Nano astaxanthin thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh hơn, thời gian tồn tại dài hơn và khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh hơn so với astaxanthin

Nghiên cứu hiện tại nhằm mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano (NP) chitosan (CS)-tripolyphosphate (TPP) đến tính ổn định, hoạt động chống oxy hóa và khả dụng sinh học của astaxanthin (ASX). Các Nano astaxanthin – Chitosan – TPP (NP – ACT) được nạp ASX (ACT-NP) được điều chế bằng phương pháp tạo gel ion giữa CS (0,571 mg/mL) và TPP (0,571 mg/mL) cho kích thước hạt, thế zeta, chỉ số đa phân tán và hiệu suất nano hóa tương ứng 505,2 ± 184,8 nm, 20,4 ± 1,2 mV, 0,348 ± 0,044 và 63,9 ± 3,0%. Một nghiên cứu giải phóng in vitro đã xác nhận rằng sự giải phóng ASX trong dịch dạ dày mô phỏng (pH 1,2) và dịch ruột (pH 6,8) đã được kéo dài trong ACT-NP. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của ACT-NP được cải thiện đáng kể so với ASX (FA) tự do ( p < 0,05). Hơn nữa, phân tích chất chống oxy hóa tế bào và in vivo đã xác minh rằng Nano astaxanthin có thể tăng cường tác dụng bảo vệ tế bào trên dòng tế bào BHK-21 và chứng minh các đặc tính giải phóng bền vững, dẫn đến thời gian tồn tại kéo dài trong huyết tương chuột. Kết quả cho thấy tính ổn định, đặc tính chống oxy hóa và khả dụng sinh học của ASX có thể được tăng cường một cách hiệu quả thông qua việc nano hóa Nano astaxanthin.

NANOCMM TECHNOLOGY

1.Giới thiệu

Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β-β′-carotene-4-4′-dione, ASX), một sắc tố caroten tự nhiên thường có nhiều trong các sinh vật biển bao gồm tôm, cua, cá lóc và cá hồi, là một chất chống oxy hóa tự nhiên hiệu quả [ 1 ]. Cấu trúc phân cực của ASX, do các nhóm hydroxyl (OH) và carbonyl (C=O) của mỗi vòng ion, đã được báo cáo là cho thấy hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với β-carotene, tocopherol và axit ascorbic ( Hình 1 ) [ 2 , 3 ]. Hơn nữa, các hoạt động sinh lý khác nhau của ASX như chống viêm, chống ung thư và hoạt động miễn dịch, thể hiện từ tác dụng chống oxy hóa cao, đã được báo cáo [ 4 ]. Tuy nhiên, bất chấp những tác dụng có lợi khác nhau, độ hòa tan trong nước kém, dẫn đến tỷ lệ hấp thụ in vivo thấp, đã được báo cáo là một hạn chế đối với việc ứng dụng ASX như một vật liệu chức năng tiềm năng trong thực phẩm [ 5 ]. Hơn nữa, một nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng ASX dễ dàng phân hủy dưới tác dụng của nhiệt, ánh sáng và oxy do có 11 liên kết đôi carbon-carbon liên hợp [ 6 ]. Vì vậy, việc khắc phục tính không hòa tan và không ổn định của ASX đã được nghiên cứu như một nhiệm vụ thiết yếu cần giải quyết để nó có thể được sử dụng làm thành phần thực phẩm hoặc dược phẩm hiệu quả [ 7 , 8 ].

Nano hóa nano là công nghệ nhốt một hợp chất hoạt tính sinh học vào trong cấu trúc có kích thước nano được làm từ các vật liệu tường khác [ 9 ]. Do tác dụng bảo vệ của vật liệu thành và diện tích bề mặt tăng lên do các chất mang có kích thước nano, nên việc nano hóa nano đã được sử dụng rộng rãi cho các hệ thống phân phối tiềm năng nhằm tăng cường khả năng hòa tan, tính ổn định và khả năng hấp thụ của vật liệu hoạt tính sinh học [ 10 ]. Gần đây, một số nghiên cứu áp dụng nhiều loại kỹ thuật nano hóa nano khác nhau cho ASX đã được báo cáo, chẳng hạn như các hạt nano (NP) poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) [ 11 ] và các chất mang nano dựa trên lipid bao gồm nanoliposome [ 12 ], nanonhũ tương [ 13 ] và chất mang lipid có cấu trúc nano [ 14 ]. Mặc dù các nghiên cứu này cho thấy kết quả trong việc tăng cường tính ổn định, hoạt động chống oxy hóa và hấp thụ ASX, nhưng quy trình và vật liệu được coi là không phù hợp để ứng dụng vào thực phẩm, đòi hỏi mức độ an toàn cao do sử dụng polyme tổng hợp và chất hoạt động bề mặt [ 15 , 16 ]. Hơn nữa, liposome có một số hạn chế như độ ổn định kém và hiệu quả nano hóa thấp [ 17 ].

