุ้งขาว
การศึกษาปัจจุบันตรวจสอบผลของ แอสตาแซนธิน (AX) ในอาหารต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต พารามิเตอร์สารต้านอนุมูลอิสระ และการฟื้นตัวของความเสียหายต่อตับและตับอ่อนในกุ้งขาวแปซิฟิก (Litopenaeus vannamei) เพื่อประเมินหน้าที่การป้องกันตับและตับอ่อนของ แอสตาแซนธิน ในกุ้ง เราได้เปรียบเทียบประสิทธิภาพของอาหาร 5 ชนิดภายใต้สภาวะน้ำมันปลาออกซิไดซ์ที่มี แอสตาแซนธิน ในระดับต่างกันในช่วงระยะเวลาทดลอง 50 วัน อาหารได้รับการกำหนดสูตรดังนี้: (i) OFO (น้ำมันปลาออกซิไดซ์); (ii) OFO/AX150 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX150 มก./กก.); (iii) OFO/AX250 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX250 มก./กก.); (iv) OFO/AX450 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX450 มก./กก.); และ (v) กลุ่มควบคุม (น้ำมันปลาสด) ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าน้ำมันปลาออกซิไดซ์ที่มีค่าเปอร์ออกไซด์ (POV) 275.2 meq/kg ทำให้สามารถลดน้ำหนักตัวสุดท้ายของกุ้งขาวได้อย่างมีนัยสำคัญ (P > 0.05) และทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่เห็นได้ชัดในตับอ่อน ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO/AX450 เมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO (p < 0.05) อย่างไรก็ตามไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบอาหาร OFO/AX450 กับอาหารควบคุมที่มีน้ำมันปลาสด ( p > 0.05) นอกจากนี้ กุ้งที่ได้รับอาหาร OFO/AX450 แสดงให้เห็นถึงการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในสุขภาพของตับและตับอ่อน และการลดลงของมาโลนไดอัลดีไฮด์ (MDA) เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO (p < 0.05) แอสตาแซนธิน จากอาหารช่วยเพิ่มศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระของ L. vannamei โดยเพิ่มกิจกรรมของคาตาเลส (CAT) ในน้ำเหลือง การทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลันแสดงให้เห็นว่าอัตราการรอดชีวิตของกุ้งในอาหาร OFO/AX450 สูงกว่าในอาหาร OFO ( p <0.05) ซึ่งชี้ให้เห็นว่า AX อาจมีส่วนช่วยในการเพิ่มความทนทานต่อความเครียด จากการสรุป ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่า AX ออกฤทธิ์ปกป้องต่อความเสียหายจากออกซิเดชันที่เกิดจากน้ำมันปลาที่ถูกออกซิไดซ์ในกุ้งตามขนาดยา
1. บทนำ
แอสตาแซนธิน ซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์ทางทะเล (AX) พบได้ตามธรรมชาติในสิ่งมีชีวิตในน้ำหลายชนิด เช่น สาหร่ายขนาดเล็ก สัตว์จำพวกกุ้ง (ปู กุ้งก้ามกราม และกุ้ง) และปลา (ปลาแซลมอน) [ 1 , 2 ] AX มีโครงสร้างโพลีอันเซอตูเอตแบบไม่ชอบน้ำที่ปลายทั้งสองด้านของโครงสร้างโอเลฟินคอนจูเกต ซึ่งช่วยให้สามารถระบุตำแหน่งได้อย่างแม่นยำในเยื่อหุ้มเซลล์และไลโปโปรตีนที่หมุนเวียน ในความเป็นจริง AX แสดงให้เห็นการทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งในฐานะตัวกำจัดอนุมูลอิสระออกซิเจนที่มีประสิทธิภาพในการลดความเครียดออกซิเดชันและการเกิดออกซิเดชันของไขมัน [ 3 ] แอสตาแซนธินเป็นที่รู้จักกันดีว่าเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพซึ่งมีรายงานว่าแซงหน้าเบตาแคโรทีนหรือลูทีนและแม้แต่อัลฟาโทโคฟีรอล [ 4 ] ในสัตว์จำพวกกุ้ง มีงานวิจัยหลายชิ้นที่แสดงให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน ในอาหารสามารถเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด (TOC), เพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโต [ 5 , 6 , 7 ], เพิ่มอัตราการรอดชีวิต [ 8 ] และเพิ่มความต้านทานต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมต่างๆ รวมถึงความเครียดจากความเค็ม [ 9 ], ความเครียดจากการขาดออกซิเจน [ 10 ] และความเครียดจากอุณหภูมิสูง [ 11 ] ดังนั้น แอสตาแซนธินในอาหาร ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระชั้นยอด สามารถนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโต และเพิ่มความทนทานต่อความเครียดของสิ่งมีชีวิตในทะเลได้
การเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันคือการสลายด้วยออกซิเดชันของกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อน (PUFAs) โดยผ่านปฏิกิริยาลูกโซ่ของอนุมูลอิสระ ลิพิดเปอร์ออกไซด์สามารถทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ของสิ่งมีชีวิตที่อุดมไปด้วยไขมันได้ [ 12 ] น้ำมันปลาซึ่งอุดมไปด้วย PUFA เป็นสิ่งจำเป็นในการรักษาความลื่นไหลของเยื่อหุ้มเซลล์ของสัตว์น้ำ อย่างไรก็ตาม PUFAs มีความอ่อนไหวต่อการเกิดเปอร์ออกซิเดชันสูงจนก่อให้เกิดลิพิดไฮโดรเปอร์ออกไซด์ซึ่งเป็นพิษ ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ออกซิเดชันหลัก โดยผ่านกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับอนุมูลอิสระ ไฮโดรเปอร์ออกไซด์ไขมันที่ไม่เสถียรสามารถสลายตัวไปเป็นกรดไขมันอัลคอกซีได้ง่าย [ 13 ] หรือสลายตัวเพื่อปลดปล่อยผลิตภัณฑ์ออกซิเดชันรองที่หลากหลาย