Nano bạc điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở gà thịt gây ra bởi vi khuẩn Clostridium perfringens
Viêm ruột hoại tử liên quan đến Clostridium perfringens (NE) là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến chăn nuôi gà thịt. Một thách thức lớn toàn cầu là giảm việc sử dụng kháng sinh trong ngành chăn nuôi gia cầm do tác động tiêu cực của chúng đối với sức khỏe cộng đồng. Một giải pháp thay thế là sử dụng các hạt nano (NP) để khắc phục tình trạng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn. Các hạt nano bạc (AgNP) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
Phương pháp
Tổng cộng có 120 gà thịt Cobb (1 ngày tuổi) được thu thập cho nghiên cứu này và được chia thành 4 nhóm bằng nhau ở 14 ngày tuổi (mỗi nhóm 30 con); mỗi nhóm được chia thành 3 lần lặp lại bằng nhau (mỗi lần 10 con). Các nhóm được chỉ định như sau:
G1, bị nhiễm bệnh;
G2, bị nhiễm và điều trị bằng nano bạc AgNP;
G3, được xử lý bằng AgNP;
và G4, đối chứng âm.
Gia cầm bị nhiễm 4×108 đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)/mL/con do vi khuẩn C. perfringens loại A trong 2 ngày liên tiếp. Trong các nhóm được xử lý, các AgNP (đường kính trung bình 15 nm; tổng liều 150 µg/con) được sử dụng thông qua ống tiêu hóa cây trồng. Trong thời gian quan sát (5 tuần), năng suất của gia cầm và các chỉ số cơ quan miễn dịch đã được ghi lại. Các mẫu huyết thanh được thu thập để đánh giá miễn dịch và các mẫu mô được thu thập để phân tích mô bệnh học và ước tính dư lượng nano bạc AgNP.
Kết quả
Điều trị bằng AgNP làm giảm sự xâm nhập của C. perfringens trong ruột và manh tràng, giảm mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu lâm sàng và giảm tỷ lệ tử vong so với nhóm bị nhiễm bệnh không được điều trị. Việc điều trị bằng AgNP làm giảm bớt các tổn thương bệnh lý ở ruột và gan, nhưng dư lượng của chúng được tìm thấy trong cơ.
Phần kết luận
AgNP có tác động tích cực đến tính toàn vẹn của sức khỏe đường ruột trong khi không có tác động đến các cơ quan miễn dịch. AgNP có một số dư lượng trong cơ bắp; do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn về nồng độ và kích thước của AgNP, đường dùng và thời gian ngừng sử dụng để đảm bảo an toàn cho thịt gà đối với người tiêu dùng.
Giới thiệu
Ngành chăn nuôi gà thịt rất quan trọng ở Ai Cập, nhưng hiện nay nước này đang phải đối mặt với thách thức nhiễm trùng tiêu chảy, một tình trạng phổ biến đe dọa chăn nuôi gia cầm. 1 Viêm ruột hoại tử (NE) ở gà là do Clostridium perfringens , một loại vi khuẩn hình que, gram dương, hình thành bào tử, kỵ khí. 2 , 3 C. perfringens được phân thành năm loại độc tố (A–E) tùy theo khả năng sản xuất bốn loại độc tố chính khác nhau (alpha, beta, epsilon và iota). 4 , 5
Gần đây, các độc tố mới (Beta2, NetB và TpeL) đã được phát hiện, đòi hỏi phải có một sơ đồ phân loại mở rộng. 6 Viêm ruột hoại tử thường do C. perfringens loại A và đôi khi do loại C. 7 C. perfringens thường được tìm thấy trong ruột của gia cầm khỏe mạnh, thường ở mức dưới 102 –104 CFU/g hàm lượng trong ruột, so với với 107 –109 CFU/g ở gà mắc bệnh. 8 Tác động của NE lâm sàng và cận lâm sàng ước tính khiến ngành này thiệt hại 6 tỷ USD mỗi năm. 9
NE cấp tính ảnh hưởng đến gà thịt từ 2 đến 6 tuần tuổi, gây tử vong 1% mỗi ngày, với tỷ lệ tử vong tích lũy lên tới 10–40%. 3 , 10 NE cận lâm sàng dẫn đến tổn thương niêm mạc ruột dẫn đến giảm tiêu hóa và hấp thu, giảm tăng trọng và tăng hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR). Nó cũng có thể gây viêm gan hoặc viêm gan đường mật. 11 , 12
- perfringensgây bệnh viêm ruột nghiêm trọng do thực phẩm ở người, 13và sự hiện diện của nó trong thực phẩm của con người, chẳng hạn như thịt gà, có thể là điều không thể tránh khỏi. Về mặt mô bệnh học, NE được đặc trưng bởi hoại tử tế bào ruột nghiêm trọng, sự kết hợp các nhung mao lan rộng và phản ứng viêm nghiêm trọng ở lớp đệm với sự giãn nở nghiêm trọng của các mao mạch máu liên quan đến xuất huyết nhỏ ở hầu hết các nhung mao, đặc biệt là ở tá tràng và hỗng tràng.