Mặt khác, NP sử dụng polysaccharide tự nhiên như chitosan (CS) được coi là một kỹ thuật phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm vì quy trình sản xuất không độc hại, có khả năng phân hủy sinh học, tương thích sinh học và kinh tế [ 18 ]. CS, được tạo ra bằng quá trình deacetyl hóa chitin thu được từ vỏ cua hoặc tôm, là một polyme sinh học cation có khả năng phân hủy sinh học. Do đặc tính tích điện cation trong dung dịch axit, CS có thể tạo ra NP thông qua tương tác tĩnh điện với các polyme anion tích điện trái dấu. CS-NP đã được nghiên cứu để nano hóa các vật liệu chức năng khác nhau như resveratrol, quercetin và curcumin để cải thiện khả năng hòa tan trong nước và tính ổn định của chúng trước nhiệt độ và môi trường đường tiêu hóa [ 19 , 20 , 21 ]. Ngoài ra, CS-NP đã được nghiên cứu rộng rãi như một hệ thống phân phối do đặc tính tích điện dương của chúng, có ái lực mạnh mẽ với màng tế bào anion, dẫn đến tăng cường khả năng bám dính niêm mạc và khả dụng sinh học, cả ex vivo và in vivo [ 22 ]. Tuy nhiên, chỉ có một số nghiên cứu cố gắng nghiên cứu việc nano hóa ASX trong CS-NP để tăng cường tính ổn định, hoạt động chống oxy hóa và khả dụng sinh học của nó [ 23 , 24 ].

Do đó, mục đích của nghiên cứu này là gói gọn ASX trong CS-NP để nghiên cứu ảnh hưởng của CS-NP đối với hoạt động phân phối sinh học và chống oxy hóa của ASX. Các CS-NP được nạp ASX đã được điều chế bằng cách sử dụng natri tripolyphosphate (TPP), một trong những polyme anion không độc hại hiệu quả nhất để liên kết ngang ion với các nhóm cation amino của CS [ 21 ]. Các đặc điểm hóa lý, bao gồm cả các đặc điểm của NP CS-TPP (ACT-NP) được nạp ASX đã được nghiên cứu, bao gồm kích thước hạt, thế zeta (ZP), chỉ số đa phân tán (PDI), hiệu suất nano hóa (EE) và các đặc tính giải phóng trong ống nghiệm. Hơn nữa, tác động của ACT-NP đối với hoạt động chống oxy hóa của ASX đã được nghiên cứu bằng quá trình peroxid hóa lipid bằng phương pháp thiocyanate sắt (FTC) và axit thiobarbituric (TBA), xét nghiệm loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), bảo vệ tế bào. đặc tính và xét nghiệm khả năng khử sắt trong huyết tương (FRAP) in vivo.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên vật liệu

Chitosan (CS, 50–190 kDa, 24 cps, khử 95%), natri triphosphate (TPP), 2,2-Diphenyl-1-pikryl-hydrazyl (DPPH), axit linoleic và natri dodecyl sulfate (SDS) đã được mua từ Công ty Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Astaxanthin (ASX) được lấy từ Neo Cremar Co. (Sungnam, Hàn Quốc). Tế bào thận của chuột hamster con (BHK) -21 được lấy từ Ngân hàng Tế bào Hàn Quốc (Seoul, Hàn Quốc). Môi trường nuôi cấy Đại bàng sửa đổi (DMEM) và huyết thanh bào thai của Dulbecco được lấy từ Gibco Invitrogen Co. (Grand Island, NY, USA). Penicillin-streptomycin và dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) được lấy từ Lonza (Walkersville, MD, USA). 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) được mua từ Công ty Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Tất cả các hóa chất khác đều thuộc loại thuốc thử và tất cả các dung môi đều thuộc loại HPLC.

2.2. Chuẩn bị ACT-NP

ACT-NP được tạo thành bằng phương pháp tạo gel ion với một số cải tiến nhỏ từ nghiên cứu trước đó [ 25 ]. CS, ASX và TPP bị đình chỉ lần lượt trong axit axetic 1% ( v / v ) và nước khử ion (DW) ở nồng độ cuối cùng ( Bảng 1 ). Sau đó, 0,5 mL dung dịch ASX được kết hợp với 2 mL dung dịch CS trong điều kiện khuấy từ ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó thêm 4,5 mL dung dịch TPP bằng bơm linh hoạt chính (Master flex 77200-60, Cole Parmer Inc. , Vernon Hills, IL, USA) với tốc độ dòng 1 mL/phút.

Bảng 1. Điều kiện và đặc tính chế tạo của hạt nano chitosan chứa astaxanthin được chế tạo với các nồng độ TPP khác nhau. ^a–d Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ( p < 0,05).

2.3. Đặc tính của ACT-NP

2.3.1. Kích thước hạt, ZP và PDI của ACT-NP

Kích thước hạt, ZP và PDI của NP được phân tích bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) bằng Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK). Huyền phù ACT-NP thu được ngay sau khi chế tạo được chuyển vào tế bào zeta dùng một lần DTS 1060C để đo. Tất cả các phép đo được thực hiện ở nhiều chế độ hẹp ở 25 ± 1 ° C.

