Nano kẽm oxit (nano ZnO) được sử dụng để điều trị bệnh thối trái cây bưởi
Bưởi ( Citrus paradisi ) là một loại cam quýt được trồng rộng rãi và trái của nó bị ảnh hưởng bởi nhiều loại stress sinh học và phi sinh học. Theo dõi tác hại của thuốc diệt nấm tổng hợp , xu hướng gần đây đang chuyển sang hướng kiểm soát bệnh trái cây an toàn hơn và thân thiện với môi trường. Nghiên cứu này nhằm mục đích chẩn đoán bệnh thối trái của bưởi và phòng trừ bệnh bằng cách sử dụng các hạt nano kẽm oxit xanh (ZnO NPs). Các triệu chứng thối trái đã được quan sát thấy ở các địa điểm trồng bưởi khác nhau của Pakistan. Các mẫu bệnh được thu thập và phân lập mầm bệnh. Theo các định đề của Koch, mầm bệnh phân lập được xác định là Rhizoctonia solani . Để kiểm soát thân thiện với môi trường đối với bệnh này, các nano kẽm oxit đã được chuẩn bị trong chiết xuất hạt củaTrachyspermum ammi và đặc trưng. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) của các NP này đã mô tả sự hiện diện của các hợp chất ổn định và khử như phenol, aldehyde và vinyl ete, đặc biệt là thymol (phenol). Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) cho thấy bản chất và kích thước tinh thể của chúng (48,52 nm). Phân tích tia X phân tán năng lượng (EDX) đã giải thích cặn kẽ sự hiện diện của các nguyên tố chính trong các mẫu, trong khi kính hiển vi điện tử quét (SEM) xác nhận hình thái của các NP được chế tạo sinh học. Các NPN ZnO thể hiện hoạt tính chống nấm rất tốt và sự ức chế sự phát triển của nấm đáng kể nhất được quan sát thấy ở nồng độ 1,0 mg / ml của NPs xanh, in vitro và in vivo. Những phát hiện này mô tả rằng các thành phần hoạt tính sinh học của T. chiết xuất hạt ammi có thể làm giảm và ổn định hiệu quả các NP ZnO. Đây là một phương pháp tiết kiệm chi phí để kiểm soát thành công bệnh thối trái của bưởi.
(Bản quyền NanoCMM Technology)
1 . Giới thiệu
Trái cây có múi có sản lượng toàn cầu cao nhất so với bất kỳ chi trái cây nào khác, với sản lượng ước tính là 95 triệu tấn trong năm 2019–20, bao gồm bưởi, chanh, cam và quýt ( Costa và cộng sự, 2020 ). Cam quýt rất dễ bị ảnh hưởng bởi các mầm bệnh khác nhau ( Rasool et al., 2014 ) và những rụng trái này hầu hết là do nấm bệnh gây ra ( El-Otmani et al., 20011 ). Các bệnh do nấm đang là mối quan tâm ngày càng tăng trên toàn thế giới, với ảnh hưởng nghiêm trọng nhưng được phân tích kém đối với sức khỏe cộng đồng ( Zhou và cộng sự, 2020 ). Mất an ninh lương thực và suy dinh dưỡng là những vấn đề lớn ở cả các nước đang phát triển và công nghiệp hóa trên thế giới (Friedmann, 1993; Koffi và cộng sự, 2017 ; Saleem và cộng sự, 2020a; Saleem và cộng sự, 2020b ). Nấm đã được báo cáo là gây ra thiệt hại lớn về năng suất của các loại trái cây quan trọng về mặt kinh tế. Do các chiến lược quản lý trước và sau thu hoạch kém, các nước đang phát triển quan sát thấy thiệt hại do nấm 20–25% trong tổng sản lượng cây trồng ( Dukare et al., 2019 ). Trong điều kiện môi trường không thuận lợi, sự mất mát năng suất này có thể tăng lên 50% hoặc hơn ( Carmona-Hernandez và cộng sự, 2019 , Saleem và cộng sự, 2020c , Saleem và cộng sự, 2020d , Saleem và cộng sự, 2020e ). Nấm bệnh có thể gây hại cho tất cả các loại mô thực vật, ở mọi giai đoạn phát triển của cây ( Fernández-Acero và cộng sự, 2007 ). Rhizoctonia solani, Phythophora spp. và Fusariumspp. có thể lây nhiễm các bộ phận trên không và dưới đất của thực vật ( Bashir et al., 2018 ). Do đặc tính dễ hỏng, trái cây rất dễ bị tấn công và thối rữa bởi nhiều loại nấm bệnh ( Chohan và cộng sự, 2015 ). Sản lượng quả bị mất do nấm bệnh được ước tính là 50% tổng sản lượng quả ( Zhang và cộng sự, 2017 ).
