Nano bạc điều trị bệnh đốm đen (NHPB) do vi khuẩn Rickettsia gây ra

Tác dụng kháng khuẩn của các hạt nano bạc sinh tổng hợp trên tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Litopenaeus vannamei (Boone) bị nhiễm vi khuẩn viêm gan tụy hoại tử (NHPB) hay còn gọi là bệnh đốm đen

TỔNG QUÁT

Bệnh viêm gan tụy hoại tử ở tôm là do vi khuẩn Rickettsialike Gram âm đa hình thái còn gọi là bệnh đốm đen. Ai cũng biết rằng bạc là một chất diệt khuẩn hiệu quả, nhưng các thí nghiệm với các sinh vật dưới nước rất khan hiếm, ở cấp độ hạt nano thì càng hiếm hoi hơn. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng kháng khuẩn của các hạt nano bạc (AgNP) đối với bệnh đốm đen trên tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei ở Thái Bình Dương. Vì vậy, AgNO3 được sử dụng làm nguồn nguyên liệu bạc, và chiết xuất từ lá khô của cây trà xanh Camellia sinensis và cây neem Azadirachta indica làm chất khử. Các lô tôm nhiễm bệnh khác nhau được xử lý với 0,5 và 35 μg AgNP bằng cách cho ăn cưỡng bức. Sự khác biệt giữa số lượng nốt vi khuẩn trong gan tụy tôm và tỷ lệ tôm chết so với lượng AgNP được chứng minh là có hiệu quả chống lại mầm bệnh này.

(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)

GIỚI THIỆU MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA NANO BẠC

Một số bệnh do nhiều loại mầm bệnh gây ra như vi rút, nấm, động vật nguyên sinh và vi khuẩn, đã ảnh hưởng tiêu cực đến sản lượng tôm nuôi ở các nước sản xuất lớn như Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan và Ecuador (Lightner & Pantoja, 2003). Điều kiện nuôi thâm canh, mật độ nuôi hoặc sử dụng thức ăn có chất lượng dinh dưỡng thấp và không cân đối có thể dẫn đến căng thẳng, dẫn đến sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Do đó, việc nghiên cứu để phát triển các kỹ thuật và phương pháp hiệu quả cho phép phát hiện sớm và kiểm soát bệnh là rất quan trọng. Việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi tôm bố mẹ và ấu trùng hiệu quả hơn so với giai đoạn ương giống – nơi khó thực hiện hơn nhiều. Vi khuẩn viêm gan tụy hoại tử (đốm đen), một loại vi khuẩn nội bào giống Rickettsia Gram âm, đã nổi lên như một trong những bệnh chính ảnh hưởng đến ngành nuôi tôm (Krol và cộng sự, 1991). Trong giai đoạn cấp tính của bệnh, gan tụy của tôm bị teo trong khi ở giai đoạn mãn tính, gan tụy bị biến dạng, các ống bị hoại tử, cùng nhiều dị tật khác. Căn bệnh này gây ra tỷ lệ tử vong lên tới 40% và chẩn đoán của nó dựa trên việc sử dụng các công cụ mô học và phân tử (Morales-Covarrubias, 2004; Avila-Villa và cộng sự, 2012; Nunan và cộng sự, 2013; Varela-Mejías & Peña-Navarro, 2016).

Công nghệ nano, kỹ thuật của các hệ thống chức năng ở quy mô phân tử, đã được tập trung vào ngành công nghiệp sản xuất, nhưng nó cũng đã được ứng dụng trong y học như các tác nhân phát hiện in vitro, chẩn đoán in vivo, tưởng tượng đa phương thức, hóa trị, quang trị liệu và liệu pháp miễn dịch (Giasuddin et al., 2013; Lin, 2015). Hơn nữa, trong các hoạt động nông nghiệp, người ta đã chỉ ra rằng thuốc trừ sâu sinh học kích thước nanomet mang lại hiệu quả cao hơn và chi phí thấp hơn thuốc trừ sâu thông thường, mang lại sự lựa chọn đáng tin cậy (Huang và cộng sự, 2015). Mặt khác, trong việc ứng dụng khoa học nano trong sản xuất nuôi trồng thủy sản, Khalafalla et al. (2011) báo cáo rằng các hạt nano selen có thể cải thiện sự sinh sản, tăng trưởng và sự tồn tại của Oreochromis niloticus (Cá rô phi). Ngoài ra, công nghệ nano có thể được áp dụng trên thực phẩm để ngăn ngừa ô nhiễm hoặc phân hủy vi sinh vật. Một số ứng dụng khác liên quan đến các phương tiện nano làm chất vận chuyển cho các chất dinh dưỡng, thuốc, enzym hoặc thực phẩm và các chất phụ gia kháng khuẩn (Can và cộng sự, 2011; Handy, 2012; Giasuddin và cộng sự, 2013). Một số hạt nano có thể có hoạt tính kháng khuẩn và ảnh hưởng đến nhiều loài vi khuẩn (Lu et al., 2013; Huang et al., 2015; Bakare et al., 2016). Ví dụ, các hạt nano đồng đã được chứng minh là có triển vọng chất kháng khuẩn chống lại vi khuẩn đường ruột Aeromonas hydrophila, Vibrio parahaemolyticus, và Pseudomonas fluorescens ở cá trắm bạc và cá trắm cỏ (Huang và cộng sự, 2015), và Kim và cộng sự. (2007) báo cáo rằng việc sử dụng các hạt nano bạc (AgNPs) ức chế sự phát triển của nấm men, Escherichia coli (Escherich), và Staphylococcus aureus (Rosenbach).

