Astaxanthin bảo vệ gan tụy chống lại các tác nhân oxy hóa ở tôm thẻ chân trắng
Nghiên cứu hiện tại điều tra ảnh hưởng của astaxanthin (AX) trong chế độ ăn đến hiệu suất tăng trưởng, các thông số chống oxy hóa và phục hồi tổn thương gan tụy ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương ( Litopenaeus vannamei ). Để đánh giá chức năng bảo vệ gan tụy của Astaxanthin ở tôm, chúng tôi đã so sánh hiệu quả của 5 chế độ ăn trong điều kiện dầu cá bị oxy hóa với các mức astaxanthin khác nhau trong thời gian thử nghiệm 50 ngày. Các chế độ ăn được xây dựng như sau: (i) OFO (dầu cá bị oxy hóa); (ii) OFO/AX150 (dầu cá oxy hóa + AX150 mg/kg); (iii) OFO/AX250 (dầu cá oxy hóa + AX250 mg/kg); (iv) OFO/AX450 (dầu cá oxy hóa + AX450 mg/kg); và (v) nhóm đối chứng (dầu cá tươi). Kết quả cho thấy dầu cá bị oxy hóa với giá trị peroxide (POV) là 275,2 meq/kg đã làm giảm đáng kể trọng lượng cơ thể cuối cùng của tôm thẻ ( P > 0,05) và gây ra một số thay đổi mô bệnh học rõ ràng ở gan tụy. Hiệu suất tăng trưởng cao hơn đáng kể ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO/AX450 so với tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO ( p < 0,05). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể khi so sánh chế độ ăn OFO/AX450 với chế độ ăn đối chứng chứa dầu cá tươi ( p > 0,05). Hơn nữa, tôm theo chế độ ăn OFO/AX450 cho thấy sự cải thiện đáng kể về sức khỏe gan tụy và giảm malondialdehyd (MDA) so với tôm theo chế độ ăn OFO ( p < 0,05). Chế độ ăn astaxanthin đã cải thiện khả năng chống oxy hóa của L. vannamei bằng cách tăng hoạt động catalase (CAT) trong bạch huyết. Thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính cho thấy tỷ lệ sống của tôm trong chế độ ăn OFO/AX450 cao hơn so với chế độ ăn OFO ( p < 0,05), cho thấy AX có thể góp phần tăng cường khả năng chống chịu stress. Tóm lại, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng AX có tác dụng bảo vệ phụ thuộc vào liều lượng chống lại các tổn thương oxy hóa do dầu cá bị oxy hóa gây ra ở tôm.
1. Giới thiệu
Carotenoid astaxanthin (AX) biển được tìm thấy tự nhiên trong nhiều loại sinh vật dưới nước, chẳng hạn như vi tảo, động vật giáp xác (cua, tôm hùm và tôm thẻ) và cá (cá hồi) [ 1 , 2 ]. AX có cấu trúc không bão hòa đa kỵ nước ở cả hai đầu của cấu trúc olefin liên hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho việc định vị chính xác của nó trong màng tế bào và các lipoprotein tuần hoàn. Trên thực tế, AX thể hiện chức năng chống oxy hóa mạnh mẽ như một chất tẩy mạnh mẽ các gốc tự do oxy, để giảm căng thẳng oxy hóa và peroxid hóa lipid [ 3 ]. Astaxanthin nổi tiếng là chất chống oxy hóa mạnh mẽ đã được báo cáo là vượt qua β-carotene hoặc lutein và thậm chí cả α-tocopherol [ 4 ]. Ở động vật giáp xác, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng astaxanthin trong chế độ ăn có thể làm tăng tổng khả năng chống oxy hóa (TOC), cải thiện hiệu suất tăng trưởng [ 5 , 6 , 7 ], tăng tỷ lệ sống [ 8 ] và tăng cường khả năng chống lại các loại stress môi trường khác nhau, bao gồm cả stress độ mặn [ 9 ], stress suy giảm oxy [ 10 ] và stress nhiệt độ cao [ 11 ]. Do đó, astaxanthin trong chế độ ăn uống, là một chất chống oxy hóa vượt trội, có thể được sử dụng để cải thiện hiệu suất tăng trưởng và tăng cường khả năng chịu stress của các loài sinh vật biển.