เช่น อัลดีไฮด์ คีโตน แอลกอฮอล์ และกรดคาร์บอกซิลิก [ 14 ] ผลพลอยได้จากออกซิเดชันเหล่านี้เป็นแหล่งที่มาหลักของรสชาติและกลิ่นที่ไม่พึงประสงค์ในการย่อยสลายของสิ่งมีชีวิตในทะเล เนื่องมาจากการทำลายของไบโอฟิล์มของเซลล์และการเสื่อมโทรมของสุขภาพสัตว์ [ 15 , 16 ] การศึกษาครั้งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการใช้สารน้ำมันออกซิไดซ์ในอาหารปลาสามารถชะลอการเจริญเติบโตหรือการอยู่รอดได้โดยการควบคุมความเข้มข้นของฮีโมโกลบินและกิจกรรมไกลโคไลซิส การเกิดออกซิเดชันของไขมัน [17, 18, 19, 20] และการสะสมอัลฟา-โทโคฟีรอล [21] ในทางตรงกันข้าม ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับผลกระทบของออกซิเดชันของไขมันต่อสัตว์จำพวกกุ้งยังคงจำกัดอยู่ โคชิโอะและคณะ (1994) รายงานว่าน้ำมันที่ถูกออกซิไดซ์อาจทำให้การเจริญเติบโตลดลง ขนาดโพสต์ลาร์ลดลง และสุขภาพไม่ดีใน Penaeus japonicas [ 22 ] เลาหะบรรจง และคณะ (2009) แสดงให้เห็นว่าการเกิดออกซิเดชันของไขมันในปลาป่นสามารถนำไปสู่ความผิดปกติของการแทรกซึมของเม็ดเลือดแดง การฝ่อของเยื่อบุผิวหลอด และการก่อตัวของปุ่มเนื้อในกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon [ 23 ] หวางและคณะ (2015) พบว่าการออกซิไดซ์น้ำมันในระดับปานกลางและสูงสามารถลดอัตราการรอดชีวิตและประสิทธิภาพการกินอาหารของปูจีน Eriocheir sinensis ได้ [ 24 ] แม้ว่าน้ำมันปลาที่ถูกออกซิไดซ์จะมีผลเสียต่อสัตว์จำพวกกุ้ง แต่มีเพียงไม่กี่การศึกษาที่ศึกษาวิธีลดผลกระทบเชิงลบของการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันผ่านการจัดการอาหาร
กุ้งขาวแปซิฟิก (Litopenaeus vannamei) เป็นสัตว์จำพวกกุ้งที่ถูกเพาะเลี้ยงมากที่สุดในจีนตอนใต้ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ความเสื่อมโทรมของสิ่งแวดล้อมส่งผลกระทบอย่างรุนแรงต่อการเพาะเลี้ยงกุ้ง โดยเฉพาะในพื้นที่กึ่งร้อนของมณฑลกวางตุ้ง ประเทศจีน ที่ซึ่งมีสภาพอากาศชื้นและอุณหภูมิสูงตลอดทั้งปี [ 25 , 26 ] ในเชิงพาณิชย์ อาหารสัตว์หรืออาหารสำเร็จรูปมักเก็บไว้ในถุงกระดาษ ซึ่งทำให้ไขมันไวต่อการออกซิเดชัน การศึกษามากมายแสดงให้เห็นว่าความเสียหายจากออกซิเดชันในสัตว์น้ำอันเนื่องมาจากออกซิเดชันของไขมันสามารถป้องกันได้ด้วยสารต้านอนุมูลอิสระจากภายนอก เช่น อาหารเสริมวิตามินอีหรืออัลฟา-โทโคฟีรอล [ 21 , 24 , 27 ] ในการศึกษาครั้งนี้ มีการประเมินผลประโยชน์และการป้องกันที่อาจเกิดขึ้นของ แอสตาแซนธิน ในอาหารของ L. vannamei ในกุ้งที่กินน้ำมันปลาออกซิไดซ์ (OFO) เป็นเวลา 50 วัน ผลกระทบเรื้อรังของ OFO ในอาหารและบทบาทของ AX ในอาหารในฐานะสารป้องกันเคมีที่อาจเป็นไปได้ต่อ OFO ได้รับการสังเกตแล้ว วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือ (1) เพื่อประเมินผลในระยะยาวของ OFO ในอาหารต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและความเสียหายต่อตับและตับอ่อนของ L. vannamei และ (2) เพื่อพิจารณาประโยชน์ของแอสตาแซนธินในอาหารในการป้องกันหรือบรรเทาผลกระทบของ OFO ในอาหาร
2. ผลลัพธ์
2.1. ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและการใช้ฟีด
ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและอัตราการรอดตายของกุ้งแสดงไว้ในตารางที่ 1 หลังจากการทดลองให้อาหารเป็นเวลา 50 วัน น้ำหนักตัวสุดท้าย (FBW) ของกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX450 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX450 และอาหารน้ำมันปลาสดควบคุม ( p > 0.05) พบว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO มีอัตราการเพิ่มน้ำหนัก (WG) อัตราการเจริญเติบโตจำเพาะ (SGR) และอัตราการรอดตายต่ำที่สุด แม้ว่าจะไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญใน WG, SGR และอัตราการรอดตายในกลุ่มอาหารอื่นๆ ( p > 0.05) ในทำนองเดียวกัน พบอัตราการเปลี่ยนอาหารเป็นเนื้อ (FCR) ที่สูงกว่าในกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX150 เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO และไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มอาหารอื่น ( p > 0.05)
ตารางที่ 1 ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและการใช้อาหารของกุ้งแวนนาไมวัยอ่อนที่ให้อาหารต่างกันในระหว่างการทดลองให้อาหารเป็นเวลา 50 วัน
2.2. แอสตาแซนธิน เข้มข้น
ผลกระทบของอาหารทดลองต่อความเข้มข้นของแอสตาแซนธินในเปลือกกุ้ง (% น้ำหนักแห้ง) แสดงอยู่ในรูปที่ 1 เราสังเกตว่าปริมาณแอสตาแซนธินในเปลือกหอยเพิ่มขึ้นขณะที่เราเพิ่มระดับแอสตาแซนธินในอาหาร กุ้งที่ได้รับอาหาร OFO นั้นมีระดับ AX ในเปลือกต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX250 และ OFO + AX450 อย่างมีนัยสำคัญ ( p <0.05) เราไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกุ้งที่ได้รับอาหารที่มีน้ำมันปลาสดควบคุมและอาหาร OFO + AX150 ( p > 0.05)
รูปที่ 1 ปริมาณ แอสตาแซนธิน ในเปลือกของกุ้งแวนนาไมที่ให้อาหารต่างกันในการทดลองให้อาหาร
.