Ở gan, NE gây tắc nghẽn nghiêm trọng, viêm gan cửa liên quan đến thoái hóa tế bào gan và hoại tử. Ở amidan manh tràng, nó dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng của mô bạch huyết và sự phân giải tế bào lympho. 15 , 16 Kháng sinh làm tăng tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn đường ruột ở gà thịt, dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ở các mầm bệnh đường ruột có nguồn gốc từ động vật, đặc biệt là C. perfringens . 17 Trong một nghiên cứu trước đây, 125 chủng C. perfringensthu được từ gà thịt lâm sàng bị nhiễm NE biểu hiện tính kháng đa thuốc hoàn toàn với streptomycin, gentamicin, lincomycin, erythromycin, spiramycin và axit oxolinic và kháng một phần với Spectinomycin, tylosin-fosfomycin, ciprofloxacin, rifampicin, chloramphenicol, enrofloxacin, neomycin, colistin, pefloxacin, doxycycline, norfloxacin, oxytetracycline, flumequine và trimethoprim–sulfamethoxazole. 17
Công nghệ nano hiện đang cung cấp các công cụ mới để hỗ trợ cải thiện sức khỏe và năng suất vật nuôi cũng như khắc phục vấn đề đa kháng thuốc. 18 Hạt nano bạc (AgNP) có nhiều ứng dụng khác nhau trong chăn nuôi gia cầm, ví dụ, chúng được sử dụng trong các chế phẩm khử trùng trong trại giống, 19 và chúng được khai thác vì tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều vi khuẩn gram âm và gram dương; 19–24 hơn nữa, chúng còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại Campylobacter jejuni, Escherichia coli ( E. coli), Bacillus spp., Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa . 25 , 26 AgNP cũng đã được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng trong nước uống cho gà thịt27 và đã được báo cáo là cải thiện sức khỏe và năng suất của chúng. 28 Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng kháng khuẩn của các AgNP đối với NE được tạo ra trong thực nghiệm ở gà thịt và để đo lường hiệu suất cũng như phản ứng miễn dịch của gia cầm.
Nguyên liệu và phương pháp
Chuẩn bị và đặc tính hạt nano bạc
AgNP được điều chế bằng phương pháp khử hóa học. Bạc nitrat được khử bằng natri borohydrua và natri citrat với sự có mặt của polyvinylpyrrolidone làm chất đóng nắp. 18
Các NP tổng hợp được đặc trưng bằng cách nghiên cứu phổ hấp thụ của các Nano bạc trong dung dịch thông qua quang phổ UV-Vis (NanoDrop 2000) và bằng cách chụp ảnh các đặc điểm hình thái của chúng qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (FEI Tecnai G20, Hà Lan) ở điện áp gia tốc 200 kV.
Chuẩn bị chủng Clostridium perfringens
Chủng gây bệnh của C. perfringens loại A được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ ngân hàng chủng tại Khoa Gia cầm, Khoa Thú y, Đại học Cairo. Trong điều kiện vô trùng, chủng C. perfringens loại A được cấy vào môi trường thịt đã nấu chín và ủ kỵ khí ở 37°C trong 18 giờ. Sau đó, các tế bào vi khuẩn thu được được hòa lại vào dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) và số lượng khuẩn lạc được điều chỉnh bằng ống McFarland. Vào lúc 14 ngày tuổi, những gà trong nhóm đối chứng dương tính và những gà trong nhóm bị nhiễm bệnh được điều trị bằng AgNP bị nhiễm bệnh qua ống tiêu hóa cây trồng với 4×10 8 CFU/mL/con C. perfringens mới được chuẩn bị trong PBS trong 2 ngày liên tiếp trong theo phương pháp được mô tả bởi Awaad et al. 29
Thiết kế thử nghiệm
Tổng cộng có 120 gà con Cobb (1 ngày tuổi) được lấy từ Công ty Gia cầm Cairo, Ai Cập và được nuôi trên hệ thống lót chuồng sâu với dăm gỗ tươi làm lớp lót chuồng có độ dày ~ 10 cm trên sàn bê tông. Gà con được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và thông gió tối ưu và được duy trì dưới hệ thống ánh sáng liên tục 24 giờ trong suốt thời gian quan sát (5 tuần). Gà nhận được khẩu phần ăn cân bằng (bao gồm khẩu phần ban đầu, gà trưởng thành và gà xuất chuồng) không có bất kỳ chất phụ gia nào và nước sạch tùy ý. Khi được 14 ngày tuổi, 120 gà con được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm bằng nhau (mỗi nhóm 30 con). Mỗi nhóm được chia thành 3 lần nhắc lại bằng nhau (10 con/lần lặp). Các nhóm được chỉ định như sau: nhiễm đối chứng dương (G1), bị nhiễm và điều trị bằng AgNP (G2), được điều trị bằng AgNP (G3) và đối chứng âm (G4). Chương trình tiêm phòng cho tất cả các loài chim bao gồm tiêm vắc xin Hitchner B1+H120 vào mắt lúc 7 ngày tuổi, tiêm dưới da vắc xin H5N2 vô hoạt cúm gia cầm lúc 10 ngày tuổi, tiêm vắc xin LaSota vào mắt lúc 14 ngày tuổi, tiêm vắc xin IBDV 228E vào mắt. lúc 18 ngày tuổi, và cuối cùng là tiêm vắc xin LaSota vào nước uống lúc 28 ngày tuổi, theo các quy trình đã được công bố trước đó. 16 , 29
Mỗi con gà ở nhóm G2 và G3 nhận được 1 mL huyền phù AgNP (30 µg/mL) qua ống tiêu hóa cho cây trồng trong 5 ngày liên tiếp sau khi nhiễm bệnh (PI) bắt đầu từ 14 ngày tuổi, dẫn đến tổng liều cho mỗi con là 150 µg AgNP.