2.3.2. Hiệu quả nano hóa của ACT-NP

Huyền phù ACT-NP được siêu ly tâm trong 30 phút ở 30.000 × g và 4 ° C (Optima TL, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Sau khi tách phần nổi phía trên, ACT-NP được thu thập và đông khô (FD8508; Ilshin Co., Seoul, Hàn Quốc). ACT-NP đông khô (14 mg) được tạo huyền phù trong 2,5 mL axeton để chiết xuất ASX, sau đó đo tia cực tím ở bước sóng 478nm (Biomate 3S; Thermo Scientific, Madison, WI, USA). EE của ACT-NP được tính theo phương trình sau:

2.4. Thuộc tính phát hành trong ống nghiệm

Dịch dạ dày mô phỏng (SGF, pH 1,5) chứa hydro clorua 0,1 M (HCl) và natri clorua 0,05 M và dịch ruột mô phỏng (SIF, pH 6,8) chứa natri hydroxit 0,1 M và dung dịch đệm natri dihydrogen photphat 0,05 M được sử dụng để nghiên cứu giải phóng ASX từ ACT-NP. Tóm lại, Nano astaxanthin ACT-NP đông khô (20 mg) được tạo huyền phù tương ứng trong 5 mL SGF và SIF, và giữ trong tủ ấm nằm ngang ở 37°C, khuấy ở tốc độ 100 vòng/phút. Để phân tích tốc độ giải phóng tại thời điểm xác định trước, 2 mL mỗi mẫu được lấy vào lúc 2, 6 và 12 giờ và ASX được chiết bằng cloroform. Nồng độ ASX được giải phóng được đo bằng máy quang phổ UV như đã nói ở trên. Tỷ lệ phát hành ASX được tính bằng phương trình sau:

2.5. Hoạt động chống oxy hóa trong ống nghiệm

2.5.1. Xét nghiệm peroxid hóa lipid

Hệ thống mô hình axit linoleic đã được sử dụng để đánh giá hoạt động chống oxy hóa của ASX không được bao bọc và nano hóa [ 26 ]. Các lượng đo 0,143 g tween 20, 10 mL dung dịch đệm kali photphat (20 mM, pH 7,0), 0,08 mL axit linoleic và 10 mL ethanol 30% đã được sử dụng để tạo ra hệ thống mô hình cho hoạt động ức chế peroxid hóa lipid. Thể tích được điều chỉnh thành 25 mL bằng DW. Các lượng ASX (FA) và ACT-NP tự do được cân chính xác có chứa 2 mg ASX đã được thêm vào hệ thống mô hình axit linoleic làm mẫu thử nghiệm. Hệ thống mô hình axit linoleic không có FA và ACT-NP được sử dụng làm đối chứng. Tất cả các mẫu được ủ ở 40 ± 1 °C trong phòng tối để tăng tốc độ oxy hóa và sau đó rút ra trong khoảng thời gian đều đặn (2, 4, 6 ngày). Để ước tính mức độ oxy hóa, các giá trị FTC và TBA đã được xác định.

Phương pháp FTC được thực hiện theo nghiên cứu trước đó với một số sửa đổi nhỏ [ 27 ]. Trong phương pháp FTC, lượng peroxid được tạo ra ở giai đoạn đầu của quá trình peroxid hóa axit linoleic được ước tính. Fe ²⁺ bị oxy hóa thành Fe ³⁺ bởi peroxit và phức thiocyanate được tạo ra khi Fe ³⁺ phản ứng với thiocyanate [ 28 ]. Dung dịch phản ứng linoleic ở trên (20 μL) được rút ra đều đặn trong khoảng thời gian đều đặn được trộn với 20 μL dung dịch sắt clorua 20 mM, 20 μL 30% ( w / v ) amoni thiocyanate trong HCl 3,5% ( v / v ) và 1,14 mL ethanol 75% ( v / v ). Sau khi ủ trong ba phút ở 40 ° C, độ hấp thụ của hỗn hợp được phân tích ở bước sóng 500nm bằng đầu đọc vi bản ELISA (ELx800UV, Bio-Tek Instrument Inc., Windoski, VT, USA). Sự hấp thụ tăng lên chứng tỏ quá trình peroxid hóa lipid tăng lên.

Giá trị TBA được đo bằng phương pháp được mô tả bởi Ohkawa (1979) [ 29 ]. Giá trị TBA phản ánh mức độ peroxid hóa lipid liên quan đến sự hình thành malonaldehyde, một dấu ấn sinh học cần thiết để đánh giá giai đoạn thứ cấp của quá trình peroxid hóa axit linoleic [ 30 ]. Tóm lại, các mẫu (200 μL) được rút ra trong khoảng thời gian xác định trước được thêm vào 0,2 mL SDS 8,1%, 1,5 mL axit axetic 20% ( v / v ) được điều chỉnh về độ pH 3,5 và 1,5 mL 0,8% ( w / v). ) TBA. Sau khi điều chỉnh các hỗn hợp này thành 4 mL bằng DW, hỗn hợp này được phản ứng trong một giờ ở 4°C trước khi được đun nóng trong bóng tối trong một giờ ở 95°C. Cuối cùng, độ hấp thụ của hỗn hợp được phân tích ở bước sóng 532nm bằng đầu đọc vi bản ELISA sau khi làm nguội ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính ức chế quá trình peroxid hóa lipid được thực hiện bằng phương pháp FTC và TBA được tính theo phương trình sau:

Trong đó Ac là độ hấp thụ của mẫu đối chứng và As là độ hấp thụ của mẫu.

