Nano bạc kết hợp kháng sinh diệt vi khuẩn đa kháng thuốc Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii đề kháng với kháng sinh carbapenem là một thách thức lâm sàng nghiêm trọng. Là một công nghệ mới được phát triển, các hạt nano bạc (AgNPs) thể hiện một số đặc điểm tuyệt vời so với các phương pháp điều trị cũ và là một ứng cử viên để chống lại sự lây nhiễm A. baumannii . Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của nó vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp AgNPs với kháng sinh để điều trị A. baumannii kháng carbapenem (aba1604). Kết quả của chúng tôi cho thấy các AgNP đơn lẻ ức chế hoàn toàn A. baumannii tăng trưởng ở 2,5 µg / mL. Điều trị bằng AgNP cũng cho thấy tác dụng hiệp đồng với kháng sinh polymixin B và rifampicin, và tác dụng phụ với tigecyline. In vivo, chúng tôi nhận thấy rằng sự kết hợp AgNPs-kháng sinh dẫn đến tỷ lệ sống sót tốt hơn trong các mô hình viêm phúc mạc chuột nhiễm A. baumannii so với điều trị bằng thuốc đơn lẻ. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng các chủng Escherichia coli nhắm mục tiêu RNA đối kháng khác nhau để làm sáng tỏ cơ chế hiệp đồng liên quan đến phản ứng của vi khuẩn với AgNP và kháng sinh.

(Bản quyền  thuộc NanoCMM Technology)

Giới thiệu

Acinetobacter baumannii kháng thuốc là một mầm bệnh truyền nhiễm hiện đang có những thách thức lâm sàng nghiêm trọng. A. baumannii đặc biệt liên quan đến các bệnh nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện như viêm phổi, đường máu, ổ bụng, hệ thần kinh trung ương, đường tiết niệu và nhiễm trùng da và mô mềm. ¹ A. baumannii có thể phát triển khả năng kháng thuốc kháng sinh thông qua một số cơ chế; ² nói riêng, vi khuẩn này thường đề kháng với các carbapenem. ³ Số lượng các chủng A. baumannii kháng carbapenem ngày càng tăng đã được báo cáo trên toàn thế giới. ⁴ Phần lớn các vi khuẩn như vậy có khả năng kháng thuốc rộng rãi, có thể bao gồm kháng carbapenems và tất cả các loại kháng sinh khác ngoại trừ polymyxin và tigecycline. ⁵ Polymyxin B có hiệu quả chống lại A. baumannii kháng thuốc , nhưng sử dụng toàn thân có nguy cơ gây độc, chủ yếu là độc tính trên thận và độc tính thần kinh. ^6 , 7 Nhiễm A. baumannii thường gặp ở những bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng, và thường đi kèm với các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và / hoặc nấm khác. ⁸ Bệnh nhân nhiễm A. baumannii kháng thuốc có tỷ lệ tử vong cao. ⁹ Do đó, việc tìm ra các loại thuốc điều trị thích hợp để điều trị bệnh khángNhiễm trùng A. baumannii .

Sự kém hiệu quả của kháng sinh tổng hợp chống lại vi khuẩn kháng thuốc đã dẫn đến sự tái xuất hiện của mối quan tâm đối với bạc, vốn có lịch sử xa xưa như một chất kháng khuẩn. ^10 – 12 Hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano bạc (AgNPs) đã được báo cáo chống lại nhiều loài vi khuẩn; ví dụ, Escherichia coli ATCC 8739, ¹³ Staphylococcus aureus ATCC1431, ¹⁴ Escherichia fergusonii , và Klebsiella aerogenes ATCC 1950, ¹⁵ trong số những loại khác. AgNP được tổng hợp với các chất bảo vệ, chẳng hạn như citrat, natri dodecyl sulfat và polyvinylpyrolidone cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại S. aureus và E. coli tăng lên. ¹⁶ Huang và cộng sự đã báo cáo hoạt động kháng khuẩn chống lại A. baumannii với sự kết hợp hiệp đồng của chitosan acetate và AgNPs. ¹⁷ Jain và cộng sự đã nghiên cứu sự tương tác của AgNPs với kháng sinh thường dùng ở Pseudomonas aeruginosa , ¹⁵ trong khi Morones-Ramirez và cộng sự đã chứng minh rằng vi khuẩn Gram âm được điều trị bằng Ag ^{+ đã} nhạy cảm với vancomycin kháng sinh đặc hiệu Gram dương, cả in vitro và in vivo . ¹⁸ Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn hiệp đồng của kháng sinh kết hợp với nano bạc chứa citrate vẫn chưa được nghiên cứu.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát tác dụng phối hợp hiệp đồng của kháng sinh với nano bạc chống lại vi khuẩn A. baumannii kháng thuốc thu được từ bệnh nhân lâm sàng cả in vivo và in vitro. Chúng tôi cũng đã nghiên cứu các cơ chế có thể có của hiệu ứng hiệp đồng này.