Việc sử dụng thuốc trừ sâu trong sản xuất cây trồng là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh ( Zhang và cộng sự, 2011 ). Tuy nhiên, những hoạt động nông nghiệp này có thể gây bất lợi cho con người và môi trường, và lợi ích tiềm năng của chúng cần được cân bằng với những tác hại này ( Donley, 2019 ). Thuốc diệt nấm hóa học (thuốc trừ sâu) được sử dụng rộng rãi trên các loại cây trồng khác nhau và chúng đang được sử dụng như một yếu tố chính của canh tác hiện nay ( Dara, 2019 ). Việc sử dụng quá mức và không an toàn các loại thuốc diệt nấm hóa học này đã được báo cáo là có thể làm hỏng độ màu mỡ của đất ( Joko et al., 2017 ). Đất bị ô nhiễm cuối cùng dẫn đến mất khả năng tăng trưởng, năng suất và các thuộc tính cộng sinh ( Garg và cộng sự, 2017). Do tác dụng bất lợi của chúng, người ta đã bắt đầu tìm kiếm các giải pháp thay thế cho các loại thuốc diệt nấm hóa học. Các nhà khoa học đang nhấn mạnh đến các nguồn tài nguyên thiên nhiên có hoạt tính sinh học và hầu hết các loài thực vật bậc cao và các thành phần của chúng có hiệu quả trong việc quản lý bệnh thực vật. Do các mối quan tâm liên quan đến môi trường và sức khỏe, các nhà khoa học thực vật quan tâm đến việc xác định các hợp chất sinh học rẻ hơn và thân thiện với môi trường để kiểm soát bệnh thực vật ( Cherkupally và cộng sự, 2017 ).
Công nghệ nano là một lĩnh vực nghiên cứu mới nổi được ứng dụng trong các lĩnh vực hóa học, vật lý, sinh học, dược phẩm và khoa học vật liệu ( Fahimmunisha và cộng sự, 2020 ; Govindarajan và Benelli, 2016 ). Công nghệ nano đang được áp dụng trong lĩnh vực bệnh lý thực vật và nó đang cho thấy hiệu quả to lớn trong việc điều trị các bệnh khác nhau ( Park và cộng sự, 2006 ). Việc sử dụng các hạt nano làm chất kháng nấm và kháng khuẩn đã được đề xuất như một chiến lược thay thế hiệu quả về chi phí và an toàn với môi trường để điều trị vi khuẩn gây bệnh ( Alam và cộng sự, 2019 ). Ứng dụng đầy hứa hẹn của công nghệ nano trong nông nghiệp đã mở ra những khả năng và triển vọng mới.Vật liệu nano được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, từ bảo vệ thực vật đến dinh dưỡng và các hoạt động quản lý trang trại, do quy mô nhỏ, tỷ lệ bề mặt trên thể tích cao và các đặc tính quang học độc đáo ( Shang et al., 2019 ).
So với các chất khử trùng và chất kháng khuẩn gốc hữu cơ, ZnO là một oxit kim loại bền hơn nhiều và tồn tại lâu hơn. Quá trình chuẩn bị hóa thực vật của các hạt nano ZnO mang lại các đặc tính kháng khuẩn đáng kể ( Khalil và cộng sự, 2018 ). ZnO tổng hợp màu xanh lá cây là một vật liệu tương thích sinh học và được xử lý tốt trong tự nhiên, khiến nó trở nên hấp dẫn đối với các ứng dụng y sinh ( Petkova và cộng sự, 2016 ). So với các oxit kim loại khác, ZnO được coi là ổn định và an toàn hơn ( Kim và cộng sự, 2020 ). Khoảng 550 tấn ZnO NP được sản xuất mỗi năm cho nhiều ứng dụng khác nhau trên khắp thế giới ( Bondarenko và cộng sự, 2013). Các NPN ZnO đã được báo cáo là hữu ích trong việc cải thiện độ phì nhiêu của đất , năng suất cây trồng và sự sẵn có của kẽm ( Rossi và cộng sự, 2019 , Esper-Neto và cộng sự, 2020 ). Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã phân loại ZnO, cùng với bốn hợp chất kẽm khác , được công nhận là sản phẩm an toàn (GRAS) ( Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm FDA, 2015 ). Các hạt nano ZnO không độc và nhiều nghiên cứu đã mô tả vai trò bảo vệ của chúng ( Roselli et al., 2003 ). Chiết xuất từ các cây thuốc khác nhau bao gồm Pelargonium zonale, Punica granatum, Aegle marmelos, Olea ferruginea, Ruta Tombolen, Hibiscus subariffa, Passiflora caerulea vàBerberis vulgaris đã được sử dụng để tổng hợp các NP ZnO ( Anzabi, 2018 ; Hussain et al., 2020 ; Vahidi et al., 2019 ).
