นาโนแอสตาแซนธิน มีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งกว่า อายุการใช้งานยาวนานกว่า และความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระได้ดีกว่าแอสตาแซนธิน
การศึกษาปัจจุบันนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อศึกษาผลของนาโนอนุภาคไคโตซาน (CS)-ไตรโพลีฟอสเฟต (TPP) (NPs) ต่อความเสถียร กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ และการดูดซึมของแอสตาแซนธิน (ASX) สาร นาโนแอสตาแซนธิน – ไคโตซาน – TPP ที่บรรจุ ASX (ACT) (ACT-NPs) ถูกเตรียมโดยวิธีการเจลไอออนระหว่าง CS (0.571 มก./มล.) และ TPP (0.571 มก./มล.) ซึ่งให้ขนาดอนุภาค ศักย์ซีตา ดัชนีการกระจายตัว และประสิทธิภาพความเข้มข้นระดับนาโนที่ 505.2 ± 184.8 นาโนเมตร 20.4 ± 1.2 มิลลิโวลต์ 0.348 ± 0.044 และ 63.9 ± 3.0% ตามลำดับ การศึกษาการปล่อยสารในหลอดทดลองยืนยันว่าการปล่อย ASX ในน้ำย่อยในกระเพาะอาหารจำลอง (pH 1.2) และในน้ำย่อยลำไส้ (pH 6.8) ยาวนานขึ้นใน ACT-NP กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลองของ ACT-NP ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ ASX ฟรี (FA) (p < 0.05) นอกจากนี้ การวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระในระดับเซลล์และในร่างกายยังยืนยันว่า นาโนแอสตาแซนธิน สามารถเพิ่มผลการปกป้องเซลล์บนเซลล์สายพันธุ์ BHK-21 ได้ และแสดงให้เห็นคุณสมบัติการปลดปล่อยแบบยั่งยืน ส่งผลให้ระยะเวลาคงอยู่ในพลาสมาของหนูนานขึ้น ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเสถียรภาพ คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ และการดูดซึมของ ASX สามารถเพิ่มขึ้นได้อย่างมีประสิทธิภาพผ่านการสร้าง นาโนแอสตาแซนธิน ให้เป็นนาโน
1.แนะนำ
แอสตาแซนธิน (3,3′-dihydroxy-β-β′-carotene-4-4′-dione, ASX) ซึ่งเป็นเม็ดสีแคโรทีนอยด์ตามธรรมชาติที่พบได้ทั่วไปในสิ่งมีชีวิตในทะเล รวมทั้งกุ้ง ปู ปลาช่อน และปลาแซลมอน เป็นสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติที่มีประสิทธิภาพ [ 1 ] โครงสร้างแบบขั้วของ ASX ซึ่งเกิดจากกลุ่มไฮดรอกซิล (OH) และคาร์บอนิล (C=O) ของวงแหวนไอออนิกแต่ละวง ได้รับการรายงานว่าแสดงกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่สูงกว่าเบตาแคโรทีน โทโคฟีรอล และกรดแอสคอร์บิก (รูปที่ 1) [2, 3] ยิ่งไปกว่านั้น ยังมีการรายงานถึงกิจกรรมทางสรีรวิทยาต่างๆ ของ ASX เช่น การต้านการอักเสบ ต้านมะเร็ง และปรับภูมิคุ้มกัน ซึ่งแสดงออกมาจากผลต้านอนุมูลอิสระในระดับสูง [ 4 ] อย่างไรก็ตาม แม้จะมีผลประโยชน์ต่างๆ มากมาย แต่การละลายน้ำที่ไม่ดีซึ่งส่งผลให้มีอัตราการดูดซึมในร่างกายต่ำนั้นเป็นข้อจำกัดของการใช้ ASX เป็นวัสดุฟังก์ชันที่มีศักยภาพในอาหาร [ 5 ] นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ยังรายงานว่า ASX สลายตัวได้ง่ายภายใต้อิทธิพลของความร้อน แสง และออกซิเจน เนื่องจากมีพันธะคู่คาร์บอน-คาร์บอนคอนจูเกต 11 พันธะ [ 6 ] ดังนั้น การเอาชนะความไม่ละลายน้ำและความไม่เสถียรของ ASX จึงได้รับการศึกษาว่าถือเป็นภารกิจสำคัญที่ต้องแก้ไข เพื่อให้สามารถนำมาใช้เป็นส่วนผสมของอาหารหรือยาที่มีประสิทธิภาพได้ [ 7 , 8 ].
นาโนเอ็นแคปซูเลชั่นคือเทคโนโลยีการห่อหุ้มสารประกอบชีวภาพลงในโครงสร้างขนาดนาโนที่ทำจากวัสดุผนังอื่นๆ [ 9 ] เนื่องจากผลการปกป้องของวัสดุผนังและพื้นที่ผิวที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากตัวพาที่มีขนาดนาโน นาโนเอ็นแคปซูเลชั่นจึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับระบบการส่งมอบที่มีศักยภาพเพื่อเพิ่มความสามารถในการละลาย ความเสถียร และการดูดซึมของวัสดุชีวภาพ [ 10 ] เมื่อไม่นานมานี้ มีรายงานการศึกษามากมายที่นำเทคนิคทางเคมีระดับนาโนมาประยุกต์ใช้กับ ASX เช่น นาโนอนุภาคโพลีแลกติกโคไกลโคลิกแอซิด (PLGA) (NPs) [ 11] และนาโนแคริเออร์แบบลิพิดรวมทั้งนาโนไลโปโซม [ 12] นาโนอิมัลชัน [ 13] และตัวพาลิพิดที่มีโครงสร้างระดับนาโน [ 14] แม้ว่าการศึกษาเหล่านี้จะแสดงให้เห็นผลลัพธ์ในด้านความเสถียรที่เพิ่มขึ้น กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ และการดูดซับ ASX แต่กระบวนการและวัสดุถือว่าไม่เหมาะสมสำหรับการใช้ในอาหารซึ่งต้องได้รับความปลอดภัยในระดับสูงเนื่องจากการใช้โพลีเมอร์สังเคราะห์และสารลดแรงตึงผิว [ 15 , 16 ] นอกจากนี้ ไลโปโซมยังมีข้อจำกัดบางประการ เช่น มีเสถียรภาพต่ำ และประสิทธิภาพนาโนไนเซชันต่ำ [ 17 ]