2.5.2. Hoạt động nhặt rác triệt để DPPH

Khả năng nhặt gốc tự do DPPH được đo lường theo một nghiên cứu trước đó với một số điều chỉnh [ 31 ]. FA và ACT-NP trong quá trình bảo quản, chúng được ủ ở 25°C trong 30 ngày và sau đó được lấy ra trong khoảng thời gian xác định trước để đo hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Một lượng 0,7 mL dung dịch etanol DPPH (0,1 mM) được trộn với 0,3 mL mẫu, sau đó ủ trong bể nước lắc ở 37 ° C trong một giờ. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517 nm ngay sau khi ly tâm (Combi 408, Hanil Co., Seoul, Korea) với tốc độ 10.000 vòng / phút trong 10 phút. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được tính theo phương trình:

Trong đó C là độ hấp thụ của mẫu đối chứng, CB độ hấp thụ của mẫu trắng đối chứng, S độ hấp thụ của mẫu và SB độ hấp thụ của mẫu trắng.

2.6. Hoạt động chống oxy hóa Ex Vivo của ACT-NP

Thử nghiệm MTT được tiến hành để phân tích khả năng tồn tại của tế bào nhằm xác định xem liệu Nano astaxanthin ACT-NP có bất kỳ tác dụng bảo vệ và gây độc tế bào nào hay không [ 32 ]. Một lượng 180 µL dòng tế bào nguyên bào sợi ở thận hamster con BHK-21 được gieo vào đĩa 96 giếng với mật độ 1,0 × 10 ⁴ tế bào/giếng và nuôi cấy ở 37°C trong môi trường ẩm với 5% CO ₂ . Sau khi các tế bào BHK-21 đạt đến mức hợp lưu 80%, các tế bào được xử lý bằng 20 μL FA, NP trắng (BNP) và huyền phù ACT-NP ở nồng độ từ 12,5 đến 500,0 μg/mL, sau đó ủ trong 24 giờ. Các tế bào được rửa bằng PBS, sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào và bôi 1 mM hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) để tạo ra stress oxy hóa trong tế bào trong một giờ.

Sau đó, 20 µL thuốc thử MTT mới chuẩn bị (5 mg/mL) được đưa vào từng giếng và phản ứng ở 37°C trong 4 giờ nữa để mô phỏng sự hình thành tinh thể formazan màu tím được tạo ra bởi sự biến đổi tetrazolium bromide màu vàng do succinate ty thể. dehydrogenase trong tế bào sống. Chất nổi phía trên được loại bỏ sau khi ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 400 × g và dimethyl sulfoxide được thêm vào để hòa tan hoàn toàn formazan. Độ hấp thụ tia cực tím của formazan được xác định ở bước sóng 540 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi bản ELISA để đánh giá khả năng sống của tế bào.

2.7. Xét nghiệm Vivo FRAP

Chuột Sprague−Dawley (SD) (đực, 6 tuần tuổi) được lấy từ Woojung Bio Co., Ltd. (Suwon, Hàn Quốc). Chuột được nuôi trong chu kỳ sáng-tối 12 giờ ở độ ẩm 55 ± 5% và nhiệt độ 22 ± 2 ° C. Chúng được làm quen với khí hậu với quyền sử dụng miễn phí thức ăn tiêu chuẩn và nước máy trong 1 tuần. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều tuân theo hướng dẫn IACUC của Đại học Hanyang. Trước khi nghiên cứu, tất cả những con chuột đều bị bỏ đói qua đêm và sau đó chúng được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm, mỗi nhóm sáu con. Một nhóm được điều trị bằng ACT-NP mới được chuẩn bị với liều 10 mL/kg trọng lượng cơ thể (BW). Một nhóm khác được cấp BNP, được chuẩn bị không có ASX. Nhóm cuối cùng được điều trị bằng FA. Vào lúc 2, 4, 6, 8, 10 và 12 giờ sau khi xử lý mẫu, các phần máu từ việc đâm thủng quỹ đạo ngược được thu thập trong các ống EDTA 1 mL, sau đó ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 2000 × g . Cho đến khi phân tích, các mẫu huyết tương được đông lạnh kịp thời ở −70 ° C.

Đặc tính chống oxy hóa trong các mẫu huyết tương được đánh giá bằng xét nghiệm FRAP, được sửa đổi một chút từ Benzie và Strain (1996) [ 33 ]. Dung dịch FRAP, chứa đệm axetat (pH 3,6, 300 mM), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (10 mM) trong HCl (40 mM) và FeCl ₃ ·6H ₂ O (20 mM) theo tỷ lệ 10:1:1 ( v / v / v ), được sản xuất mới và làm ấm ở 37°C trước khi xét nghiệm. Các mẫu huyết tương (30 µL) được phản ứng với hỗn hợp thuốc thử FRAP (900 µL) và DW (90 µL) trong bóng tối trong 30 phút ở 37°C. Hoạt tính chống oxy hóa trong các mẫu huyết tương được phân tích bằng cách đọc độ hấp thụ tia cực tím của hỗn hợp ở bước sóng 595 nm bằng máy đọc đĩa đa vi đĩa Synergy HT.