Trachyspermum ammi được biết đến với các đặc tính chữa bệnh và các hoạt động kháng khuẩn ( Sharifzadeh et al., 2015 ). Hạt giống của T. ammi được sử dụng trong y học cổ truyền và nó nổi tiếng với đặc tính kích thích tình dục. Hạt của nó có chứa thymol , được sử dụng trong điều trị bệnh dạ dày-ruột và các vấn đề về phế quản. Rễ của nó có bản chất là lợi tiểu và dầu của nó có đặc tính kháng nấm và kháng khuẩn ( Singh và Singh, 2000 ).
Nghiên cứu này được thiết kế nhằm sử dụng công nghệ nano để tổng hợp các hạt nano ZnO từ dịch chiết hạt của cây T. ammi để kiểm soát bệnh thối quả trên bưởi.
2 . Nguyên liệu và phương pháp
2.1 . Thu thập các mẫu bệnh từ các vùng lõi cây ăn quả có múi của Pakistan
Trong giai đoạn 2018–19, một vụ thối trái nghiêm trọng đã được quan sát thấy trong các vườn cây ăn quả của bốn khu vực trồng cây có múi của Pakistan (, Phụ lục A Tài liệu bổ sung ). Vườn cây ăn quả có múi của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia (NARC), Islamabad (33 ° 40’12.4 “N 73 ° 07’34.0” E) là vùng / địa điểm đầu tiên thu thập các mẫu bưởi bị bệnh. Từ vùng thứ hai của Huyện Sargodha, các mẫu bưởi bị bệnh được thu thập từ ba địa điểm khác nhau, tức là Bhulwal (32 ° 16’57,4 “N 72 ° 54’14,4” E), Kot Momin (31 ° 57’39,6 “N 73 ° 06 ‘38,8 “E) và Siyal Mor (31 ° 58’58,2” N 73 ° 06’54,8 “E) ( Hình 1 ). Những quả bưởi thối bị nhiễm bệnh được thu thập từ những cây ngẫu nhiên, ít nhất là khoảng 10 m. Tất cả các mẫu được thu thập từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 1 năm 2019, được giữ trong túi polythene bảo vệ và dán nhãn riêng.
Hình 1 . Ban đầu, các triệu chứng xuất hiện ở dạng đốm (A), tiến triển sâu hơn thành hoại tử hoàn toàn quả (B). Nấm được phân lập từ quả bị bệnh trên môi trường SDA (C). Sợi nấm được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 × (D). Sau khi cấy vào trái khỏe mạnh, các triệu chứng bệnh xuất hiện chậm ở tuần thứ 1 (E) nhưng tiến triển nhanh ở tuần thứ 2 dẫn đến hoại tử cho đến tuần thứ 3 (F).
2.2 . Phân lập mầm bệnh từ các mẫu bệnh
Để phân lập mầm bệnh, quả bị bệnh được khử trùng bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorit 2% và rửa bằng nước cất. Đối với việc phân lập và phát triển mầm bệnh gây bệnh, bị bệnh 4 Thảo luận , 5 Kết luận và triển vọng ,mm) được cắt bỏ và đặt trên môi trường thạch dextrose khoai tây (PDA). Đĩa Petri đã cấy được đậy kín bằng parafilm và giữ trong tủ ấm ở 26 ± 2 ° C trong 5 ngày.
2.3 . Kiểm tra khả năng gây bệnh
Để xác nhận khả năng gây bệnh của từng loại nấm được phân lập, các định đề của Koch đã được tuân theo. Các đĩa nấm khoảng 4 mm từ các nấm phân lập 7 ngày tuổi được chuyển sang môi trường nuôi cấy Czapek và lắc trong 3–4 ngày. Môi trường nuôi cấy được lọc và tạo huyền phù bào tử cụ thể (10 6 conidia ml −1) đã được duy trì. Có tổng cộng 12 quả nho khỏe mạnh đã được khoan bằng kim vô trùng (sâu 5 mm). Trong số này, sáu trái khỏe mạnh được cấy 5 µL huyền phù bào tử và sáu trái còn lại được cung cấp 5 µL nước cất (đối chứng). Quả đã cấy được bọc bằng vải dạ và giữ ở 25 ° C. Các triệu chứng bệnh được quan sát và so sánh với các triệu chứng của các mẫu ruộng. Tác nhân gây bệnh được phân lập lại trên môi trường PDA từ những quả đã cấy này và so sánh với nấm được phân lập ban đầu.