Tất cả các quy trình thí nghiệm và xử lý chim đã được phê duyệt từ ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Khoa Thú y, Đại học Cairo.
Đánh giá năng suất của chim
Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong
Tình trạng sức khỏe chung, dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ tử vong được ghi nhận hàng ngày.
Trọng lượng cơ thể và tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR)
Về trọng lượng cơ thể, 15 con/nhóm (5 con/lặp lại) được chọn ngẫu nhiên và cân riêng lẻ vì các con được cân vào tuần 2, 3, 4, 5. Lượng tiêu thụ thức ăn được đo vào cùng ngày cân gà. FCR được xác định theo công thức (g thức ăn/g tăng trọng cơ thể sống) theo Timmerman et al. 30
Lấy mẫu để đếm C. perfringens
Ba con gà được chọn ngẫu nhiên và giết mổ theo quy định từ mỗi nhóm (một con/con) vào thời điểm 21, 28 và 35 ngày sau khi nhiễm bệnh (PI).
- perfringenssố lượng ruột và phân; Tại thời điểm PI 7 ngày, 0,2 g từ chất chứa trong ruột và phân được thu thập riêng biệt từ mỗi con gà (3 con/nhóm) (một con/lần lặp lại) và pha loãng theo từng giai đoạn trong PBS vô trùng thành 1:100, 1:1000 và 1:10.000; sau đó, 0,1 mL của mỗi độ pha loãng được đổ lên bề mặt các đĩa thạch máu cừu và thạch tryptose sulfite cycloserine (TSC) (được bổ sung D-cycloserine) với nhũ tương lòng đỏ trứng và ủ kỵ khí bằng bình kỵ khí GasPak và bộ dụng cụ kỵ khí GasPak trong 24 giờ. ở 37°C. Các khuẩn lạc C. perfringensđiển hình (các khuẩn lạc màu đen) trên môi trường thạch TSC, hoặc các khuẩn lạc hình vòm lớn có vùng tan máu kép trên các đĩa thạch máu, được đếm và báo cáo là CFU/g. Các khuẩn lạc được chọn và xác nhận bằng tiêu chí của Harmon 31 và Garrido et al. 32
Điểm tổn thương vĩ mô
Các tổn thương vĩ mô được tính điểm theo hệ thống sáu điểm của Keyburn et al 33 và Shojadoost et al. 34
Kiểm tra mô bệnh học
Ruột, gan, thận và các cơ quan miễn dịch (tuyến ức, túi Fabricius (BF) và lá lách) được thu thập và cố định trong formalin đệm 10%, sau đó được xử lý, cắt và nhuộm HE theo các phương pháp được mô tả bởi Bancroft và Đánh bạc. 35
Đánh giá miễn dịch
Chỉ số cơ quan miễn dịch (BF, tuyến ức và lá lách)
Các cơ quan miễn dịch được thu thập và cân để tính chỉ số (%) như sau:
Chỉ số cơ quan miễn dịch = trọng lượng cơ quan miễn dịch (g) × 100/trọng lượng cơ thể sống (g).
Ước tính miễn dịch dịch thể
Để đánh giá vai trò của AgNP đối với khả năng miễn dịch của gia cầm, hiệu giá kháng thể của vắc xin Anti-ND được ước tính bằng cách thu thập mẫu máu lúc 0 và 7 ngày sau khi tiêm vắc xin ND từ tĩnh mạch cánh của 5 con/nhóm được chọn ngẫu nhiên và huyết thanh được thử nghiệm. xét nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). 36
Xác định dư lượng mô Nano bạc
Dư lượng AgNP trong cơ được xác định thông qua phép đo phổ phát xạ quang plasma kết hợp cảm ứng (ICP-OES). 21 Tóm lại, các mẫu mô cơ (5 g) từ cả hai nhóm được xử lý bằng AgNP (G2 và G3) đã được lấy mẫu vào cuối thí nghiệm (ngày 35). Các mẫu được phân hủy bằng vi sóng dưới nhiệt độ và áp suất (nhiệt độ 200°C; áp suất 40 bar) với việc bổ sung 2 mL axit nitric (30%) trước khi phân tích qua ICP-OES (Thermo Fisher Scientific, Anh).
Phân tích thống kê
Phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh tác động của các phương pháp điều trị khác nhau lên các thông số hiệu suất tăng trưởng, chỉ số cơ quan miễn dịch và số lượng clostridial trong ruột của gà thịt. Thử nghiệm Kruskal–Wallis được sử dụng khi dữ liệu không được phân phối bình thường (điểm tổn thương và chuẩn độ HI). Dữ liệu được thể hiện dưới dạng phương tiện và lỗi tiêu chuẩn. Thử nghiệm chính xác của Fisher được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa tỷ lệ tử vong và các nhóm điều trị. Ý nghĩa thống kê được đặt thành P <0, 05. Phần mềm PASW Statistic Phiên bản 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) đã được sử dụng để tiến hành phân tích thống kê. Phần mềm R 3.6.1 ( http://www.r-project.org/ ) đã được sử dụng để tạo đồ họa biểu đồ.