ในทางกลับกัน NP ที่ใช้โพลีแซ็กคาไรด์ธรรมชาติ เช่น ไคโตซาน (CS) ถือเป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการใช้ในอาหาร เนื่องจากกระบวนการผลิตไม่มีพิษ ย่อยสลายได้ทางชีวภาพ เข้ากันได้ทางชีวภาพ และประหยัด [ 18 ] CS ผลิตโดยการดีอะเซทิลเลชันของไคตินที่ได้จากเปลือกปูหรือกุ้ง เป็นไบโอโพลิเมอร์ประจุบวกที่ย่อยสลายได้ทางชีวภาพ เนื่องจากคุณสมบัติการชาร์จประจุบวกในสารละลายกรด CS จึงสามารถสร้าง NP ได้โดยอาศัยปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตกับโพลีเมอร์ประจุลบที่มีประจุตรงข้าม CS-NPs ได้รับการศึกษาวิจัยเกี่ยวกับการปรับนาโนวัสดุฟังก์ชันต่างๆ เช่น เรสเวอราทรอล เคอร์ซิติน และเคอร์คูมิน เพื่อปรับปรุงความสามารถในการละลายน้ำและความเสถียรต่ออุณหภูมิและสภาพแวดล้อมในระบบทางเดินอาหาร [ 19 , 20 , 21 ] นอกจากนี้ CS-NPs ยังได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางในฐานะระบบการขนส่งเนื่องจากลักษณะประจุบวกซึ่งมีความสัมพันธ์อย่างแข็งแกร่งกับเยื่อหุ้มเซลล์ประจุลบ ส่งผลให้การยึดเกาะของเยื่อเมือกและการดูดซึมทางชีวภาพดีขึ้น ทั้งภายนอกและในร่างกาย [ 22 ] อย่างไรก็ตาม มีเพียงไม่กี่การศึกษาที่พยายามตรวจสอบการสร้างนาโนสูตรของ ASX ใน CS-NP เพื่อเพิ่มความเสถียร กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ และการดูดซึมทางชีวภาพ [ 23 , 24 ]
ดังนั้น จุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือการสรุป ASX ไว้ใน CS-NP เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ CS-NP ต่อการกระจายทางชีวภาพและกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX CS-NP ที่บรรจุ ASX ได้รับการเตรียมโดยใช้โซเดียมไตรโพลีฟอสเฟต (TPP) ซึ่งเป็นหนึ่งในโพลีเมอร์แอนไออนิกที่ไม่เป็นพิษที่มีประสิทธิภาพสูงสุดสำหรับการเชื่อมโยงแบบไอออนิกกับกลุ่มอะมิโนแคตไอออนของ CS [ 21 ] ลักษณะทางฟิสิกเคมี รวมถึงลักษณะเฉพาะของ CS-TPP NPs ที่บรรจุ ASX (ACT-NPs) ได้รับการตรวจสอบแล้ว ได้แก่ ขนาดของอนุภาค ศักย์ซีตา (ZP) ดัชนีการกระจายตัวของอนุภาคหลายแบบ (PDI) ประสิทธิภาพการปล่อยนาโน (EE) และคุณสมบัติการปล่อยในหลอดทดลอง นอกจากนี้ ผลของ ACT-NP ต่อฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ ASX ได้รับการตรวจสอบด้วยการใช้ลิพิดเปอร์ออกซิเดชันโดยใช้วิธีเฟอร์ริกไทโอไซยาเนต (FTC) และกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBA), การทดสอบกำจัดอนุมูลอิสระ 1,1-ไดฟีนิล-2-พิคริลไฮดราซิล (DPPH) และการป้องกันเซลล์ การจำแนกลักษณะและการทดสอบความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริกในพลาสมาในร่างกาย (FRAP)
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. วัตถุดิบ
ไคโตซาน (CS, 50–190 kDa, 24 cps, ลดลง 95%), โซเดียมไตรฟอสเฟต (TPP), 2,2-ไดฟีนิล-1-ไพคริล-ไฮดราซิล (DPPH), กรดไลโนเลอิก และโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ซื้อจากบริษัท Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา) แอสตาแซนธิน (ASX) ได้มาจาก Neo Cremar Co. (ซองนัม ประเทศเกาหลี) เซลล์ไตหนูแฮมสเตอร์เด็ก (BHK)-21 ได้รับจากธนาคารเซลล์เกาหลี (โซล เกาหลี) อาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle’s medium ดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM) และซีรั่มจากตัวอ่อนโค ได้รับมาจากบริษัท Gibco Invitrogen (แกรนด์ไอส์แลนด์ รัฐนิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) เพนิซิลลินสเตรปโตมัยซินและฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์ (PBS) ได้รับจาก Lonza (วอล์กเกอร์สวิลล์ รัฐแมริแลนด์ สหรัฐอเมริกา) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ซื้อจากบริษัท Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา) สารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดเป็นเกรดรีเอเจนต์ และตัวทำละลายทั้งหมดเป็นเกรด HPLC
2.2. การเตรียมสอบ ACT-NP
ACT-NPs ถูกเตรียมโดยวิธีการเจลไอออนโดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยจากการศึกษาครั้งก่อน [ 25 ] CS, ASX และ TPP ถูกแขวนลอยในกรดอะซิติก 1% (v/v) และน้ำดีไอออนไนซ์ (DW) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย ตามลำดับ (ตารางที่ 1) จากนั้น ผสมสารละลาย ASX ปริมาณ 0.5 มิลลิลิตรกับสารละลาย CS ปริมาณ 2 มิลลิลิตรโดยกวนด้วยแม่เหล็กที่ความเร็ว 1,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที แล้วเติมสารละลาย TPP ปริมาณ 4.5 มิลลิลิตรโดยใช้ปั๊มแบบยืดหยุ่นหลัก (Master flex 77200-60, Cole Parmer Inc., Vernon Hills, IL, USA) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตรต่อนาที
ตารางที่ 1 สภาวะการผลิตและคุณสมบัติของนาโนอนุภาคไคโตซานที่มีแอสตาแซนธินซึ่งผลิตด้วยความเข้มข้นของ TPP ต่างกัน a–d ตัวอักษรที่แตกต่างกันในคอลัมน์เดียวกันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)
2.3. ลักษณะเด่นของ ACT-NP
2.3.1. ขนาดอนุภาค ZP และ PDI ของ ACT-NP
ขนาดอนุภาค ZP และ PDI ของ NP ได้รับการวิเคราะห์โดยการกระเจิงแสงแบบไดนามิก (DLS) โดยใช้ Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, สหราชอาณาจักร) สารแขวนลอย ACT-NP ที่ได้มาทันทีหลังจากการเตรียมถูกถ่ายโอนเข้าสู่เซลล์ซีตาแบบใช้แล้วทิ้ง DTS 1060C เพื่อการวัด การวัดทั้งหมดดำเนินการในโหมดแคบหลายโหมดที่อุณหภูมิ 25 ± 1 °C