Peroxid hóa lipid là sự phẩn hủy oxy hóa khử của các axit béo không bão hòa đa (PUFA) thông qua phản ứng chuỗi gốc tự do. Lipid peroxide có thể làm hỏng màng tế bào giàu lipid của sinh vật [ 12 ]. Dầu cá, rất giàu PUFA, cần thiết để duy trì tính lưu động của màng tế bào của động vật thủy sản. Tuy nhiên, PUFA rất dễ bị peroxy hóa để tạo thành hydroperoxide lipid độc hại, sản phẩm oxy hóa chính, thông qua quá trình liên quan đến gốc tự do. Các hydroperoxide lipid không ổn định có thể dễ dàng phân hủy thành alkoxy axit béo [ 13 ] hoặc phân hủy để giải phóng một loạt sản phẩm oxy hóa thứ cấp, chẳng hạn như aldehyd, xeton, rượu và axit cacboxylic [ 14 ]. Những sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa này là nguồn chính tạo ra hương vị và mùi khó chịu khi phân hủy các sinh vật biển, do sự phá hủy màng sinh học tế bào và suy giảm sức khỏe động vật [ 15 , 16 ]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng dầu oxy hóa trong chế độ ăn của cá có thể trì hoãn sự phát triển hoặc tỷ lệ sống bằng cách điều chỉnh nồng độ hemoglobin và hoạt động glycolytic, peroxid hóa lipid [ 17 , 18 , 19 , 20 ] và sự lắng đọng của α-tocopherol [ 21 ]. Ngược lại, sự hiểu biết của chúng ta về tác động của quá trình oxy hóa lipid đối với các loài giáp xác còn hạn chế. Koshio và cộng sự. (1994) báo cáo rằng dầu bị oxy hóa có thể dẫn đến giảm tăng trưởng, giảm kích thước hậu ấu trùng và sức khỏe kém ở Penaeus japonicas [ 22 ]. Laohabanjong và cộng sự. (2009) cho thấy quá trình oxy hóa lipid bột cá có thể dẫn đến những bất thường về thâm nhiễm hồng cầu, teo biểu mô ống và hình thành nốt sần ở tôm sú Penaeus monodon [ 23 ]. Vương và cộng sự. (2015) phát hiện ra rằng quá trình oxy hóa dầu ở mức độ trung bình và cao có thể làm giảm tỷ lệ sống và hiệu quả kiếm ăn của cua con Trung Quốc Eriocheir sinensis [ 24 ]. Mặc dù dầu cá bị oxy hóa có tác động tiêu cực đến động vật giáp xác nhưng chỉ có một số nghiên cứu khám phá cách giảm tác động bất lợi của quá trình peroxid hóa lipid thông qua quản lý chế độ ăn uống.
Tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương ( Litopenaeus vannamei ) là loài giáp xác được nuôi phổ biến nhất ở Nam Trung Quốc. Trong những năm gần đây, môi trường suy thoái đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm, đặc biệt là ở các vùng cận nhiệt đới của tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm và nhiệt độ cao quanh năm [ 25 , 26 ]. Trong thương mại, thức ăn chăn nuôi hoặc khẩu phần ăn thường được bảo quản trong túi giấy, khiến lipid dễ bị oxy hóa. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng tổn thương oxy hóa ở động vật thủy sản do lipid oxy hóa có thể được ngăn ngừa bằng các chất chống oxy hóa ngoại sinh, chẳng hạn như bổ sung vitamin E hoặc α-tocopherol [ 21 , 24 , 27 ]. Trong nghiên cứu này, lợi ích tiềm tàng và tác dụng bảo vệ của chế độ ăn Astaxanthin ở tôm thẻ L. vannamei đã được đánh giá ở tôm được nuôi bằng dầu cá oxy hóa (OFO) trong thời gian 50 ngày. Các tác động mãn tính của OFO trong chế độ ăn uống và vai trò của AX trong chế độ ăn uống, như một tác nhân bảo vệ hóa học có thể chống lại OFO, đã được quan sát. Mục tiêu của nghiên cứu này là (1) đánh giá tác động lâu dài của OFO trong chế độ ăn đối với hiệu suất tăng trưởng và tổn thương gan tụy của L.vannamei và (2) để xác định lợi ích của Astaxanthin trong chế độ ăn trong việc ngăn ngừa hoặc cải thiện tác dụng của OFO trong chế độ ăn.
2. Kết quả
2.1. Hiệu suất tăng trưởng và sử dụng thức ăn
Hiệu suất tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm được thể hiện trong Bảng 1 . Sau thử nghiệm cho ăn 50 ngày, trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW) của tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO + AX450 cao hơn đáng kể so với tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO ( p < 0,05). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO + AX450 và chế độ ăn dầu cá tươi đối chứng ( p > 0,05). Tăng trọng thấp nhất (WG), tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) và tỷ lệ sống được tìm thấy ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO, mặc dù không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy về WG, SGR và tỷ lệ sống giữa các nhóm chế độ ăn khác ( p > 0,05). Tương tự, tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) cao hơn được tìm thấy ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO + AX150 so với tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO và không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy giữa các nhóm chế độ ăn khác ( p > 0,05).
Bảng 1. Hiệu suất tăng trưởng và sử dụng thức ăn của tôm thẻ L. vannamei non , được cho ăn với các chế độ ăn khác nhau trong thử nghiệm cho ăn 50 ngày.
2.2. Astaxanthin đậm đặc
Ảnh hưởng của các khẩu phần thử nghiệm đến nồng độ Astaxanthin trong vỏ tôm (% trọng lượng khô) được trình bày trong Hình 1 . Chúng tôi quan sát thấy hàm lượng Astaxanthin trong vỏ ngày càng tăng khi chúng tôi tăng mức Astaxanthin trong khẩu phần ăn. Tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO cho thấy mức AX trong vỏ thấp hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn OFO + AX250 và OFO + AX450 ( p < 0,05). Chúng tôi quan sát thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa tôm được nuôi bằng dầu cá tươi đối chứng và chế độ ăn OFO + AX150 ( p > 0,05).
Hình 1. Hàm lượng astaxanthin trong vỏ L. vannamei được cho ăn với các khẩu phần ăn khác nhau trong thử nghiệm cho ăn.
