แอสตาแซนธินที่ให้อาหารเป็นอาหารจะช่วยเพิ่มอัตราการเจริญเติบโต ปรับปรุงสีสัน และเพิ่มความต้านทานต่อภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนีย (NH3) ในกุ้งขาว
แอสตาแซนธิน (AX) เป็นแคโรทีนอยด์ธรรมชาติที่มักใช้เป็นอาหารเสริมในอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงกุ้งขาวแปซิฟิก (Litopenaeus vannamei) การศึกษาครั้งนี้ประเมินผลของ แอสตาแซนธิน สังเคราะห์ทางเคมีต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต อัตราการรอดชีวิต ความทนทานต่อความเครียด การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน และการสร้างเม็ดสีของกุ้งขาวแปซิฟิกที่ได้รับอาหารเสริม AX ห้าระดับในอาหารที่มี 0, 20, 40, 80 และ 160 มก./กก. การทดลองการให้อาหารดำเนินการเป็นเวลา 8 สัปดาห์ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าผู้ที่ได้รับอาหารเสริม AX นั้นมีการเจริญเติบโตที่ดีขึ้น โดยน้ำหนักตัวสุดท้าย (FBW) การเพิ่มขึ้นของน้ำหนักตัว (BWG) อัตราการเจริญเติบโตจำเพาะ (SGR) และไมโอสแตติน (MSTN) แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของแอสตาแซนธินตามขนาดยา หลังจากทดสอบภาวะขาดออกซิเจนเฉียบพลันและภาวะเครียดจากแอมโมเนีย อัตราการรอดชีวิต (SR) ของกุ้งที่ได้รับอาหารระดับ 40, 80 และ 160 มก./กก. สูงกว่ากลุ่มควบคุม กลุ่มอาหาร AX มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดีขึ้นเพื่อป้องกันความเสียหายจากออกซิเดชัน รวมถึงเพิ่มกิจกรรมของฟอสฟาเทสกรด (ACP) ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด (T-AOC) และลดกิจกรรมของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) และคาตาเลส (CAT) รวมทั้งมีปริมาณมาโลนไดอัลดีไฮด์ (MDA) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม นอกจากนี้ การแสดงออกของยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระต่างๆ ในตับอ่อนของกุ้งยังถูกควบคุมขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ เช่น แมงกานีสซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (MnSOD) และกลูตาไธโอน เอส-ทรานสเฟอเรส (GST) การแสดงออกในระดับสูงของปัจจัยชักนำภาวะขาดออกซิเจน 1α (HIF-1α) และกลูตาเมตดีไฮโดรจีเนส (GDH-β) กลูตามีนซินเทส (GS) ในกลุ่ม 80 และ 160 มก./กก. แสดงให้เห็นถึงผลของสารเหล่านี้ต่อไกลโคไลซิส ซึ่งมีความสำคัญต่อการผลิตพลังงานที่จำเป็น การวิเคราะห์การถดถอยกำลังสองบ่งชี้ว่าระดับที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเจริญเติบโตและการสร้างเม็ดสีคือ 126.94 มก./กก. และ 138.96 มก./กก. ตามลำดับ สรุปได้ว่า แอสตาแซนธิน สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโต ลดความเครียดออกซิเดชันและแอมโมเนีย และปรับปรุงภูมิคุ้มกันของกุ้งขาวแปซิฟิก
1. แนะนำ
Litopenaeus vannamei เป็นสัตว์จำพวกกุ้งทะเลที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจและเชิงพาณิชย์มากที่สุดชนิดหนึ่งสำหรับการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ มีลักษณะเด่นคือมีอัตราการเติบโตที่รวดเร็ว เนื้อนุ่ม ทนต่อความเครียดได้ดี มีอัตราการสืบพันธุ์สูง และมีคุณค่าทางโภชนาการสูง คุณสมบัติที่เหนือกว่าเหล่านี้ทำให้มูลค่าตลาดสูงและความต้องการของตลาดเพิ่มมากขึ้น (Jin และ Du, 2015, Liang et al., 2008, Pan et al., 2007) อย่างไรก็ตาม กุ้งมีความอ่อนไหวต่อปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมต่างๆ เนื่องมาจากการทำฟาร์มแบบหนาแน่นสูงเพื่อเพิ่มผลผลิตในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ เมื่อระบบการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำไม่ได้รับการออกแบบอย่างดีหรือมีการจัดการที่ไม่ดี (Aklakur, 2018, Fan et al., 2016, Pan et al., 2007) ในระบบการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ การแลกเปลี่ยนน้ำที่ไม่เพียงพอและการป้อนอาหารที่สูงจะทำให้มีระดับแอมโมเนียมากเกินไปและทำให้มีออกซิเจนละลายน้ำ (DO) ในน้ำต่ำ (Chen et al., 2012) ส่งผลให้เกิดความผิดปกติทางสรีรวิทยาหลายประการ เช่น ความเสียหายที่เกิดจากอนุมูลออกซิเจน (ROS) ภูมิคุ้มกันบกพร่อง และการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยา (Hong et al., 2007, Harris et al., 2001) การสัมผัสกับสิ่งแวดล้อมเป็นเวลานานอาจทำให้เกิดการระบาดของโรคและการตายของสัตว์น้ำได้ (Jiang et al., 2005) เนื่องจากความเสี่ยงเหล่านี้ต่อการดำเนินการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ การปรับปรุงความสามารถเหล่านี้จึงสามารถทำได้โดยการเสริมอาหารด้วยสารป้องกันแอมโมเนียและสารต้านอนุมูลอิสระ เช่น วิตามินซี อัลฟาโทโคฟีรอล และแคโรทีนอยด์
แอสตาแซนธิน (3,3′-dihydroxy-β, β’-carotene-4,4′-dione) ซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์สีแดงส้ม มักใช้เป็นอาหารเสริม สี และผลิตภัณฑ์ทางโภชนาการในอุตสาหกรรมอาหาร โดยพบได้อย่างกว้างขวางในสัตว์ทะเลในธรรมชาติ (Ambati et al., 2014, Mezzomo and Ferreira, 2016) จนถึงปัจจุบัน มีการค้นพบข้อมูลอันมีค่ามากมายเกี่ยวกับหน้าที่ของแอสตาแซนธินในระบบการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ มีรายงานว่ามีประโยชน์ต่อการเจริญเติบโต การลอกคราบ และการสืบพันธุ์ของสัตว์น้ำ (Ambati et al., 2014, Lim et al., 2018, Higuera-Ciapara et al., 2006, Wade et al., 2017b) แอสตาแซนธิน (AX) เป็นเม็ดสีหลักในกุ้ง ทำให้กุ้งมีสีส้มแดงที่สวยงาม (Shigeru et al., 1994) ส่งผลให้ความต้องการของผู้บริโภคเพิ่มมากขึ้น (Wade et al., 2017a) บทบาทสำคัญอีกประการหนึ่งของ AX คือฟังก์ชันต้านอนุมูลอิสระในเซลล์ของสัตว์ เนื่องจากมีสารต้านอนุมูลอิสระและสารกำจัดอนุมูลอิสระหลายชนิด และยังช่วยยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของไขมัน ซึ่งสามารถลดความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมได้ (Miki, 1991) เนื่องจาก AX มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ยอดเยี่ยม จึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะโปรโมเตอร์และตัวควบคุมระบบภูมิคุ้มกันเพื่อเพิ่มการตอบสนองภูมิคุ้มกันและความต้านทานต่อความเครียดของกุ้งต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจน (Chien และ Shiau, 2005) ความเครียดจากความเค็ม และความเครียดจากแอมโมเนีย (Flores et al., 2007, Pan et al., 2003) งานวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น คาตาเลส ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส เปอร์ออกซิเดส และสารที่ทำปฏิกิริยากับกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBARS) ในพลาสมาและตับของหนูได้รับผลกระทบจาก AX (Ranga et al., 2010, Saad et al., 2016) ดังนั้น การใช้ AX เป็นสารเติมแต่งอาหารในการเลี้ยงสัตว์จำพวกกุ้งเพื่อปรับปรุงคุณภาพของสิ่งมีชีวิตจึงมีประโยชน์มากกว่าในการเพิ่มผลผลิต ซึ่งมีรายงานพบในปูและกุ้งชนิดอื่นๆ อย่างไรก็ตาม ข้อมูลพื้นฐานโดยละเอียดเกี่ยวกับผลของ AX ของกุ้งขาว Litopenaeus vannamei ต่อความทนทานต่อความเครียดยังคงไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด
การประเมินพารามิเตอร์ทางชีวเคมี (กิจกรรมเอนไซม์และการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์กัน) ของกุ้งเป็นสิ่งสำคัญในการประเมินผลของการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารภายใต้ความเครียด ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระรวม (T-AOC) ถือเป็นตัวบ่งชี้สถานะสารต้านอนุมูลอิสระและสถานะสุขภาพของสิ่งมีชีวิตที่ครอบคลุม (Griendling และ Alexander, 1997; Castillo et al., 2006) คาตาเลส (CAT) ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GSH-Px) เป็นเอนไซม์ป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งการเปลี่ยนแปลงจะสะท้อนถึงสภาวะทางสรีรวิทยาของสิ่งมีชีวิตหรือเซลล์ภายใต้สภาพแวดล้อมที่แตกต่างกันในระดับหนึ่ง ดังนั้นจึงสามารถถือเป็นตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาที่สำคัญในการพิจารณาว่ากุ้งขาวแปซิฟิกอยู่ภายใต้ความเครียดจากสภาพแวดล้อมภายนอกหรือไม่ (Li et al., 2021) นอกจากนี้ ในฐานะตัวบ่งชี้โดยตรงของ AX สำหรับผลทางสรีรวิทยาและภูมิคุ้มกัน การควบคุมการแสดงออกของยีนของเอนไซม์เผาผลาญต่างๆ มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความเข้มข้นของการเผาผลาญของกุ้งขาวแปซิฟิกต่อการตอบสนองต่อความเครียด เช่น เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ (glutamate dehydrogenase-β, GDH-β; glutamine synthetase, GS) และการดีท็อกซ์แอมโมเนีย (Manganese superoxide dismutase, MnSOD; glutathione S-transferase, GST) และอื่นๆ (Mayzaud และ Conover, 1988, Ahn et al., 2019) ดังนั้น การควบคุมการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์กันอาจสะท้อนให้เห็นว่าอาหาร AX ที่แตกต่างกันส่งผลต่อการเผาผลาญทางสรีรวิทยาของกุ้งขาวแปซิฟิกภายใต้ความเครียด
จนถึงปัจจุบัน มีวรรณกรรมน้อยมากที่สำรวจผลกระทบของ AX ต่อความต้านทานต่อความเครียดจากแอมโมเนียและความเครียดจากการขาดออกซิเจนในกุ้งขาว L. vannamei ยังไม่ชัดเจนว่าการเสริม AX ในอาหารจะมีประโยชน์ต่ออัตราการรอดชีวิตของกุ้งขาว L. vannamei ที่สัมผัสกับสภาวะขาดออกซิเจนและแอมโมเนียหรือไม่ และกลไกการปรับภูมิคุ้มกันเป็นอย่างไร ดังนั้น จึงดำเนินการศึกษานี้เพื่อตรวจสอบผลของ AX ต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต สี ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ และความทนต่อแอมโมเนียของกุ้งขาว L. vannamei ข้อมูลของเรามีส่วนช่วยในการทำความเข้าใจความสัมพันธ์การตอบสนองระหว่าง AX กับภาวะขาดออกซิเจนและทนต่อแอมโมเนียของ L. vannamei ซึ่งอาจเป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับการกำหนดสูตรอาหารของ L. vannamei
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. การรับประทานอาหารแบบทดลอง
เม็ดสีสังเคราะห์ทางเคมี (Astaplus®10%; Guangzhou Juyuan Bio-chem Co., Ltd., Guangzhou, China) ซึ่งมีปริมาณ แอสตาแซนธิน อิสระ 10% ถูกใช้เป็นแหล่งอาหารเสริม AX เนื่องจากปริมาณของ AX และส่วนประกอบอื่นๆ (ซูโครส แป้งข้าวโพด เจลาติน แป้งโซเดียมอ็อกเทนิลซักซิเนต บิวทิลเลเต็ดไฮดรอกซีโทลูอีน) ในแหล่งนี้แตกต่างกันค่อนข้างมาก จึงไม่ได้พิจารณาถึงการมีส่วนสนับสนุนของส่วนประกอบอื่นๆ สูตรอาหารพื้นฐานและการวิเคราะห์องค์ประกอบโดยประมาณแสดงอยู่ในตารางที่ 1 AX ได้รับการเสริมเข้ากับอาหารพื้นฐานในความเข้มข้น 0, 20, 40, 80 และ 160 มก./กก. ตามลำดับ ความเข้มข้นที่แท้จริงของ AX ในอาหารทดลองทั้ง 5 ชนิดแสดงอยู่ในตารางที่ 1 ด้วย ส่วนผสมแห้งทั้งหมดจะถูกบดละเอียด ชั่งน้ำหนัก และผสมให้เข้ากัน จากนั้นจึงเติมส่วนประกอบของไขมันและ Astaplus®10% ลงในส่วนผสม และสุดท้ายเติมน้ำ (40% ของน้ำหนักส่วนผสมแห้ง) และผสมให้เข้ากัน เม็ดพลาสติกที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 1.2 มม. ผลิตโดยใช้เครื่องอัดรีดแบบสกรูเดี่ยว อาหารจะถูกอบในเตาอบไฟฟ้าที่อุณหภูมิ 40°C จนความชื้นลดลงเหลือ <10% และเก็บในถุงพลาสติกที่อุณหภูมิ -20°C จนกว่าจะใช้งาน
ตารางที่ 1 สูตรและส่วนประกอบโดยประมาณของอาหารทดลอง 5 ชนิด (น้ำหนักแห้ง)
2.2. การทดลองและการจัดการการเลี้ยงกุ้ง
การทดลองดังกล่าวดำเนินการที่วิทยาเขตเซินเจิ้น สถาบันวิจัยการประมงทะเลจีนใต้ และสถาบันการประมงแห่งจีน (เซินเจิ้น ประเทศจีน) กุ้งขาววัยอ่อน L. vannamei ซื้อจาก Shenzhen Global Lianzhong Biotechnology Co., Ltd. (เซินเจิ้น ประเทศจีน) ก่อนการทดลองให้อาหาร กุ้งทั้งหมดได้รับการปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมการทดลองและให้อาหารควบคุมเป็นเวลา 1 สัปดาห์ หลังจากปรับตัวแล้ว กุ้งจะได้รับอาหารเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นกุ้งที่มีสุขภาพแข็งแรงทั้งหมด 800 ตัว ซึ่งมีน้ำหนักตัวเริ่มต้นประมาณ 0.95 กรัม จะถูกแบ่งแบบสุ่มในถังไฟเบอร์กลาสทรงกระบอกจำนวน 20 ถัง (ถังละ 500 ลิตร อาหาร 4 ถัง ถังละ 40 ตัว) กุ้งทั้งหมดได้รับอาหารทดลองวันละ 3 ครั้ง เวลา 07.00 น. 12.00 น. และ 18.00 น. ในอัตรา 6% ของน้ำหนักตัวต่อวัน เป็นเวลา 8 สัปดาห์ เศษอาหารและอุจจาระที่ไม่รับประทานจะถูกกำจัดออกโดยใช้เครื่องดูดทุกวัน มีการติดตามและบันทึกอัตราการเสียชีวิตเป็นประจำทุกวัน การจัดสรรอาหารจะได้รับการปรับตามปริมาณการบริโภคอาหารที่สังเกตได้ การเลี้ยงกุ้งด้วยระบบไหลผ่านด้วยน้ำทะเลที่ผ่านการกรอง ในระหว่างการทดลอง คุณภาพน้ำทะเลได้รับการรักษาไว้ดังนี้: pH ตั้งแต่ 7.9 – 8.0; อุณหภูมิ 26–30 °C; ความเค็ม 30 ‰; แอมโมเนีย-N 0.05–0.07 มก./ลิตร DO 5.8–6.7 มก. / ลิตร การทดลองใช้แสงธรรมชาติและรอบมืด