2.3.2. ประสิทธิภาพในระดับนาโนของ ACT-NP
สารแขวนลอย ACT-NP ถูกปั่นด้วยแรงเหวี่ยงสูงเป็นเวลา 30 นาทีที่ 30,000 × g และ 4 °C (Optima TL, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) หลังจากแยกส่วนของเหลวส่วนบนออกแล้ว ACT-NP จะถูกเก็บรวบรวมและทำการทำให้แห้งแบบแช่แข็ง (FD8508; Ilshin Co., Seoul, Korea) ACT-NP แบบแช่แข็งแห้ง (14 มก.) ถูกแขวนลอยในอะซิโตน 2.5 มล. เพื่อสกัด ASX ตามด้วยการวัด UV ที่ 478 นาโนเมตร (Biomate 3S; Thermo Scientific, เมดิสัน, WI, สหรัฐอเมริกา) ค่า EE ของ ACT-NP คำนวณได้จากสมการต่อไปนี้:
2.4. คุณสมบัติการปลดปล่อยในหลอดทดลอง
ใช้ของเหลวจำลองในกระเพาะอาหาร (SGF, pH 1.5) ที่มีไฮโดรเจนคลอไรด์ (HCl) 0.1 M และโซเดียมคลอไรด์ 0.05 M และของเหลวจำลองในลำไส้ (SIF, pH 6.8) ที่มีโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.1 M และบัฟเฟอร์โซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 0.05 M เพื่อศึกษาการปลดปล่อย ASX จาก ACT-NP โดยสรุป นาโนแอสตาแซนธิน ACT-NP แบบแช่แข็งแห้ง (20 มก.) ถูกแขวนลอยใน SGF และ SIF ปริมาตร 5 มล. ตามลำดับ แล้วเก็บในตู้ฟักแนวนอนที่อุณหภูมิ 37°C โดยคนด้วยความเร็ว 100 รอบต่อนาที เพื่อวิเคราะห์อัตราการปลดปล่อย ณ จุดเวลาที่กำหนดไว้ จะมีการสุ่มตัวอย่าง 2 มิลลิลิตรจากแต่ละตัวอย่างที่เวลา 2, 6 และ 12 ชั่วโมง จากนั้นจึงสกัด ASX ด้วยคลอโรฟอร์ม ความเข้มข้นของ ASX ที่ปล่อยออกมาจะถูกวัดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น อัตราส่วนการออก ASX คำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:
2.5. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง
2.5.1. การวิเคราะห์เปอร์ออกซิเดชันของไขมัน
ระบบจำลองกรดลิโนเลอิกถูกนำมาใช้เพื่อประเมินกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX ที่ไม่ได้หุ้มแคปซูลและหุ้มด้วยนาโนแคปซูล [ 26 ] ใช้ปริมาณทวีน 20 0.143 กรัม บัฟเฟอร์โพแทสเซียมฟอสเฟต 10 มิลลิลิตร (20 มิลลิโมลาร์ pH 7.0) กรดไลโนเลอิก 0.08 มิลลิลิตร และเอธานอล 30% 10 มิลลิลิตร เพื่อสร้างระบบจำลองสำหรับกิจกรรมการยับยั้งการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน ปรับปริมาตรเป็น 25 มล. โดยใช้ DW เติม ASX ฟรี (FA) และ ACT-NP ที่มี ASX 2 มก. ที่ชั่งน้ำหนักอย่างแม่นยำลงในระบบจำลองกรดลิโนเลอิกเป็นตัวอย่างทดสอบ ใช้ระบบจำลองกรดลิโนเลอิกที่ไม่มี FA และ ACT-NP เป็นตัวควบคุม ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการฟักที่อุณหภูมิ 40 ± 1 °C ในที่มืดเพื่อเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชัน จากนั้นจึงนำออกเป็นระยะๆ (2, 4, 6 วัน) เพื่อประมาณระดับออกซิเดชัน จึงกำหนดค่า FTC และ TBA
วิธี FTC ดำเนินการตามการศึกษาก่อนหน้านี้โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [ 27 ] ในวิธี FTC จะประมาณปริมาณของเปอร์ออกไซด์ที่ผลิตในระยะเริ่มต้นของการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของกรดลิโนเลอิก Fe 2+ จะถูกออกซิไดซ์ไปเป็น Fe 3+ โดยเปอร์ออกไซด์ และสารเชิงซ้อนไทโอไซยาเนตจะเกิดขึ้นเมื่อ Fe 3+ ทำปฏิกิริยากับไทโอไซยาเนต [ 28 ] นำสารละลายปฏิกิริยากรดลิโนเลอิกข้างต้น (20 μL) ออกเป็นระยะๆ และผสมกับสารละลายเฟอร์ริกคลอไรด์ 20 μL ความเข้มข้น 20 mM แอมโมเนียมไทโอไซยาเนต 30% (w/v) 20 μL ใน HCl 3.5% (v/v) และเอธานอล 75% (v/v) 1.14 มิลลิลิตร หลังจากฟักเป็นเวลาสามนาทีที่ 40 °C แล้ว จะวิเคราะห์ค่าการดูดกลืนแสงของส่วนผสมที่ 500 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต ELISA (ELx800UV, Bio-Tek Instrument Inc., Windoski, VT, USA) การดูดซึมที่เพิ่มขึ้นบ่งชี้ว่ามีไขมันเปอร์ออกซิเดชันเพิ่มขึ้น
ค่า TBA ถูกวัดโดยใช้วิธีที่ Ohkawa (1979) อธิบาย [ 29 ] ค่า TBA สะท้อนถึงระดับของการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของไขมันที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของมาโลนัลดีไฮด์ ซึ่งเป็นไบโอมาร์กเกอร์ที่จำเป็นสำหรับการประเมินขั้นที่สองของการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของกรดไลโนเลอิก [ 30 ] โดยสรุป ตัวอย่าง (200 μL) ที่ดึงออกในช่วงเวลาที่กำหนดจะถูกเติมลงใน SDS 8.1% 0.2 มิลลิลิตร กรดอะซิติก 20% (v/v) 1.5 มิลลิลิตรที่ปรับค่า pH เป็น 3.5 และกรดอะซิติก 0.8% (w/v) 1.5 มิลลิลิตร ) จะประกาศให้ทราบในภายหลัง หลังจากปรับส่วนผสมเหล่านี้ให้เป็น 4 มล. ด้วย DW แล้ว ส่วนผสมเหล่านี้จะทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C ก่อนที่จะให้ความร้อนในที่มืดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 95°C ในที่สุด การดูดกลืนแสงของส่วนผสมจะถูกวิเคราะห์ที่ความยาวคลื่น 532 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต ELISA หลังจากการทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง กิจกรรมการยับยั้งการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันดำเนินการโดยวิธี FTC และ TBA และคำนวณตามสมการต่อไปนี้:
โดยที่ Ac คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างควบคุม และ As คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง
2.5.2. กิจกรรมเก็บขยะอย่างทั่วถึงของ DPPH
ความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH ได้รับการวัดตามการศึกษาครั้งก่อนโดยมีการปรับเปลี่ยนบางประการ [ 31 ] FA และ ACT-NP ได้รับการฟักที่อุณหภูมิ 25°C เป็นเวลา 30 วัน จากนั้นจึงนำออกในช่วงเวลาที่กำหนดเพื่อวัดกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ ผสมเอธานอล DPPH ปริมาณ 0.7 มิลลิลิตร (0.1 มิลลิโมลาร์) เข้ากับตัวอย่าง 0.3 มิลลิลิตร จากนั้นฟักในอ่างน้ำเขย่าที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรทันทีหลังจากการปั่นเหวี่ยง (Combi 408, Hanil Co., Seoul, Korea) ที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH ได้รับการคำนวณตามสมการ:
โดยที่ C คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่างควบคุม CB คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่างควบคุมเปล่า S คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง และ SB คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่างเปล่า
2.6. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ACT-NP ต่อเซลล์ Ex Vivo
ดำเนินการทดสอบ MTT เพื่อวิเคราะห์ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์เพื่อตรวจสอบว่า Nano astaxanthin ACT-NP มีผลในการปกป้องเซลล์และความเป็นพิษต่อเซลล์หรือไม่ [32] เซลล์ไฟโบรบลาสต์ไตหนูแฮมสเตอร์ BHK-21 ปริมาณ 180 µL ถูกเพาะลงในจาน 96 หลุมที่มีความหนาแน่น 1.0 × 10 4 เซลล์ต่อหลุม และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37°C ในบรรยากาศที่มีความชื้นด้วย CO 2 5% หลังจากที่เซลล์ BHK-21 ถึงการบรรจบกันที่ 80% เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วย FA 20 µL, NP เปล่า (BNP) และสารแขวนลอย ACT-NP ที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 12.5 ถึง 500.0 µg/mL จากนั้นฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ล้างเซลล์ด้วย PBS หลังจากนำอาหารเลี้ยงเซลล์ออกและใส่ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H 2 O 2) 1 มิลลิโมลาร์เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันในเซลล์เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง
จากนั้นเติมน้ำยา MTT ที่เตรียมสดใหม่ 20 µL (5 มก./มล.) ลงในแต่ละหลุม แล้วทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลาอีก 4 ชั่วโมงเพื่อจำลองการก่อตัวของผลึกฟอร์มาซานสีม่วงที่เกิดจากการเปลี่ยนสีเหลืองของเทตระโซเลียมโบรไมด์โดยซักซิเนตในไมโตคอนเดรีย ดีไฮโดรจีเนสในเซลล์ที่มีชีวิต จากนั้นทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสออกไปหลังจากการปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่ 400 × g จากนั้นจึงเติมไดเมทิลซัลฟอกไซด์ลงไปเพื่อละลายฟอร์มาซานให้หมด การดูดกลืนแสงยูวีของฟอร์มาซานถูกกำหนดที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต ELISA เพื่อประเมินความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์
2.7. การทดสอบ Vivo FRAP
หนู Sprague−Dawley (SD) (ตัวผู้ อายุ 6 สัปดาห์) ได้รับจาก Woojung Bio Co., Ltd. (ซูวอน เกาหลีใต้) หนูถูกเลี้ยงไว้ในรอบสว่าง-มืด 12 ชั่วโมง ที่ความชื้น 55 ± 5% และอุณหภูมิ 22 ± 2 °C พวกมันได้รับการปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมโดยสามารถเข้าถึงอาหารมาตรฐานและน้ำประปาได้ฟรีเป็นเวลา 1 สัปดาห์ การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทาง IACUC ของมหาวิทยาลัยฮันยาง ก่อนการศึกษา หนูทั้งหมดถูกปล่อยให้อดอาหารข้ามคืน จากนั้นจึงแบ่งแบบสุ่มเป็น 3 กลุ่ม กลุ่มละ 6 ตัว กลุ่มหนึ่งได้รับการรักษาด้วย ACT-NP ที่เตรียมสดใหม่ในปริมาณ 10 มล. ต่อน้ำหนักตัว 1 กก. (BW) อีกกลุ่มหนึ่งได้รับ BNP ซึ่งจัดทำโดยไม่มี ASX กลุ่มสุดท้ายได้รับการรักษาด้วย FA เมื่อผ่านไป 2, 4, 6, 8, 10 และ 12 ชั่วโมงหลังการประมวลผลตัวอย่าง จะเก็บเศษส่วนของเลือดจากการเจาะย้อนกลับเบ้าตาในหลอด EDTA ขนาด 1 มล. จากนั้นนำไปปั่นที่ 2,000 × g เป็นเวลา 10 นาที จนกว่าจะทำการวิเคราะห์ ตัวอย่างพลาสมาจะถูกแช่แข็งที่อุณหภูมิ -70 °C ทันที
คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระในตัวอย่างพลาสมาได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ FRAP ที่ดัดแปลงเล็กน้อยจาก Benzie และ Strain (1996) [ 33 ] สารละลาย FRAP ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์อะซิเตท (pH 3.6, 300 mM) 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (10 mM) ใน HCl (40 mM) และ FeCl 3 ·6H 2 O (20 mM) ในอัตราส่วน 10:1:1 (v / v / v ) ได้รับการเตรียมใหม่และอุ่นถึง 37°C ก่อนการทดสอบ ตัวอย่างพลาสมา (30 µL) ทำปฏิกิริยากับส่วนผสมรีเอเจนต์ FRAP (900 µL) และ DW (90 µL) ในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37°C กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในตัวอย่างพลาสมาได้รับการวิเคราะห์โดยการอ่านค่าการดูดกลืนแสง UV ของส่วนผสมที่ 595 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต Synergy HT
2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ
การทดลองทั้งหมดดำเนินการซ้ำสามครั้ง และข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) เพื่อประเมินความแตกต่างที่สำคัญระหว่างกลุ่มต่างๆ จะใช้การวิเคราะห์ทางสถิติแบบ One-way ANOVA ตามด้วยการทดสอบช่วงหลายช่วงของ Duncan (SPSS เวอร์ชัน 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในผลการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH ระหว่างทั้งสองกลุ่มได้รับการกำหนดโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียน ค่า p ที่ต่ำกว่า 0.05 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ
3. ผลการศึกษาและการอภิปราย
3.1. คุณสมบัติของ ACT-NP
3.1.1. ขนาดอนุภาคและ ZP ของ ACT-NP
ACT-NP ได้รับการกำหนดสูตรในอัตราส่วนที่แตกต่างกันของ CS ที่มีประจุบวกและ TPP ที่มีประจุลบโดยมีความเข้มข้นของ ASX ที่เท่ากันตามที่แสดงในตารางที่ 1 ในการศึกษานี้ TPP สูงกว่า 0.571 มก./มล. และต่ำกว่า 0.429 มก./มล. ถือว่าไม่เหมาะสมสำหรับการเตรียม Nano astaxanthin ACT-NPs เนื่องจากการก่อตัวของ NP ที่ไม่สม่ำเสมอตามที่กำหนดก่อนหน้านี้ในทดลองเบื้องต้นของเรา ที่ความเข้มข้น CS 0.571 มก./มล. เท่ากัน ขนาดอนุภาคของ ACT-NP มีช่วงตั้งแต่ 483.9 ± 148.4 ถึง 505.2 ± 184.8 นาโนเมตร โดยที่ความเข้มข้นของ TPP มีช่วงตั้งแต่ 0.571 ถึง 0.468 มก./มล. จากนั้นจึงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเป็น 653.8 ± 215.1 นาโนเมตร โดยลดความเข้มข้นของ TPP ลงเหลือ 0.429 มก./มล. (p < 0.05) แม้ว่าโดยทั่วไป NP จะถูกกำหนดให้เป็นอนุภาคที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 นาโนเมตรหรือน้อยกว่า แต่ช่วงขนาดอนุภาคในอุตสาหกรรมอาหารได้ขยายไปถึง 1,000 นาโนเมตรเนื่องจากการนำวัสดุเกรดอาหารมาใช้ซึ่งมีแนวโน้มที่จะลดความสม่ำเสมอและขนาดเล็กของ NP เนื่องจากมีความบริสุทธิ์ค่อนข้างต่ำและมีน้ำหนักโมเลกุลใหญ่ [ 34 ] ตามการศึกษาครั้งก่อน คุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของ NP ที่เกิดจากการเจลไอออนิกระหว่างพอลิเมอร์ที่มีประจุบวกและประจุลบ อาจได้รับอิทธิพลจากสัดส่วนสัมพันธ์ของกลุ่มประจุ [ 35 ] ดังนั้น ความเข้มข้นของ TPP ที่สูงหรือต่ำกว่าระดับที่เหมาะสมที่ความเข้มข้นของ CS ที่สอดคล้องกันจะรบกวนสมดุลประจุระหว่าง CS และ TPP และส่งผลต่อคุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของ NP เช่น ขนาดของอนุภาค ZP และแนวโน้มการรวมตัวของอนุภาค มีรายงานผลลัพธ์ที่คล้ายกันว่าการลดอัตราส่วนมวลของ CS และ TPP จาก 5:1 เป็น 2:1 ส่งผลให้ขนาดอนุภาคของ CS-NP เพิ่มขึ้น [ 36 ] สิ่งนี้อาจอธิบายได้ด้วยปริมาณ TPP ที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกัน ดังนั้น TPP ส่วนเกินในสารแขวนลอยอาจสร้าง NP ที่ใหญ่ขึ้นได้ [ 37 ] อย่างไรก็ตาม การลดความเข้มข้นของ TPP ลงเหลือ 0.429 มก./มล. แสดงให้เห็นว่าขนาดอนุภาคเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ผลลัพธ์เหล่านี้เน้นย้ำว่าคาดว่าขนาดอนุภาคของ CS-TPP NPs จะแตกต่างกันไปตามส่วนประกอบต่างๆ เช่น ความเข้มข้นและอัตราส่วนของ CS และ TPP
ค่า ZP ของ ACT-NP เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจาก 20.4 ± 1.2 เป็น 30.6 ± 0.6 mV ขณะที่ความเข้มข้นของ TPP ลดลง (p < 0.05) ค่า ZP ของ NP ขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของกลุ่มประจุดังที่กล่าวไว้ข้างต้น ที่ความเข้มข้นของ TPP ที่สูงขึ้น ระดับของการทำให้เป็นกลางของกลุ่มอะมิโนที่มีโปรตอนจะเพิ่มขึ้น ส่งผลให้ค่า ZP ของ CS-TPP NPs ลดลง [ 38 ] นอกจากนี้ เนื่องจาก CS และ TPP มีประจุบวกและประจุลบตามลำดับ จึงสมเหตุสมผลที่จะสรุปได้ว่าการเพิ่มความเข้มข้นของ TPP นำไปสู่การลดลงของประจุบวกของ NP เนื่องจาก ZP แสดงประจุพื้นผิวของ NP เสถียรภาพการกระจายตัวที่ดีขึ้นจึงสัมพันธ์กับค่า ZP ที่สูงขึ้นเนื่องจากแรงผลักไฟฟ้าระหว่าง NP แต่ละตัว [ 18 ] นอกจากนี้ ยังแสดงให้เห็นอีกว่า NP ที่มีค่า ZP มากกว่า +20 mV หรือต่ำกว่า −20 mV ถือว่ามีเสถียรภาพ [ 39 ] ได้รับการยืนยันว่าเสถียรภาพการกระจายตัวของ NP อยู่ที่ประมาณ 0.3 PDI ซึ่งเป็นระดับที่แนะนำสำหรับระบบส่งมอบ [ 40 ] ดังนั้นสูตร ACT-NP ทั้งหมดที่แสดงในตารางที่ 1 จึงถือเป็น NP ที่เสถียรได้
3.1.2. ประสิทธิภาพในระดับนาโนของ ACT-NP