2.3. อัตราการรอดตายของกุ้งภายหลังการทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลัน
อัตราการรอดตายของกุ้งหลังจากการทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลัน 5 ชั่วโมงในกลุ่มอาหารทั้งหมดแสดงไว้ในรูปที่ 2 พบว่าอัตราการรอดตายต่ำที่สุดในกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO และต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX450 อย่างมีนัยสำคัญ ( p <0.05) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ได้รับอาหารน้ำมันปลาสดควบคุม OFO + AX150 และ OFO + AX250 ( p > 0.05)
รูปที่ 2 อัตราการรอดตาย (%) ของกุ้งแม่น้ำสายพันธุ์ L.vannamei ที่ได้รับอาหารควบคุมและอาหารทดลองหลังจากการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลันเป็นเวลา 5 ชั่วโมง
2.4. พารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันตับ ตับอ่อน และเลือดน้ำเหลือง
ตารางที่ 2 แสดงพารามิเตอร์ภูมิคุ้มกันต่อน้ำเลือดและตับและตับอ่อนของกุ้ง โดยพบว่าอาหาร OFO กระตุ้นให้กุ้งมีปริมาณน้ำเลือดและมาโลนไดอัลดีไฮด์ (MDA) สูง ดังนั้นปริมาณน้ำเลือด MDA ในน้ำเลือดของกุ้งจึงสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) พบกิจกรรมของเอนไซม์เฮโมไลซิสคาตาเลส (CAT) ต่ำที่สุดในกุ้งที่กินอาหาร OFO และกิจกรรมของ CAT แสดงให้เห็นถึงแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นเมื่อเพิ่มปริมาณ AX ในอาหาร
ตารางที่ 2 พารามิเตอร์บางประการของน้ำเหลืองและตับอ่อนของกุ้งแวนนาไมวัยอ่อนที่ได้รับอาหารต่างกัน
.
2.5. องค์ประกอบของกรดไขมันในกล้ามเนื้อ
องค์ประกอบกรดไขมันของกล้ามเนื้อกุ้งแสดงอยู่ในตารางที่ 3 ปริมาณกรดไขมันไม่อิ่มตัว (กรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงเดี่ยวและกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อน) ในกล้ามเนื้อของกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO ต่ำกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO + AX250 อย่างมีนัยสำคัญ ( p <0.05) ในกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO ปริมาณกรดไอโคซาเพนทาอีโนอิก (EPA) กรดโดโคซาเฮกซาอีโนอิก (DHA) และกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อนโอเมก้า-3 (n-3) (PUFA) ต่ำที่สุด ในขณะที่ปริมาณ PUFA n-6 สูงที่สุด –
ตารางที่ 3 องค์ประกอบกรดไขมันของกล้ามเนื้อกุ้งแวนนาไม (% น้ำหนัก)
2.6. เนื้อเยื่อวิทยาของตับและตับอ่อน
เราสังเกตเห็นรอยโรคในตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO เซลล์เยื่อบุหลอดตับและตับอ่อนมีช่องว่างจำนวนมากและบางส่วนแตก พบว่าเซลล์เยื่อบุผิวมีการสร้างเมลานินอย่างเห็นได้ชัดและเซลล์ B ลดลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 3b) การเสริม AX ในอาหารช่วยลดความเสียหายของเนื้อเยื่อตับและตับอ่อนที่เกิดจากน้ำมันปลาที่ถูกออกซิไดซ์ได้อย่างมีนัยสำคัญ จึงทำให้พบภาพทางพยาธิวิทยาที่คล้ายคลึงกันหรือดีกว่ากลุ่มควบคุมด้วยซ้ำ (รูปที่ 3 ก) ยิ่งไปกว่านั้น ยังสังเกตเห็นระยะห่างที่เพิ่มขึ้นระหว่างหลอดที่อยู่ติดกันและลูเมนของหลอดที่ผิดปกติในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3 ก) การรักษาด้วย AX ร่วมกันช่วยรักษาลักษณะทางกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนปกติของตับอ่อน ทำให้ได้ลักษณะทางเนื้อเยื่อที่คล้ายคลึงหรือดีกว่าที่สังเกตได้ในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3 c–e)
รูปที่ 3 ตับอ่อนจากอาหารทดลองที่ได้รับการรักษาด้วย L. vannamei (ก) ตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับอาหารควบคุมเป็นเวลา 50 วัน (b) ตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับอาหารน้ำมันปลาออกซิไดซ์เป็นเวลา 50 วัน บาร์ = 50 ม. เซลล์เยื่อบุหลอดตับและตับอ่อนมีช่องว่างจำนวนมากและบางส่วนแตก เกิดการสร้างเมลานินในเซลล์เยื่อบุผิว (c) ตับอ่อนจากกุ้งที่เลี้ยงด้วยน้ำมันปลาออกซิไดซ์ + อาหาร AX 150 มก./กก. เป็นเวลา 50 วัน บาร์ = 50 ม. ภาพตัดขวางของบริเวณกลางของหลอดไต แสดงให้เห็นหลอดไตเรียงกันอย่างมีระเบียบและมีลักษณะเป็นรูปดาวภายในลูเมนของหลอดไต สามารถสังเกตเห็นเซลล์ประเภทต่างๆ ได้ และจำนวนเซลล์เหล่านี้มีมากกว่ากลุ่มควบคุมและกลุ่ม OFO (d) ตับอ่อนจากกุ้งที่ได้รับน้ำมันปลาออกซิไดซ์ + อาหาร AX 250 มก./กก. เป็นเวลา 50 วัน บาร์ = 50 ม. (e) ตับอ่อนจากกุ้งที่ได้รับน้ำมันปลาออกซิไดซ์ + อาหาร AX 450 มก./กก. เป็นเวลา 50 วัน บาร์ = 50 ม. ทั้ง (e) และ (f) แสดงให้เห็นว่าท่อไตมักปรากฏเป็นรูปดาวในลูเมน นอกจากนี้ยังสามารถสังเกตเห็นเซลล์ประเภทต่างๆ ได้ ALU ลูเมนผิดปกติ BL, ลามินาฐาน; REc เซลล์เยื่อบุผิวฉีกขาด เมล เมลาโนไซต์; *, รูปดาวของลูเมนเซลล์; *,รูปหัวใจ