2.8. Phân tích thống kê

Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ba lần và tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình ± (SD). Để đánh giá sự khác biệt đáng kể giữa tất cả các nhóm, ANOVA một chiều, sau đó là thử nghiệm đa phạm vi của Duncan (SPSS Phiên bản 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) đã được sử dụng. Sự khác biệt đáng kể về tác dụng loại bỏ gốc tự do DPPH giữa hai nhóm được xác định bằng cách sử dụng t -test của Học sinh . giá trị p dưới 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Đặc điểm của ACT-NP

3.1.1. Kích thước hạt và ZP của ACT-NP

Các ACT-NP được tạo thành theo các tỷ lệ khác nhau của CS cation và TPP anion với nồng độ ASX giống hệt nhau như trong Bảng 1 . Trong nghiên cứu này, TPP cao hơn 0,571 mg/mL và thấp hơn 0,429 mg/mL được coi là không phù hợp để điều chế Nano astaxanthin ACT-NP do sự hình thành NP không đều của chúng như đã được xác định trước trong các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi. Ở cùng nồng độ CS là 0,571 mg/mL, kích thước hạt của ACT-NP dao động từ 483,9 ± 148,4 đến 505,2 ± 184,8 nm với nồng độ TPP dao động từ 0,571 đến 0,468 mg/mL, sau đó tăng đáng kể lên 653,8 ± 215,1 nm. với việc giảm nồng độ TPP xuống 0,429 mg/mL ( p < 0,05). Mặc dù NP thường được định nghĩa là các hạt có đường kính từ 100 nm trở xuống, phạm vi kích thước hạt trong ngành công nghiệp thực phẩm đã được mở rộng đến 1000 nm do các vật liệu thành cấp thực phẩm được chấp nhận có khả năng làm xáo trộn tính đồng nhất và kích thước nhỏ của NP do độ tinh khiết tương đối thấp và trọng lượng phân tử lớn của chúng [ 34 ]. Theo một nghiên cứu trước đây, các đặc tính hóa lý của NP, được hình thành do sự tạo gel ion giữa các polyme tích điện dương và âm, có thể bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ tương đối của các nhóm tích điện [ 35 ]. Do đó, nồng độ TPP trên hoặc dưới mức thích hợp ở nồng độ CS nhất quán sẽ làm gián đoạn sự cân bằng điện tích giữa CS và TPP và ảnh hưởng đến các đặc tính hóa lý của NP, như kích thước hạt, ZP và xu hướng kết tụ hạt. Một kết quả tương tự đã được báo cáo rằng việc giảm tỷ lệ khối lượng của CS và TPP từ 5:1 xuống 2:1 đã dẫn đến sự gia tăng kích thước hạt của CS-NP [ 36 ]. Điều này có thể được giải thích là do lượng TPP tăng lên tương đối, do đó, TPP dư thừa ở trạng thái lơ lửng có thể tạo ra NP lớn hơn [ 37 ]. Tuy nhiên, việc giảm nồng độ TPP xuống 0,429 mg/mL cho thấy kích thước hạt tăng đáng kể ( p < 0,05). Những kết quả này nhấn mạnh rằng kích thước hạt của NP CS-TPP được cho là thay đổi theo các thành phần khác nhau như nồng độ và tỷ lệ của CS và TPP.

Giá trị ZP của ACT-NP tăng đáng kể từ 20,4 ± 1,2 lên 30,6 ± 0,6 mV khi nồng độ TPP giảm ( p < 0,05). Giá trị ZP của NP phụ thuộc vào thành phần của các nhóm tích điện như đã nói ở trên. Ở nồng độ TPP cao hơn, mức độ trung hòa của các nhóm amino được proton hóa tăng lên, dẫn đến giá trị ZP của NP CS-TPP thấp hơn [ 38 ]. Hơn nữa, vì CS và TPP lần lượt mang điện tích dương và âm, nên có lý khi kết luận rằng việc tăng nồng độ TPP dẫn đến giảm điện tích dương của NP. Vì ZP minh họa điện tích bề mặt của NP, độ ổn định phân tán tốt hơn có liên quan đến giá trị ZP cao hơn do lực đẩy điện giữa mỗi NP [ 18 ]. Hơn nữa, người ta đã chứng minh rằng các NP có giá trị ZP lớn hơn +20 mV hoặc nhỏ hơn −20 mV được cho là ổn định [ 39 ]. Độ ổn định phân tán của NP đã được xác nhận là ở khoảng 0,3 mức PDI, đây là mức được khuyến nghị cho hệ thống phân phối [ 40 ]. Do đó, tất cả các công thức ACT-NP được trình bày trong Bảng 1 đều có thể được coi là NP ổn định.