2.3. การเตรียมตัวอย่าง
เมื่อสิ้นสุดการทดลองให้อาหาร กุ้งจะถูกอดอาหารเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงชั่งน้ำหนักและนับกุ้งที่รอดชีวิตทั้งหมดในแต่ละถังเพื่อกำหนดน้ำหนักตัวขั้นสุดท้ายและอัตราการรอดตาย กุ้งจำนวน 5 ตัวจากแต่ละถังถูกเก็บรวบรวมแบบสุ่มและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C เพื่อวิเคราะห์เพื่อหาความเข้มข้นของ AX และน้ำหนักตัว ตัวอย่างเลือดน้ำเหลืองถูกเก็บจากช่องท้องของกุ้ง 6 ตัวในแต่ละถัง จากนั้นตัวอย่างเฮโมไลเสตถูกผสมเบาๆ ในหลอด Eppendorf ที่ไม่มี RNase และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 °C ข้ามคืน จากนั้นนำไปปั่นที่ 8,000 g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เพื่อให้ได้ซีรั่ม จากนั้นตับอ่อนและกล้ามเนื้อของกุ้งจะถูกผ่าออกและแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อกำหนดการแสดงออกของยีนและกิจกรรมเอนไซม์เพิ่มเติม กุ้งสามตัวถูกสุ่มเก็บตัวอย่างจากแต่ละถังเพื่อวัดสี
2.4. การทดสอบความเครียด
หลังจากการทดลองการให้อาหารเป็นเวลา 8 สัปดาห์ ได้มีการทดสอบภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนียตามลำดับ ผู้ที่อยู่ในกลุ่มอาหารทั้ง 5 กลุ่มรวม 200 รายไม่ได้รับการบำบัดเป็นกลุ่มควบคุม ในขณะที่กุ้งที่เหลือได้รับการรักษาด้วยภาวะขาดออกซิเจนและภาวะเครียดจากแอมโมเนีย เมื่อสิ้นสุดการทดลองท้าทาย ตัวอย่างเลือดและตับอ่อนจะถูกนำออกจากกุ้งสดเพื่อการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระและภูมิคุ้มกัน
2.4.1. การทดลองความเครียดจากภาวะขาดออกซิเจน
มีผู้เข้าร่วมทั้งหมด 150 รายใน 5 กลุ่มการรับประทานอาหารสำหรับการทดลองความเครียดจากการขาดออกซิเจน กุ้ง 30 ตัวต่ออาหารถูกย้ายลงในถุงพลาสติก 3 ใบ (3 แบบจำลอง โดยแต่ละแบบจำลองมี 10 ตัวแบบสุ่ม) ซึ่งเติมน้ำทะเลสด 10 ลิตรไว้ก่อนหน้านี้ โดยไม่ได้เสริมออกซิเจนหรือการเติมอากาศ (Lu et al., 2019) ถุงพลาสติกแต่ละใบถูกมัดอย่างแน่นหนาและบันทึกอัตราการรอดชีวิตทุก ๆ ชั่วโมงจนกระทั่งถึงเวลาเสียชีวิต สุดท้ายการทดสอบความเครียดกินเวลานาน 6 ชั่วโมง ระดับออกซิเจนที่ละลายน้ำจะถูกวัดตอนเริ่มต้นและหลังการสังเกตเป็นเวลา 6 ชั่วโมง กุ้งจะถูกตรวจสอบอย่างใกล้ชิดและบันทึกอัตราการรอดทุก ๆ ชั่วโมงจนกระทั่งถึงเวลาตาย อุณหภูมิของน้ำ ค่า pH และความเค็มในถุงได้รับการรักษาไว้ที่ 26–30 °C, 7.9–8.0 และ 30‰.
2.4.2. การทดสอบความเครียดแอมโมเนีย
ในทำนองเดียวกัน มีการคัดเลือกบุคคลทั้งหมด 150 รายใน 5 กลุ่มอาหารสำหรับการทดลองความเครียดจากแอมโมเนีย กุ้ง 30 ตัวต่ออาหาร (จำลอง 3 ครั้ง โดยแต่ละครั้งสุ่ม 10 ตัว) ได้รับการทดลองความเครียดจากแอมโมเนีย เตรียมสารละลายทดสอบแอมโมเนียโดยการเติมแอมโมเนียมคลอไรด์ (NH4Cl) ลงในแต่ละถัง จากการศึกษาครั้งก่อน พบว่าแอมโมเนียที่มีความเข้มข้นสูง (∼10 mg L -1 ) ได้รับการออกแบบสำหรับการทดลองนี้ (Lu et al., 2019) ในที่สุด ความเข้มข้นของ 12.85 มก. / ลิตร NH 3-N ถูกกำหนดตามมาตรฐานแห่งชาติของสาธารณรัฐประชาชนจีน (GB3097–1997) โดยอาศัยความเค็มที่ 30‰ ค่า pH ที่ 8.0 และอุณหภูมิที่ 26℃ ในขณะนั้น ในระหว่างการทดสอบความเครียด อัตราการรอดชีวิตของกุ้งได้รับการติดตามอย่างใกล้ชิดและบันทึกทุก ๆ ชั่วโมงจนถึงเวลาเฉลี่ยของการตาย การทดสอบความเครียดด้วยแอมโมเนียใช้เวลา 6.5 ชั่วโมง
2.5. การวิเคราะห์องค์ประกอบโดยประมาณ AX และสี
ความชื้น โปรตีนดิบ เถ้าดิบ และไขมันดิบของอาหารทดลองและร่างกายทั้งหมดถูกกำหนดตามขั้นตอน AOAC (AOAC, 1995) ปริมาณความชื้นจะถูกตรวจสอบโดยการอบแห้งในตู้อบที่อุณหภูมิ 105°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง วิเคราะห์ปริมาณโปรตีนดิบโดยวิธี Kjeldahl หลังจากการย่อยด้วยกรด (เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ 1030; Tecator, Hoganas, สวีเดน) เถ้าดิบจะถูกกำหนดภายหลังการเผาไหม้ในเตาเผาแบบปิดที่อุณหภูมิ 550°C ให้มีมวลคงที่ ไขมันดิบถูกวัดโดยการสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์โดยใช้เครื่อง Soxtec System HT (Soxtec System HT6; Tecator)
การวิเคราะห์เชิงปริมาณของเนื้อหา AX ฟรีในอาหารทดลองและเนื้อเยื่อกุ้งดำเนินการโดยเครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) ตามวิธีของ Wade et al. (2548) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย AX สกัดจากกุ้งบดและอาหารด้วยอะซิโตน 50 มล. จากนั้นสารสกัดอะซิโตนจะถูกกรองผ่านกรวยแก้วทราย และสารตกค้างที่เป็นของแข็งจะถูกสกัดสองครั้งด้วยอะซิโตน 30 มล. ในอ่างน้ำ 40 องศาเซลเซียสสำหรับการสกัดเพิ่มเติม จนกระทั่งสารสกัดทั้งหมดเกือบไม่มีเม็ดสี เพื่อให้ได้สารสกัด AX ที่อิสระอย่างสมบูรณ์ ตัวทำละลายถูกถ่ายโอนไปยังขวดทรงกลมและทำให้แห้งโดยการระเหยแบบหมุนภายใต้สุญญากาศที่ 45°C ตัวอย่างสารละลายได้มาจากการละลายสารตกค้างด้วยเมทานอล 20 มล. จนกระทั่งวิเคราะห์ด้วย HPLC การแยกด้วย HPLC ดำเนินการบนคอลัมน์ Shimadzu VP-ODS (150 L × 4.6: ขนาดอนุภาค 5 µm) AX ฟรีถูกกำหนดที่ความยาวคลื่น 470 นาโนเมตร เฟสเคลื่อนที่ที่อัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตรต่อนาที มีดังนี้: เมทานอล (A), ไดคลอโรมีเทน (B), อะซีโตไนไตรล์ (C), H 2 O (D) (A: B: C: D = 85 :5:5:5) ปริมาตรการฉีด 20 μl. ความเข้มข้นของ AX ฟรีได้รับการคำนวณโดยใช้พื้นที่สูงสุดเทียบกับมาตรฐาน AX ของความเข้มข้นที่ทราบ