Kết quả
Đặc tính hạt nano bạc
Hình ảnh TEM cho thấy các Nano bạc hình cầu, phân tán có đường kính trung bình 15 nm (Hình 1A). Phổ hấp thu UV-Vis cho thấy độ hấp thụ cực đại của các AgNP đã chuẩn bị ở bước sóng 398 nm (Hình 1B).
Đặc tính của hạt nano bạc. ( A ) Ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy các hạt nano bạc hình cầu có đường kính trung bình 15 nm (thanh tỷ lệ 100 nm). ( B ) Phổ hấp thụ UV-vis cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 398 nm.
Dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ mắc bệnh và tử vong
Sau khi gây nhiễm thực nghiệm, các dấu hiệu lâm sàng được quan sát rõ ràng sau 1 tuần PI ở gà G1, biểu hiện là trầm cảm toàn thân, xù lông và có phân màu cam sẫm ở 40% số gà bị nhiễm bệnh. Ở nhóm G2, các dấu hiệu lâm sàng quan sát được biểu hiện ở ~15% số gà, trong khi 2 nhóm còn lại không có dấu hiệu lâm sàng.
Tỷ lệ tử vong ở nhóm G1 và G2 sau 1 tuần PI lần lượt là 20% (6/30) và 3,3% (1/30), trong khi hai nhóm còn lại không ghi nhận trường hợp tử vong nào (Bảng 1). So với nhóm đối chứng dương tính (G1), tỷ lệ tử vong ở các nhóm khác giảm đáng kể ( P = 0,004).
Bảng 1 Ảnh hưởng của Nano bạc đến hiệu suất tăng trưởng và tỷ lệ tử vong của gà thịt
Ghi chú: a,b,c Giá trị trung bình hoặc tỷ lệ phần trăm có chỉ số trên khác nhau trong cùng một cột là khác nhau có ý nghĩa thống kê ( P < 0,05). d Phương pháp xử lý: G1, gà con bị nhiễm Clostridium perfringens nhưng không được điều trị bằng AgNP; G2, gà con bị nhiễm C. perfringens và được điều trị bằng AgNP; G3, gà con không bị nhiễm bệnh được điều trị bằng AgNP; G4, gà con không bị nhiễm cũng như không được điều trị bằng AgNP.
Các chữ viết tắt: FCR, hệ số chuyển hóa thức ăn (g thức ăn/g tăng trọng); SEM, sai số chuẩn của giá trị trung bình; NS, không đáng kể.
Trọng lượng cơ thể và FCR
Các thông số hiệu suất cho sự tăng trưởng được trình bày trong Bảng 1. Vào lúc 28 ngày tuổi, những gà được điều trị bằng AgNP (G2 và G3) có trọng lượng cơ thể cao hơn đáng kể ( P = 0,002) và tăng trọng ( P < 0,0001) so với gà đối chứng (G1 và G4). Những cải thiện đáng kể đã được quan sát thấy ở FCR của những gà nhận được AgNP (G2 và G3) vào ngày 14 đến ngày 28 ( P < 0,0001).
C. perfringens Số lượng ruột và manh tràng
Số lượng của C. perfringen ở phân và ruột s được minh họa trong Hình 2. Sau 7 ngày PI, G2, G3 và G4 cho thấy số lượng C. perfringens trong manh tràng giảm đáng kể ( P = 0,001) so với G1. Hơn nữa, cả G2 và G3 đều cho thấy số lượng C. perfringens trong ruột thấp hơn đáng kể so với G1 và G4 ( P < 0,0001).
Ảnh hưởng của nano bạc đến số lượng phân gà thịt và C. perfringens trong ruột gà thịt (log10 CFU/g). G1: Kiểm soát nhóm nhiễm dương tính; G2: Nhóm được điều trị bằng NP bị nhiễm và Ag; G3: Nhóm được xử lý Nano bạc; G4: Kiểm soát nhóm âm. a,b Các chỉ số trên khác nhau cho thấy sự khác biệt đáng kể (thử nghiệm Tukey; P < 0,05).
Đánh giá miễn dịch
Chỉ số cơ thể của cơ quan miễn dịch (BF, tuyến ức và lá lách)
Tỷ lệ trọng lượng cơ quan miễn dịch/trọng lượng cơ thể được trình bày trong bảng 2. Không có sự khác biệt về chỉ số BF ở tất cả các nghiệm thức. Lúc 21 ngày tuổi, G2 có trọng lượng tuyến ức thấp nhất ( P = 0,016), trong khi G1 có trọng lượng lách thấp nhất ( P < 0,0001). Ở 28 ngày tuổi, trọng lượng lách cao nhất được ghi nhận ở G3 và thấp nhất ở G1 ( P < 0,0001). Vào ngày thứ 35, không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm khác nhau về chỉ số cơ quan miễn dịch.
Bảng 2 Ảnh hưởng của AgNP đến các chỉ số cơ quan miễn dịch (BF, tuyến ức và lá lách)
Ghi chú: a,b,c Các giá trị trung bình có chỉ số trên khác nhau trong cùng một cột là khác nhau có ý nghĩa thống kê ( P < 0,05). d Phương pháp xử lý: G1, gà con bị nhiễm Clostridium perfringens nhưng không được điều trị bằng AgNP; G2, gà con bị nhiễm C. perfringens và được điều trị bằng AgNP; G3, gà con không bị nhiễm bệnh được điều trị bằng AgNP; G4, gà con không bị nhiễm cũng như không được điều trị bằng Nano bạc.