Một số nghiên cứu đã được chứng minh tác dụng kháng khuẩn của nano bạc chống lại các vi khuẩn gây bệnh phổ biến lây nhiễm cho các loài nuôi trồng thủy sản. Ví dụ, tác dụng kháng khuẩn của AgNPs được tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất Prosopis chilensis đã được thử nghiệm trên nấm Penaeus monodon bị nhiễm Vibrio cholerae, V. harveyi và V. parahaemolyticus (Kandasamy et al., 2013). Hơn nữa, tác dụng của AgNPs, được tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất trà xanh đã được thử nghiệm trên Fenneropenaeus indicus bị nhiễm V. harveyi (Vaseeharan et al., 2010). Gần đây, Juárez-Moreno et al. (2017) đã chứng minh các đặc tính kháng vi rút của AgNPs chống lại vi rút hội chứng đốm trắng lây nhiễm cho tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei con. Do đó, việc sử dụng các hạt nano chống lại mầm bệnh là một lĩnh vực đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản (Can et al., 2011; Rather et al., 2011; Selvaraj et al., 2014). Các cơ chế trên hoạt động diệt khuẩn của bạc chủ yếu liên quan đến các nhóm sulfhydryl của các enzym và protein như glucose-6-phosphate dehydrogenase và glutathione reductase (Shukla & Chandra, 1977), bằng cách can thiệp vào các chức năng bình thường của protein. Bạc cũng ức chế sự sao chép DNA, và ở vi khuẩn, nó gây ra stress oxy hóa trong thành tế bào, nơi xảy ra các chức năng quan trọng của tế bào, ảnh hưởng đến việc duy trì cân bằng ion bên trong. Bằng cách này, vi khuẩn tiếp xúc với bạc cho thấy sự ức chế tăng trưởng, mất nhiều kali và ngăn chặn sự vận chuyển hóa học từ thành tế bào (Hwang et al., 2007; Luoma, 2008). Người ta đã công nhận rõ rằng một số vi khuẩn sống trong không bào hoặc phagosome, có thể tổng hợp một số protein và độc tố để tạo thành các lỗ trên màng không bào của vật chủ để thoát ra khỏi các bào quan này (Van der Meer-Janssen và cộng sự, 2010). Màng tế bào bị phá vỡ có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của các hạt nano vào tế bào chủ và một số báo cáo đã chứng minh rằng vi khuẩn Gram âm cho thấy sự nhạy cảm với nano bạc tăng lên (Sondi & Salopek-Sondi, 2004; Radzig et al., 2013), điều này làm cho xe ứng cử viên phù hợp như một chất kháng khuẩn chống lại bênh đốm đen – NHPB. Ứng dụng của các hạt nano để ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn trong tế bào người đã được khám phá, nhưng không có tiến bộ nào được báo cáo chống lại bênh đốm đen – NHPB trong các loài nuôi trồng thủy sản. Mặc dù thực tế là hoạt động kháng khuẩn hiệu quả của AgNPs đã được chứng minh, có rất ít thí nghiệm được tiến hành trên các sinh vật sống dưới nước. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng kháng khuẩn của AgNPs chống lại NHPB trong Tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương, Litopenaeus vannamei.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA NANO BẠC