2.3. Tỷ lệ sống của tôm sau thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính
Tỷ lệ sống của tôm sau thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính trong 5 giờ ở tất cả các nhóm khẩu phần được trình bày trong Hình 2 . Tỷ lệ sống thấp nhất được tìm thấy ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO và thấp hơn đáng kể so với tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO + AX450 ( p < 0,05). Không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy ở tôm được nuôi bằng dầu cá tươi đối chứng, chế độ ăn OFO + AX150 và OFO + AX250 ( p > 0,05).
Hình 2. Tỷ lệ sống (%) của L.vannamei được cho ăn khẩu phần đối chứng và khẩu phần thử nghiệm sau khi thay đổi độ mặn cấp tính trong 5 giờ.
2.4. Các thông số miễn dịch gan tụy và tan máu
Các thông số miễn dịch tan máu và gan tụy của tôm được thể hiện trong Bảng 2 . Hàm lượng malondialdehyde tan máu và gan tụy cao (MDA) ở tôm được tạo ra bởi chế độ ăn OFO, do đó, hàm lượng MDA tan máu của tôm cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng ( p < 0,05). Hoạt tính catalase (CAT) thấp nhất của bệnh tan máu được tìm thấy ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO và hoạt động CAT cho thấy xu hướng ngày càng tăng cùng với AX trong chế độ ăn ngày càng tăng.
Bảng 2. Một số thông số về bạch huyết và gan tụy của tôm thẻ L. vannamei non được nuôi bằng các chế độ ăn khác nhau.
2.5. Thành phần axit béo cơ bắp
Thành phần axit béo trong cơ của tôm được trình bày trong Bảng 3 . Hàm lượng axit béo không bão hòa (axit béo không bão hòa đơn và không bão hòa đa) trong cơ tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO thấp hơn đáng kể so với tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO + AX250 ( p < 0,05). Ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO, hàm lượng axit eicosapentaenoic (EPA), axit docosahexaenoic (DHA) và axit béo không bão hòa đa omega-3 ( n -3) (PUFA) là thấp nhất, trong khi n -6 PUFA là cao nhất. .
Bảng 3. Thành phần axit béo trong cơ của tôm thẻ L. vannamei (% trọng lượng)
2.6. Mô học gan tụy
Chúng tôi quan sát thấy các tổn thương ở gan tụy của tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO. Các tế bào biểu mô ống gan tụy bị bong nhiều không bào và một số bị vỡ. Rõ ràng là có sự xuất hiện hắc tố của các tế bào biểu mô và sự giảm đáng kể của các tế bào B ( Hình 3 b). Việc bổ sung AX trong chế độ ăn uống làm giảm đáng kể tổn thương mô gan tụy do dầu cá bị oxy hóa gây ra, do đó quan sát thấy hình ảnh mô bệnh học tương tự hoặc thậm chí tốt hơn so với nhóm đối chứng ( Hình 3 a). Hơn nữa, khoảng cách gia tăng giữa các ống lân cận và lòng ống bất thường đã được quan sát thấy ở nhóm đối chứng ( Hình 3 a). Phương pháp điều trị đồng thời AX bảo tồn hình dạng hiển vi điện tử bình thường của gan tụy, tạo ra mô học tương tự hoặc thậm chí tốt hơn so với mô học được quan sát thấy ở nhóm đối chứng ( Hình 3 c–e)
Hình 3. Gan tụy từ khẩu phần thí nghiệm được điều trị bằng L. vannamei . ( a ) Gan tụy của tôm được nuôi bằng chế độ ăn contol trong 50 ngày ( b ) Gan tụy của tôm được nuôi bằng chế độ ăn dầu cá bị oxy hóa trong 50 ngày. Thanh = 50 m. Các tế bào biểu mô ống gan tụy bị bong nhiều không bào và một số bị vỡ. Sự hắc tố của các tế bào biểu mô đã xuất hiện. ( c ) Gan tụy từ tôm được nuôi bằng dầu cá oxy hóa + chế độ ăn AX 150 mg/kg trong 50 ngày. Thanh = 50 m. Mặt cắt ngang của vùng giữa của ống thận cho thấy các ống được sắp xếp hợp lý và xuất hiện dưới dạng hình ngôi sao trong lòng ống. Các loại tế bào khác nhau có thể được quan sát và số lượng của các tế bào này nhiều hơn nhóm đối chứng và nhóm OFO. ( d ) Gan tụy từ tôm được nuôi bằng dầu cá oxy hóa + chế độ ăn AX 250 mg/kg trong 50 ngày. Thanh = 50 m. ( e ) Gan tụy từ tôm được nuôi bằng dầu cá oxy hóa + chế độ ăn AX 450 mg/kg trong 50 ngày. Thanh = 50 m. Cả ( e ) và ( f ) đều cho thấy các ống thận thường xuất hiện dưới dạng hình ngôi sao trong lòng. Các loại tế bào khác nhau cũng có thể được quan sát. ALU, lumen bất thường; BL, lamina cơ bản; REc, tế bào biểu mô bị vỡ; Mel, làm hắc tố tế bào; *, hình dạng ngôi sao của lòng tế bào; *, hình ngôi sao của lòng.