3.1.2. Hiệu quả nano hóa của ACT-NP

EE của ACT-NP tăng đáng kể khi tăng nồng độ TPP như trong Bảng 1 ( p <0,05). Điều này có thể là do số lượng đơn vị liên kết ngang ở các nồng độ TPP khác nhau. Sự gia tăng nồng độ TPP lên đến một tỷ lệ nhất định có liên quan đến khả năng liên kết chéo tốt hơn giữa CS và TPP, gây ra ái lực mạnh [ 38 ]. Mối quan hệ mạnh mẽ giữa CS và TPP sẽ dẫn đến việc ASX bị ràng buộc chặt chẽ với cấu trúc CS-TPP, do đó ASX khó có thể giải phóng nhanh chóng khỏi các NP. Mặt khác, với sự gia tăng hơn nữa nồng độ TPP, EE có thể giảm do cấu trúc nhỏ gọn hơn giữa CS và TPP, điều này có thể cản trở sự tương tác giữa TPP và vật liệu cốt lõi để liên kết CS [ 38 ]. Tuy nhiên, do ACT-NP trình bày trong nghiên cứu này được điều chế với tỷ lệ CS và TPP tối ưu cho sự hình thành NP, do đó, Nano astaxanthin ACT-NP có nồng độ TPP cao nhất (0,571 mg/mL) cho thấy EE cao hơn đáng kể (63,9%). ) ( p < 0,05). Theo thảo luận ở trên, tỷ lệ CS và TPP là 1:1 đã được chọn để nghiên cứu sâu hơn vì các Nano astaxanthin ACT-NP được điều chế theo tỷ lệ này mang lại EE cao nhất với kích thước và phân bố hạt có thể chấp nhận được.

3.2. Thuộc tính phát hành trong ống nghiệm

Trong môi trường SGF, tốc độ giải phóng ASX từ ACT-NP tăng dần mà không giải phóng hàng loạt trong thời gian ủ bệnh và tốc độ giải phóng đạt 88,1 ± 2,4% sau 12 giờ ( Hình 2 ). Việc giải phóng vật liệu lõi chủ yếu bị ảnh hưởng bởi sự xuống cấp của cấu trúc NP. Liên kết ngang giữa CS và TPP có thể bị ảnh hưởng do trạng thái tích điện của vật liệu vách có thể bị thay đổi bởi môi trường pH bên ngoài nơi các NP phân tán [ 20 ]. Hơn nữa, các NP có giá trị ZP cao có xu hướng có các ion tích điện mạnh trên bề mặt, điều này cho thấy khả năng chống phân hủy của NP cao hơn khi có môi trường axit [ 41 ]. Nói cách khác, các NP có giá trị ZP thấp dễ bị phân hủy trong môi trường axit dẫn đến sự giải phóng vật liệu lõi cao hơn. Như đã nói ở trên, giá trị ZP của ACT-NP được điều chế theo tỷ lệ 1:1 của CS và TPP là 20,4 ± 1,2 mV, thấp hơn so với các công thức khác. Do đó, điều này biểu thị rằng việc giải phóng Nano astaxanthin ACT-NP cao trong SGF có thể được giải thích bằng việc giảm lực hút tĩnh điện giữa CS và TPP trong môi trường axit. Một lời giải thích khả dĩ khác cho việc giải phóng ASX tăng lên trong SGF là khả năng hòa tan của CS trong môi trường axit. Nói chung, vì CS hòa tan trong phạm vi pH axit, nên sự tương tác giữa các NP CS-TPP được điều chế bằng quá trình tạo gel ion có xu hướng giảm SGF và đẩy nhanh quá trình giải phóng ASX [ 42 ].

Hình 2. Tốc độ giải phóng astaxanthin từ nano astaxanthin trong dịch dạ dày mô phỏng (SGF, pH 1.2) và dịch ruột (SIF, pH 6.8).

Mặt khác, việc giải phóng ASX từ ACT-NP không được tạo ra trong môi trường SIF và tốc độ giải phóng đạt 11,4 ± 2,7% sau 12 giờ ( Hình 2 ). Sự khác biệt này có thể được giải thích bằng hai cơ chế tương tác chính giữa CS-NP và môi trường SIF. Một là sự khử proton của các phân tử CS ở pH trung tính, có thể ổn định cấu trúc NP do hình thành nhiều liên kết hydro hơn [ 43 ]. Một khả năng khác là tính không hòa tan của CS ở pH trung tính. Cấu trúc của ACT-NP có thể được duy trì mà không bị hòa tan CS vì độ hòa tan của CS trong điều kiện trung tính thấp hơn đáng kể so với trong môi trường axit. Tương tự như vậy, nghiên cứu trước đây đã quan sát hoạt động của CS-NP trong các môi trường pH khác nhau (pH 1,2, 6,5, 7,2) để nghiên cứu đặc điểm giải phóng insulin. Họ khẳng định rằng CS-NP cho thấy sự giải phóng insulin thấp hơn ở độ pH 6,5 so với độ pH 1,2, do khả năng hòa tan của chitosan trong các môi trường khác nhau [ 42 ]. Do đó, các ACT-NP được điều chế bằng CS và TPP dường như đã bị suy giảm kéo dài trong SIF, dẫn đến việc phát hành ASX kéo dài.

3.3. Hoạt động chống oxy hóa trong ống nghiệm

Kết quả phân tích peroxid hóa lipid bằng phương pháp FTC và TBA được thể hiện trên Hình 3 a,b. Độ hấp thụ của chất đối chứng bắt đầu tăng nhanh trong vòng 2 ngày. Tuy nhiên, nó giảm dần khi đạt đến mức tối đa. Giá trị hấp thụ của FA liên tục tăng và đạt mức tối đa trong vòng 4 ngày, nhưng giảm nhẹ theo thời gian. Tuy nhiên, giá trị hấp thụ của ACT-NP tăng nhẹ sau 6 ngày và cho thấy mức độ thấp hơn đáng kể so với các giá trị khác trong thời gian thử nghiệm ( p < 0,05). Phương pháp TBA cho kết quả tương tự. Trong khi độ hấp thụ của đối chứng và FA tăng nhanh, đạt mức tối đa lần lượt là 2 và 4 ngày và giảm dần theo thời gian. Mặt khác, độ hấp thụ của Nano astaxanthin ACT-NP duy trì ở mức thấp hơn đáng kể mà không tăng dần trong thời gian thử nghiệm ( p <0,05).