Tổng hợp nano bạc

Lá khô của trà xanh (Camellia sinensis, Kuntze) và lá tươi của cây neem (Azadirachta indica, Jussieu) được sử dụng làm chất khử để xác định loài nào trong số hai loài ưa sản xuất AgNPs đơn phân tán. Lá neem được làm khô trong bóng tối ở nhiệt độ phòng và bảo quản trong túi giấy trong ba ngày. Quá trình tổng hợp hạt nano được thực hiện dựa trên phương pháp được mô tả bởi Vasseharan và cộng sự. (2010) với một số sửa đổi về số lượng và thời gian như sau: Đối với cả hai cây, 6 g lá khô được cho vào 60 mL nước khử ion sôi trong 2 phút, thỉnh thoảng khuấy. Sau đó, sau 5 phút, dịch truyền được lọc qua bộ lọc 4 μm ba lần để tách các chất rắn lơ lửng. Việc truyền dịch được thực hiện ngay trước khi bắt đầu tổng hợp các hạt nano. Phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm 50 mL với 1,0 mL bạc nitrat 0,01 M, 3,0 mL nước khử ion và 30 mL dịch truyền thực vật. Độ hấp thụ của phản ứng được đánh giá trong máy quang phổ Shimadzu UV-2450 cứ sau 5 phút trong 1 giờ. Để đánh giá dạng và độ phân tán của các hạt nano, một mẫu 3 μL dung dịch phản ứng được đặt và phân tích trong kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL 2000 sử dụng lưới đồng 200 mesh được sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 6-12 giờ. Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm ImageJ 1.44 p (NIH).

Mẫu vi khuẩn đốm đen (NHPB)

Để lưu trữ mô tôm nhiễm bênh đốm đen – NHPB, 60 mẫu vật sống đã được thu thập từ hai trại nuôi tôm (30 mẫu mỗi trại). Các trang trại được giấu tên theo yêu cầu của người nuôi, và được xác định là Trang trại A và Trang trại B. Toàn bộ gan tụy của mỗi con tôm được mổ xẻ bằng vật liệu phẫu thuật khử trùng bằng ngọn lửa tại phòng thí nghiệm, và gan tụy được chia thành ba phần được phân phối như sau: một mảnh được đặt trong ống 1,5 mL với ethanol tuyệt đối để phân tích PCR thêm để xác nhận sự hiện diện của vi khuẩn và WSSV. Một mảnh khác được ngâm trên dung dịch Davidson để phân tích mô học. Theo Gracia-Valenzuela và cộng sự, để cấy vi khuẩn vào tôm khỏe mạnh nếu kết quả chẩn đoán PCR dương tính, mảnh thứ ba được chuyển vào dung dịch bảo vệ lạnh (50% glycerol). (2011). Các mẫu trong cồn và glycerol được bảo quản ở -20 ° C, và các mẫu Davidson được chuyển sang ethanol 70% để phân tích mô học. Để xác nhận tình trạng nhiễm vi khuẩn, DNA được phân lập từ gan tụy đã mổ xẻ trước đó bằng cách sử dụng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc định lượng DNA và xác minh tỷ lệ A260 / A280 được thực hiện trong máy quang phổ NanoDrop 1000. Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng hạt PCR Ready-To-Go của Illustra PuRe Taq (GE Healthcare). Theo kết quả định lượng DNA, phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng 1 µL DNA nếu nồng độ lớn hơn 100 ng µL-1 và 2 µL nếu nồng độ DNA thấp hơn 100 ng µL-1. Một µL các oligonucleotide được mô tả bởi Loy và cộng sự. (1996) để chẩn đoán bênh đốm đen – NHPB (pf-1: 5′-ACGTTGGAGGT TCGTCCTTCAG-3 ‘và pr-1: 5′-TCACCCCCTTGC TTCTCATTGT-3’) đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Điều kiện chu kỳ nhiệt được mô tả bởi Loy và cộng sự. (1996).

Do vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao ở các trang trại nuôi tôm ở tây bắc Mexico, một phân tích PCR cũng đã được tiến hành để loại trừ các mẫu xét nghiệm dương tính với vi rút. Những phân tử WSSVVP28-F1: 5’-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3 ’và WSSVVP28-R1: 5’-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3’ được báo cáo bởi Ramos-Paredes và cộng sự. (2012) đã được sử dụng, cũng như các điều kiện chu kỳ nhiệt theo khuyến nghị của các tác giả này. Đối chứng âm tính không có DNA được sử dụng trong mọi trường hợp. Do vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao ở các trang trại nuôi tôm ở tây bắc Mexico, một phân tích PCR cũng đã được tiến hành để loại trừ các mẫu xét nghiệm dương tính với vi rút. Những phân tử WSSVVP28-F1: 5’-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3 ’và WSSVVP28-R1: 5’-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3’ được báo cáo bởi Ramos-Paredes và cộng sự. (2012) đã được sử dụng, cũng như các điều kiện chu kỳ nhiệt theo khuyến nghị của các tác giả này. Đối chứng âm tính không có DNA được sử dụng trong mọi trường hợp.