2.4 . Xác định nấm phân lập bằng kính hiển vi
Kính hiển vi được thực hiện để nghiên cứu các đặc điểm hình thái của từng loại nấm được phân lập. Các đặc điểm cấu trúc chính như sợi nấm (vách ngăn / không vách ngăn) và cấu trúc sinh sản (túi bào tử và bào tử) của nấm được quan sát dưới kính hiển vi phức hợp ( James và Natalie, 2001 ). Với mục đích này, người ta đã chuẩn bị một lam kính chứa sợi nấm. Sử dụng kim gắn, các mảnh sợi nấm non từ mép nuôi cấy nấm tươi được đặt trên phiến kính với một hoặc hai giọt màu xanh lam lactophenol. Tránh tạo bọt khí bằng cách đặt cẩn thận tấm bìa. Các slide được kiểm tra dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 10 × và 40 ×. Các bức ảnh được chụp với sự hỗ trợ của một máy ảnh gắn trên máy.
2.5 . Nhận dạng phân tử của nấm
Loại nấm phân lập cũng được xác định bằng phân tích trình tự của gen RNA ribosome 18 S. DNA của nấm được tách chiết bằng kỹ thuật CTAB ( White et al., 1990 ). Nanodrop® được sử dụng để đánh giá chất lượng và số lượng DNA chiết xuất. Để khuếch đại gen rRNA, các đoạn mồi thuận và nghịch phổ biến đã được sử dụng. Hỗn hợp phản ứng PCR 20 µL bao gồm 0,5 µL mỗi mồi, 1 µL dNTP, 1 µL TaqDNA polymerase, 0,5 µL DNA bộ gen và 2 µL đệm polymerase 10 ×. Phản ứng PCR được thực hiện ở 94 ° C trong 4 phút, tiếp theo là 35 vòng 94 ° C trong 1 phút, 58 ° C trong 1 phút và 72 ° C trong 10 phút. Sản phẩm cuối cùng được giải trình tự bằng Trình điều hướng trình tự (phiên bản 1.0.1, Hệ thống sinh học ứng dụng) và được khám phá trong cơ sở dữ liệu của NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
2.6 . Chuẩn bị chiết xuất thực vật
Chiết xuất từ sáu loại cây khác nhau bao gồm Chenopodium album, Callistemon citrius, Magnifera indica, Lawsonia trơ, Cassia fistula và Trachyspermum ammi đã được chuẩn bị để phân tích hoạt tính kháng nấm của chúng. Hạt giống của T. ammivà lá của năm cây khác được rửa kỹ trong nước chảy và phơi khô trong bóng râm trong môi trường đối chứng. Lá và hạt khô được nghiền thành bột, mỗi mẫu 100 g bột được pha trong 1000 ml nước cất hai lần đã được hấp tiệt trùng. Các hỗn hợp này được đặt trong tủ ấm lắc ở 24 ° C trong 48 giờ và đun sôi trong năm phút trước khi được ủ trong 15 phút trong nồi cách thủy ở 50 ° C. Hỗn hợp được để nguội và lọc qua vải muslin và không có giấy lọc Whatman. 1. Tất cả các dịch lọc đã được dán nhãn và bảo quản ở 4 ° C, cho đến khi sử dụng tiếp.
2.7 . Phân tích hoạt tính kháng nấm in vitro của chiết xuất thực vật
Sử dụng kỹ thuật thực phẩm bị nhiễm độc, hoạt tính kháng nấm của sáu chất chiết xuất từ thực vật đã được đánh giá trong ống nghiệm . Với mục đích này, môi trường PDA được hấp tiệt trùng, và môi trường nuôi cấy ấm được trộn với 5 µL của mỗi chất chiết xuất từ thực vật, riêng biệt và để đông đặc. Môi trường PDA không có chiết xuất thực vật được dùng làm đối chứng. Mỗi đĩa Petri được cấy một đĩa cấy (5 mm) nấm đã phân lập và ủ ở 25 ° C. Sau bảy ngày ủ bệnh, sự ức chế phát triển của sợi nấm được đo bằng công thức sau:Sự ức chế sự phát triển của nấm % = (CT) / 100Trong đó C = Sự phát triển sợi nấm trung bình trong đối chứng dương, T = Sự phát triển sợi nấm trung bình trong đĩa Petri đã xử lý.
Trong số sáu chiết xuất từ thực vật, chiết xuất từ hạt của T. ammi cho kết quả tốt nhất và nó tiếp tục được sử dụng để tổng hợp các hạt nano.
2.8 . Chuẩn bị màu xanh lá cây của các hạt nano kẽm oxit (ZnO NPs)
Theo phương pháp luận của Matinise et al. (2017) , các NP ZnO được tổng hợp trong chiết xuất hạt của T. ammi. Dịch chiết hạt được đun nóng ở 60–80 ° C và thêm 2 mg Zinc Nitrate Hexahydrate [Zn (NO 3 ) 2.6 H 2 O]. Hỗn hợp được đun sôi cho đến khi tạo thành hỗn hợp sền sệt màu vàng đậm. Bột nhão này được đặt trong một chén nung bằng sứ và chịu nhiệt độ cao ở 500 ° C trong 3 giờ, trong một lò nung nóng. Do sự gia nhiệt mạnh này, bột màu vàng nhạt đã thu được, cho thấy sự hình thành các nano kẽm oxit ( Elumalai và Velmurugan, 2015 ). Các NP này đã được đặc trưng thêm, trước khi phân tích hoạt tính chống nấm của chúng.