Nguyên liệu và phương pháp

Vật liệu

Trisodium citrate, bạc nitrate (AgNO₃) và natri borohydride (NaBH₄) được sử dụng để tổng hợp AgNPs. Rifampicin, tigecyline, polymyxin B (PMB), mucin, dimethyl sulfoxide, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), isopropyl-β- D-thiogalactoside, penicillin – streptomycin và trypsin – ethylenediaminetetraacetic acid được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA). Các ô A549 và ô HL-7702 được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Loại của Viện Khoa học Trung Quốc (Thượng Hải, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa). Môi trường Roswell Park Memorial Institute-1640 được mua từ Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) và huyết thanh bò thai được mua từ HyClone (Logan, UT, USA). Không cần sự chấp thuận của ủy ban đạo đức đối với bộ thí nghiệm này vì thí nghiệm được thực hiện trên các dòng tế bào có bán trên thị trường và được coi là miễn đánh giá đầy đủ bởi ủy ban đạo đức tại Đại học Giao thông Thượng Hải.

Tất cả các quy trình động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Tổ chức tại Đại học Giao thông Thượng Hải. Tất cả các nghiên cứu trên động vật được thực hiện theo Nguyên tắc Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm theo Quy định của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa về Quản lý Động vật Phòng thí nghiệm. Tất cả các thủ tục động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Động vật của Đại học Giao thông Thượng Hải. Chuột C57BL / 6 được mua từ Slac Laboratory Animal Co., Ltd. (Thượng Hải, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa).

Tổng hợp và mô tả đặc điểm của AgNPs

Trong một bình cầu có đáy tròn ba cổ, 20 mL trinatri citrat (1%) và 75 mL nước siêu tinh khiết được trộn trong 15 phút ở 70 ° C. Thêm vào dung dịch 1,5 mL dung dịch bạc nitrat (1%); NaBH ₄ (1%) sau đó được thêm vào, sau đó trộn nhanh. Dung dịch hỗn hợp này được đun nóng trong 60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm nước đến thể tích 100 mL.

Để mô tả hình thái của các AgNP được tổng hợp, phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được thực hiện bằng thiết bị TEM Tecnai G2 Spirit 120 kV (độ phân giải 0,23 nm) (Công ty FEI, Hillsboro, OR, Hoa Kỳ).

AgNP còn được đặc trưng bằng cách quét quang phổ hấp thụ trong dải bước sóng 300–500 nm bằng máy phân tích vi bước sóng đầy đủ đa chức năng (BioTek Co., Winooski, VT, USA).

Một thiết bị Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Louis, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để mô tả tiềm năng zeta của các hạt nano trong dung dịch. Dữ liệu được thu thập và phân tích bằng phần mềm Zetasizer (Malvern, Louis, Hoa Kỳ).