Phân tích TEM đã chứng minh rằng trong gan tụy của tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO và OFO/AX450 trong 50 ngày, mạng lưới nội chất thô ở nhiều tế bào B trải qua quá trình sưng tấy và nổi mụn nước rõ rệt và cho thấy các không bào lớn, các lớp vỏ bên trong của ty thể giảm, các cristae biến mất trong những trường hợp nghiêm trọng và cấu trúc RER mờ ( Hình 4 a,b). Việc bổ sung OFO/AX450 trong chế độ ăn uống làm giảm tổn thương gan tụy do OFO gây ra ( Hình 4 c, d).
Hình 4. Gan tụy từ khẩu phần thử nghiệm được điều trị bằng Litopenaeus vannamei . a – d TEM ( a ) và ( b ). Gan tụy từ tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO trong 50 ngày. Các tế bào gan cho thấy phù nề vừa phải, màng tế bào nguyên vẹn, sưng tấy vừa phải và có không bào của các bào quan trong tế bào chất, nhiều không bào hơn trong tế bào và mật độ electron cục bộ giảm. Ty thể (M) có biểu hiện sưng nhẹ, hầu hết chất nền ty thể yếu đi một chút, các cristae bên trong giảm và các cristae biến mất trong những trường hợp nặng; cấu trúc RER mờ nhạt. Glycogen (GL) dồi dào. Autophagy (AP) rất phong phú. Các giọt lipid (LD) hiện diện riêng lẻ. Có nhiều lysosome (L) và lysosome thứ cấp (SL). ( c ) và ( d ) Gan tụy từ tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO/AX450 trong 56 ngày. Tế bào gan có biểu hiện phù nề nhẹ, màng tế bào nguyên vẹn, các cơ quan nội bào sưng nhẹ và có một số không bào. autophagy (AP), ty thể (M), không bào lớn (V), nucleoli (Nu), nhân (N), Glycogen (GL), lysosome (L), lysosome thứ cấp (SL), mạng lưới nội chất thô (RER).
3. Thảo luận
Nghiên cứu hiện tại điều tra xem liệu chất bổ sung Astaxanthin có mang lại sự bảo vệ chống lại tác động mãn tính của chế độ ăn OFO đối với hiệu suất tăng trưởng và nhiễm độc gan ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương hay không. Chế độ ăn OFO có liên quan đến việc giảm khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng [ 28 ] và giá trị dinh dưỡng thấp của nguyên liệu thức ăn, bằng cách phá hủy hàm lượng PUFA và các thành phần thực phẩm thiết yếu khác [ 29 ]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng việc cho ăn chất béo bị oxy hóa không làm giảm sự tăng trưởng của một số loài cá khác nhau [ 12 , 30 , 31 ]. Ngược lại, sự giảm tăng trưởng do OFO gây ra cũng được quan sát thấy ở một số động vật thủy sinh, bao gồm cá giống Labeo rohita [ 32 ], Pagrus Major [ 33 ] và M. salmoide [ 34 ]. Yang và cộng sự. (2015) đã chứng minh sự giảm tăng trưởng đáng kể ở tôm thẻ L. vannamei non được nuôi bằng chế độ ăn OFO (giá trị peroxide (POV): 234,84 meq/kg) [ 35 ]. Việc giảm tăng trọng ở vật nuôi được nuôi bằng lipid bị oxy hóa trong khẩu phần ăn có thể là do khẩu vị thay đổi, dẫn đến năng suất tăng trưởng kém [ 21 , 24 , 27 ].
Astaxanthin trong chế độ ăn uống, như một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, có thể tăng cường sử dụng chất dinh dưỡng và cuối cùng là cải thiện sự tăng trưởng. Ngoài ra, AX có thể tăng khả năng chịu đựng căng thẳng và đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất trung gian của động vật thủy sinh [ 36 , 37 , 38 ]. Trong nghiên cứu này, việc bổ sung đầy đủ AX trong chế độ ăn OFO cải thiện đáng kể hiệu suất tăng trưởng của L. vannamei . Astaxanthin có chức năng tương tự như Vitamin E [ 39 ] và Selenium (Se) [ 40 ] trong việc bảo vệ quá trình oxy hóa lipid, từ đó tối đa hóa khả năng cung cấp chất dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của L. vannamei [ 6 , 10 ].
Thử nghiệm các chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) được sử dụng rộng rãi như một xét nghiệm duy nhất để đo MDA của sản phẩm phụ peroxid hóa lipid. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ ra rằng mức MDA trong bệnh tan máu tăng đáng kể ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO, cho thấy rằng OFO gây ra trạng thái căng thẳng oxy hóa. Chế độ ăn AX loại bỏ mức độ peroxid hóa lipid, vì mức MDA giảm trong bạch huyết của tôm khi AX được đưa vào chế độ ăn OFO. Tương tự như nghiên cứu của chúng tôi, các nhà nghiên cứu khác đã ghi nhận rằng mức TBARS tăng lên trong huyết thanh và gan do quá trình oxy hóa dầu trong chế độ ăn uống [ 21 , 24 , 27 ]. CAT là một trong những enzyme chống oxy hóa chính chịu trách nhiệm loại bỏ các loại oxy phản ứng (ROS) và đóng vai trò như một cơ chế bảo vệ để tránh tổn thương mô do các gốc tự do và quá trình thực bào gây ra [ 5 ]. Chúng tôi cho thấy rằng hoạt động CAT trong bệnh tan máu của tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO giảm đáng kể. Kết quả này chỉ ra rằng, theo chế độ ăn OFO, khả năng loại bỏ các gốc tự do của tôm giảm đáng kể. Là một chất chống oxy hóa sinh học mạnh mẽ, nồng độ vừa phải của Astaxanthin trong chế độ ăn có thể ức chế sự tích lũy MDA và do đó làm giảm hoạt động CAT được quan sát thấy. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng Astaxanthin có hoạt tính dập tắt O tự do mạnh và Astaxanthin trong chế độ ăn uống có thể làm giảm căng thẳng oxy hóa [ 6 , 10 ]. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng chế độ ăn AX có thể làm giảm một phần căng thẳng oxy hóa do chế độ ăn OFO gây ra ở L. vannamei , điều này có thể giúp giảm thiệt hại do các loài oxy phản ứng gây ra.
Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng chế độ ăn Astaxanthin có thể tăng cường khả năng chịu stress ở động vật thủy sản. Pan và cộng sự. (2003) và Chiến và Shiau (2005) cho thấy P. monodon được nuôi bằng chế độ ăn AX có tỷ lệ sống tăng lên sau các thử thách về nhiệt, thẩm thấu, amoniac và oxy hòa tan (DO) thấp [ 41 , 42 ]. Chiến và Shiau (2005) cho rằng trong điều kiện DO thấp, M. Japonicus được nuôi bằng chế độ ăn tảo hoặc AX tổng hợp có thời gian sống sót lâu hơn nhóm đối chứng [ 41 ]. Trong thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính, chúng tôi cho thấy tôm được nuôi bằng chế độ ăn OFO có tỷ lệ sống thấp hơn so với nhóm đối chứng, trong khi tôm được nuôi bằng chất bổ sung AX có tỷ lệ sống cao hơn so với nhóm OFO. Những kết quả này chỉ ra rằng việc bổ sung AX có thể cải thiện khả năng chống chịu kém với stress mặn ở tôm được nuôi bằng OFO.
Người ta biết rõ rằng OFO có thể gây ra những thay đổi bệnh lý ở gan tụy của các sinh vật trên cạn và dưới nước. Chen và cộng sự. (2012) cho rằng căng thẳng oxy hóa gia tăng ở M. salmoides được nuôi bằng lipid bị oxy hóa có thể là nguyên nhân gây ra những thay đổi bệnh lý quan sát được [ 43 ]. Gan tụy là một cơ quan tiêu hóa quan trọng có một số chức năng, bao gồm hấp thu, tiêu hóa, dự trữ, bài tiết và giải độc ở động vật giáp xác [ 44 , 45 ]. Gan tụy chủ yếu bao gồm các ống phân nhánh và các loại tế bào biểu mô khác nhau lót trong ống. Gan tụy của loài giáp xác rất nhạy cảm với các chất ô nhiễm sinh ra từ chế độ ăn uống và thường được sử dụng để theo dõi tác động của các chất độc khác nhau [ 46 ]. Trong nghiên cứu này, việc kiểm tra mô học ở tôm theo chế độ ăn OFO cho thấy các đặc điểm thoái hóa ở ống thận và tế bào biểu mô của gan tụy, nhưng việc bổ sung Astaxanthin vào chế độ ăn sẽ làm giảm những thay đổi mô bệnh học này ( Hình 3 ). Từ phân tích TEM, chúng tôi phát hiện thấy mạng lưới nội chất thô trong tế bào B bị sưng tấy và phồng rộp rõ rệt. Những kết quả này cho thấy tôm có thể được hưởng lợi từ chế độ ăn AX bằng cách cải thiện mọi thay đổi bệnh lý liên quan đến lipid bị oxy hóa.
Theo Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia (2011) [ 47 ], chế độ ăn có chứa lipid bị oxy hóa có thể được coi là thiếu axit béo thiết yếu. Trong nghiên cứu hiện tại, thành phần axit béo trong cơ và AX trong vỏ đã được thay đổi khi bổ sung OFO và AX trong chế độ ăn uống. UFA của cơ đạt giá trị cao nhất trong chế độ ăn kiêng OFO + AX250 và cao hơn đáng kể so với chế độ ăn kiêng OFO. Hàm lượng Astaxanthin hiện tại đã giảm từ 1,24 mg/kg trong chế độ ăn đối chứng xuống 0,72 mg/kg trong chế độ ăn OFO, điều này có thể chỉ ra rằng tôm tiêu thụ chất bổ sung AX có thể chống lại stress oxy hóa. Phân tích tương quan cho thấy MDA gan tụy không chỉ có mối tương quan dương rất đáng kể với UFA mà còn có mối tương quan nghịch đáng kể với tỷ lệ sống sót trong thử nghiệm cho ăn hoặc sau thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính. Điều này có thể gợi ý rằng tỷ lệ chết và khả năng chịu stress có liên quan đến quá trình peroxid hóa lipid ở gan tụy. Tỷ lệ sống sau thử nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính có mối tương quan dương đáng kể với hàm lượng AX trong vỏ, điều này cho thấy mối quan hệ trực tiếp hoặc gián tiếp giữa AX và khả năng chịu stress. Nồng độ Astaxanthin được lưu trữ trong tôm tăng lên khi tăng mức AX trong khẩu phần ăn. Hơn nữa, Astaxanthin có thể làm giảm quá trình peroxid hóa lipid ở mô và các sản phẩm peroxid hóa lipid giảm có thể giúp bảo vệ hàm lượng UFA trong cơ khỏi tác động bất lợi của quá trình oxy hóa. Do đó, nghiên cứu hiện tại đưa ra giả thuyết rằng Astaxanthin có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc giải độc quá trình peroxid hóa do dầu cá bị oxy hóa trong chế độ ăn uống.