ค่า EE ของ ACT-NP เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อความเข้มข้นของ TPP เพิ่มขึ้น ดังที่แสดงในตารางที่ 1 (p <0.05) อาจเป็นเพราะจำนวนหน่วยเชื่อมโยงที่ความเข้มข้น TPP ต่างกัน การเพิ่มความเข้มข้นของ TPP ขึ้นจนถึงอัตราส่วนที่กำหนดจะเกี่ยวข้องกับความสามารถในการเชื่อมโยงระหว่าง CS และ TPP ที่ดีขึ้น ส่งผลให้เกิดความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่ง [ 38 ] ความสัมพันธ์อันแน่นแฟ้นระหว่าง CS และ TPP จะส่งผลให้ ASX ผูกพันกับโครงสร้าง CS-TPP อย่างแน่นแฟ้น จนทำให้ ASX ไม่สามารถถอนตัวจาก NP ได้อย่างรวดเร็ว ในทางกลับกัน หากความเข้มข้นของ TPP เพิ่มขึ้นอีก EE อาจลดลงเนื่องจากโครงสร้างที่แน่นหนาขึ้นระหว่าง CS และ TPP ซึ่งอาจขัดขวางการโต้ตอบระหว่าง TPP และวัสดุแกนเพื่อจับกับ CS [ 38 ] อย่างไรก็ตาม เนื่องจาก ACT-NP ที่นำเสนอในการศึกษานี้ถูกเตรียมด้วยอัตราส่วน CS และ TPP ที่เหมาะสมสำหรับการก่อตัวของ NP ดังนั้น ACT-NP Astaxanthin Nano ที่มีความเข้มข้นของ TPP สูงสุด (0.571 มก./มล.) จึงแสดงค่า EE ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (63.9%) ) (ค่า < 0.05) จากการอภิปรายข้างต้น ได้มีการเลือกอัตราส่วน CS ต่อ TPP ที่ 1:1 สำหรับการศึกษาเพิ่มเติม เนื่องจาก ACT-NP แอสตาแซนธินที่เตรียมในอัตราส่วนนี้ให้ค่า EE สูงสุด โดยมีขนาดอนุภาคและการกระจายที่ยอมรับได้
3.2. คุณสมบัติการปลดปล่อยในหลอดทดลอง
ในอาหารเลี้ยงเชื้อ SGF อัตราการปล่อย ASX จาก ACT-NP เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ โดยไม่มีการปล่อยมวลในระหว่างระยะฟักตัว และอัตราการปล่อยจะถึง 88.1 ± 2.4% หลังจาก 12 ชั่วโมง (รูปที่ 2) การปล่อยวัสดุแกนกลางได้รับผลกระทบเป็นหลักจากการเสื่อมสภาพของโครงสร้าง NP การเชื่อมโยงระหว่าง CS และ TPP อาจได้รับผลกระทบเนื่องจากสถานะประจุของวัสดุผนังอาจเปลี่ยนแปลงไปตามสภาพแวดล้อม pH ภายนอกที่ NP กระจายอยู่ [ 20 ] นอกจากนี้ NP ที่มีค่า ZP สูงมีแนวโน้มที่จะมีไอออนที่มีประจุสูงบนพื้นผิว ซึ่งชี้ให้เห็นว่า NP มีความต้านทานต่อการย่อยสลายได้สูงกว่าในสภาพแวดล้อมที่มีกรด [ 41 ] กล่าวอีกนัยหนึ่ง NP ที่มีค่า ZP ต่ำจะอ่อนไหวต่อการสลายตัวในสภาพแวดล้อมที่มีกรด ส่งผลให้มีการปล่อยวัสดุแกนออกมาในปริมาณมากขึ้น ตามที่กล่าวมาข้างต้น ค่า ZP ของ ACT-NP ที่เตรียมในอัตราส่วน 1:1 ของ CS และ TPP อยู่ที่ 20.4 ± 1.2 mV ซึ่งต่ำกว่าค่าของสูตรอื่นๆ ดังนั้น สิ่งนี้บ่งชี้ว่าการปลดปล่อย นาโนแอสตาแซนธิน ACT-NP ใน SGF ในปริมาณสูงสามารถอธิบายได้จากการลดลงของแรงดึงดูดไฟฟ้าสถิตระหว่าง CS และ TPP ในสภาพแวดล้อมที่มีกรด คำอธิบายที่เป็นไปได้อีกประการหนึ่งสำหรับการปล่อย ASX ที่เพิ่มขึ้นใน SGF ก็คือความสามารถในการละลายของ CS ในสภาพแวดล้อมที่มีกรด โดยทั่วไป เนื่องจาก CS ละลายได้ในช่วง pH ที่เป็นกรด ปฏิกิริยาระหว่าง CS-TPP NPs ที่เตรียมโดยการเจลไอออนิกจึงมีแนวโน้มที่จะลด SGF และเร่งการปล่อย ASX [42]
รูปที่ 2 อัตราการปล่อยแอสตาแซนธินจาก นาโนแอสตาแซนธิน ในของเหลวในกระเพาะอาหารจำลอง (SGF, pH 1.2) และของเหลวในลำไส้ (SIF, pH 6.8)
ในทางกลับกัน การปลดปล่อย ASX จาก ACT-NPs ไม่ได้เกิดขึ้นในตัวกลาง SIF และอัตราการปลดปล่อยจะถึง 11.4 ± 2.7% หลังจาก 12 ชั่วโมง (รูปที่ 2) ความแตกต่างนี้สามารถอธิบายได้ด้วยกลไกการโต้ตอบหลักสองประการระหว่าง CS-NP และสภาพแวดล้อม SIF ประการหนึ่งคือการดีโปรตอนของโมเลกุล CS ที่ค่า pH เป็นกลาง ซึ่งสามารถทำให้โครงสร้าง NP มีเสถียรภาพเนื่องจากการเกิดพันธะไฮโดรเจนมากขึ้น [ 43 ] ความเป็นไปได้อีกประการหนึ่งคือความไม่ละลายของ CS ในค่า pH เป็นกลาง โครงสร้างของ ACT-NP สามารถคงอยู่ได้โดยไม่ต้องละลาย CS เนื่องจากความสามารถในการละลายของ CS ภายใต้สภาวะที่เป็นกลางต่ำกว่าในสภาวะที่เป็นกรดอย่างมีนัยสำคัญ ในทำนองเดียวกัน การศึกษาก่อนหน้านี้ได้สังเกตกิจกรรมของ CS-NP ในสภาพแวดล้อม pH ที่แตกต่างกัน (pH 1.2, 6.5, 7.2) เพื่อตรวจสอบลักษณะการปล่อยอินซูลิน พวกเขายืนยันว่า CS-NPs แสดงการปล่อยอินซูลินที่ต่ำกว่าที่ pH 6.5 เมื่อเทียบกับที่ pH 1.2 เนื่องมาจากความสามารถในการละลายของไคโตซานในสื่อที่แตกต่างกัน [ 42 ] ดังนั้น ACT-NP ที่เตรียมด้วย CS และ TPP จึงดูเหมือนว่าจะได้รับการย่อยสลายเป็นเวลานานใน SIF ส่งผลให้มีการปล่อย ASX เป็นเวลานาน
3.3. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง
ผลการวิเคราะห์ลิพิดเปอร์ออกซิเดชันด้วยวิธี FTC และ TBA แสดงไว้ในรูปที่ 3 a, b การดูดซับของการควบคุมเริ่มเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วภายใน 2 วัน อย่างไรก็ตามมันจะค่อย ๆ ลดลงเมื่อถึงจุดสูงสุด ค่าการดูดซึม FA เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องและถึงจุดสูงสุดภายใน 4 วัน แต่ลดลงเล็กน้อยเมื่อเวลาผ่านไป อย่างไรก็ตามค่าการดูดซึมของ ACT-NP เพิ่มขึ้นเล็กน้อยหลังจาก 6 วัน และแสดงระดับที่ต่ำกว่าค่าอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญในช่วงการทดลอง (p < 0.05) วิธี TBA ให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกัน ในขณะที่การดูดซึมของการควบคุมและ FA เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว ถึงจุดสูงสุดที่ 2 และ 4 วันตามลำดับ และลดลงเรื่อยๆ เมื่อเวลาผ่านไป ในทางกลับกัน การดูดกลืนของ Nano astaxanthin ACT-NP ยังคงต่ำอย่างมีนัยสำคัญโดยไม่เพิ่มขึ้นทีละน้อยในช่วงระยะเวลาการทดลอง (p <0.05)