Kích hoạt lại chất cấy bênh đốm đen – NHPB

Mười con tôm sống từ quá trình nuôi thử nghiệm tại các cơ sở của Universidad de Sonora ở Bahía de Kino, Sonora, đã được vận chuyển đến phòng thí nghiệm nội địa của chúng tôi.

Các mẫu vật này được đặt trong một bể chứa 15 L nước biển đã lọc và được cho ăn thức ăn tôm thương phẩm hai lần mỗi ngày trong 5 ngày. Sau đó, không có thức ăn nào được cung cấp sau đó trong 24 giờ để làm sạch ruột và sau đó sinh vật bị ép ăn gan tụy đã được đánh bắt từ tôm âm tính với NHPB / WSSV từ ngân hàng mô được lưu trữ được đề cập ở trên, sử dụng một ống thông thích nghi với microipette 20-100 µL , và quy trình này được lặp lại mỗi ngày thứ ba trong ba lần. Sau 30 ngày, toàn bộ gan tụy được mổ xẻ, hầu hết được bảo quản trong glycerol và một phần nhỏ được sử dụng để tách chiết DNA và phân tích bằng PCR tìm kiếm sự hiện diện của NHPB theo phương pháp mô tả ở trên. Các sinh vật xét nghiệm NHPB dương tính tham gia vào ngân hàng mô bị nhiễm bệnh để tiến hành xử lý nhiễm trùng và xử lý thử nghiệm sinh học bằng nano bạc.

Xét nghiệm sinh học nhiễm NHPB

Sau một tuần kể từ khi chủng NHPB được kích hoạt lại, một trăm chín mươi con tôm sống nặng 6 g từ các cơ sở của chúng tôi tại Bahía de Kino, Sonora, đã được vận chuyển đến các cơ sở nội địa của chúng tôi. Số lượng tôm này được xem xét vì khả năng tử vong do xử lý, căng thẳng, ăn thịt đồng loại hoặc bệnh tật, và do đó, đảm bảo có đủ số lượng tôm sống sót để thực hiện xét nghiệm sinh học. Để đánh giá rằng những con tôm đó không nhiễm cả NHPB và WSSV, 11 con tôm được chọn ngẫu nhiên và phân tích bằng PCR sử dụng DNA chiết xuất từ ​​một con tôm thẻ, với phương pháp đã được mô tả trước đó. Tất cả tôm được chuyển vào 16 bể nuôi (10 đến 12 con mỗi bể) chứa 40 L nước biển đã được lọc và khử trùng bằng tia cực tím và duy trì ở 28-29 ° C. Tôm được theo dõi trong ba tháng với sục khí liên tục và thức ăn công nghiệp dạng viên, được cung cấp hai lần một ngày với liều lượng 5% sinh khối của chúng. Vào thời điểm đó, một số con tôm bị chết vì một số con bị ăn thịt đồng loại hoặc do chúng nhảy ra khỏi bể nuôi, nhưng không có con nào bị bệnh. Thay nước 80% được thực hiện 3-4 ngày một lần bằng nước biển đã được lọc và khử trùng bằng tia cực tím. Một trăm hai mươi con tôm được đề cập trong đoạn trên, nặng 16 g, đã bị nhiễm NHPB do cho ăn bắt buộc bằng cách sử dụng chất lây nhiễm thu được trước đó. Để đảm bảo sự lây nhiễm và giai đoạn tiến triển của bệnh, tôm được duy trì trong thời gian 50 ngày. Điều này được thực hiện bởi vì, trong các thử nghiệm nhân giống trước đây, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh trên tôm được quan sát thấy sau 50 ngày. Xử lý đối chứng bao gồm tôm không bị nhiễm bệnh. Để phát hiện nhiễm NHPB ở tôm, phân được thu thập hàng ngày. Để làm như vậy, tôm của mỗi bể nuôi được đặt trong lưới hình trụ và để khoảng 30 – 40 phút để có thời gian lắng đọng phân. Phân được bảo quản trong các ống 1,5 mL với> 95% ethanol. Sau khi nhiễm NHPB ở tất cả tôm, chúng tôi tiến hành áp dụng các phương pháp điều trị dựa trên nano bạc.