4. Vật liệu và phương pháp
4.1. Chuẩn bị chế độ ăn kiêng
Tôm thẻ được cho ăn bằng 5 chế độ ăn isonitrogenous và isolipidic. Chế độ ăn được xây dựng với các mức độ khác nhau của dầu cá bị oxy hóa và/hoặc chất bổ sung astaxanthin (AX) (Lucantin @Pink10%; BASF SE, Ludwigshafen, Đức). Các điều kiện ăn uống như sau: (i) OFO (dầu cá bị oxy hóa); (ii) OFO/AX150 (dầu cá oxy hóa + AX150 mg/kg); (iii) OFO/AX250 (dầu cá oxy hóa + AX250 mg/kg); (iv) OFO/AX450 (dầu cá oxy hóa + AX450 mg/kg); và (v) nhóm đối chứng (dầu cá tươi) ( Bảng 4 ). Giá trị peroxide của dầu cá bị oxy hóa là 275,2 meq/kg. Mỗi chế độ ăn được cho ăn bốn nhóm tôm. Tóm lại, tất cả các thành phần bột được cân chính xác, trộn kỹ, sau đó thêm lipid và nước vào. Các viên ép đùn nguội (đường kính 1,2 mm) được làm khô trong không khí đến độ ẩm khoảng 10%. Các viên khô được đặt trong túi đóng gói chân không và bảo quản ở -20 ° C cho đến khi sử dụng. Tổng cộng 40 g của mỗi chế độ ăn đã được lấy mẫu để phân tích thành phần sinh hóa [ 48 ].
Bảng 4. Thành phần và mức dinh dưỡng của các khẩu phần thí nghiệm.
Dầu cá oxy hóa được điều chế như sau: (1) dầu cá bị oxy hóa bằng cách đun nóng ở 70°C trong điều kiện sục khí mạnh; (2) Sau 36 giờ, giá trị peroxide (POV) được theo dõi cứ sau 8 giờ cho đến khi đạt được mức oxy hóa cao (275,2 meq/kg). Giá trị peroxide được xác định theo AOAC. Tóm lại, 5 g dầu, 0,5 mL dung dịch KI bão hòa và 30 mL hỗn hợp dung môi bao gồm axit axetic và cloroform (3:2) được kết hợp. Chuẩn độ được thực hiện bằng Na2S2O3 0,1 mol/L, sử dụng chỉ thị tinh bột 1%. Theo cách tương tự, chúng tôi lặp lại điều này với thử nghiệm trắng thuốc thử. Sau đó, chúng tôi tính toán và phân tích kết quả đo. Tính toán: X = [( V − V 0) × N × 0,1269]/m ( X : Giá trị peroxide của mẫu, %. V : Thể tích dung dịch natri thiosulfate mà mẫu đã tiêu thụ, mL. V 0: Thể tích mẫu trắng lượng tiêu thụ dung dịch natri thiosulfate, mL.N : Nồng độ mol của dung dịch chuẩn natri thiosulfate, mol/L.) [ 33 ].
4.2. Tôm và điều kiện thí nghiệm
Nguồn tôm L. vannamei non được cung cấp bởi Evergreen South Ocean Tech Co. Ltd, Zhan-jiang, Trung Quốc. Trước thí nghiệm, tôm đã được làm quen với môi trường mới bằng cách thả chúng vào bể trong hai tuần, cho ăn bằng chế độ ăn thương mại (Nhóm thường xanh Quảng Đông, Zhan-jiang, Trung Quốc) và cung cấp nước biển lọc tuần hoàn có sục khí. Sau đó, tôm (khối lượng ban đầu là 0,53 g) được phân ngẫu nhiên vào 20 bể sợi thủy tinh (300 L, đáy 0,6 m2 , 4 bể mỗi khẩu phần, 30 con tôm mỗi bể). Tất cả các nhóm được cho ăn bằng tay bốn lần một ngày (lúc 7 giờ, 12 giờ, 17 giờ và 21 giờ) bằng tay, với tổng lượng thức ăn chiếm khoảng 9% trọng lượng cơ thể. Để duy trì điều kiện nuôi cấy thích hợp, tất cả thức ăn thừa và phân đều được hút ra ngoài trong suốt thời gian thử nghiệm 50 ngày.
Trong thời gian thí nghiệm, nhiệt độ dao động từ 27 đến 30 °C, độ mặn khoảng 27‰ –30‰, pH 7,7–8,0, nitơ – amoniac không quá 0,05 mg/L và oxy hòa tan không dưới 6,5 mg/ L.