รูปที่ 3 กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX และ นาโนแอสตาแซนธิน (ACT-NP) ในระบบการเกิดออกซิเดชันของกรดลิโนเลอิกโดยวิธีเฟอร์ริกไทโอไซยาเนต (ก) และวิธีกรดไทโอบาร์บิทูริก (ข) a–c ค่าที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)
ตามที่แสดงในรูปที่ 4 ประสิทธิภาพการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH ของทั้ง FA และ Nano astaxanthin ACT-NP อยู่ที่ 13.77 และ 14.80% ในวันที่ 0 ตามลำดับ โดยไม่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม ผลของ FA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 0.21% ในวันที่ 30 ในขณะที่ ACT-NP แสดงให้เห็นผลการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH คงที่ตลอดระยะฟักตัว (p < 0.05)
รูปที่ 4 การทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระของ ASX และอนุภาค นาโนแอสตาแซนธิน (ACT-NP) ที่เป็นอิสระ โดยใช้วิธีกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH เครื่องหมายดอกจันตัวเดียวแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ระหว่างสองกลุ่มในแต่ละจุดเวลาโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียน
ผลลัพธ์ที่ได้จากการทดสอบลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและ DPPH แสดงให้เห็นว่า ACT-NP รักษาการทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระของ ASX ได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเปรียบเทียบกับ FA นอกจากนี้ ACT-NP ยังแสดงให้เห็นผลการยับยั้งการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของกรดไลโนเลอิกที่แข็งแกร่งถึง 92% ภายใน 2 วันโดยวิธี FTC และ TBA ซึ่งบ่งชี้ว่า ACT-NP มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของกรดไลโนเลอิกทั้งในระยะหลักและระยะรอง ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ยาวนานของ ACT-NP สามารถอธิบายได้ด้วยกลไกที่แตกต่างกันสามประการ ได้แก่ ความสามารถในการละลายที่เพิ่มขึ้น คุณสมบัติการปลดปล่อยอย่างต่อเนื่อง และพื้นที่ผิวขนาดใหญ่ ความสามารถในการละลายของวัสดุแกนกลางเป็นหนึ่งในปัจจัยหลักที่ส่งผลต่อกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในขณะที่ทำปฏิกิริยากับอนุมูลอิสระในสถานะละลาย [ 44 ] ตัวอย่างเช่น การศึกษาก่อนหน้านี้ได้ยืนยันว่ากิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของเคมเฟอรอลเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจากการห่อหุ้มด้วยนาโนแคปซูลใน CS-NP เนื่องจากความสามารถในการละลายน้ำเพิ่มขึ้น [ 45 ] นอกจากนี้ CS-NP ที่มีคุณสมบัติการปลดปล่อยต่อเนื่องอาจเพิ่มกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระโดยการรักษาเสถียรภาพของวัสดุแกนกลาง [ 46 ] ยิ่งไปกว่านั้น กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้นของ Nano astaxanthin ACT-NP อาจเกี่ยวข้องกับพื้นที่ผิวขนาดใหญ่ของ CS-TPP NPs ที่ทำให้โมเลกุล ASX โต้ตอบกับตัวกลางปฏิกิริยาได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น [47] ดังนั้น การศึกษานี้จึงยืนยันว่ากิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX ได้รับการปรับปรุงโดยการห่อหุ้มนาโนไว้ใน CS-TPP NPs
3.4. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ACT-NP ต่อเซลล์ Ex Vivo
ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ BHK-21 ต่ำกว่า 40% เนื่องจากการบาดเจ็บที่เกิดจาก H2O2 และความสามารถในการมีชีวิตไม่ได้ดีขึ้นเมื่อได้รับการรักษาด้วย ASX น้อยกว่า 50 μg/L หรือ ACT-NP ที่มี ASX ในปริมาณเท่ากัน ดังที่แสดงในรูปที่ 5 อย่างไรก็ตาม ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ FA 500 μg/L (46.7 ± 4.3%) (p < 0.05) และกิจกรรมของ ASX เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่ออยู่ในขนาดนาโนใน ACT-NP (52.9 ± 4.7%) เห็นได้ชัดว่า ACT-NPs ที่ความเข้มข้น 500 μg/L ASX มีประสิทธิภาพในการปกป้องเซลล์ BHK-21 จากการบาดเจ็บที่เกิดจาก H2O2
รูปที่ 5 ผลการป้องกันเซลล์ของ NP เปล่า ASX ฟรี และ ACT-NP นาโนแอสตาแซนธิน หลังจากความเสียหายของเซลล์สายพันธุ์ BHK-21 ที่เกิดจากไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ a–c ค่าที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)