การวิเคราะห์ TEM แสดงให้เห็นว่าในตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO และ OFO/AX450 เป็นเวลา 50 วัน พบว่าเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมที่หยาบในเซลล์ B จำนวนมากมีอาการบวมและเกิดถุงน้ำอย่างเห็นได้ชัด และพบว่ามีช่องว่างขนาดใหญ่ เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นในลดลง คริสตีหายไปในกรณีที่รุนแรง และโครงสร้าง RER ที่ไม่ชัดเจน (รูปที่ 4 ก, ข) การเสริมอาหารด้วย OFO/AX450 ช่วยลดอาการบาดเจ็บของตับและตับอ่อนที่เกิดจาก OFO (รูปที่ 4 c, d)
รูปที่ 4 ตับอ่อนจากอาหารทดลองที่ได้รับการรักษาด้วย Litopenaeus vannamei a – d TEM ( a ) และ ( b ) ตับอ่อนจากกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO เป็นเวลา 50 วัน เซลล์ตับมีอาการบวมน้ำในระดับปานกลาง เยื่อหุ้มเซลล์ยังสมบูรณ์ มีอาการบวมปานกลางและมีช่องว่างในออร์แกเนลล์ในไซโตพลาซึม มีช่องว่างมากขึ้นในเซลล์ และความหนาแน่นของอิเล็กตรอนในบริเวณลดลง ไมโตคอนเดรีย (M) แสดงอาการบวมเล็กน้อย เมทริกซ์ไมโตคอนเดรียส่วนใหญ่จะอ่อนแอลงเล็กน้อย คริสตีภายในลดลงและคริสตีจะหายไปในกรณีที่รุนแรง โครงสร้าง RER มีลักษณะคลุมเครือ ไกลโคเจน (GL) มีมากมาย ออโตฟาจี (Autophagy: AP) มีอยู่มากมาย หยดไขมัน (LDs) มีอยู่แต่ละส่วน มีไลโซโซมหลายตัว (L) และไลโซโซมรอง (SL) (c) และ (d) ตับอ่อนจากกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO/AX450 เป็นเวลา 56 วัน เซลล์ตับมีอาการบวมน้ำเล็กน้อย เยื่อหุ้มเซลล์ยังสมบูรณ์ ออร์แกเนลล์ภายในเซลล์บวมเล็กน้อย และมีช่องว่างบางส่วน ออโตฟาจี (AP), ไมโตคอนเดรีย (M), ช่องว่างขนาดใหญ่ (V), นิวคลีโอลัส (Nu), นิวเคลียส (N), ไกลโคเจน (GL), ไลโซโซม (L), ไลโซโซมรอง (SL), เอนโดพลาสมิกเรติคูลัมหยาบ (RER)
3. การอภิปราย
การศึกษาปัจจุบันศึกษาว่าการเสริมแอสตาแซนธินช่วยปกป้องประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและความเป็นพิษต่อตับในกุ้งขาวแปซิฟิกหรือไม่ อาหาร OFO มีความเกี่ยวข้องกับการย่อยสารอาหารที่ลดลง [28] และคุณค่าทางโภชนาการต่ำของส่วนผสมอาหาร โดยการทำลายปริมาณ PUFA และส่วนประกอบอาหารที่จำเป็นอื่นๆ [29] การศึกษามากมายแสดงให้เห็นว่าการให้อาหารที่เป็นไขมันออกซิไดซ์ไม่ได้ทำให้การเจริญเติบโตของสายพันธุ์ปลาหลายชนิดลดลง [ 12 , 30 , 31 ] ในทางกลับกัน การลดลงของการเจริญเติบโตที่เกิดจาก OFO ยังพบได้ในสัตว์น้ำหลายชนิด เช่น Labeo rohita [ 32] , Pagrus major [ 33] และ M. salmoide [ 34] หยาง และคณะ (2015) แสดงให้เห็นการลดลงของการเจริญเติบโตอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งแวนนาไมรุ่นเยาว์ที่ได้รับอาหาร OFO (ค่าเปอร์ออกไซด์ (POV): 234.84 meq/kg) [ 35 ] การเพิ่มขึ้นของน้ำหนักที่ลดลงในสัตว์ที่ได้รับอาหารที่มีไขมันออกซิไดซ์อาจเกิดจากความอยากอาหารที่เปลี่ยนไป ซึ่งนำไปสู่การเจริญเติบโตที่ไม่ดี [ 21 , 24 , 27 ]
แอสตาแซนธิน ที่ได้รับจากอาหารเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพซึ่งสามารถเพิ่มการใช้สารอาหารและปรับปรุงการเจริญเติบโตได้ในที่สุด นอกจากนี้ AX ยังสามารถเพิ่มความทนทานต่อความเครียดและมีบทบาทสำคัญในกระบวนการเผาผลาญอาหารกลางของสัตว์น้ำ [ 36 , 37 , 38 ] ในการศึกษานี้ การเสริม AX อย่างเพียงพอในอาหาร OFO สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของ L. vannamei ได้อย่างมีนัยสำคัญ แอสตาแซนธิน มีหน้าที่คล้ายกับวิตามินอี [ 39 ] และซีลีเนียม (Se) [ 40 ] ในการปกป้องการเกิดออกซิเดชันของไขมัน จึงทำให้อาหารที่มี L. vannamei อุดมไปด้วยสารอาหารสูงสุด [ 6 , 10 ]
การทดสอบสารที่มีปฏิกิริยาต่อกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBARS) ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นการทดสอบเดี่ยวเพื่อวัด MDA ซึ่งเป็นผลพลอยได้จากลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน ในการศึกษาครั้งนี้ เราพบว่าระดับ MDA ในน้ำเลือดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO ซึ่งบ่งชี้ว่า OFO กระตุ้นให้เกิดความเครียดออกซิเดชัน อาหาร AX ช่วยระงับระดับของลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน เนื่องจากระดับ MDA ลดลงในน้ำเลือดของกุ้งเมื่อรวม AX ลงในอาหาร OFO คล้ายกับการศึกษาของเรา นักวิจัยรายอื่นได้สังเกตว่าระดับ TBARS เพิ่มขึ้นในซีรั่มและตับเนื่องมาจากการออกซิเดชันของน้ำมันในอาหาร [ 21 , 24 , 27 ] CAT