4.3. Bộ sưu tập mẫu
Tất cả tôm được nhịn ăn trong 24 giờ trước khi lấy mẫu. Trong quá trình lấy mẫu, tôm được cân riêng lẻ và thu thập để phân tích thêm. Đối với mỗi bể, 5 con tôm được thu thập ngẫu nhiên để phân tích hàm lượng Astaxanthin vỏ và axit béo trong cơ (FA), trong khi 6 con tôm được thu thập ngẫu nhiên để lấy mẫu máu và gan tụy. Máu huyết được lấy mẫu từ khoang bụng hoặc xung quanh tâm thất bằng ống tiêm 1 mL. Các mẫu tan máu được giữ nguyên trong tủ lạnh trong 24 giờ ở 4°C và sau đó ly tâm trong 10 phút (4°C, 8000 vòng/phút). Chất nổi phía trên được sử dụng để phân tích hoạt tính enzyme và hàm lượng malondialdehyd (MDA). Sáu mẫu gan tụy ngay lập tức được đặt vào nitơ lỏng và được bảo quản ở −80 ° C. Trước khi phân tích hoạt động của enzyme, gan tụy của mỗi con tôm được cân riêng lẻ (0,5 g) và đồng nhất hóa trong dung dịch đệm photphat 10× (w/v) (0,1 mol L -1 , pH 6,4) trong nước đá. Dịch đồng nhất được ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút) ở 4°C và một phần dịch nổi phía trên được sử dụng để xác định MDA ở gan.
4.4. Nghiên cứu mô bệnh học
Gan tụy được lấy mẫu của ba con tôm (mỗi bể) được cố định trong formalin trung tính 4% và sau đó được nhúng vào parafin. Các phần mô (độ dày 8 μm) của gan tụy được nhuộm bằng vết hematoxylin và eosin (H&E) và các phiến kính cuối cùng được kiểm tra dưới kính hiển vi ánh sáng để tìm các tổn thương mô bệnh học.
Đối với kính hiển vi TEM, mẫu vật được cố định trong 2,5% glutaraldehyde với dung dịch đệm photphat 0,1 M và được cố định sau trong 1% OsO 4 . Các mẫu thử được nhúng trong nhựa epoxy trung bình của Spurr sau khi khử nước trong axeton đã được phân loại (Polysciences Ltd., Warrington, PA, USA). Máy siêu âm Leica UCT được sử dụng để cắt các phần siêu mỏng, sau đó các phần siêu mỏng được nhuộm bằng chì citrate và dung dịch bão hòa uranylacetate trong ethanol 50%. Các phần siêu mỏng sau đó được sàng lọc bằng TEM (FEI Tecnai G2 20, Hà Lan) ở 150 kV và hình ảnh được thu lại bằng camera Megaview III (SIS GmbH), được trang bị phần mềm AnalySIS.
4.5. Thành phần axit béo
Tổng lipid được chiết bằng cloroform: metanol (2:1, v/v). Phương pháp sắc ký khí mao quản (GC) được sử dụng để xác định thành phần axit béo. Máy HP6890 (máy dò FID; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) và cột SPTM-2380 (30 m × 0,25 mm × 0,20 µm) đã được sử dụng trên máy GC. Việc tách được thực hiện với nitơ làm khí mang. Nhiệt độ của cột tăng từ 140 đến 240 °C ở 4 °C phút -1 , giữ ở 140 °C trong 5 phút và ở 240 °C trong 10 phút, với máy dò ở 260 °C. Sử dụng kim phun chia dòng (50:1) ở 260°C. Mỗi axit béo được xác định bằng thời gian lưu theo tiêu chuẩn sắc ký (Sigma, Northampton, UK). Diện tích cực đại được xác định bằng phần mềm Varian (Varian, Inc., Palo Alto, CA, USA). Nồng độ của từng axit béo được biểu thị bằng phần trăm của tổng số axit béo.
4.6. Thành phần Astaxanthin của vỏ
Theo phương pháp của Chiến và Shiau (2005) [ 41 ], vỏ của 10 con tôm trong mỗi bể được mổ xẻ, đông khô, băm nhỏ và cho vào ống ly tâm polypropylen 50 mL. Dung môi axeton (20 mL) được thêm vào mỗi ống để đồng nhất hóa hỗn hợp (Polytron PT-MR-3000; PT. Hartono IstanaTeknologi, Indonesia) ở tốc độ 12700× g trong 1 phút và sau đó ly tâm (Hitachi 18 PR-52; Hitachi Ltd ., Tokyo, Nhật Bản) ở tốc độ 12700× g trong 5 phút. Các viên được tạo huyền phù lại và ly tâm với thêm 20 mL axeton, cho đến khi dịch chiết axeton trong suốt. Dịch chiết axeton gộp lại được chuyển vào phễu tách 250mL được phân chia bằng 30mL n-hexan và rửa ba lần bằng NaCl 10% để loại bỏ axeton còn sót lại. Sau đó, dịch chiết được giảm xuống còn 10 mL bằng thiết bị bay hơi quay. Sau đó, dịch chiết được lọc qua bộ lọc Millipore 0,2 Am và được bảo quản trong ba lọ màu nâu 2 mL. Hàm lượng AX được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Agilent 1200; Công nghệ Agilent, Waldbronn, Đức). Tiêu chuẩn của Astaxanthin tinh khiết về mặt sắc ký được mua từ Sigma-Aldrich Co. LLC (St. Louis, MO, USA). Điều kiện HPLC được điều chỉnh theo phương pháp trước đây của Yuan et al. (1996) [ 49 ]. Các đỉnh sắc ký được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu với các tiêu chuẩn đã biết.