Chữ viết tắt: SEM, sai số chuẩn của giá trị trung bình; NS, không đáng kể.
Ước tính miễn dịch dịch thể
Các giá trị hiệu giá HI quan sát được sau khi tiêm chủng ND được minh họa trong Hình 3. Không có sự khác biệt về hiệu giá HI giữa các nhóm ở thời điểm PI 7 hoặc 14 ngày.
Tác dụng của nano bạc đối với hiệu giá HI của gà thịt đối với NDV. G1: Kiểm soát nhóm nhiễm dương tính; G2: Nhóm được điều trị bằng NP bị nhiễm và Ag; G3: Nhóm được xử lý AgNP; G4: Kiểm soát nhóm âm. So sánh thống kê được thực hiện bằng Kruskal–Wallis Test, ở mức ý nghĩa P <0,05.
Điểm tổn thương vĩ mô
Sự khác biệt về điểm tổn thương chỉ được quan sát thấy ở ngày thứ 21 (PI 7 ngày). Nhiễm C. perfringens gây tổn thương ruột cao hơn ( P = 0,027) ở G1 so với G2 (hinh 4).
Ảnh hưởng của Nano bạc đến điểm tổn thương vĩ mô ở gà thịt. G1: Kiểm soát nhóm nhiễm dương tính; G2: Nhóm được điều trị bằng NP bị nhiễm và Ag; G3: Nhóm được xử lý AgNP; G4: Kiểm soát nhóm âm. a,b Các chỉ số trên khác nhau cho thấy sự khác biệt đáng kể (Thử nghiệm Kruskal–Wallis; P < 0,05).
Tổn thương đại thể ở ruột nặng ở G1; nhóm này biểu hiện sự căng phồng của ruột và tắc nghẽn đường ruột nghiêm trọng từ bề mặt huyết thanh trong một số trường hợp (Hình 5). Sau khi mổ xẻ, phần ruột mở cho thấy sự hiện diện của chất chứa bọt trong ruột trộn lẫn với các hạt thức ăn chưa tiêu hóa (Hình 6). Niêm mạc ruột cho thấy mức độ hoại tử ruột khác nhau với sự hiện diện của các mảng xuất huyết và tắc nghẽn mạch máu ruột. Các tổn thương thường thấy ở quai tá tràng và hỗng tràng (Hình 6).
( A ) Ruột non nhóm 1 có biểu hiện tắc ruột nặng. ( B ) Ruột non nhóm 1 cho thấy ruột phình to chứa khí.
( A ) Ruột non hở của nhóm 1 có biểu hiện hoại tử nặng, ứ đọng niêm mạc ruột kèm theo các mảng xuất huyết lớn. ( B ) Ruột non hở nhóm 1 có biểu hiện hoại tử dạng nhung ở niêm mạc ruột. ( C ) Ruột hở của Nhóm 1 cho thấy sự hiện diện của các hạt thức ăn chưa tiêu hóa trộn lẫn với chất màu Cam. ( D ) Ruột hở của nhóm 2 có biểu hiện tắc nghẽn nhẹ niêm mạc ruột. ( E ) Ruột hở cho thấy niêm mạc ruột bình thường thuộc Nhóm 3. ( F ) Ruột hở cho thấy niêm mạc ruột bình thường thuộc Nhóm 4.
Gan của gia cầm bị nhiễm bệnh trong thí nghiệm (G1) cho thấy xuất huyết dưới bao, đặc biệt là ở rìa gan, trong khi ruột của gia cầm ở G2 xuất hiện tắc nghẽn với biểu hiện gan dường như bình thường (Hình 7). Không quan sát thấy tổn thương vĩ mô ở G3 hoặc G4.
( A ) Thân gà mổ mổ cho thấy gan nhợt nhạt và xuất huyết dưới bao gan của Nhóm 1. ( B ) Thân thịt gà mổ mổ cho thấy gan bình thường của Nhóm 2.
Kiểm tra mô bệnh học
Các tổn thương mô bệnh học hầu hết nổi bật ở những gia cầm bị nhiễm bệnh thực nghiệm (G1, nhóm đối chứng dương tính). Lớp biểu mô của nhung mao ruột bị bong tróc gây hoại tử lớn các nhung mao ruột và tuyến ruột. Các tế bào viêm trộn lẫn với các mảnh vụn tế bào và trực khuẩn C. perfringens đã được quan sát thấy (Hình 8AVàvà B).B). Ở gan, tĩnh mạch cửa cho thấy sự giãn nở và ứ máu nghiêm trọng với các tế bào hồng cầu. Khu vực cửa cho thấy phù cửa và thâm nhiễm tế bào viêm (Hình 9A); tĩnh mạch trung tâm cũng bị tắc nghẽn (Hình 9B). Có sự tập trung khu trú của các tế bào viêm đơn nhân trong nhu mô gan, sự giãn nở của các xoang gan và sự thoái hóa của tế bào gan.Hình 9CVàvà DD).