เป็นเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระหลักตัวหนึ่งที่ทำหน้าที่กำจัดอนุมูลอิสระ (ROS) และทำหน้าที่เป็นกลไกป้องกันเพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากอนุมูลอิสระและการจับกิน [ 5] เราพบว่ากิจกรรม CAT ในน้ำเหลืองของกุ้งที่ได้รับอาหาร OFO ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าภายใต้อาหาร OFO ความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระของกุ้งลดลงอย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจากเป็นสารต้านอนุมูลอิสระทางชีวภาพที่มีประสิทธิภาพ แอสตาแซนธิน ในปริมาณปานกลางในอาหารจึงสามารถยับยั้งการสะสมของ MDA และช่วยลดการลดลงของกิจกรรม CAT ที่สังเกตได้ การศึกษาครั้งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน มีฤทธิ์กำจัด O อิสระอย่างแข็งแกร่ง และ แอสตาแซนธิน ในอาหารสามารถลดความเครียดออกซิเดชันได้ [6, 10] ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าอาหาร AX สามารถบรรเทาภาวะเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากอาหาร OFO ใน L. vannamei ได้บางส่วน ซึ่งอาจช่วยลดความเสียหายที่เกิดจากอนุมูลออกซิเจนได้
การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า แอสตาแซนธิน ในอาหารสามารถเพิ่มความทนทานต่อความเครียดในสัตว์น้ำได้ ปาน และคณะ (2003) และ Chien และ Shiau (2005) แสดงให้เห็นว่า P. monodon ที่ได้รับอาหาร AX มีอัตราการรอดชีวิตที่เพิ่มขึ้นหลังจากการทดสอบด้วยความร้อน ออสโมซิส แอมโมเนีย และปริมาณออกซิเจนละลายน้ำ (DO) ต่ำ [ 41 , 42 ] Chien และ Shiau (2005) รายงานว่าภายใต้สภาวะ DO ต่ำ M. Japonicus ที่ได้รับอาหารสาหร่ายหรืออาหาร AX สังเคราะห์จะมีอายุยืนยาวกว่ากลุ่มควบคุม [41] จากการทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลัน เราพบว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร OFO มีอัตราการรอดชีวิตต่ำกว่ากลุ่มควบคุม ในขณะที่กุ้งที่ได้รับอาหารเสริม AX มีอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่ากลุ่ม OFO ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเสริม AX สามารถปรับปรุงความทนทานต่อความเครียดจากความเค็มในกุ้งที่กิน OFO ได้
เป็นที่ทราบกันดีว่า OFO สามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาในตับอ่อนของสิ่งมีชีวิตบนบกและในน้ำได้ เฉินและคณะ (2012) แนะนำว่าความเครียดออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นใน M. salmoides ที่ได้รับอาหารที่มีลิปิดออกซิไดซ์อาจเป็นสาเหตุของการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่สังเกตได้ [43] ตับอ่อนเป็นอวัยวะย่อยอาหารที่สำคัญซึ่งมีหน้าที่หลายประการ เช่น การดูดซึม การย่อย การสะสม การขับถ่าย และการกำจัดพิษในสัตว์จำพวกกุ้ง [ 44 , 45 ] ตับอ่อนประกอบด้วยหลอดกิ่งและเซลล์เยื่อบุผิวหลายประเภทที่เรียงรายอยู่ภายในหลอด ตับอ่อนของสัตว์จำพวกกุ้งมีความอ่อนไหวต่อสารปนเปื้อนในอาหารเป็นอย่างมาก และมักใช้ในการตรวจติดตามผลกระทบของสารพิษต่างๆ [ 46] ในการศึกษาครั้งนี้ การตรวจทางจุลพยาธิวิทยาของกุ้งที่กินอาหาร OFO แสดงให้เห็นลักษณะเสื่อมในท่อไตและเซลล์เยื่อบุผิวของตับอ่อน แต่การเสริมอาหารด้วย แอสตาแซนธิน ทำให้การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาเหล่านี้ลดลง (รูปที่ 3) จากการวิเคราะห์ TEM พบว่าเอนโดพลาสมิกเรติกูลัมหยาบในเซลล์ B มีอาการบวมและพุพองอย่างเห็นได้ชัด ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ากุ้งอาจได้รับประโยชน์จากอาหาร AX โดยการลดการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่เกี่ยวข้องกับลิปิดออกซิไดซ์
ตามที่สภาวิจัยแห่งชาติ (2011) [ 47] ระบุว่าอาหารที่มีไขมันออกซิไดซ์อาจถือว่าขาดกรดไขมันจำเป็น ในการศึกษานี้ องค์ประกอบของกรดไขมันของกล้ามเนื้อและ AX ในเปลือกได้รับการเปลี่ยนแปลงโดยการเสริมอาหารด้วย OFO และ AX ค่า UFA ของกล้ามเนื้อสูงที่สุดในการรับประทานอาหาร OFO + AX250 และสูงกว่าในการรับประทานอาหาร OFO อย่างมีนัยสำคัญ ปัจจุบันปริมาณ แอสตาแซนธิน ลดลงจาก 1.24 มก./กก. ในอาหารควบคุมเป็น 0.72 มก./กก. ในอาหาร OFO ซึ่งอาจบ่งชี้ว่ากุ้งที่กินอาหารเสริม AX อาจสามารถต่อต้านความเครียดออกซิเดชันได้ การวิเคราะห์ความสัมพันธ์แสดงให้เห็นว่า MDA ของตับและตับอ่อนไม่เพียงแต่มีความสัมพันธ์เชิงบวกที่มีนัยสำคัญอย่างยิ่งกับ UFA แต่ยังมีความสัมพันธ์เชิงลบที่มีนัยสำคัญกับอัตราการรอดชีวิตในระหว่างการทดลองให้อาหารหรือหลังการทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลันอีกด้วย สิ่งนี้อาจชี้ให้เห็นว่าอัตราการเสียชีวิตและความทนทานต่อความเครียดมีความเกี่ยวข้องกับการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในตับอ่อน