Hình 3. Hoạt tính chống oxy hóa của ASX tự do và nano astaxanthin (ACT-NP) trong hệ thống peroxid hóa axit linoleic bằng phương pháp thiocyanate sắt ( a ) và phương pháp axit thiobarbituric ( b ). ^a–c Các giá trị có các chữ cái khác nhau thì khác nhau đáng kể ( p < 0,05).

Như được hiển thị trong Hình 4 , hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH của cả FA và Nano astaxanthin ACT-NP lần lượt là 13,77 và 14,80% vào ngày 0, cho thấy không có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, tác dụng của FA giảm đáng kể xuống còn 0,21% vào ngày 30, trong khi ACT-NP cho thấy tác dụng loại bỏ gốc DPPH không đổi trong thời gian ủ bệnh ( p < 0,05).

Hình 4. Hoạt tính chống oxy hóa của ASX tự do và nano astaxanthin (ACT-NP) sử dụng phương pháp quét gốc DPPH. Dấu hoa thị đơn biểu thị sự khác biệt đáng kể ( p < 0,05) giữa hai nhóm tại mỗi thời điểm bằng cách sử dụng t -test của Học sinh.

Kết quả thu được từ quá trình peroxid hóa lipid và xét nghiệm DPPH chỉ ra rằng ACT-NP duy trì hoạt động chống oxy hóa của ASX một cách hiệu quả so với FA. Hơn nữa, ACT-NP cho thấy tác dụng ức chế mạnh mẽ quá trình peroxid hóa axit linoleic tới 92% trong vòng 2 ngày cả theo phương pháp FTC và TBA, cho thấy rằng ACT-NP có hiệu quả trong việc cản trở quá trình oxy hóa axit linoleic ở cả giai đoạn đầu và giai đoạn thứ cấp. Hoạt động chống oxy hóa kéo dài của ACT-NP có thể được giải thích bằng ba cơ chế khác nhau: tăng độ hòa tan, đặc tính giải phóng bền vững và diện tích bề mặt lớn. Độ hòa tan của vật liệu lõi là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động chống oxy hóa khi nó phản ứng với các gốc tự do ở trạng thái hòa tan [ 44 ]. Ví dụ, một nghiên cứu trước đây đã xác nhận rằng hoạt tính chống oxy hóa của kaempferol đã tăng lên đáng kể do sự nano hóa trong CS-NP khi khả năng hòa tan trong nước của nó tăng lên [ 45 ]. Ngoài ra, CS-NP có đặc tính giải phóng kéo dài có thể tăng cường hoạt động chống oxy hóa bằng cách duy trì tính ổn định của vật liệu lõi [ 46 ]. Hơn nữa, hoạt tính chống oxy hóa được tăng cường của Nano astaxanthin ACT-NP có thể liên quan đến diện tích bề mặt lớn của NP CS-TPP cho phép các phân tử ASX tương tác với môi trường phản ứng hiệu quả hơn [ 47 ]. Do đó, nghiên cứu này đã xác nhận rằng hoạt động chống oxy hóa của ASX đã được cải thiện bằng cách nano hóa trong các NP CS-TPP.

3.4. Hoạt động chống oxy hóa Ex Vivo của ACT-NP

Khả năng tồn tại của tế bào BHK-21 thấp hơn 40% do tổn thương do H₂O₂ gây ra và khả năng tồn tại không được cải thiện khi xử lý dưới 50 μg/L ASX hoặc ACT-NP có chứa cùng một lượng ASX , như thể hiện trong Hình 5 . Tuy nhiên, khả năng tồn tại của tế bào tăng đáng kể ở mức 500 μg/L FA (46,7 ± 4,3%) ( p < 0,05) và hoạt động của ASX tăng lên rõ rệt khi nano hóa trong ACT-NP (52,9 ± 4,7%). Rõ ràng, ACT-NP ở nồng độ 500 μg/L ASX có hiệu quả trong việc bảo vệ tế bào BHK-21 chống lại tổn thương do H₂O₂ gây ra.

Hình 5. Tác dụng bảo vệ tế bào của các NP trắng, ASX tự do và nano astaxanthin ACT-NP sau khi làm hỏng dòng tế bào BHK-21 do hydro peroxide gây ra. ^a–c Các giá trị có các chữ cái khác nhau thì khác nhau đáng kể ( p < 0,05).