ถ่ายภาพกุ้งที่รอดชีวิตจากอาหารแต่ละประเภทจำนวน 12 ตัว จากนั้นนำทั้งหมดไปวางในอ่างน้ำเดือด (>95 °C) เป็นเวลา 3 นาที หลังจากต้มเป็นเวลา 1 นาที สีที่ปรุงแล้วจะถูกประเมินโดยใช้ระบบถ่ายภาพดิจิทัลและการให้คะแนนแบบอัตนัย สีของกุ้งดิบและกุ้งสุกจะถูกวัดปริมาณด้วยพารามิเตอร์สี (L* = ความสว่าง, a* = สีแดง, b* = สีเหลือง) โดยใช้เครื่องวัดสี (Minolta Chroma Meter CR400, Konica Minolta Sensing Inc., โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น) ค่า L* มีตั้งแต่ 0 สำหรับสีดำล้วน ถึง 100 สำหรับสีขาวล้วน โดย a* แทนค่าระดับสีแดง-เขียว และ b* แทนค่าระดับสีน้ำเงิน-เหลือง เมื่อพิจารณาสีที่แตกต่างกันในส่วนต่างๆ ของกุ้ง สีของส่วนทั้ง 3 ส่วนของกุ้ง (หัว ลำตัว และหาง) ถูกอ่านด้วยเครื่องวัดสี
2.6. การทดสอบพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระและภูมิคุ้มกัน
ทำการทำให้ตับอ่อนเป็นเนื้อเดียวกัน (1:9) โดยการเติมน้ำเกลือเย็น จากนั้นปั่นส่วนที่เป็นเนื้อเดียวกันที่ 3,500 กรัม เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จากนั้นนำส่วนที่เป็นเนื้อเดียวกันของตับอ่อนที่เย็นมาใช้เพื่อตรวจวัดกิจกรรมของเอนไซม์ ปริมาณโปรตีนทั้งหมดในของเหลวส่วนบนถูกกำหนดโดยใช้ BCA Protein Assay Kit (Q045–3, Jiancheng Institute of Bioengineering, Nanjing, China) กิจกรรมของ superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), acid phosphatase (ACP), total acid ability (T-AOC) และ malondialdehyde (MDA) ในซีรั่มและตับอ่อน ได้รับการวัดตามคำแนะนำของชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China) กิจกรรมของ SOD ถูกกำหนดโดยวิธี xanthine oxidase (hydroxylamine) CAT เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา H 2O2 และปฏิกิริยานี้สามารถหยุดได้อย่างรวดเร็วด้วยการเติมแอมโมเนียมโมลิบเดต H 2 O 2 ที่เหลือจะรวมกับแอมโมเนียมโมลิบเดตเพื่อสร้างสารประกอบสีเหลืองอ่อน กิจกรรม CAT ได้รับการวิเคราะห์โดยการกำหนดความแตกต่างของการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตร ACP สามารถเร่งปฏิกิริยาฟีนิลฟอสเฟตให้เป็นฟีนอลอิสระและกรดฟอสฟอริกได้ ภายใต้สภาวะเป็นด่าง ฟีนอลสามารถทำปฏิกิริยากับ 4-aminoantipyrin เพื่อผลิตอนุพันธ์ควิโนนสีแดง ดังนั้น จึงวิเคราะห์กิจกรรมของ ACP โดยการเปลี่ยนแปลงโทนสีแดงที่ความยาวคลื่น 520 นาโนเมตร ใช้การลด Fe 3+ เพื่อตรวจจับ T-AOC ใช้การตรวจสอบปริมาณ MDA โดยใช้วิธีกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBA)
2.7. การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ
RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RNeasy ® Mini Kit (QIAGEN cat. nos. 74104, เยอรมนี) RNA ถูกตรวจสอบปริมาณโดยการวิเคราะห์สเปกโตรโฟโตเมตริก และประเมินคุณภาพโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส 1% การสังเคราะห์ cDNA สายแรกโดยใช้การถอดรหัสย้อนกลับดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับ PrimeScript™ RT Reagent Kit (TaKaRa cat. nos. RR047A, ญี่ปุ่น) ดำเนินการ Real-time PCR สำหรับยีนเป้าหมายโดยใช้ GoTaq® qPCR Master Mix (Promega cat. nos. A6002, USA) และวัดปริมาณบน LightCycler 480 (Roche Applied Science, Switzerland) ปัจจัยการยืดออก 1α (EF1α) ถูกใช้เป็นยีนอ้างอิง ลำดับของยีนที่ประเมินได้มาจาก NCBI GenBank ลำดับไพรเมอร์เฉพาะของแต่ละยีนได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer Premier 5.0 (ตารางที่ 2) RT-PCR ประกอบด้วยขั้นตอนการทำลายโครงสร้างที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 4 นาที ตามด้วยการขยายสัญญาณ 40 รอบที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5 วินาที การแอนนีลที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 15 วินาที และการยืดออกที่อุณหภูมิ 72°C เป็นเวลา 15 วินาที ระดับการแสดงออกสัมพันธ์ของยีนถูกคำนวณโดยอาศัยสมการ 2 −ΔΔCT (Livak และ Schmittgen, 2001) แต่ละข้อมูลจะถูกสร้างขึ้นเป็นสำเนาอิสระสามชุด
ตารางที่ 2 ลำดับไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้
2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติแบบทางเดียว (One-way ANOVA) ถูกใช้เพื่อทดสอบความสำคัญของผลการรักษาโดยรวมที่มีต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต การสร้างเม็ดสี แอสตาแซนธิน ในร่างกายของกุ้งที่ได้รับอาหารเป็นเวลา 8 สัปดาห์ในระดับต่างๆ อัตราการรอด และ แอสตาแซนธิน ในร่างกายของกุ้งที่ใช้ในการทดลองภาวะเครียดจากการขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนีย การทดสอบตามด้วยการทดสอบหลายช่วงของ Duncan (DMRT) การถดถอยกำลังสองใช้ในการประมาณระดับ AX ในอาหารที่เหมาะสมที่สุด สถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้โปรแกรม SPSS (เวอร์ชัน 19.0) และข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ยพร้อมข้อผิดพลาดมาตรฐาน (SE) ความแตกต่างระหว่างการรักษาถือว่ามีนัยสำคัญที่ระดับ 0.05
3. ผลลัพธ์
3.1. ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตและองค์ประกอบของร่างกายทั้งหมด
ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตโดยเฉพาะการเพิ่มน้ำหนักตัวและอัตราการเจริญเติบโตเฉพาะถือเป็นดัชนีสำคัญของผลผลิตและประสิทธิภาพการเลี้ยงกุ้ง น้ำหนักตัวสุดท้าย (FBW) ของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX80 และ AX160 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 อย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) (ตารางที่ 3) ในทำนองเดียวกัน อัตราการเพิ่มน้ำหนักตัว (BWG) และอัตราการเจริญเติบโตจำเพาะ (SGR) ของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 จะสูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 อย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการรอดชีวิต (SR) และประสิทธิภาพการกินอาหาร (FE) ของกุ้งระหว่างการให้อาหารทุกประเภท (P > 0.05)
ตารางที่ 3 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อการเจริญเติบโตของกุ้งขาว L. vannamei เมื่อให้อาหาร 5 ชนิด