2.9 . Đặc tính của các nano kẽm oxit
Các thông số sau được sử dụng để phân tích kích thước, hình dạng và thành phần của NP.
2.9.1 . Quang phổ hồng ngoại bốn biến đổi (FTIR)
Loại nhóm chức liên kết của chiết xuất thực vật với các hạt nano được xác định bằng quang phổ FTIR . Sử dụng phương pháp viên KBr, 10 mg bột hạt nano được bao gói trong 100 mg viên KBr và được phân tích trong máy quang phổ FTIR với độ phân giải 4 cm −1 và phạm vi quét 400–4000 cm −1 .
2.9.2 . Nhiễu xạ tia X (XRD)
Bản chất tinh thể của các hạt nano xanh mới được chế tạo đã được khảo sát bằng máy đo nhiễu xạ tia X. Các phát hiện được rút ra từ cấu trúc nguyên tử của các mẫu bột và tinh thể rắn, cũng như các góc mà tại đó hiện tượng nhiễu xạ xảy ra. Kích thước của các hạt nano được xác định bằng công thức sau đây của Scherrer (2018) :D=0,9λ/βcosθD = kích thước miền tinh thể trung bình vuông góc với mặt phẳng phản xạ, K = hệ số hình dạng, ʎ = bước sóng tia X, β = FWHM (độ rộng toàn phần ở nửa cực đại), và θ = góc nhiễu xạ.
2.9.3 . Kính hiển vi điện tử quét (SEM) và tia X phân tán năng lượng (EDX)
Các phép phân tích SEM và EDX được sử dụng để xác định hình dạng, quy mô và thành phần hóa học của các hạt nano xanh đã được chuẩn bị. Để tạo huyền phù của các hạt nano kẽm oxit màu xanh lục trong nước cất, các mẫu được ngâm trong năm phút. Một giọt huyền phù được gắn trên băng dẫn điện có lớp phủ carbon kép và để khô dưới đèn. Trên thiết bị VEGA3 TESCAN, các phân tích SEM và EDX đã được thực hiện.
2.10 . Phân tích hoạt tính kháng nấm của các nano kẽm oxit, trong ống nghiệm
Để phân tích hoạt tính kháng nấm in vitro, các nano kẽm oxit đã được thêm vào môi trường PDA ở các nồng độ khác nhau. Với sự trợ giúp của sâu đục bẹ, các đĩa cấy 4 mm gồm các loại nấm đã phân lập được đặt ở tâm của đĩa petri PDA. Môi trường nuôi cấy không có hạt nano màu xanh lá cây được dùng như một đối chứng tích cực. Các đĩa Petri đã cấy được đặt trong tủ ấm ở 25 ± 1 ° C và nấm được phép phát triển. Sau một tuần, sự ức chế tăng trưởng trong mỗi đĩa Petri được đo bằng công thức sau:Sự ức chế sự phát triển của nấm% = (CT) * 100Trong đó C = Sự phát triển sợi nấm trung bình trong đối chứng tích cực và T = Sự phát triển sợi nấm trung bình trong các đĩa Petri đã qua xử lý.
2.11 . Phân tích hoạt tính kháng nấm in vivo so sánh của các nano kẽm oxit và chất chiết xuất từ thực vật
Hoạt tính chống nấm của các nano kẽm oxit và sáu chất chiết xuất từ thực vật cũng đã được thử nghiệm, in vivo. Những quả bưởi khỏe mạnh đã chọn được cấy các loại nấm phân lập, theo “phương pháp cấy vết thương” tiêu chuẩn . Với mục đích này, sáu trái cây khỏe mạnh được làm vết thương bằng kim và cấy 10 µL huyền phù bào tử (10 6 bào tử / ml) của nấm. Mầm bệnh được phép xâm nhập và gây nhiễm và sau hai ngày cấy, các loại thuốc trừ bệnh nano nêu trên được phun (cho đến khi chảy nước) trên ba quả được chọn ngẫu nhiên. Ba quả không được xử lý (đối chứng). Tất cả trái cây được bao phủ bằng một miếng vải muslin đã được hấp tiệt trùng để tránh bất kỳ sự ô nhiễm nào. Theo phương pháp tương tự, 10 µL của mỗi chiết xuất thực vật được chọn đã được phun (cho đến khi chảy nước) trên ba quả được chọn ngẫu nhiên để kiểm soát bệnh thối quả, thay thế thuốc diệt nấm nano. Sau bảy ngày cấy, diện tích bị bệnh của mỗi quả được đo để đánh giá hiệu quả của các loại thuốc trừ bệnh riêng lẻ .