Ảnh vi mô các phần ruột gà: ( A và B ) Clostridium perfringens – nhóm gây nhiễm thực nghiệm (Nhóm 1), ( C và D ) Nhóm nhiễm C. perfringens và được xử lý bằng hạt nano bạc (Nhóm 2), ( E và F ) Đã xử lý hạt nano bạc nhóm (Nhóm 3), ( G và H ) Nhóm đối chứng âm (Nhóm 4). ( A ) Hoại tử lớn và lan tỏa của các nhung mao ruột kèm theo hoại tử hoàn toàn và bong tróc các tế bào ruột (mũi tên) (HE, x40), ( B ) Các tế bào ruột bị hoại tử và bong tróc trộn lẫn với trực khuẩn clostridial và các tế bào viêm (mũi tên) (HE, x200), ( C ) Các nhung mao ruột vẫn duy trì tính toàn vẹn trong khi lớp đệm bị các tế bào viêm xâm nhập (mũi tên) (HE, x100), ( D ) Nhiều không bào trong tế bào ruột và niêm mạc biểu mô của tuyến ruột (mũi tên) (HE, x200), ( E ) Cấu trúc bình thường của nhung mao ruột (HE, x100), ( F ) Xâm nhập nhẹ vào lớp đệm với các tế bào viêm (mũi tên) (HE, x200), ( G ) Cấu trúc mô học bình thường của nhung mao ruột (HE, x100), ( H ) Độ phóng đại cao hơn của ảnh vi mô trước đó cho thấy cấu trúc bình thường của tế bào ruột và tuyến ruột (HE, x200).
Ảnh vi thể gan gà: ( A–D ) Clostridium perfringens – nhóm nhiễm thực nghiệm (Nhóm 1), ( E và F ) Nhóm nhiễm C. perfringens và được xử lý bằng hạt nano bạc (Nhóm 2), ( G ) Nhóm được xử lý hạt nano bạc (Nhóm 3), ( H ) Nhóm đối chứng âm (Nhóm 4). ( A ) Tĩnh mạch cửa bị giãn và ứ máu nghiêm trọng do hồng cầu và được bao quanh bởi phù cửa và thâm nhiễm tế bào viêm (mũi tên) (HE, x100), ( B ) Tắc nghẽn tĩnh mạch trung tâm gan (mũi tên) (HE, x200), ( C ) Tập trung khu trú các tế bào viêm đơn nhân trong nhu mô gan (mũi tên) (HE,x200), ( D ) Tế bào gan đang thoái hóa và giãn các xoang gan (HE, x200), ( E ) Tĩnh mạch trung tâm được bao quanh bởi các tế bào viêm (mũi tên ) (HE, x200), ( F ) Tiểu thùy gan và vùng cửa đang có mô hình bình thường ( G và H ) Cấu trúc mô học bình thường của tiểu thùy gan (HE, x200).
Ở nhóm bị nhiễm và được điều trị bằng AgNP, ruột cho thấy các nhung mao và tuyến ruột còn nguyên vẹn, trong khi lớp đệm niêm mạc bị thâm nhiễm nhẹ bởi các tế bào viêm với nhiều không bào trong tế bào ruột và niêm mạc biểu mô của tuyến ruột (Hình 8CVàvà D).D). Gan có mô học bình thường chỉ có một vài tĩnh mạch trung tâm được bao quanh bởi các tế bào viêm (Hình 9EVàvà FF).
Nhóm được điều trị bằng AgNP biểu hiện cấu trúc mô học bình thường của nhung mao ruột, tế bào ruột và tuyến ruột, với một số ít tế bào viêm xâm nhập vào lớp đệm (lamina propria) (Hình 8EVàvà F),F), trong khi nhóm đối chứng âm tính cho thấy mô học bình thường của ruột (Hình 8GVàvà HH).
Cả nhóm được điều trị bằng AgNP và nhóm đối chứng âm tính đều cho thấy mô học gan bình thường (Hình 9GVàvà H),H), và các cơ quan miễn dịch được kiểm tra không có tổn thương bệnh lý.
Xác định dư lượng mô AgNP
Phân tích ICP-OES ở tuổi 35 ngày cho thấy sự hiện diện của Ag dư trong cơ ở G2 và G3 ở nồng độ lần lượt là 413 và 501 ng/g (trung bình = 457 ± 44 ng/g). Không phát hiện thấy Ag dư trong G1 hoặc G4.
Cuộc thảo luận
Công nghệ nano có nhiều ứng dụng trong ngành chăn nuôi gia cầm. 24 Trong nghiên cứu này, đặc tính của AgNP thông qua quang phổ UV-Vis cho thấy đỉnh hấp thụ tối đa ở bước sóng 398 nm, tương ứng với sự hấp thụ plasmonic của Nano bạc 37 và xác nhận quá trình tổng hợp thành công của chúng. TEM cũng xác nhận sự hình thành của các AgNP và tiết lộ các đặc tính hình thái của chúng liên quan đến kích thước và hình dạng. Trong nghiên cứu này, những con chim được điều trị được dùng tổng liều 150 µg AgNP trong 5 ngày. Ở nồng độ được sử dụng, các AgNP có tác dụng kháng khuẩn đối với C. perfringens (thể hiện bằng số lượng giảm) và cải thiện tình trạng sức khỏe chung của các loài gia cầm được thử nghiệm, mặc dù không quan sát thấy tác dụng nào đối với các thông số miễn dịch được kiểm tra. Trong một nghiên cứu song song của Al-Saeedi, 38 AgNP được cung cấp trong nước uống của gà thịt ở các nồng độ khác nhau (20, 30, 40 và 50 ppm) trong toàn bộ thời gian nuôi. Trong nghiên cứu đó, các tác giả nhận thấy rằng các AgNP ở nồng độ 50 ppm mang lại giá trị cao đáng kể ( P < 0,05) cho chỉ số BF, cũng như cải thiện đáng kể ( P < 0,05) về số lượng vi khuẩn có lợi (Lactobacilli) trong jejunum và giảm số lượng vi khuẩn có hại ( E. coli ).