อัตราการรอดชีวิตหลังการทดสอบการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลันมีความสัมพันธ์เชิงบวกอย่างมีนัยสำคัญกับเนื้อหาของ AX ในเปลือก ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์โดยตรงหรือโดยอ้อมระหว่าง AX และความทนต่อความเครียด ความเข้มข้นของ แอสตาแซนธิน ที่เก็บไว้ในกุ้งเพิ่มขึ้นตามระดับ AX ในอาหารที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ แอสตาแซนธิน สามารถลดการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในเนื้อเยื่อ และผลิตภัณฑ์จากลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่ลดลงอาจช่วยปกป้องปริมาณ UFA ในกล้ามเนื้อจากผลเสียของการเกิดออกซิเดชันได้ ดังนั้น การศึกษาปัจจุบันจึงตั้งสมมติฐานว่า แอสตาแซนธิน อาจมีบทบาทสำคัญในการล้างพิษเปอร์ออกซิเดชันที่เกิดจากน้ำมันปลาที่ถูกออกซิไดซ์จากอาหาร
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. เตรียมอาหารของคุณ
กุ้งขาวได้รับอาหารที่มีไนโตรเจนและไอโซลิปิดิก 5 ชนิด อาหารได้รับการกำหนดสูตรโดยใช้น้ำมันปลาออกซิไดซ์และ/หรืออาหารเสริมแอสตาแซนธิน (AX) ในระดับที่แตกต่างกัน (Lucantin @Pink10%; BASF SE, Ludwigshafen, เยอรมนี) เงื่อนไขการให้อาหารเป็นดังนี้: (i) OFO (น้ำมันปลาออกซิไดซ์); (ii) OFO/AX150 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX150 มก./กก.); (iii) OFO/AX250 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX250 มก./กก.); (iv) OFO/AX450 (น้ำมันปลาออกซิไดซ์ + AX450 มก./กก.); และ (v) กลุ่มควบคุม (น้ำมันปลาสด) (ตารางที่ 4) ค่าเปอร์ออกไซด์ของน้ำมันปลาออกซิไดซ์คือ 275.2 meq/kg อาหารแต่ละชนิดจะเลี้ยงกุ้ง 4 กลุ่ม สรุปคือ ชั่งน้ำหนักส่วนผสมผงทั้งหมดอย่างแม่นยำ ผสมให้เข้ากัน แล้วจึงเติมไขมันและน้ำลงไป เม็ดพลาสติกอัดเย็น (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1.2 มม.) จะถูกทำให้แห้งด้วยอากาศจนมีความชื้นประมาณ 10% เม็ดพลาสติกแห้งถูกใส่ไว้ในถุงสูญญากาศและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C จนกว่าจะใช้งาน ตัวอย่างอาหารแต่ละชนิดรวม 40 กรัมถูกสุ่มตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์องค์ประกอบทางชีวเคมี [ 48 ]
ตารางที่ 4 องค์ประกอบและระดับสารอาหารของอาหารทดลอง
น้ำมันปลาออกซิไดซ์เตรียมได้ดังนี้: (1) น้ำมันปลาออกซิไดซ์โดยการให้ความร้อนที่ 70°C ภายใต้การเติมอากาศที่เข้มข้น (2) หลังจากผ่านไป 36 ชั่วโมง ให้ตรวจสอบค่าเปอร์ออกไซด์ (POV) ทุกๆ 8 ชั่วโมง จนกระทั่งถึงระดับออกซิเดชันที่สูง (275.2 meq/kg) ค่าเปอร์ออกไซด์จะถูกกำหนดตาม AOAC โดยสรุป ได้ผสมน้ำมัน 5 กรัม สารละลาย KI อิ่มตัว 0.5 มิลลิลิตร และตัวทำละลาย 30 มิลลิลิตร ซึ่งประกอบด้วยกรดอะซิติกและคลอโรฟอร์ม (3:2) การไทเทรตดำเนินการด้วย Na2S2O3 0.1 โมลต่อลิตร โดยใช้ตัวบ่งชี้แป้ง 1% ในทำนองเดียวกันเราทำซ้ำขั้นตอนนี้ด้วยการทดสอบรีเอเจนต์แบลงค์ จากนั้นเราจะคำนวณและวิเคราะห์ผลการวัด การคำนวณ: X = [( V − V 0) × N × 0.1269]/m (X : ค่าเปอร์ออกไซด์ของตัวอย่าง, %. V : ปริมาตรของสารละลายโซเดียมไทโอซัลเฟตที่ใช้โดยตัวอย่าง, มล. V 0 : ปริมาตรของตัวอย่างเปล่าที่ใช้สารละลายโซเดียมไทโอซัลเฟต, มล. N : ความเข้มข้นโมลของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไทโอซัลเฟต, โมล/ลิตร) [ 33 ].
4.2. กุ้งและสภาวะการทดลอง
แหล่งที่มาของกุ้งขาวแวนนาไมวัยอ่อนได้รับมาจากบริษัท Evergreen South Ocean Tech จำกัด เมืองจางเจียง ประเทศจีน ก่อนการทดลอง กุ้งจะถูกปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมใหม่ด้วยการปล่อยลงในถังเป็นเวลาสองสัปดาห์ ได้รับอาหารสำเร็จรูป (Guangdong Evergreen Group, Zhan-jiang, China) และน้ำทะเลที่กรองและหมุนเวียนด้วยการเติมอากาศ จากนั้นกุ้ง (มวลเริ่มต้น 0.53 กรัม) ถูกสุ่มแบ่งให้ใส่ในถังไฟเบอร์กลาส 20 ถัง (300 ลิตร พื้นถัง 0.6 ตารางเมตร อาหาร 4 ถัง กุ้ง 30 ตัวต่อถัง) กลุ่มต่างๆ ทั้งหมดได้รับการป้อนอาหารด้วยมือวันละ 4 ครั้ง (เวลา 07:00 น. 12:00 น. 17:00 น. และ 21:00 น.) โดยมีปริมาณอาหารที่บริโภคทั้งหมดประมาณ 9% ของน้ำหนักตัว เพื่อรักษาสภาพการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม อาหารสัตว์และอุจจาระที่ไม่กินทั้งหมดจะถูกกำจัดออกในช่วงระยะเวลาทดลอง 50 วัน
ในระหว่างการทดลอง อุณหภูมิจะอยู่ระหว่าง 27 ถึง 30 °C ความเค็มอยู่ที่ประมาณ 27‰ –30‰ ค่า pH อยู่ระหว่าง 7.7–8.0 ไนโตรเจน-แอมโมเนียไม่เกิน 0.05 มก./ล. และออกซิเจนที่ละลายน้ำไม่น้อยกว่า 6.5 มก./ล.