Phương pháp điều trị bằng AgNPs

Từ những con tôm bị nhiễm bệnh, 45 con được chọn và ba nhóm được thành lập, với ba bể nuôi mỗi nhóm (n = 5), đối với các nghiệm thức AgNPs được giải thích như sau. AgNPs tổng hợp với A. indica được sử dụng trong hai nghiệm thức khác nhau, 5 µg và 35 µg AgNPs trong dung dịch nước, và được sử dụng bằng thức ăn cưỡng bức cho 15 con tôm trong mỗi nghiệm thức, phân bổ cho 5 con tôm trong mỗi bể nuôi. Điều này được quyết định bởi nồng độ cực đoan được sử dụng bởi Vaseeharan et al. (2010) chống lại Vibrio harveyi. Nhóm thứ ba của tôm bị nhiễm bệnh được cấy bằng dung dịch nước không có hạt nano. Nhóm thứ tư gồm 15 con tôm không bị nhiễm bệnh mà không có hạt nano vẫn là nhóm đối chứng. Một con tôm trong mỗi bể (ba con mỗi lần xử lý) ở ngày 12 và 24 được thu thập, và được hy sinh bằng cách hạ thân nhiệt để giảm sự trao đổi chất của nó, và được xử lý ngay lập tức. Các phần cephalothorax (dày 3-5 mm) từ các sinh vật được lấy mẫu được đặt trong băng cassette để kiểm tra mô học trong dung dịch Davidson. Một phần nhỏ của gan tụy được lấy và đặt vào các ống 1,5 mL với> 95% ethanol để phân tích PCR như đã giải thích ở trên. Nhiễm trùng mô gan tụy được đánh giá bằng mô học, dựa trên Lightner & Pantoja (2003) và Del Río-Rodríguez et al. (2006).

Xác định các chất chuyển hóa ở gan tụy Glucose ở gan tụy, tổng số protein, glycogen, tổng số lipid, acylglycerid và sterol được chiết xuất và đo theo Sánchez-Paz et al. (2007) trong đầu đọc vi tấm Synergy (BioTek Instrumets), sử dụng bộ dụng cụ thương mại (Phòng thí nghiệm Randox). Một cách ngắn gọn, một phần gan tụy đã cân được tẩm ướp với một thể tích đệm A (100 mM đệm kali photphat, pH 7,2 và 1,0 mM EDTA, 10 µM PMSF) và một thể tích cloroform-metanol-nước (2: 2: 1) và ly tâm ở 15.000 × g trong 15 phút. Pha nước được sử dụng để định lượng mức glucose, tổng số protein và glycogen. Xác định glycogen được thực hiện bằng cách thủy phân và được đo dưới dạng glucose theo Passonneau & Lauderdale (1974). Pha dung môi có chứa cloroform được thu thập và làm khô trong không khí trong 12 giờ trong bóng tối hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (25 ° C), sau đó được đồng nhất với nước cất và được sử dụng để định lượng tổng số lipid, acylglycerid và sterol. Dữ liệu về chất chuyển hóa, được biểu thị bằng mg g-1 của gan tụy, được phân tích thống kê bởi KruskalWallis phân tích phương sai một chiều với thử nghiệm so sánh nhiều lần của Dunn dưới dạng phân tích hậu kỳ bằng SigmaPlot v.12.0.

CÁC KẾT QUẢ VỀ NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ NANO BẠC

Đặc tính của các hạt nano AgNPs

Dung dịch phản ứng của Azadirachta indica khi tiếp xúc với AgNO3 cho thấy một đỉnh hấp thụ duy nhất ở 440 nm, trong khi dung dịch phản ứng của Camelia sinensis cho thấy một đỉnh hấp thụ nhỏ ở 390 nm và một đỉnh rõ rệt hơn ở 440 nm. Dung dịch đối chứng của AgNO3 không có đỉnh hấp thụ trong cả hai trường hợp. Nano bạc được tổng hợp bằng A. indica cho thấy cả hình bán cầu đa diện và hình dẹt sau 120 phút thời gian phản ứng. Kích thước AgNPs nằm trong khoảng từ 5 đến 45 nm với mức trung bình là 14,84 ± 5,81 nm. 84,65% hạt nano được tìm thấy trong khoảng từ 5 đến 21 nm với trung bình là 13,01 ± 3,71 nm. AgNPs thu được từ A. indica là đơn phân tán do tỷ lệ cao các hạt nano trong cùng loại kích thước (Hình 1a), và đây là tiêu chí để sử dụng nó trong xét nghiệm sinh học xử lý. Mặt khác, đối với C. sinensis, sau 120 phút thời gian phản ứng, các hình dạng đa diện, hình bán cầu, hình dẹt và một số dạng dây nano đã được quan sát thấy. Dải kích thước nằm trong khoảng từ 7,4 đến 68,8 nm với trung bình là 29,67 ± 14,17 nm, 29% là từ 13,1 đến 20,8 nm với trung bình là 16,60 ± 2,02 nm và 20% là từ 37,05 đến 44,03 nm với trung bình là 40,56 ± 1,88 nm (Hình 1b). Đây là lý do đủ để loại bỏ các hạt nano này khỏi các xét nghiệm sinh học.