4.7. Xét nghiệm hoạt tính enzyme và peroxid hóa lipid
Quá trình peroxid hóa lipid (LPO) được đánh giá bằng cách đo các chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) trong phản ứng đun nóng axit, như mô tả trước đây của Esterbauer và Cheeseman (1990) [ 50 ]. Việc xác định hàm lượng LPO trong tôm được thực hiện bằng bộ phát hiện MDA (A003-1, Viện Kỹ thuật Sinh học Jian-Cheng, Nan jing, Trung Quốc). Các kết quả được biểu thị bằng nmol MDA tương đương trên mỗi miligam protein của gan tụy và mmol MDA tương đương trên mỗi lít máu tan máu.
Hoạt tính Catalase (CAT) được xác định bằng cách sử dụng bộ thử nghiệm (Viện Công nghệ sinh học Jian-Cheng, Nan jing, Trung Quốc). Hoạt động CAT của mô được đo bằng phương pháp đo quang phổ ở 405 bằng đầu đọc vi bản SpectraMax M5 (Thiết bị phân tử, Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Một đơn vị hoạt độ CAT được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác quá trình phân hủy 1,0 μmol H 2 O 2 mỗi phút. Kết quả được biểu thị bằng U/L của lượng máu tan [ 48 ].
Hoạt động của iNOS được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm iNOS (Viện kỹ thuật sinh học JianThành, Nam Kinh, Trung Quốc). Tóm lại, 10% chất đồng nhất não (30 μL) hoặc huyết thanh (15 μL) được trộn với dung dịch làm việc được cung cấp trong bộ sản phẩm và sau khi ủ ở 37°C trong 15 phút, phản ứng đã kết thúc bằng cách thêm dung dịch kết thúc được cung cấp trong bộ sản phẩm. bộ dụng cụ. Độ hấp thụ ở bước sóng 530nm được ghi lại trên máy quang phổ Hitachi U-2010 (Tokyo, Nhật Bản) và hoạt động iNOS được tính toán theo tham chiếu của đường cong chuẩn. Lượng NO tạo ra trong các mẫu được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm.
4.8. Thí nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính
Tổng cộng 10 con tôm trong mỗi bể được chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm thay đổi độ mặn cấp tính. Thử nghiệm liên quan đến việc giảm độ mặn ngay lập tức từ 29% xuống 10% bằng cách thêm nước ngọt khử clo. Tôm được theo dõi cẩn thận và tỷ lệ tử vong được ghi lại trong toàn bộ thí nghiệm kéo dài 5 giờ.
4.9. Tính toán và phân tích thống kê
Các thông số được tính toán như sau:
Phần trăm tăng cân (WG, %) = 100 × ( Wt − Wi )/ Wi
Tốc độ tăng trưởng riêng (SGR, % ngày −1 ) = 100 × (Ln Wt − Ln Wi )/ t
Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) = thức ăn tiêu thụ (g, trọng lượng khô)/tăng trọng (g, trọng lượng ướt)
Tỷ lệ sống (%) = 100 × (số lượng tôm cuối cùng)/(số lượng tôm ban đầu)
trong đó Wt là trọng lượng cơ thể cuối cùng (g), Wi là trọng lượng cơ thể ban đầu (g) và t là thời gian thử nghiệm tính bằng ngày.
Các phân tích của tất cả dữ liệu bao gồm kiểm tra tính đồng nhất và nếu quan sát thấy các phương sai tương tự, ANOVA một chiều sẽ được thực hiện để xác định tác động chính của việc điều chỉnh chế độ ăn uống. Khi sự khác biệt đáng kể ( P 0,05) xuất hiện sau ANOVA một chiều, phương tiện của nhóm được so sánh sâu hơn bằng cách sử dụng thử nghiệm đa phạm vi của Duncan. Mặt khác, nếu dữ liệu không có phương sai tương tự, thử nghiệm Kruskal–Wallis phi tham số sẽ được áp dụng, sau đó là so sánh nhiều cặp theo cặp nếu kết quả của thử nghiệm Kruskal–Wallis cho thấy sự khác biệt đáng kể ( P 0,05). Các phân tích tương quan cũng được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các thông số sinh hóa. Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) và kết quả được trình bày dưới dạng phương tiện ± SEM.
5. Kết Luận
Nhìn chung, nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng dầu cá bị oxy hóa trong khẩu phần ăn (POV: 275,2 meq/kg) có thể gây ra những thay đổi mô bệnh học rõ ràng và stress oxy hóa ở tôm thẻ L. vannamei . Hơn nữa, Astaxanthin trong chế độ ăn có thể cải thiện những tác động này bằng cách tăng hoạt động CAT và giảm tích lũy MDA trong huyết tương của tôm. Tôm được nuôi bằng chế độ ăn Astaxanthin có khả năng tốt hơn để duy trì thử nghiệm khả năng chịu stress độ mặn cấp tính. Cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác minh cơ chế tiềm năng của AX trong việc giảm bớt tình trạng oxy hóa và nhiễm độc gan ở tôm và các loài giáp xác khác.
by Yingying Yu 1,2,3,Yang Liu 2,Peng Yin 1,Weiwen Zhou 1,Lixia Tian 1,Yongjian Liu 1,Donghui Xu 3 andJin Niu 1,*ORCID
1
State Key Laboratory of Biocontrol, Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals, School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
2
Guangdong Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precision Breeding, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528225, Guangdong, China
3
Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Marine Drugs, Department of Biochemistry, Traditional Chinese Medicine and Marine Drugs, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China