Trong nghiên cứu này, các dấu hiệu lâm sàng quan sát được là trầm cảm toàn thân, xù lông và xuất hiện phân sủi bọt màu cam ở G1 và G2. Những phát hiện tương tự (các mức độ tiêu chảy khác nhau) đã được báo cáo ở gà bị nhiễm C. perfringens trong thực nghiệm . 16
Tỷ lệ tử vong lần lượt là 20% và 3,3% ở G1 và G2. Tỷ lệ tử vong tích lũy từ 10%–40% do NE ở gà thịt đã được báo cáo. 2 , 10 Awaad và cộng sự 16 ghi nhận tỷ lệ tử vong thấp hơn (7,41%) ở gà bị nhiễm C. perfringens trong thực nghiệm , mặc dù sự khác biệt này có thể là do sự khác biệt về chủng vi khuẩn, liều lượng hoặc điều kiện thí nghiệm. Tỷ lệ tử vong giảm đáng kể ở G2 ( P = 0,004) có thể là do tác dụng kháng khuẩn của AgNP đối với nhiễm trùng C. perfringens .
Sự khác biệt về điểm số tổn thương được quan sát thấy sau 7 ngày PI. Gà bị nhiễm bệnh không được điều trị cho thấy số lượng tổn thương đường ruột tăng lên ( P = 0,027;hinh 4) so với các nhóm được điều trị bằng AgNP. Kết quả của chúng tôi đối với nhóm đối chứng dương tính (bị nhiễm) phù hợp với kết quả được báo cáo bởi Awaad et al. 16 , 29
Các thông số về hiệu suất tăng trưởng ở 28 ngày tuổi cho thấy gà được điều trị bằng AgNP (G2 và G3) có trọng lượng cơ thể cao hơn đáng kể ( P = 0,002) và tăng trọng ( P < 0,0001) so với gà đối chứng (G1 và G4). Những cải thiện đáng kể đã được quan sát thấy ở FCR của những gia cầm nhận được AgNP (G2 và G3) vào ngày 14 và 28 ( P < 0,0001). Małaczewska 28 , 39 kết luận rằng AgNP đã cải thiện sức khỏe của gia cầm và thúc đẩy hiệu suất tăng trưởng của chúng.
Trong nghiên cứu này, lượng C. perfringens trong phân và ruột sau 7 ngày PI đối với G2, G3 và G4 thấp hơn đáng kể ( P = 0,001) so với nhóm đối chứng bị nhiễm bệnh (G1). Hơn nữa, cả G2 và G3 đều có số lượng C. perfringens trong ruột thấp hơn đáng kể so với G1 và G4 ( P < 0,0001). Những kết quả này phù hợp với kết quả của nghiên cứu trước đó, trong đó các AgNP thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trong ống nghiệm chống lại C. botulinum loại A. 40 Tác dụng kháng khuẩn của NP kim loại có thể là do sự phá vỡ và xâm nhập của màng tế bào vi sinh vật, gây tổn thương cho tế bào vi sinh vật. thành tế bào dẫn đến rò rỉ các chất trong tế bào chất. 41 AgNP đã được chứng minh là có tác dụng ức chế kháng khuẩn thông qua tương tác chặt chẽ với các nhóm thiol có trong các enzyme hô hấp chính. 42
Sau khi xử lý bằng AgNP, không có ảnh hưởng đáng kể nào đến đáp ứng miễn dịch của gà và không có thay đổi nào được quan sát thấy về chỉ số BF. Sau 35 ngày, không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi nhận về tất cả các chỉ số cơ quan miễn dịch giữa tất cả các nhóm được điều trị. Điều này có thể là do sử dụng AgNP trong khoảng thời gian 5 ngày (ngày 14 đến ngày 19), sự cải thiện năng suất của gà chủ yếu được quan sát thấy trong 14 ngày tiếp theo (từ ngày 14 đến ngày 28). Ngoài ra, không có sự khác biệt đáng kể về hiệu giá HI giữa các nhóm ở thời điểm PI 7 hoặc 14 ngày. Kulak và cộng sự 43 phát hiện ra rằng việc sử dụng AgNP (2,87 và 12,25 mg/con) một cách thường xuyên đã cải thiện HI (được chứng minh bằng mức độ tăng của globulin miễn dịch và interleukin 6), và họ xác nhận rằng tác dụng của AgNP đối với hệ miễn dịch. trạng thái của các loài chim phụ thuộc vào kích thước và nồng độ của AgNP. Ngược lại, Ognik và cộng sự phát hiện ra rằng việc sử dụng AgNP cho gà gây ra sự gián đoạn trong quá trình dị hóa protein, được chứng minh bằng hoạt động của men gan giảm và nồng độ của các sản phẩm chuyển hóa protein quan trọng (creatinine và urê) thấp hơn. Ahmadi và cộng sự 45 đã sử dụng AgNP làm phụ gia thức ăn ở các nồng độ khác nhau (4, 8 và 12 mg AgNP trên mỗi kg khẩu phần) ở gà thịt, nhận thấy rằng tất cả nồng độ đều có tác động tiêu cực đến hiệu suất, sức khỏe và phản ứng miễn dịch.