Phát hiện mầm bệnh

Các sinh vật từ trang trại A chỉ ra rằng 17% dương tính với NHPB, 23% dương tính với WSSV, 3% với cả hai bệnh nhiễm trùng và 57% không có mầm bệnh này.

Hơn nữa, các mẫu từ trang trại B cho thấy 63% bị nhiễm WSSV, 3% có biểu hiện nhiễm kép và trong 33% mẫu không phát hiện thấy sự hiện diện của các mầm bệnh này. Chuỗi NHPB cho thấy sự đồng nhất 100% với chuỗi NHPB U65509 của GenBank và được đăng ký thêm với số gia nhập KM305771.

Thử nghiệm Thử nghiệm sinh học về Nhiễm trùng NHPB Thực nghiệm, tôm nhiễm NHPB có các dấu hiệu lâm sàng điển hình của bệnh như bộ xương ngoài mềm, gan tụy giảm, bơi lội thất thường và lờ đờ (Vincent và cộng sự, 2004). Ngoài ra, kết quả này cho thấy rằng mỗi con tôm tiếp xúc với nhiễm trùng vật liệu đã được lây nhiễm thành công vì 100% các xét nghiệm chẩn đoán cho kết quả dương tính (Hình 2).

Đáng chú ý là tỷ lệ chết của tôm nhiễm NHPB được xử lý với 35 μg AgNPs là 0%, trong khi tôm được xử lý với 5 μg AgNPs có tỷ lệ chết là 40% vào cuối thí nghiệm. Các sinh vật không có hạt nano, nhưng bị nhiễm bệnh cho thấy tỷ lệ tử vong là 41%. Sau 12 ngày điều trị, nhiều nốt vi khuẩn đã được quan sát thấy trong mô gan tụy ở tôm với 5 µg AgNPs và các ống này hơi co lại và có các nốt vi khuẩn (Hình 3a). Sau 24 ngày, gan tụy phì đại nghiêm trọng và các nốt vi khuẩn được quan sát thấy trong mô biểu mô của ống gan tụy (Hình 3b). Trong điều trị 35 µg AgNPs, và sau 12 và 24 ngày điều trị, gan tụy của tôm có dấu hiệu bị nhiễm trùng với gan tụy bị tổn thương và biểu mô bị hút chân không nghiêm trọng (Hình 3c-3d). Mô gan tụy của tôm bị nhiễm bệnh nhưng không có nano bạc cho thấy mức độ nhiễm nặng rõ rệt kể từ mẫu đầu tiên ở ngày thứ 12, với nhiều nốt vi khuẩn và ống gan tụy bị teo nghiêm trọng (Hình 3e).

Các chất chuyển hóa qua gan tụy

Phân tích thống kê của các thành phần sinh hóa được phân tích ở 12 và 24 ngày thử thách vi khuẩn, cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về tổng số protein (P = 0,225), acylglycerid (P = 0,174), tổng số lipid (P = 0,166), glucose (P = 0,225

) và glycogen (P = 0,270). Tuy nhiên, có sự khác biệt về nồng độ sterol (P = 0,017), với giá trị cao hơn ở tôm nhiễm bệnh không nhận AgNPs (Hình 4).