3 . Kết quả
3.1 . Phân lập và xác định đặc điểm của mầm bệnh gây bệnh từ quả nho
Các triệu chứng bệnh được quan sát thấy trên các mẫu trái cây, trên đồng ruộng ( Hình 1 A và B). Mầm bệnh đã được phân lập thành công và các khuẩn lạc sợi nấm màu trắng nhạt được quan sát thấy trên PDA ( Hình 1 C). Quan sát bằng kính hiển vi giúp chúng tôi thấy được hình thái của nấm và có thể dễ dàng quan sát được sợi nấm dài và giống hình que ( Hình 1 D). Tất cả những đặc điểm này đã xác định mầm bệnh này là Rhizoctonia solani (Parmeter, 1970). Khả năng gây bệnh của R. solani phân lập được thực hiện một cách hiệu quả. Sau bốn ngày cấy , các triệu chứng ban đầu có thể được quan sát thấy dưới dạng các đốm nhỏ màu nâu sẫm ( Hình 1E). Các nốt này tiến triển nhanh chóng vào tuần thứ 2 và dẫn đến hoại tử hoàn toàn cho đến tuần thứ 3 ( Hình 1 F). Người ta lại phân lập nấm từ những quả bị bệnh này và thấy giống với nấm đã cấy. Những phát hiện này đã khẳng định độc lực và sự tham gia của loại nấm này trong bệnh thối trái của bưởi. Giải trình tự thành công vùng rDNA 18 S khuếch đại của mầm bệnh phân lập cũng xác nhận sự xác định của nó. Phân tích BLAST về trình tự kết quả cho thấy độ tương đồng> 99% với R. solani (HG934415.1).
3.2 . Phân tích hoạt tính kháng nấm và lựa chọn chiết xuất thực vật để tổng hợp các NP ZnO
Trong số sáu cây thuốc bản địa đã được thử nghiệm , chiết xuất từ hạt của T. ammi thể hiện hoạt tính kháng nấm tốt nhất ( Bảng 1 ). Dựa trên những kết quả này, các chất chiết xuất từ hạt của T. ammi đã được sử dụng để tổng hợp các NP ZnO .
Bảng 1 . Hoạt động kháng nấm in vitro của sáu chất chiết xuất từ cây thuốc bản địa R. solani .
3.3 . Đặc điểm của các NP ZnO được tổng hợp trong chiết xuất hạt của T. ammi
Các thông số sau đây đã giúp chúng tôi xác định đặc điểm của các nano kẽm oxit một cách đáng kể và đề xuất ứng dụng của chúng cho các phân tích hoạt tính kháng nấm.
3.3.1 . Quang phổ FT-IR của các NP ZnO xanh lục
Phân tích FTIR của các nano kẽm oxit, được chuẩn bị trong dịch chiết T. ammi cho thấy một đỉnh đặc trưng ở 1738,69 cm −1 , cho thấy sự hiện diện của nhóm Aldehyde (C=O kéo dài) trên NP ( Hình 2 ). Phổ của mẫu này cũng cho thấy một số dải cụ thể ở 1366,16,34 cm – 1 (OH uốn) và 1216,90 cm – 1 (kéo dài CO), cho thấy các thành phần hữu cơ của chất chiết xuất chịu trách nhiệm điều chế thành công các NP ZnO. Các NP được điều chế được phát hiện có chứa các phân tử sinh học như phenol (thymol), aldehyde và vinyl ete. Thymol đã được báo cáo là một chất khử và đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp NP ( Manukumar và cộng sự, 2017).
Hình 2 . Phổ FTIR cho thấy các đỉnh nhọn của các NP ZnO được tổng hợp trong T. ammi.
3.3.2 . Phân tích XRD của các NP ZnO tổng hợp
Mẫu nhiễu xạ tia X của các NP ZnO cho thấy các đỉnh đáng chú ý tại 31,8 0 , 34,32 0 , 47,44 0 , 56,44 0 , 62,80 0 , 66,25 0 , 67,80 0 , 68,93 0 , 72,51 0 và 76,86 0 tương ứng với các giá trị đỉnh (100), ( 002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) và (202) ( Hình 3). Các mặt phẳng của các mẫu XRD đã có một thỏa thuận tuyệt vời với JCPDS số 01-079-0207. Mẫu NP đã chuẩn bị được lập chỉ mục thành cấu trúc lục giác một pha với số nhóm không gian P63mc: 186, kẽm oxit. Kích thước hạt trung bình (48,52 nm) được tính bằng công thức Debye Scherrer, phù hợp với những phát hiện trước đó ( Saravanakkumar và cộng sự, 2016 ).
Hình 3 . Phân tích XRD của các NP ZnO được tổng hợp trong T. ammi .