ตารางที่ 4 แสดงองค์ประกอบของร่างกายทั้งหมดโดยประมาณของกุ้งในกลุ่มอาหารที่ได้รับอาหารเสริม AX ในระดับต่างๆ โดยไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในด้านความชื้น โปรตีนดิบ เถ้า และไขมันดิบของทั้งร่างกายในกลุ่มอาหารที่ได้รับอาหารเสริมทั้งหมด (P > 0.05) ระดับการแสดงออกของไมโอสแตติน (MSTN) ในกล้ามเนื้อของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 (P < 0.05) ซึ่งสอดคล้องกับผล BWG (รูปที่ 1)
ตารางที่ 4 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อองค์ประกอบร่างกายของ L. vannamei ที่ได้รับอาหารที่มีระดับ AX ต่างกัน (%)
รูปที่ 1 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน (AX) ในอาหารต่อโปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของไมโอสแตติน (MSTN) ในกล้ามเนื้อของ L. vannamei ที่กินอาหาร 5 ชนิด ค่าเป็นค่าเฉลี่ยโดยมีค่าผิดพลาดมาตรฐาน (จำลองสี่ครั้ง n = 4) แท่งที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระดับ AX ในอาหารทดลองทั้ง 5 ชนิดแสดงไว้ในตารางที่ 1
3.2. ปริมาณ แอสตาแซนธิน และสีกุ้ง
ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าปริมาณ AX ที่กำหนดในอาหารมีความคล้ายคลึงกับระดับอาหารเสริม (ตารางที่ 5) นอกจากนี้ ปริมาณ AX ในเนื้อเยื่อกุ้งยังเพิ่มขึ้นตามระดับอาหารเสริม AX ที่เพิ่มขึ้น สำหรับตับอ่อน มีการสะสม AX ฟรีอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX40, AX80 และ AX160 (P < 0.05) เนื้อหา AX อิสระในคอร์เทกซ์และกล้ามเนื้อแสดงให้เห็นแนวโน้มที่คล้ายคลึงกันกับเนื้อหาในตับอ่อน ผลการศึกษาพบว่า AX ถูกสะสมอยู่ในตับอ่อนเป็นหลัก รองลงมาคือเปลือกและกล้ามเนื้อ
ตารางที่ 5 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อปริมาณ แอสตาแซนธิน อิสระในเนื้อเยื่อต่างๆ ในกุ้งแวนนาไมที่ให้อาหาร 5 ชนิด (มก./กก.)
กลุ่มอาหารทุกกลุ่มแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในสีของกุ้งดิบและกุ้งสุก (รูปที่ 2) สีของตัวเปลี่ยนจากเขียวอ่อนไปเป็นแดงอ่อนและน้ำตาลอ่อนโดยเริ่มตั้งแต่กลุ่ม AX20 ในขณะที่กุ้งที่ได้รับอาหารเสริมแอสตาแซนธิน (AX20, AX40, AX80 และ AX160) จะมีสีแดงมากขึ้นหลังจากการปรุงอาหาร และสีจะค่อยๆ เข้มขึ้นเมื่อมีปริมาณ AX เพิ่มขึ้น
รูปที่ 2 สีของกุ้งขาวดิบและกุ้งขาวปรุงสุก L. vannamei ที่ได้รับ แอสตาแซนธิน (AX) 5 ระดับในอาหารเป็นเวลา 8 สัปดาห์ ระดับ AX ในอาหารทดลองทั้ง 5 ชนิดแสดงไว้ในตารางที่ 1
ใช้พารามิเตอร์สีทั้งสามสี (L*, a* และ b*) เพื่อพิจารณาผลการวัดสีของ Ax ต่อหัว ลำตัว และหางของกุ้งทดลอง หลังการรักษา ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในค่าความสว่าง (L*) ในกลุ่มอาหารทุกกลุ่ม (ตารางที่ 6) หลังจากปรุงสุกแล้ว กุ้งจะมีค่าความสว่าง (L*) สีแดง (a*) และสีเหลือง (b*) มากกว่ากุ้งดิบ นอกจากนี้ ยังพบว่ามีแนวโน้มเพิ่มขึ้นของสีแดง (a*) และสีเหลือง (b*) ในอาหาร AX ที่สูงขึ้น ค่าสีแดง (a*) และสีเหลือง (b*) ในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม AX มีค่ามากกว่าค่าในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริมควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05)
ตารางที่ 6 ผลของปริมาณ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อสีของกุ้งขาว L. vannamei ที่ให้อาหาร 5 ชนิดก่อนและหลังการปรุงอาหาร
3.3. อัตราการรอดชีวิตหลังจากภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนีย
ภายใต้ภาวะเครียดจากการขาดออกซิเจน SR รายชั่วโมงของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX40, AX80 และ AX160 เปลี่ยนแปลงน้อยกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 เมื่อเวลาผ่านไป และพบการเปลี่ยนแปลงที่เล็กที่สุดในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 (รูปที่ 3a) เมื่อสิ้นสุดช่วงความเครียดจากภาวะขาดออกซิเจน SR สุดท้ายของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX40, AX80 และ AX160 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 อย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) (รูปที่ 3 c) นอกจากนี้ ยังพบผลลัพธ์ที่คล้ายกันภายใต้ความเครียดจากแอมโมเนีย (รูปที่ 3 b, d)
รูปที่ 3 อัตราการรอดชีวิตรายชั่วโมงและขั้นสุดท้ายของ L. vannamei ที่ให้อาหาร 5 ชนิด ได้แก่ ในสภาวะขาดออกซิเจน (a) และเครียดจากแอมโมเนีย (b) หลังจากการขาดออกซิเจน (c) และความเครียดจากแอมโมเนีย (d) ข้อมูลสำหรับค่าเฉลี่ยตามการกำหนดค่าอิสระสามประการ ค่าเป็นค่าเฉลี่ยโดยมีค่าผิดพลาดมาตรฐาน (จำลองสามครั้ง n = 3) แท่งที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระดับ แอสตาแซนธิน (AX) ในอาหารทดลองทั้ง 5 ชนิดแสดงอยู่ในตารางที่ 1
3.4. กิจกรรมเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ
ดัชนีสารต้านอนุมูลอิสระในตับอ่อนของกุ้งที่ได้รับอาหารทดลองที่แตกต่างกันแสดงอยู่ในตารางที่ 7 ในช่วงเริ่มต้นการทดลอง จะวัดออกซิเจนที่ละลายน้ำได้เป็น 6.72 มก. / ลิตร ในขณะที่ตอนท้าย จะวัดออกซิเจนที่ละลายน้ำได้เป็น 0.9 มก. / ลิตร ก่อนเกิดความเครียดเฉียบพลัน ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของ SOD และ CAT ระหว่างการรักษาด้วยอาหารทุกประเภท (P > 0.05) อย่างไรก็ตาม กิจกรรมของเอนไซม์ทั้งสองชนิดนี้ลดลงเมื่อเสริมด้วย AX มากขึ้น T-AOC เพิ่มขึ้นตามการเสริม AX ที่เพิ่มขึ้น และปริมาณ MDA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม AX40, AX80 และ AX160 (P < 0.05) หลังจากภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนีย กิจกรรม T-AOC, SOD และ CAT ของกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 สูงกว่ากุ้งที่ได้รับอาหารควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) พบปริมาณ MDA ต่ำที่สุดในกลุ่มการรักษา AX160 (P < 0.05) กิจกรรมของ ACP ในซีรั่มและตับอ่อนหลังจากภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนียแสดงอยู่ในรูปที่ 4 หลังจากความเครียดจากการขาดออกซิเจน การรักษาด้วย AX160 จะมีกิจกรรมของ ACP ในซีรั่มและตับอ่อนสูงกว่าการรักษาด้วย AX0 อย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) หลังจากความเครียดจากแอมโมเนีย ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของ ACP ในซีรั่มระหว่างการรักษาทั้งหมด (P > 0.05) ในขณะที่กิจกรรมของ ACP สูงสุดในตับอ่อนเกิดขึ้นในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 (P < 0.05)