THẢO LUẬN

Các hạt nano bạc từ chiết xuất trà xanh và lá neem đã được tổng hợp thành công một cách nhanh chóng, thiết thực và kinh tế so với các kỹ thuật hóa học và vật lý khác (Poole & Owens, 2007; Guzmán và cộng sự, 2009). Tuy nhiên, sự khác biệt về hình dạng và độ phân tán của các phân tử nano so với Vaseeharan et al. (2010) và Gavhane et al. (2012). Chiết xuất trà xanh, như một chất khử, cho thấy hai đỉnh trong phổ hấp thụ, cho thấy sự gia tăng polydispersit (Hsu & Wu, 2010; Kamal et al., 2010), được xác nhận trong kính hiển vi điện tử truyền qua, nơi kích thước của nano bạc được phân tán rộng rãi. Trong nghiên cứu này, người ta đã quan sát thấy các hình dạng khác nhau của các hạt nano, và mặc dù chưa xác định rõ liệu hoạt tính kháng khuẩn có phụ thuộc vào hình dạng của hạt nano hay không, nhưng có vẻ như chắc chắn hợp lý rằng tất cả các dạng được tìm thấy đều có thể dẫn đến tác dụng kháng khuẩn. Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu hơn để xác nhận rằng cả hình thức và kích thước của các hạt nano đều không phù hợp cho việc sử dụng điều trị.

Kết quả mô học của tôm nhiễm NHPB phù hợp với kết quả báo cáo của Del RíoRodríguez et al. (2006). Tôm được xử lý với 5 µg AgNPs cho thấy tổn thương mô tương tự như tôm bị nhiễm bệnh không có hạt nano, cũng bị hoại tử mô cũng như sự hiện diện của nốt vi khuẩn và thâm nhiễm tế bào máu. Hơn nữa, trong khi tôm được xử lý với 35 µg AgNPs, một số tổn thương mô đã được quan sát thấy, không có vi khuẩn hoặc sự xâm nhập của tế bào máu được tìm thấy như bằng chứng của NHPB. Ngoài ra, biểu mô của các ống hơi mỏng đi và tính toàn vẹn của mô đã bị thay đổi. Điều này có thể chỉ ra rằng việc xử lý bằng AgNPs loại bỏ hoặc làm giảm đáng kể NHPB trong tế bào tôm. Trong trường hợp này, phân tích PCR dương tính cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn, có lẽ với số lượng ít, nhưng không rõ ràng khi phân tích bằng kính hiển vi, hoặc DNA vi khuẩn còn sót lại từ vi khuẩn chết vẫn còn trong tôm. Xác suất nano bạc vẫn còn trong mô là cao. Bianchini và cộng sự. (2007) báo cáo rằng ở Penaeus duorarum (Burkenroad), sự tích tụ bạc chủ yếu xảy ra ở gan tụy, sau đó là hemolymph, tuy nhiên, ở mang, cơ và mắt có rất ít sự tích tụ bạc. Có lẽ, có lợi ích lớn là bạc tích tụ trong gan tụy vì nó là cơ quan đích của NHPB (Lightner et al., 1992), vì vậy hầu hết bạc sẽ có sẵn như một chất kháng khuẩn đặc vụ. Ngoài ra, do mối quan tâm lớn về tác động của AgNPs đối với sức khỏe con người (Korani và cộng sự, 2015), và do thị trường tiêu dùng chủ yếu coi phần bụng chứ không phải cephalothorax, thực tế là cơ của tôm tích tụ ít hạt nano là một lợi thế.

Theo Vincent và cộng sự. (2004), diễn biến của bệnh NHPB chỉ ra rằng trong 20 ngày đầu tiên bệnh đang ở giai đoạn phát triển. Sau thời gian đó, bệnh chuyển sang giai đoạn cấp tính và bắt đầu tử vong, và từ 35 ngày sau khi nhiễm bệnh, giai đoạn mãn tính bắt đầu. Trong nghiên cứu hiện tại, hành vi bình thường và các dấu hiệu lâm sàng đã được quan sát thấy trên tôm cho đến trước 20 ngày, trong khi tỷ lệ chết xảy ra trong quá trình thử nghiệm. Tuy nhiên, giai đoạn mãn tính bắt đầu ở 56 ngày thử thách, sau khi kết thúc thử nghiệm của chúng tôi. Sự khác biệt này với Vincent et al. (2004) nghiên cứu cần được đánh giá, tìm kiếm các biến thể di truyền NHPB hoặc tình trạng sức khỏe miễn dịch của tôm. Sự khác biệt nhỏ về tỷ lệ tử vong giữa các nghiệm thức 0 µg và 5 µg AgNPs có thể cho thấy rằng nồng độ của các hạt nano bạc không đủ để chống lại mầm bệnh, điều này phù hợp với những phát hiện trong phân tích mô học. Hơn nữa, các sinh vật được sử dụng 35 µg AgNPs có tỷ lệ sống sót là 100%, và mặc dù kết quả phân tích phân tử là tích cực vào cuối thí nghiệm, mô hầu như được phục hồi về mặt giải phẫu khi so sánh với các mẫu đầu tiên. Morales Covarrubias et al. (2012) đã thử nghiệm florfenicol và oxytetracycline trên tôm bị nhiễm NHPB, và quan sát thấy tỷ lệ sống từ 56 đến 83%, với dư lượng kháng sinh lên đến 10 ngày trong cơ tôm. Điều quan trọng cần lưu ý là việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản liên quan đến việc sinh ra vi khuẩn đề kháng. Vi khuẩn có thể chịu được nồng độ bạc nhất định và giảm chúng để tạo thành các tinh thể nano trong không gian ngoại chất như một biện pháp bảo vệ (Klaus-Joerger et al., 2001). Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn gây bệnh không chống lại được AgNPs (Parameswari và cộng sự, 2010; Saxena và cộng sự, 2010; Vaseeharan và cộng sự, 2010). Hơn nữa, người ta nhận thấy rằng các sinh vật kháng kháng sinh, so với không kháng, đều nhạy cảm với AgNPs như nhau. Ví dụ, Lara et al. (2010) phát hiện ra rằng các chủng Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) kháng kháng sinh nhạy cảm với nano bạc.