Các quan sát về sự thay đổi mô học ở ruột và gan gà giữa nhóm đối chứng bị nhiễm bệnh thực nghiệm và nhóm được điều trị bằng AgNP cho thấy những khác biệt khác nhau. Trong ruột, nhóm bị nhiễm bệnh cho thấy những thay đổi hoại tử nghiêm trọng ở các nhung mao và tuyến ruột với sự hiện diện của số lượng lớn vi khuẩn liên quan đến vùng hoại tử, theo hình ảnh bệnh lý thông thường đối với C. perfringens . 46 Với phương pháp điều trị bằng Nano bạc, tình trạng nhung mao ruột được cải thiện đáng kể, cấu trúc được duy trì và phản ứng viêm giảm. Tế bào ruột có một số không bào nhưng chưa đến giai đoạn hoại tử. Các tổn thương gan do nhiễm trùng thực nghiệm nổi bật ở G1 và bao gồm tắc nghẽn tĩnh mạch cửa và tĩnh mạch trung tâm, thâm nhiễm tế bào viêm và thay đổi thoái hóa ở tế bào gan. Sự xuất hiện các tổn thương ở gan trong nhiễm trùng C. perfringens là do sự di chuyển của vi khuẩn qua ruột bị tổn thương đến gan qua tĩnh mạch cửa. 47 Nhóm được điều trị có mô hình mô học bình thường của tế bào gan và mạch máu gan với chỉ một số tế bào viêm xung quanh tĩnh mạch trung tâm. Ahmadi và cộng sự 48 đã báo cáo rằng các mức Ag khác nhau không có tác động đáng kể đến sự thay đổi tế bào trong mô gan của gà thịt.
Sự cải thiện các dấu hiệu lâm sàng kết hợp với việc giảm tải lượng vi khuẩn và không có những thay đổi âm tính về mô bệnh học ở ruột và gan đã khẳng định hoạt tính kháng khuẩn của các AgNP dùng đường uống chống lại C. perfringens . Những kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đây về tác dụng kháng khuẩn của AgNP đối với E. coli ở gà, 49 Pseudomonas aeruginosa và Flavobacter johnsoniae ở cá, 50 , 51 Salmonella spp. ở cừu và dê, 21 và Staphylococcus Aureus và E. coli trong các nghiên cứu in vitro. 52 Ngoài ra, Sawosz và cộng sự 53 phát hiện ra rằng uống nước có chứa 25 mg/kg AgNP làm tăng quần thể vi khuẩn axit lactic trong ruột chim cút và cải thiện sức khỏe đường ruột.
Sự tích lũy các AgNP trong các cơ quan ảnh hưởng đến chức năng sinh học và trọng lượng của chúng. 43 Phát hiện của chúng tôi xác nhận rằng việc sử dụng AgNP cho gà để lại Ag còn sót lại trong cơ ở thời điểm 35 ngày tuổi (trung bình là 457 ng/g), điều này có thể dẫn đến việc con người tiếp xúc với AgNP thông qua việc tiêu thụ các phần ăn được của gà đã được xử lý . Phát hiện của chúng tôi đồng ý với phát hiện của Ahmadi và Rahimi; 54 họ đã kết hợp các Nano bạc vào nước uống của gà thịt ở các nồng độ khác nhau (4, 8 và 12 ppm) và tìm thấy dư lượng trong các phần ăn được của cơ gà thịt ở mọi nồng độ. Tuy nhiên, trong một nghiên cứu, cho uống sáu liều khoảng 1 mg/kg AgNP (đường kính, 20 nm) không để lại bất kỳ dư lượng nào trong cơ của gà mái mà chỉ tích lũy trong gan và trứng. 55 Kulak và cộng sự 43 phát hiện ra rằng việc sử dụng AgNP qua đường uống ở gà thịt dẫn đến tồn dư trong ruột non và gan nhưng không tồn tại ở tim hoặc cơ ức. Người ta cho rằng hàm lượng lên tới 100 µg Ag/L trong nước uống là an toàn cho con người mà không gây ra tác dụng phụ. 56 Chúng tôi dự định thực hiện các nghiên cứu sâu hơn để xác định thời gian ngừng thuốc cần thiết sau khi điều trị bằng đường uống bằng AgNP.
Phần kết luận
Chúng tôi kết luận rằng các Nano bạc có thể làm giảm sự xâm chiếm của C. perfringens trong ruột gà thịt và chúng có tác động tích cực đến năng suất, sức khỏe nói chung và tính toàn vẹn của sức khỏe đường ruột trong khi không ảnh hưởng đến các cơ quan miễn dịch và phản ứng miễn dịch. Nano bạc có tác dụng tồn dư tích lũy trong thịt gà; do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn về nồng độ và kích thước của AgNP, đường dùng và thời gian ngừng sử dụng để đảm bảo an toàn cho thịt gà đã qua xử lý đối với con người.
Heba M Salem, 1 Elshaimaa Ismael, 2 and Mohamed Shaalan 3