เนื่องจากกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX ถูกกระตุ้นหลังจากการดูดซึมเข้าเซลล์ ผลลัพธ์เหล่านี้จึงสามารถอธิบายได้ด้วยลักษณะการซึมผ่านเซลล์ของ CS-NP ภายในเยื่อหุ้มเซลล์มีประจุลบเนื่องจากปั๊ม Na+-K+ จะใช้พลังงานจากการไฮโดรไลซิสเพื่อปั๊ม Na+ และ K+ ผ่านการไล่ระดับทางเคมีไฟฟ้า [ 48 ] เนื่องจาก CS มีประจุบวกเนื่องจากมีกลุ่มอะมิโนอยู่ในโครงสร้าง ปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตระหว่าง CS ที่มีประจุบวกและพื้นผิวเซลล์ที่มีประจุลบอาจเป็นหนึ่งในปัจจัยหลักที่ส่งผลต่อคุณสมบัติการซึมผ่านของเซลล์ของ CS-NP [ 49 ] ดังนั้น การสัมผัสเป็นเวลานานระหว่าง นาโนแอสตาแซนธิน ACT-NP กับพื้นผิวเซลล์จะช่วยเพิ่มการดูดซึมของ CS-NP และเพิ่มกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ ASX
3.5. การทดสอบ Vivo FRAP
การเปลี่ยนแปลงของค่า FRAP ในหนู SD หลังจากการให้ BNP, ASX และ ACT-NP ทางปากแสดงไว้ในรูปที่ 6 ค่า FRAP ของหนูที่ได้รับ BNP และ FA เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วภายใน 2 ชั่วโมงถึงระดับสูงสุดที่ 95.26 ± 4.00 และ 106.68 ± 17.93 μmol/L ตามลำดับ ในขณะที่ค่า FRAP ของหนูที่ได้รับ ACT-NP เพิ่มขึ้นเพียง 85.33 ± 22.45 μmol/L ในช่วงเวลาเดียวกัน อย่างไรก็ตามค่า FRAP กลับด้าน 2 ชั่วโมงหลังการให้ยาทางปาก โดยสรุป ค่า FRAP ของหนูที่ได้รับอาหาร ASX ลดลงเหลือ 94.07 ± 20.85 μmol/L หลังจาก 4 ชั่วโมง ลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อเวลาผ่านไป และกลับสู่ค่าเริ่มต้นหลังจาก 8 ชั่วโมง แสดงให้เห็นว่า ASX มีความเสถียรต่ำภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง [ 50 ] ในทางกลับกันค่า FRAP ของ ACT-NP เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องและเกินค่า FRAP ของ FA หลังจาก 4 ชั่วโมง แม้ว่าค่า FRAP ของ ACT-NP จะเริ่มลดลง 4 ชั่วโมงหลังการใช้ แต่ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ ACT-NP ยังคงเหนือกว่าของ FA เสมอ
รูปที่ 6 การเปลี่ยนแปลงค่า FRAP ในพลาสมาหนูหลังจากได้รับ NP เปล่า, ASX ฟรี และ นาโนแอสตาแซนธิน ACT-NP ครั้งเดียว
การศึกษาครั้งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการดูดซึมของ ASX ที่ให้ทางปากมีเพียง 12% ของ ASX ที่ให้ทางช่องท้อง ซึ่งชี้ให้เห็นว่า ASX ดูดซึมทางปากได้ต่ำเนื่องจากคุณสมบัติชอบไขมัน [51] ข้อจำกัดของ ASX นี้สามารถเอาชนะได้ผ่านการสร้างนาโนไนเซชันใน CS-TPP NP อาจเกิดจากการปลดปล่อย ASX อย่างต่อเนื่องจาก CS-TPP NPs ตามที่แสดงในงานวิจัยการปลดปล่อยในหลอดทดลอง ซึ่งระบุว่า CS-TPP NPs มีประสิทธิภาพในการปกป้อง ASX จากการย่อยสลายในระหว่างการดูดซึมในระบบทางเดินอาหาร ยิ่งไปกว่านั้น เนื่องจากมีการรายงานว่าการห่อหุ้มนาโนใน CS-NP เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงความสามารถในการละลายของวัสดุแกน ดังนั้น นาโนแอสตาแซนธิน ACT-NP จึงอาจเพิ่มความสามารถในการละลายของ ASX ได้ จึงส่งเสริมการดูดซึมทางปาก [45] ดังนั้น การใช้นาโนฟอร์มเมเลชันใน CS-TPP NP อาจมีศักยภาพในการใช้เป็นระบบการส่งมอบยา ASX ทางปากเพื่อรักษาความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระหลังการให้ยาทางปาก
4. บทสรุป
ในการศึกษานี้ เราหุ้ม ASX ใน ACT-NP ด้วย CS และ TPP โดยใช้วิธีการสร้างเจลไอออนิก นาโนแอสตาแซนธิน แสดงสมบัติทางฟิสิกเคมีที่ยอมรับได้ เช่น ขนาดของอนุภาค ZP, PDI และ EE คุณสมบัติทางฟิสิกเคมีแสดงให้เห็นว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่าง CS และ TPP ต่อการก่อตัวของ NP ได้รับอิทธิพลอย่างมีนัยสำคัญจากอัตราส่วนระหว่าง CS และ TPP พบว่าสาร NP CS-TPP ที่มีอัตราส่วน CS และ TPP 1:1 ช่วยเพิ่มคุณสมบัติในการปลดปล่อย กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลองและในร่างกาย และผลการป้องกันเซลล์ของ ASX ACT-NPs ของแอสตาแซนธินแสดงให้เห็นการปล่อย ASX อย่างต่อเนื่อง (11.4 ± 2.7%) ในตัวกลาง SIF ซึ่งบ่งชี้ว่า CS-TPP NPs มีศักยภาพในการเพิ่มเสถียรภาพของ ASX แนวโน้มนี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ของกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง ex vivo และ in vivo ซึ่งบ่งชี้ว่า CS-TPP NPs สามารถส่งผลต่อกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระและการดูดซึมทางปากของ ASX ได้สำเร็จเมื่อเปรียบเทียบกับ FA ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า CS-TPP NPs ที่มีคุณสมบัติ NP ที่ต้องการสามารถใช้เป็นระบบการส่งมอบทางปากที่มีศักยภาพในการปรับปรุงเสถียรภาพ กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ และการดูดซึมทางชีวภาพของ ASX
อ้างอิง: Chitosan-Tripolyphosphate Nanoparticles Prepared by Ionic Gelation Improve the Antioxidant Activities of Astaxanthin in the In Vitro and In Vivo Model
by Eun Suh Kim 1,Youjin Baek 1,Hyun-Jae Yoo 1,Ji-Soo Lee 2,* and Hyeon Gyu Lee 1,*