Việc áp dụng các nano bạc được tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất từ ​​trà bao gồm các nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có so với các chất khử khác. Điều này có nghĩa là giảm đáng kể chi phí cũng như áp dụng các phương pháp luận đơn giản. Ngoài ra, lợi nhuận của việc áp dụng các hạt nano được tổng hợp theo cách thân thiện với môi trường và khối lượng liều lượng thấp có thể là một ứng cử viên tuyệt vời như một chất kháng khuẩn trong một số ngành nuôi tôm, ví dụ như trong việc duy trì đàn tôm bố mẹ. Mặc dù người ta thấy rằng các hạt nano có tác dụng kháng khuẩn chống lại vi khuẩn nội bào gây ra NHPB, nhưng cần phải hiểu cơ chế hoạt động của các hạt nano này chống lại các vi khuẩn này. Việc không có sự khác biệt thống kê trong năm thành phần sinh hóa được phân tích cho thấy không có đủ bằng chứng để chứng minh rằng mức độ của các thành phần đó bị ảnh hưởng bởi tác động của nhiễm trùng và nồng độ khác nhau của các hạt nano ở tôm bị nhiễm bệnh và khỏe mạnh. Các nghiên cứu trong tương lai nên tính đến cỡ mẫu lớn hơn để tránh các giá trị phân tán lớn như quan sát được trong phân tích các chất chuyển hóa, vì các giá trị phân tán cao che lấp bất kỳ sự khác biệt nào có thể tồn tại. Điều quan trọng nữa là phải thử nghiệm phạm vi rộng hơn về nồng độ của các hạt nano và kiểm tra tính khả thi trong việc ứng dụng các hạt nano trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản lớn, có thể bổ sung các hạt nano làm phụ gia thực phẩm. Gần đây đã chỉ ra tác dụng bất lợi của AgNP đối với quần thể sinh vật ven biển (Burić và cộng sự, 2015; Degger và cộng sự, 2015; Gambardella và cộng sự, 2015; Rocha và cộng sự, 2015), nhưng may mắn thay Juárez-Moreno và cộng sự. (2017) đã chứng minh rằng nano bạc ở liều điều trị không gây độc và không ảnh hưởng đến tỷ lệ trao đổi chất hoặc tổng số lượng tế bào máu ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus con non. Tuy nhiên, do có nhiều kim loại và kim loại được sử dụng làm hạt nano, điều quan trọng là phải nghiên cứu tác động của việc sử dụng chúng đối với các loài nuôi trồng thủy sản, sức khỏe con người và môi trường ven biển, để thực hiện các chiến lược trong tương lai nhằm phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững và có trách nhiệm.

Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây

Nguồn tham khảo: Antibacterial effect of biosynthesized silver nanoparticles in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone) infected with necrotizing hepatopancreatitis bacterium (NHP-B)

Martín Rodrigo Acedo-Valdez, José Manuel Grijalva-Chon, Eduardo Larios-Rodríguez, Amir Darío Maldonado-Arce, Fernando Mendoza-Cano, José Arturo Sánchez-Paz & Reina Castro-Longoria, Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Ingeniería Química y Metalurgia, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Física, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Laboratorio de Referencia, Análisis y Diagnóstico en Sanidad Acuícola, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C., Hermosillo, Sonora, México