4.3. การเก็บตัวอย่าง
กุ้งทั้งหมดได้รับการงดอาหารเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนทำการสุ่มตัวอย่าง ในระหว่างการสุ่มตัวอย่าง กุ้งจะถูกชั่งน้ำหนักทีละตัวและรวบรวมไปเพื่อวิเคราะห์เพิ่มเติม สำหรับแต่ละถังมีการเก็บกุ้งแบบสุ่ม 5 ตัวเพื่อวิเคราะห์ปริมาณแอสตาแซนธินจากเปลือกและกรดไขมันในกล้ามเนื้อ (FA) ในขณะที่มีการเก็บกุ้งแบบสุ่ม 6 ตัวเพื่อสุ่มตัวอย่างเลือดและตับอ่อน เก็บตัวอย่างเลือดจากช่องท้องหรือรอบ ๆ โพรงหัวใจโดยใช้เข็มฉีดยาขนาด 1 มล. ตัวอย่างเฮโมไลเสตถูกเก็บไว้ในตู้เย็นเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นจึงปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาที (4°C, 8,000 รอบต่อนาที) นำส่วนที่เป็นของเหลวใสเหนือตะกอนมาใช้ในการวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์และปริมาณของมาโลนไดอัลดีไฮด์ (MDA) ตัวอย่างตับอ่อนจำนวน 6 ตัวอย่างถูกวางในไนโตรเจนเหลวทันทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C ก่อนการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ ตับอ่อนของกุ้งแต่ละตัวได้รับการชั่งน้ำหนักแยกกัน (0.5 กรัม) และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 10× (w/v) (0.1 โมลต่อลิตร -1, pH 6.4) บนน้ำแข็ง นำส่วนผสมที่เป็นเนื้อเดียวกันไปปั่น (6,000 รอบต่อนาที 10 นาที) ที่อุณหภูมิ 4°C และใช้ส่วนหนึ่งของของเหลวส่วนบนเพื่อตรวจวัด MDA ของตับ
4.4. การศึกษาทางพยาธิวิทยา
ตัวอย่างตับอ่อนจากกุ้ง 3 ตัว (ต่อถัง) ได้รับการตรึงด้วยฟอร์มาลินที่เป็นกลาง 4% แล้วจึงฝังในพาราฟิน ตัดส่วนเนื้อเยื่อ (หนา 8 ไมโครเมตร) ของตับและตับอ่อนด้วยเฮมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) และตรวจสอบสไลด์สุดท้ายภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อหารอยโรคทางพยาธิวิทยา
สำหรับกล้องจุลทรรศน์ TEM ตัวอย่างได้รับการตรึงในกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% พร้อมบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M และตรึงภายหลังใน OsO 4 1% ตัวอย่างถูกฝังอยู่ในเรซินอีพอกซีของ Spurr หลังจากการทำให้แห้งในอะซิโตนที่ไล่ระดับ (Polysciences Ltd., Warrington, PA, USA) ใช้เครื่อง Leica UCT ultramicrotome เพื่อตัดส่วนที่บางเฉียบ จากนั้นย้อมด้วยเลดซิเตรตและสารละลายยูรันิลอะซิเตทอิ่มตัวในเอธานอล 50% จากนั้นส่วนบางเฉียบจะถูกคัดกรองโดยใช้ TEM (FEI Tecnai G2 20, เนเธอร์แลนด์) ที่ 150 kV และถ่ายภาพโดยใช้กล้อง Megaview III (SIS GmbH) ที่ติดตั้งซอฟต์แวร์ AnalySIS
4.5. องค์ประกอบของกรดไขมัน
ไขมันทั้งหมดถูกสกัดด้วยคลอโรฟอร์ม: เมทานอล (2:1, v/v) ใช้แก๊สโครมาโทกราฟีแบบแคปิลลารี (GC) เพื่อตรวจสอบองค์ประกอบของกรดไขมัน มีการใช้ HP6890 (ตัวตรวจจับ FID; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) และคอลัมน์ SPTM-2380 (30 ม. × 0.25 มม. × 0.20 µm) บน GC การแยกจะดำเนินการโดยใช้ไนโตรเจนเป็นก๊าซพาหะ อุณหภูมิของคอลัมน์เพิ่มขึ้นจาก 140 เป็น 240 °C ที่ 4 °C นาทีที่ 1 คงไว้ที่ 140 °C เป็นเวลา 5 นาทีและที่ 240 °C เป็นเวลา 10 นาที โดยที่ตัวตรวจจับอยู่ที่ 260 °C ใช้เครื่องฉีดแบบแยก (50:1) ที่อุณหภูมิ 260°C กรดไขมันแต่ละชนิดจะถูกระบุโดยระยะเวลาการกักเก็บเทียบกับมาตรฐานโครมาโทกราฟี (Sigma, Northampton, สหราชอาณาจักร) พื้นที่จุดสูงสุดได้รับการกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Varian (Varian, Inc., Palo Alto, CA, USA) ความเข้มข้นของกรดไขมันแต่ละชนิดจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกรดไขมันทั้งหมด
4.6. ส่วนประกอบของเปลือก แอสตาแซนธิน
โดยปฏิบัติตามวิธีของ Chien และ Shiau (2005) [ 41 ] เปลือกกุ้ง 10 ตัวในแต่ละถังจะถูกผ่าออก ทำให้แห้งด้วยการแช่แข็ง สับ และใส่ไว้ในหลอดเหวี่ยงโพลีโพรพีลีนขนาด 50 มล. เติมตัวทำละลายอะซิโตน (20 มล.) ลงในแต่ละหลอดเพื่อทำให้ส่วนผสมเป็นเนื้อเดียวกัน (Polytron PT-MR-3000; PT. Hartono IstanaTeknologi, อินโดนีเซีย) ที่อัตรา 12700× g เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นจึงปั่น (Hitachi 18 PR-52; Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) ที่อัตรา 12700× g เป็นเวลา 5 นาที เม็ดสารเหล่านี้จะถูกทำให้แขวนลอยอีกครั้งและปั่นรวมกับอะซิโตนอีก 20 มล. จนกระทั่งสารสกัดอะซิโตนใส ถ่ายโอนสารสกัดอะซิโตนรวมไปยังกรวยแยกขนาด 250 มล. แบ่งด้วย n-hexane 30 มล. แล้วล้างด้วย NaCl 10% สามครั้งเพื่อกำจัดอะซิโตนที่เหลือ จากนั้นลดสารสกัดเหลือ 10 มล. โดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน จากนั้นกรองสารสกัดผ่านตัวกรองมิลลิพอร์ขนาด 0.2 แอมแปร์ แล้วเก็บไว้ในขวดสีน้ำตาลขนาด 2 มล. จำนวน 3 ขวด ปริมาณ AX ถูกกำหนดโดยโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (Agilent 1200; Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) มาตรฐาน แอสตาแซนธิน ที่บริสุทธิ์ทางโครมาโตกราฟีซื้อจาก Sigma-Aldrich Co. LLC (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา) เงื่อนไข HPLC ได้รับการปรับตามวิธีการก่อนหน้านี้ของ Yuan et al. (1996) [ 49 ]. จุดสูงสุดของโครมาโตกราฟีจะถูกระบุโดยการเปรียบเทียบเวลาการกักเก็บกับมาตรฐานที่ทราบ
4.7. เอนไซม์และการทดสอบการเกิดออกซิเดชันของไขมัน
การเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน (LPO) ได้รับการประเมินโดยการวัดสารที่มีปฏิกิริยาต่อกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBARS) ในปฏิกิริยาการให้ความร้อนด้วยกรด ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Esterbauer และ Cheeseman (1990) [ 50 ] การกำหนดปริมาณ LPO ในกุ้งดำเนินการโดยใช้ชุดตรวจจับ MDA (A003-1, สถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Jian-Cheng, Nan jing, ประเทศจีน) ผลลัพธ์แสดงเป็น nmol MDA เทียบเท่าต่อมิลลิกรัมของโปรตีนของตับอ่อน และ mmol MDA เทียบเท่าต่อลิตรของน้ำเหลือง
กิจกรรมของคาตาเลส (CAT) ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบ (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Jian-Cheng เมืองหนานจิง ประเทศจีน) กิจกรรม CAT ของเนื้อเยื่อได้รับการวัดโดยสเปกโตรโฟโตเมตริกที่ 405 โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต SpectraMax M5 (Molecular Devices, Minneapolis, MN, USA) กิจกรรม CAT หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการย่อยสลาย H 2 O 2 1.0 μmol ต่อหนึ่งนาที ผลลัพธ์แสดงเป็น U/L ของเฮโมไลเสต [ 48 ]
กิจกรรมของ iNOS ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบ iNOS (สถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Jiancheng เมืองหนานจิง ประเทศจีน) โดยย่อ ให้ผสมเนื้อสมองที่เป็นเนื้อเดียวกัน 10% (30 μL) หรือซีรั่ม (15 μL) กับสารละลายทำงานที่มีอยู่ในชุด และหลังจากฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 15 นาที ปฏิกิริยาจะยุติลงโดยการเติมสารละลายยุติที่มีอยู่ในชุด ชุดเครื่องมือ บันทึกการดูดกลืนแสงที่ 530 นาโนเมตรโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Hitachi U-2010 (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) และกิจกรรม iNOS ถูกคำนวณโดยอ้างอิงจากกราฟมาตรฐาน ปริมาณของ NO ที่ผลิตในตัวอย่างถูกกำหนดโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 550 นาโนเมตร
4.8. การทดลองการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลัน
กุ้งทั้งหมด 10 ตัวในแต่ละถังได้รับการเลือกแบบสุ่มสำหรับการทดลองการเปลี่ยนแปลงความเค็มเฉียบพลัน การทดสอบเกี่ยวข้องกับการลดความเค็มทันทีจาก 29% เหลือ 10% โดยการเติมน้ำจืดที่ไม่มีคลอรีน กุ้งได้รับการตรวจสอบอย่างใกล้ชิดและบันทึกการตายตลอดการทดลอง 5 ชั่วโมง
4.9. การคำนวณและวิเคราะห์ทางสถิติ
พารามิเตอร์จะถูกคำนวณดังนี้:
เปอร์เซ็นต์การเพิ่มน้ำหนัก (WG, %) = 100 × ( Wt − Wi )/ Wi
อัตราการเจริญเติบโตเฉพาะ (SGR, % วัน −1 ) = 100 × (Ln Wt − Ln Wi )/ t
อัตราการแปลงอาหารเป็นพลังงาน (FCR) = อาหารที่บริโภค (กรัม, น้ำหนักแห้ง) / น้ำหนักที่เพิ่มขึ้น (กรัม, น้ำหนักเปียก)
อัตราการรอด (%) = 100 × (จำนวนกุ้งสุดท้าย)/(จำนวนกุ้งเริ่มต้น)
โดยที่ Wt คือน้ำหนักตัวสุดท้าย (กรัม), Wi คือน้ำหนักตัวเริ่มต้น (กรัม) และ t คือระยะเวลาในการทดสอบเป็นวัน
การวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดรวมถึงการทดสอบความเป็นเนื้อเดียวกัน และหากสังเกตเห็นความแปรปรวนที่คล้ายคลึงกัน เราจะดำเนินการ ANOVA แบบทางเดียวเพื่อพิจารณาผลหลักของการปรับเปลี่ยนอาหาร เมื่อพบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P 0.05) หลังการวิเคราะห์ทางสถิติแบบทางเดียว ค่าเฉลี่ยของกลุ่มจะถูกเปรียบเทียบเพิ่มเติมโดยใช้การทดสอบช่วงหลายช่วงของ Duncan มิฉะนั้น หากข้อมูลไม่มีความแปรปรวนที่คล้ายกัน จะมีการนำการทดสอบ Kruskal–Wallis แบบไม่ใช่พารามิเตอร์มาใช้ ตามด้วยการเปรียบเทียบแบบคู่กันหลายครั้ง หากผลการทดสอบ Kruskal–Wallis แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P 0.05) การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ยังใช้เพื่อกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์ทางชีวเคมีด้วย ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) และผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM
5. บทสรุป
โดยรวมแล้ว การศึกษาปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าน้ำมันปลาที่ถูกออกซิไดซ์ในอาหาร (POV: 275.2 meq/kg) สามารถกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่ชัดเจนและความเครียดออกซิเดชันใน L. vannamei ได้ นอกจากนี้ แอสตาแซนธิน ในอาหารยังอาจช่วยเพิ่มผลกระทบเหล่านี้ได้โดยการเพิ่มกิจกรรม CAT และลดการสะสม MDA ในพลาสมาของกุ้ง กุ้งที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน มีความสามารถในการทนต่อความเครียดจากความเค็มเฉียบพลันได้ดีกว่า จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันกลไกที่มีศักยภาพของ AX ในการบรรเทาความเครียดออกซิเดชันและความเป็นพิษต่อตับในกุ้งและสัตว์จำพวกกุ้งอื่นๆ.
by Yingying Yu 1,2,3,Yang Liu 2,Peng Yin 1,Weiwen Zhou 1,Lixia Tian 1,Yongjian Liu 1,Donghui Xu 3 andJin Niu 1,*ORCID
1
State Key Laboratory of Biocontrol, Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals, School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
2
Guangdong Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precision Breeding, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528225, Guangdong, China
3
Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Marine Drugs, Department of Biochemistry, Traditional Chinese Medicine and Marine Drugs, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China