3.3.3 . Phân tích SEM và EDX của các NP ZnO
Phổ EDX của NP cho thấy sự hiện diện chủ đạo của kẽm (43,72%), carbon (30,12%) và oxy (26,12%) ( Hình 4 A). Phân tích EDX cũng cho thấy các đỉnh hấp thụ quang học của các NP cho thấy hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt của chúng . Nguồn gốc của những nguyên tố này nằm trong các thành phần của chiết xuất phyto ( Wei và cộng sự, 2009 ).
Hình 4 . Phổ EDX (A) và ảnh SEM (B) của các NP ZnO được điều chế trong T. ammi.
Phân tích SEM đã giúp chúng tôi khảo sát hình thái bề ngoài của các NP ZnO, được điều chế trong chiết xuất T. ammi . Hình ảnh SEM cho thấy hình dạng lục giác của các NP tổng hợp, được sắp xếp theo hướng lên trên để tạo thành tập hợp các bó ( Hình 4 B).
3.4 . Hoạt tính kháng nấm của các nano kẽm oxit, in vitro và in vivo
Các nano kẽm oxit tổng hợp thể hiện sự ức chế sinh trưởng đáng kể của R. solani ở các nồng độ 1,0, 0,75 và 0,5 mg / ml ( Bảng 2 và Phụ lục 2). Nồng độ NPs thấp hơn (0,25 và 0,1 mg / ml) đã cho google thấy rằng nấm đã được thử nghiệm ức chế sự phát triển ít nhất. Trong xử lý in vivo, thuốc diệt nấm nano kẽm oxit cho thấy khả năng kiểm soát bệnh tốt ( Bảng 3 và Phụ lục 3). NPs kiểm soát bệnh rất nhiều và hoạt tính kháng nấm của các nano kẽm oxit này ở nồng độ 1,0 mg / ml tốt hơn tất cả các chất chiết xuất từ thực vật. Sự ức chế tăng trưởng đáng kể mô tả tầm quan trọng và khả năng sử dụng các NP này trong việc kiểm soát dịch bệnh.
Bảng 2 . Ức chế sinh trưởng của R. solani ZnO NP ở các nồng độ mg / ml khác nhau.
Bảng 3 . Diện tích bị bệnh trên bưởi sau khi xử lý với các nồng độ khác nhau của ZnO NPs.
4 . Thảo luận
Nghiên cứu này đã mô tả việc phân lập thành công và xác định đặc tính của nấm thối trái và kiểm soát thân thiện với môi trường của chúng bằng cách sử dụng các hạt nano. Trong nghiên cứu này, R. solani được phát hiện có liên quan đến bệnh thối trái của bưởi ở Pakistan. Kiểm soát những bệnh này là một vấn đề rất được quan tâm đối với các nhà nghiên cứu bệnh học cây trồng ngày nay. Vì sức khỏe con người tốt hơn, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đang không được khuyến khích trong thế giới văn minh. Các nhà khoa học đang tập trung vào việc sử dụng các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng sáu loại cây bản địa có uy tín và được ghi chép đầy đủ để kiểm tra khả năng kháng nấm của chúng. Trong số đó, chiết xuất hạt T. ammi có hoạt tính kháng nấm tốt nhất đã được sử dụng để tổng hợp màu xanh lá cây của NPs. Sự tham gia của alkaloid và flavonoid, được biết đến là những hợp chất sinh học tích cực chống lại nấm và vi khuẩn, có thể cho thấy hiệu quả chống nấm của T. ammi ( Avita, 2013 ). Riêng lẻ hoặc kết hợp, các hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong chất chiết xuất từ hạt gây trở ngại cho vòng đời của nấm bằng cách liên kết với các phân tử protein của chúng, hoạt động như tác nhân chelat, thay đổi tổng hợp thành phần cấu trúc, làm suy yếu hoặc phá hủy hàng rào tính thấm của màng tế bào, và thay đổi trạng thái sinh lý tế bào ( Rongai và cộng sự, 2015 ). Các nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh khả năng kháng nấm của T. ammi đối với nhiều chủng nấm do sự hiện diện của nhiều hợp chất chống nấm trong chiết xuất hạt của T. ammi ( Jyoti và cộng sự, 2019 ). Phổ FTIR của các NP được chuẩn bị cho thấy sự hiện diện của thymol , một hợp chất phenolic kháng khuẩn nổi tiếng ( Khan, 2017 ). Các nghiên cứu trước đây cũng mô tả rằng các hợp chất hoạt tính sinh học của chất chiết xuất từ thực vật hoạt động như chất đóng vai trò quan trọng và làm giảmcác ion kim loại để tạo ra các NP. Sự kết hợp này trở nên chết người hơn đối với mầm bệnh và kiểm soát bệnh tật, hiệu quả hơn ( Chouhan và Meena, 2015 ). Chất chiết xuất từ lá T. ammi cũng đã được sử dụng để chế tạo các hạt nano màu xanh lá cây của đồng, bạc, niken và magiê ( Jagana và cộng sự, 2017 ).