ตารางที่ 7 ผลของระดับ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระของตับและตับอ่อนใน L. vannamei ที่ให้อาหาร 5 ชนิด
รูปที่ 4 กิจกรรมของกรดฟอสฟาเตส (ACP) ในซีรั่มและตับอ่อนของกุ้งขาว L. vannamei ที่ให้อาหาร 5 ชนิด หลังจากภาวะขาดออกซิเจน (ก) และความเครียดจากแอมโมเนีย (ข) ค่าเป็นค่าเฉลี่ยโดยมีค่าผิดพลาดมาตรฐาน (จำลองสามครั้ง n = 3) แท่งที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระดับ แอสตาแซนธิน (AX) ในอาหารทดลองทั้ง 5 ชนิดแสดงอยู่ในตารางที่ 1
3.5. การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระและความเครียดในกุ้งหลังจากความเครียดเฉียบพลัน
ทดสอบผลกระทบของ AX ในอาหารต่อโปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระและยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียดในตับอ่อนของกุ้งหลังจากความเครียดเฉียบพลัน หลังจากความเครียดจากการขาดออกซิเจน กุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 จะมีระดับการแสดงออกของ MnSOD, GST และ HSP70 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหารควบคุม (P < 0.05) (รูปที่ 5) ระดับการแสดงออกของ HIF-1α ในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX80 และ AX160 สูงกว่าในกุ้งที่ได้รับอาหารควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) หลังจากความเครียดจากแอมโมเนียเฉียบพลัน ระดับการแสดงออกของ MnSOD และ GS ในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX160 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกุ้งที่ได้รับอาหาร AX0 (P < 0.05) ระดับการแสดงออกของ GST และ GDH-β ในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX80 และ AX160 สูงกว่าในกุ้งที่ได้รับอาหารควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 ในกุ้งที่ได้รับอาหาร AX40 และ AX160 ยังถูกควบคุมลงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05)
รูปที่ 5 ผลของความเข้มข้นของ แอสตาแซนธิน (AX) ในอาหารต่อโปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระและความเครียดในตับอ่อนของกุ้งแวนนาไมที่ได้รับอาหาร 5 หมู่ หลังจากภาวะขาดออกซิเจน (c) และภาวะแอมโมเนีย (d) เครียด ค่าเป็นค่าเฉลี่ยโดยมีค่าผิดพลาดมาตรฐาน (จำลองสามครั้ง n = 3) แท่งที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05)
3.6. ระดับ แอสตาแซนธิน ที่เหมาะสมในอาหาร
การถดถอยแบบกำลังสองใช้ในการประมาณระดับ AX ในอาหารที่เหมาะสมที่สุดโดยสัมพันธ์กับประสิทธิภาพการเจริญเติบโต (รูปที่ 6 ก) และเม็ดสีผิว (รูปที่ 6 ข) จุดตัดที่ 126.94 มก./กก. ของอาหาร AX ถูกประมาณโดยใช้สมการการถดถอย y = −0.0047 x 2 + 1.1932 x + 623.39, R 2 = 0.9975 ในการวัดการเพิ่มขึ้นของน้ำหนักร่างกาย การถดถอยกำลังสองที่อาหาร 138.96 มก./กก. AX ถูกประมาณโดยใช้สมการการถดถอย y = −0.3616x 2 + 5.0249x – 0.7578, R² = 0.8819 จากการวัดความแดง (a*) ของตัวกุ้งที่ปรุงสุก
รูปที่ 6 ความสัมพันธ์ระหว่างการเพิ่มขึ้นของน้ำหนักตัว (BWG) (ก) การสร้างเม็ดสีผิว (สีแดง a*) (ข) และ แอสตาแซนธิน (AX) หลังจากการทดลองการให้อาหารตามการวิเคราะห์การถดถอยกำลังสอง ค่าเป็นค่าเฉลี่ยโดยมีค่าผิดพลาดมาตรฐาน (จำลองสี่ครั้ง n = 4)
4. การอภิปราย
4.1. ผลของ แอสตาแซนธิน ในอาหารต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต
ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตที่ดีขึ้นของกุ้งที่ได้รับอาหารที่มี แอสตาแซนธิน อาจเป็นผลจากบทบาทสำคัญในการควบคุมของ AX ในกระบวนการเผาผลาญอาหารกลางของสัตว์น้ำ ซึ่งอาจส่งผลต่อการใช้ประโยชน์จากสารอาหารและท้ายที่สุดแล้วช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโตได้ (Wang et al., 2018, Wade et al., 2017a) นิว และคณะ (2012) รายงานผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันว่า BWG และ SGR ของกุ้ง Penaeus monodon ที่ได้รับอาหาร AX 0.1% และ 0.2% สูงกว่ากลุ่มควบคุม ขนาดเล็กและพันธมิตร (1997) พบว่า AX สามารถลดรอบการลอกคราบของกุ้งได้โดยการเพิ่มระดับของอีคไดสเตียรอยด์ ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการปรับปรุงการเจริญเติบโต การศึกษาครั้งก่อนหน้านี้เกี่ยวกับอาหารเสริม AX ในปูแสดงผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันซึ่งระบุว่า AX ในอาหารมีผลเชิงบวกต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโต (Amar et al., 2001, Segner et al., 1989) (รูปที่ 5 c, d)
ที่น่าสังเกตคือ การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของกุ้งขาว L. vannamei ที่ได้รับอาหาร AX 160 มก./กก.-1 ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ MSTN ที่เพิ่มขึ้นในกล้ามเนื้อ ไมโอสแตตินควบคุมการเจริญเติบโตและการแบ่งตัวของกล้ามเนื้อในทางลบโดยการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมพร้อมกัน (Hadjipavlou et al., 2008) อย่างไรก็ตาม MSTN มีบทบาทตรงกันข้ามในกุ้ง และระดับการแสดงออกของมันควบคุมการเจริญเติบโตในเชิงบวก (Santis et al., 2011, Suo et al., 2017) ดังนั้น ความแตกต่างในการแสดงออกของ MSTN จึงอธิบายประสิทธิภาพการเจริญเติบโตที่สูงขึ้นที่สังเกตได้ในกุ้งที่ได้รับอาหารแอสตาแซนธินได้ดีกว่า อย่างไรก็ตาม การศึกษาบางกรณีแสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของสัตว์น้ำไม่ได้รับผลกระทบจาก AX ในอาหาร Chien และ Shiau (2005) รายงานว่า AX สังเคราะห์ไม่สามารถปรับปรุงประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของ M. japonicas ได้อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ยังพบผลลัพธ์ที่คล้ายกันใน Portunus trituberculatus (Han et al., 2018) ผลกระทบที่แตกต่างกันของ AX ต่อการเจริญเติบโตของสัตว์น้ำอาจเกิดจากความแตกต่างในสายพันธุ์ทดลอง สุขภาพสัตว์ ระบบการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ และวิธีการให้อาหาร จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่ออธิบายกลไกพื้นฐานที่แท้จริงของ AX ในสัตว์น้ำ