Do hoạt động chống oxy hóa của ASX được kích hoạt sau khi hấp thu tế bào, những kết quả này có thể được làm rõ bằng đặc điểm thẩm thấu tế bào của CS-NP. Phần bên trong màng tế bào được tích điện âm do bơm Na+-K+ tiêu thụ năng lượng từ quá trình thủy phân để bơm Na+ và K+ qua gradient điện hóa của chúng [ 48 ]. Vì CS mang điện tích dương vì nó có các nhóm amino trong cấu trúc nên tương tác tĩnh điện giữa CS cation và bề mặt tế bào anion có thể là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến đặc tính thấm tế bào của CS-NP [ 49 ]. Do đó, sự tiếp xúc kéo dài giữa Nano astaxanthin ACT-NP và bề mặt tế bào giúp tăng cường khả năng hấp thụ của CS-NP và do đó làm tăng hoạt động chống oxy hóa của ASX.

3.5. Xét nghiệm Vivo FRAP

Sự thay đổi giá trị FRAP ở chuột SD sau khi uống BNP, ASX và ACT-NP được minh họa trong Hình 6 . Giá trị FRAP của chuột được điều trị bằng BNP và FA tăng nhanh trong vòng hai giờ lên mức cao nhất, lần lượt là 95,26 ± 4,00 và 106,68 ± 17,93 μmol/L, trong khi giá trị FRAP của chuột được cho ăn ACT-NP chỉ tăng lên 85,33 ± 22,45 μmol/L trong cùng khoảng thời gian. Tuy nhiên, giá trị FRAP đã đảo ngược sau 2 giờ dùng đường uống. Tóm lại, giá trị FRAP của chuột được cho ăn ASX giảm xuống 94,07 ± 20,85 μmol/L sau 4 giờ, liên tục giảm theo thời gian và trở về giá trị ban đầu sau 8 giờ, chứng tỏ ASX có độ ổn định thấp trong điều kiện kiềm [ 50 ]. Mặt khác, giá trị FRAP của ACT-NP không ngừng tăng và vượt quá giá trị FRAP của FA sau 4 giờ. Mặc dù giá trị FRAP của ACT-NP bắt đầu giảm 4 giờ sau khi dùng, hoạt tính chống oxy hóa của ACT-NP luôn vượt trội so với FA.

Hình 6. Những thay đổi về giá trị FRAP trong huyết tương chuột sau một liều NP trắng, ASX tự do và nano astaxanthin ACT-NP.

Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sinh khả dụng của ASX được cho ăn bằng đường uống chỉ bằng 12% ASX được truyền qua đường tiêm trong phúc mạc, cho thấy ASX có sinh khả dụng qua đường uống thấp do đặc tính ưa mỡ của nó [ 51 ]. Hạn chế này của ASX có thể được khắc phục thông qua việc nano hóa trong các NP CS-TPP. Điều này có thể là do sự giải phóng ASX bền vững từ các NP CS-TPP, như đã đề cập trong các nghiên cứu giải phóng in vitro, chỉ ra rằng các NP CS-TPP có hiệu quả trong việc bảo vệ ASX khỏi bị thoái hóa trong quá trình hấp thu ở đường tiêu hóa. Hơn nữa, vì việc nano hóa trong CS-NP đã được báo cáo là một cách hiệu quả để cải thiện khả năng hòa tan của vật liệu lõi, Nano astaxanthin ACT-NP có thể tăng cường khả năng hòa tan của ASX, do đó thúc đẩy khả dụng sinh học qua đường uống của nó [ 45 ]. Do đó, việc nano hóa trong các NP CS-TPP có thể có tiềm năng được sử dụng làm hệ thống phân phối qua đường uống cho ASX để duy trì khả năng chống oxy hóa sau khi uống.

4.Kết luận

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã gói gọn ASX trong ACT-NP bằng CS và TPP bằng phương pháp tạo gel ion. Nano astaxanthin cho thấy các đặc tính hóa lý có thể chấp nhận được như kích thước hạt, ZP, PDI và EE. Các đặc tính lý hóa đã chỉ ra rằng sự tương tác giữa CS và TPP đối với sự hình thành NP bị ảnh hưởng rõ rệt bởi tỷ lệ giữa CS và TPP. Các NP CS-TPP với tỷ lệ 1: 1 của CS và TPP đã được tìm thấy để tăng cường các đặc tính giải phóng, các hoạt động chống oxy hóa in vitro và in vivo cũng như tác dụng bảo vệ tế bào của ASX. Các Nano astaxanthin ACT-NP cho thấy sự giải phóng bền vững ASX (11,4 ± 2,7%) trong môi trường SIF, cho thấy rằng các NP CS-TPP có khả năng tăng tính ổn định của ASX. Xu hướng này phù hợp với kết quả của các hoạt động chống oxy hóa in vitro, ex vivo và in vivo, cho thấy NP CS-TPP có thể ảnh hưởng thành công đến hoạt động chống oxy hóa và khả dụng sinh học đường uống của ASX so với FA. Kết quả cho thấy các NP CS-TPP có các đặc tính NP mong muốn có thể được sử dụng làm hệ thống phân phối qua đường miệng tiềm năng nhằm cải thiện tính ổn định, hoạt động chống oxy hóa và khả dụng sinh học của ASX.

Nguồn tham khảo: Chitosan-Tripolyphosphate Nanoparticles Prepared by Ionic Gelation Improve the Antioxidant Activities of Astaxanthin in the In Vitro and In Vivo Model
by Eun Suh Kim 1,Youjin Baek 1,Hyun-Jae Yoo 1,Ji-Soo Lee 2,* and Hyeon Gyu Lee 1,*