Trong nghiên cứu này, quá trình tổng hợp các nano kẽm oxit màu xanh lá cây đã được thực hiện thành công bằng cách sử dụng chiết xuất hạt. Các nghiên cứu mô tả rằng các hợp chất hoạt tính sinh học có trong chiết xuất hạt của T. ammi có thể được hấp phụ trên bề mặt của các hạt nano kim loại bằng cách tương tác có thể có của các nhóm chức và những hợp chất này hoạt động như các chất khử và ổn định, trong quá trình hình thành các NP. Thực vật rất giàu các hợp chất như axit amin, polyphenol, bazơ nitơ và đường khử. Các loại hóa chất như vậy đóng vai trò là chất khử và ổn định, trong quá trình tổng hợp hạt nano magnetit ( López và Antuch, 2020). Trong nghiên cứu này, các nano kẽm oxit màu xanh lá cây đã được chuẩn bị cho thấy khả năng chống nấm được tăng cường vì kích thước nhỏ và tính ổn định của chúng. Kích thước nhỏ hơn làm tăng sự phân tán và thâm nhập của chất nền nội bào, đồng thời cản trở sự hấp thụ Ca 2+ nội bào và gây tổn thương tế bào ( Srihasam và cộng sự, 2020 ). Việc gắn các NP với màng tế bào vi sinh vật dẫn đến tổn thương màng tế bào và các bào quan nội bào ( Basak và cộng sự, 2014 ).
Các NPN ZnO thân thiện với môi trường, không độc hại, an toàn sinh học và tương thích sinh học ( Mohammad và cộng sự, 2010 ). Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã liệt kê ZnO, cùng với bốn hợp chất kẽm khác , là chất “thường được công nhận là an toàn (GRAS)” ( Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm FDA, 2015 ). Các nghiên cứu trước đây đã mô tả rằng ZnO không độc, nếu được sử dụng ở nồng độ thấp. Các NP của ZnO đôi khi có thể ảnh hưởng xấu đến hệ thống sống nếu tế bào gan tiếp xúc với nồng độ 14–20 mg / ml trong 12 giờ ( Siddiqi và cộng sự, 2018 ). Nó cũng gây ra tổn thương DNA do stress oxy hóa. Chất kháng khuẩn làm từ các hạt nano kẽm oxit (ZnO NP) đã nổi lên như một loại mới. Đầu tiên các NP của ZnO gặp tế bào vi khuẩn và bám vào bề mặt ngoài của màng sinh chất. Cấu trúc của màng sinh chất bị phá vỡ và tính thấm của nó bị ảnh hưởng do sự tương tác này. Sự phá vỡ cấu trúc màng và sự tích tụ tiếp theo của các NP ZnO trong tế bào chất cản trở các quá trình phát triển cơ bản của tế bào ( Zhang và cộng sự, 2017 ). Các NP của ZnO làm trung gian cho hydrogen peroxide, là một trong những chất có tác dụng kháng khuẩn quan trọng nhất ( Sawai và cộng sự, 1998 ). Ngoài ra, các NP của ZnO chứa các loại oxy phản ứng khác , chẳng hạn như gốc hydroxyl và oxy đơn, kích thích quá trình chết của tế bào.
5 . Kết luận và triển vọng
Việc sử dụng các chất chiết xuất từ thực vật để điều chế NP là một phương pháp dễ dàng và hiệu quả về chi phí. Các NP này thân thiện với môi trường và không độc hại. Các phân tử sinh học thực vật như protein (enzym), axit amin, polysaccharid , alkaloid , các hợp chất cồn và vitamin có thể đóng một vai trò trong việc giảm, hình thành và ổn định NP. Sự phát triển của nấm bệnh có thể bị ức chế bởi các nano kẽm oxit. Công nghệ nanocó thể có các giải pháp nông nghiệp và có thể cách mạng hóa các hệ thống quản lý dịch bệnh hiện tại. Các nhà khoa học vật liệu và nhà sinh học cần làm việc cùng nhau để hiểu sâu hơn về các cơ chế tương tác cơ bản trong một hệ thống nano sinh học phức tạp. Sự hiểu biết chi tiết về các đặc tính cấu trúc của các hạt nano, chẳng hạn như hình thái, quy mô, các nhóm chức năng và khả năng hấp phụ / tải tích cực, có thể cung cấp một hướng dẫn hữu ích làm điểm khởi đầu cho việc lựa chọn hợp lý các hạt nano phù hợp. Điều quan trọng nữa là phải chọn một hệ thống mạnh mẽ và có thể tái tạo để tiến hành các nghiên cứu về tính tương thích sinh học và hiệu quả ở các cấp độ hệ sinh thái của tế bào, sinh vật và dịch hại, nhằm đạt được điều kiện gần thực địa nhất có thể.