4.2. ผลของ แอสตาแซนธิน ต่อสีสัน
โดยทั่วไปสัตว์จำพวกกุ้งไม่สามารถสังเคราะห์แคโรทีนอยด์ได้ใหม่ (Velu et al., 2003) ดังนั้นดูเหมือนว่า แอสตาแซนธิน ที่เป็นอาหารเสริมจะช่วยชดเชยการสะสมแคโรทีนอยด์ที่ไม่เพียงพอในระหว่างการเพาะเลี้ยงแบบเข้มข้นได้ ในการศึกษานี้ กุ้งที่ได้รับอาหาร AX จะมีสีส้มแดงเข้มกว่ากุ้งป่า (Barclay et al., 2006, Boonyaratpalin et al., 2001) ซึ่งบ่งชี้ว่า AX มีผลในเชิงบวกต่อสีสันของกุ้ง พารามิเตอร์สี (L*, a* และ b*) เป็นหนึ่งในตัวบ่งชี้ที่สำคัญในการประเมินสีของสัตว์จำพวกกุ้ง (Smith et al., 1992) แม้ว่าค่า L* ของร่างกายของกุ้งจะไม่ได้รับผลกระทบจากอาหารที่แตกต่างกัน แต่ค่า a* และ b* ของกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน จะสูงกว่าค่าของกุ้งควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ พารามิเตอร์สีแดง (a*) มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) จากการควบคุม และเพิ่มขึ้นตามการเสริม AX ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งสนับสนุนผลลัพธ์ของเราในความเข้มข้นของ Axe ทั่วร่างกาย ในการศึกษาครั้งนี้ พบว่าปริมาณ AX ที่เป็นอิสระในตับ เปลือก และกล้ามเนื้อเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นของ AX ในอาหารที่เพิ่มขึ้น และประสิทธิภาพในการสร้างสีของตับอ่อนก็สูงกว่าในเปลือกและกล้ามเนื้อในทุกการรักษา ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันยังได้รับในกุ้งกุลาดำ P. monodon และกุ้ง Kuruma (Niu et al., 2012, Chien and Jeng, 1992) ปริมาณ AX ในเนื้อเยื่อส่งผลโดยตรงต่อสีของสัตว์จำพวกกุ้ง (Supamattaya et al., 2005) และปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งหมดในตับอ่อนของกุ้งมีมากกว่าในเปลือกและกล้ามเนื้อ (Yanar et al., 2012) – โดยรวมแล้วผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า L. vannamei สามารถใช้ AX ในอาหารเพื่อปรับปรุงสีแดงของลำตัวได้ดี
4.3 . ผลของแอสตาแซนธินต่อความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของกุ้งหลังจากความเครียด
การสร้างอนุมูลออกซิเจนที่มีปฏิกิริยา (ROS) ในระหว่างการทดสอบความเครียดอาจทำให้เกิดความเสียหายจากออกซิเดชันรุนแรง (Mascio et al., 1991) เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าความเสียหายที่เกิดจาก ROS ในสิ่งมีชีวิตนั้นสามารถจำกัดได้โดยการทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นเอนไซม์ (Sowmya และ Sachindra, 2012) ก่อนหน้านี้ ระบบต้านอนุมูลอิสระซึ่งรวมถึง SOD และ CAT ถือเป็นกลไกป้องกันในร่างกายของสัตว์จำพวกกุ้ง ซึ่งช่วยกำจัด ROS ที่มากเกินไป ป้องกันความเครียดออกซิเดชัน และปกป้องสิ่งมีชีวิตจากตัวก่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม (Marklund, 1974) T-AOC ถือเป็นตัวบ่งชี้สถานะสารต้านอนุมูลอิสระและสถานะสุขภาพของสิ่งมีชีวิตที่ครอบคลุม (Castillo et al., 2006) ในการศึกษานี้ การทดสอบความเครียดที่ทำให้ถึงตายใช้เพื่อประเมินสถานะสุขภาพโดยการวัดความทนทานต่อความเครียดของกุ้งทดลอง ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่ากลุ่มที่เสริม AX มีประสิทธิภาพดีกว่ากลุ่มควบคุมในช่วง LT 50 ประการแรก พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) ระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มรักษาในแง่ของอัตราการรอดชีวิต ประการที่สอง เมื่อเปรียบเทียบกับกุ้งควบคุม กุ้งที่เลี้ยงด้วยอาหาร AX ยังคงแสดงกิจกรรมเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระที่สูงกว่า เนื่องจากอาหารที่มีแอสตาแซนธินเพิ่ม T-AOC แม้ว่ากิจกรรมของ SOD และ CAT จะลดลงในตับอ่อนก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ของ Zhang et. อัล. (2013) และ Wu et al. (2560). เราคาดเดาว่ากิจกรรมของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในตับอ่อนจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อสัมผัสกับความเครียดออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้น ส่งผลให้ชีววิทยาของเซลล์ที่เกี่ยวข้องลดลง และ AX อาจเริ่มการตอบสนองอื่นเพื่อปรับระบบการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งในที่สุดจะเพิ่ม T-AOC
AX สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในกุ้งและปรับปรุงความต้านทานต่อภาวะขาดออกซิเจนและแอมโมเนีย ตัวอย่างเช่น MnSOD เร่งปฏิกิริยา O 2- ให้เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H 2 O 2 ) และออกซิเจนโมเลกุล ซูเปอร์ออกไซด์ที่สร้างขึ้นโดย ROS จะถูกกำจัดโดย MnSOD ในเมทริกซ์ไมโตคอนเดรียเป็นหลัก ผลการ RT-PCR ในการศึกษานี้บ่งชี้ว่า AX สามารถเสริมการป้องกันภายในได้โดยเพิ่มการแสดงออกของยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระรวมทั้งยีน MnSOD และ GST ในระดับ mRNA ซึ่งจะทำให้เกิดการป้องกันต่อความเครียดออกซิเดชัน ตรวง และคณะ (2013) ได้รับผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันในกุ้งขาว Litopenaeus vannamei ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า AX อาจมีผลโดยการมีอิทธิพลต่อการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและ/หรือการแสดงออกของยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ MDA เป็นหนึ่งในผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในเนื้อเยื่อและมีพิษทางชีวภาพสูง (Li et al., 2013) ในการศึกษาของเรา ทั้งก่อนและหลังความเครียด พบว่าเนื้อหา MDA มีแนวโน้มตรงกันข้าม ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า AX สามารถยับยั้งการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของ L. vannamei ได้ เช่นเดียวกับการศึกษาครั้งก่อนๆ (Li et al., 2014) รวมถึง AX ตามธรรมชาติ (Xie et al., 2018, Long et al., 2017)
4.4. ผลของ AX ต่อภูมิคุ้มกันและความต้านทานต่อความเครียด
เนื่องจากขาดระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวและต้องพึ่งพาระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดเป็นหลัก สัตว์จำพวกกุ้งจึงเปราะบางต่อปัจจัยภายนอกหลายประการมากกว่า (Wang และ Wang, 2013) สำหรับการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ สิ่งที่สำคัญอย่างยิ่งคือการลดสภาวะที่ไม่เอื้ออำนวยให้เหลือน้อยที่สุด เพราะจะทำให้เกิดความเครียดมากขึ้นและทำให้สิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านอ่อนแอลง Chien และ Shiau (2005) พบว่า P. monodon ที่ได้รับอาหาร AX ระดับสูงจะทำให้ SR เพิ่มขึ้นหลังจากการท้าทาย DO ต่ำ ในการศึกษาปัจจุบัน การเพิ่ม SR ในกุ้งภายใต้ความเครียดจากแอมโมเนียสูงและออกซิเจนต่ำ แสดงให้เห็นว่าอาหาร AX อาจเพิ่มความต้านทานของกุ้งต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมได้ เนื่องจาก ACP เป็นฟอสฟาเตสที่สำคัญ จึงมีส่วนเกี่ยวข้องกับกระบวนการเผาผลาญต่างๆ จึงสามารถใช้ประเมินความต้านทานของสิ่งมีชีวิตต่อปัจจัยความเครียดภายนอกได้ (Xue และ Renault, 2000) จากการศึกษาก่อนหน้านี้หลายครั้งพบว่าสัตว์ที่ได้รับอาหารที่มีสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันสามารถเพิ่มกิจกรรมของ ACP ในซีรั่มได้ (Chang et al., 2018, Deng et al., 2015) ในทำนองเดียวกัน กิจกรรม ACP ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน AX160 แสดงให้เห็นว่า AX ในอาหารที่เหมาะสมสามารถเพิ่มการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันของสัตว์จำพวกกุ้งได้อย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ HSP70 ซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญของเครื่องจักรเซลล์ในการประเมินการทำงานของภูมิคุ้มกันของสัตว์จำพวกกุ้ง สามารถใช้เป็นโปรตีนที่ตอบสนองต่อความเครียดเพื่อมีส่วนร่วมในการป้องกันความเครียด ป้องกันการเกิดอะพอพโทซิส และการตอบสนองภูมิคุ้มกันได้ (Franzellitti และ Fabbri, 2005) พบว่าการเพิ่มระดับ HSP70 ในตับอ่อนเมื่อสัมผัสกับสภาวะขาดออกซิเจนและแอมโมเนีย (Franzellitti และ Fabbri, 2005) ในการศึกษาครั้งนี้ ระดับการแสดงออกของยีน HSP70 ถูกควบคุมลงในกลุ่มที่ได้รับอาหารเสริม AX เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมภายใต้ความเครียดเฉียบพลัน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า แอสตาแซนธิน ในอาหารอาจช่วยบรรเทาผลกระทบเชิงลบที่เกิดจากความเครียดเฉียบพลันได้บางส่วน ใน Penaeus monodon, Niu และคณะ (2014) รายงานว่าระดับการแสดงออกของ mRNA ของ HSP70 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะการขาดออกซิเจนเมื่อเทียบกับสภาวะปกติ
HIF-1α เป็นปัจจัยถอดรหัสเฮเทอโรไดเมอริกที่สามารถควบคุมยีนหลายสิบตัวที่เกี่ยวข้องกับการลำเลียงออกซิเจน และทำให้สัตว์มีชีวิตรอดได้ดีขึ้นภายใต้สภาวะที่ขาดออกซิเจน (Hardy et al., 2012) หลังจากความเครียดจากการขาดออกซิเจน ระดับการแสดงออกของ HIF-1α จะสูงขึ้นในกุ้งที่ได้รับอาหารเสริม แอสตาแซนธิน มากกว่าในกุ้งที่ได้รับอาหารควบคุม คาร์นาคอฟและคณะ (พ.ศ. 2520) รายงานว่าโซ่แคโรทีนอยด์ที่มีพันธะคู่กันมีคุณสมบัติในการบริจาคและรับอิเล็กตรอนที่ดี ช่วยให้สามารถจับโมเลกุลออกซิเจนได้ เมื่อสิ่งมีชีวิตอยู่ในภาวะขาดออกซิเจน ออกซิเจนในสารสะสมแคโรทีนอยด์ภายในเซลล์สามารถบรรเทาภาวะขาดออกซิเจนและทำให้สิ่งมีชีวิตในน้ำต้านทานต่อภาวะขาดออกซิเจนได้มากขึ้น (Oshima et al., 1993) ตรวง และคณะ (2013) ยังแสดงให้เห็นอีกว่า AX สามารถบรรเทาการตอบสนองต่อความเครียดออกซิเดชันของ L. vannamei ได้บางส่วนภายใต้สภาวะการขาดออกซิเจน ดังนั้นผลลัพธ์นี้ยังยืนยันอีกว่า AXE สามารถมีส่วนร่วมในกระบวนการเผาผลาญออกซิเจนของเซลล์สัตว์และส่งออกซิเจนให้กับเซลล์ได้ GDH-β และกลูตามีน GS เป็นเอนไซม์สำคัญในการรักษาความเข้มข้นของไนโตรเจนแอมโมเนียปกติในกุ้งภายใต้ความเครียด (Mayzaud และ Conover, 1988) โดยรักษาระดับแอมโมเนียให้สมดุลผ่านปฏิกิริยาการดีอะมิเนชัน (DeBerardinis et al., 2007) GDH สลายแอมโมเนียเพื่อผลิตกรดกลูตาเมต จากนั้น GS จะเร่งปฏิกิริยากลูตาเมตและแอมโมเนียส่วนเกินเพื่อสังเคราะห์กลูตามีน (Cooper, 2012, Silvia et al., 2004) ความเครียดสามารถกระตุ้นระดับการแสดงออกของยีน GDH และ GS ในตับอ่อนของกุ้งขาว L. vannamei (Liu et al., 2012) การศึกษามากมายแสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ GDH และ GS เพิ่มขึ้นหลังจากสัมผัสกับแอมโมเนีย ซึ่งบ่งชี้ว่า L. vannamei สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของยีน GDH-β และ GS ภายใต้ความเครียดจากแอมโมเนีย ส่งผลให้ปริมาณแอมโมเนียลดลง ในการศึกษาครั้งนี้ ระดับการแสดงออกของ GDH-β และ GS ในตับอ่อนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่า AX ในอาหารสามารถเพิ่มความสามารถในการกำจัดแอมโมเนียของกุ้งขาว L. vannamei ได้ด้วยการเร่งปฏิกิริยาการแปลงแอมโมเนีย สรุปได้ว่าการเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของ HSP70, HIF-1α, GDH-β และ GS อาจมีส่วนสนับสนุนความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกลไกการตอบสนองต่อการเผาผลาญของกุ้งขาว L. vannamei ภายใต้ภาวะขาดออกซิเจนและความเครียดจากแอมโมเนีย
5. บทสรุป
จากการสรุป ผลของเราแสดงให้เห็นว่าการเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารช่วยให้การเจริญเติบโตและสีสันดีขึ้น นอกจากนี้ การเสริม แอสตาแซนธิน ในอาหารอาจเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระและควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันและความทนทานต่อความเครียดของ L. vannamei ที่น่าสังเกตคือ กลุ่มกุ้งที่ได้รับ แอสตาแซนธิน 80 และ 160 มก./กก. แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงเชิงปรับตัวที่เกิดขึ้นที่ระดับสารต้านอนุมูลอิสระสูงสุดในตับอ่อนที่มีความต้านทานต่อความเครียด ซึ่งให้ข้อมูลที่มีค่าและพื้นฐานทางทฤษฎีสำหรับการประยุกต์ใช้ AX ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ
Xiaopin Zhao a 1, Gongpei Wang a c 1, Xuange Liu a, Dingli Guo a, Xiaoli Chen a, Shuang Liu a, Sheng Bi a, Han Lai a, Jimei Zhu b, Dan Ye c, Haifang Wang b, Guifeng Li a