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ ức chế phân đoạn

Chủng vi khuẩn A. baumannii (aba 1604; Bệnh viện Hoa Sơn Đại học Phúc Đán, Thượng Hải, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa) được sử dụng làm chủng thử nghiệm mô hình để xác định hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc . Các nồng độ khác nhau của AgNP được ủ với vi khuẩn 4 × 10⁵ trong môi trường canh trường Luria Bertani (LB) trong các đĩa đáy tròn 96 giếng. Vi khuẩn được thu hoạch tại các thời điểm đã chỉ định và mật độ quang học của các mẫu được thử nghiệm ở bước sóng 600 nm. Tất cả các mẫu đều được mạ ba lần và các giá trị được tính trung bình từ ba lần thử nghiệm độc lập. A. baumannii khángchủng (aba1604) được tạo ra từ các bệnh nhân lâm sàng và tuân theo các hướng dẫn đạo đức thể chế đã được xem xét và phê duyệt bởi ủy ban đạo đức tại ủy ban đạo đức lâm sàng bệnh viện Huashan, Đại học Fudan. Trung tâm Dược phẩm Sinh học R & D Thượng Hải Laiya, nơi đã thu thập các chủng vi khuẩn này để nghiên cứu thuốc kháng khuẩn và thu thập các mẫu này là không cần thiết vì việc thu thập mẫu là một phần của chăm sóc bệnh nhân thông thường.

Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc kết hợp với kháng sinh, một xét nghiệm pha loãng vi mô hai chiều đã được sử dụng. ¹⁹ Thử nghiệm được thực hiện trong môi trường nuôi cấy LB. Lần đầu tiên ước tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với từng loại kháng sinh và nồng độ ức chế phân đoạn (FIC) của sự kết hợp giữa kháng sinh và AgNP sau đó được xác định bằng phương pháp vi mô bàn cờ trong đĩa vi tinh 96 giếng. Thuốc kháng sinh và nano bạc được pha loãng đến các nồng độ sau (2MIC, 1MIC, 1 / 2MIC, 1 / 4 MIC, 1 / 8 MIC, 1 / 16 MIC và 1 / 32 MIC) trong thử nghiệm pha loãng vi mô hai chiều.

Các đĩa này được ủ ở 37 ° C trong 18 giờ, và kết quả được kiểm tra bằng cách đo mật độ quang học (OD) ₆₀₀ . Tác dụng kháng sinh kết hợp của tác nhân A và B (trong đó A là AgNO ₃ hoặc AgNPs và B là một trong ba tác nhân kháng sinh) được tính như sau:

Các giá trị chỉ số FIC trên 4,0 cho biết các hiệu ứng đối kháng, các giá trị từ 0,5 đến 4,0 cho biết các hiệu ứng cộng thêm và các giá trị thấp hơn 0,5 cho biết các hiệu ứng hiệp đồng

Thử nghiệm độc tính tế bào

Để xác định hoạt tính gây độc tế bào của nano bạc trên tế bào động vật có vú, tế bào A549 và tế bào HL-7702 (1 × 10 ⁴ tế bào / mL) được nuôi trong môi trường Roswell Park Memorial Institute-1640 chứa 5% huyết thanh bò thai trong đĩa 96 giếng. ở 37 ° C trong môi trường có 5% CO ₂ trong 24 giờ. Tế bào được xử lý bằng AgNPs, AgNO ₃ , hoặc dung dịch đối chứng ở nồng độ từ 0,625 đến 10 μg / mL trong 24 giờ nữa. Để xác định khả năng sống sót, MTT (ở nồng độ 0,1 mg / mL) được thêm vào giếng và ủ trong 4 giờ ở 37 ° C và 5% CO ₂ để cho phép tế bào phát triển. ²¹Trong các tế bào hoạt động chuyển hóa, MTT bị khử thành formazan không hòa tan, màu tím sẫm. Formazan màu tím sau đó được hòa tan trong đimetyl sulfoxit. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm bằng máy phân tích vi tấm bước sóng đầy đủ đa chức năng và các số đọc được so sánh từ các tế bào không được xử lý. Các giá trị OD được sử dụng để sắp xếp phần trăm ô khả thi bằng cách sử dụng công thức sau:

Thử nghiệm cho hoạt động kháng khuẩn in vivo

Liều gây chết tối thiểu của AgNO ₃ hoặc nano bạc ở chuột

Chuột đực C57BL / 6 sáu tuần tuổi (trọng lượng cơ thể ~ 20 g) được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm trên động vật. Chuột được nuôi trong một môi trường được kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm, và được tiếp cận miễn phí với thức ăn và nước uống. Mười con chuột mỗi nhóm được tiêm vào phúc mạc với tổng thể tích 100 μL. Chuột được xử lý như sau: không xử lý, và 10, 20, 40 và 80 mg / kg AgNPs và AgNO₃. Các con vật được tiêm được quan sát trong 3 ngày.

Xác định liều gây chết tối thiểu của A. baumannii đối với mô hình chuột bị viêm phúc mạc

Các dung dịch pha loãng A. baumannii nối tiếp từ 1 × 10⁷ đến 1 × 10¹¹ CFU, trong 500 μL nước muối vô trùng có bổ sung 8% mucin, được tiêm vào khoang phúc mạc của chuột. ¹⁸ con vật được quan sát trong 2 ngày để xác định tỷ lệ sống sót.

Thử nghiệm sống sót

Chuột được tiêm vào màng bụng liều gây chết tối thiểu (MLD) A. baumannii , với tổng thể tích là 500 μL với 8% mucin. Sau 1 giờ, mười con chuột trong mỗi nhóm được tiêm vào màng bụng 100 μL dung dịch muối đệm phosphat xe (PBS) hoặc một trong các phương pháp điều trị kháng khuẩn khác nhau. Chuột được quan sát trong 2 ngày để đánh giá tỷ lệ sống.

Các xét nghiệm về sự xâm nhập của vi khuẩn

Những con chuột sống sót được mổ và mổ xác, đồng thời thu thập thận và phổi của chúng. Các cơ quan này được nghiền trong điều kiện vô trùng, và các chất đồng nhất được hòa tan trong nước muối khử trùng. Các đồng nhất nội tạng này sau đó được nuôi cấy trên các đĩa LB ở 37 ° C trong 24 giờ.

Hồ sơ Cytokine

Nồng độ cytokine trong huyết tương chuột được đo vào thời điểm chỉ định sau khi nhiễm bệnh bằng bộ dụng cụ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym tiêu chuẩn theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Elabscience Biotechnology Co., Ltd, Vũ Hán, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa).

Mô hình Antisense RNA để phát hiện cơ chế hiệp đồng của AgNP và sự kết hợp kháng sinh

Để điều tra các con đường liên quan đến phản ứng của vi khuẩn với nano bạc , chúng tôi đã tiến hành một loạt các thí nghiệm, trong đó kiểm tra tác động của AgNPs và AgNO₃ lên các chủng làm câm gen khác nhau do vi khuẩn E. coli gây ra ARN. ^22 – 24 Các chủng gen khác nhau được làm im lặng được sắp xếp trong các đĩa vi sóng, và sau đó được sàng lọc để xác định mức độ nhạy cảm của chúng với từng công thức Ag khác nhau so với chủng bố mẹ. Các chủng E. coli làm giảm gen được xử lý bằng isopropyl-β- D -thiogalactoside ở nồng độ thích hợp ( Bảng 1 ), và các phần nuôi cấy được chuyển vào đĩa 96 giếng. Nồng độ dung dịch pha loãng của nano bạc , AgNO₃ , rifampicin, tigecyline, và PMB đã được thêm vào vi khuẩn làm im lặng gen trong các đĩa 96 giếng. Cuối cùng, các đĩa được ủ ở 37 ° C trong 16 giờ và lắc ở tốc độ 80 vòng / phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 600 nm bằng máy phân tích vi phiến bước sóng đầy đủ đa chức năng và các giá trị OD được sử dụng để tính toán tỷ lệ ức chế (I) bằng cách sử dụng công thức sau:

Phân tích thống kê

Mỗi thử nghiệm được lặp lại ba lần. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn, trừ khi có ghi chú khác. So sánh giữa nhiều nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) và tất cả các phân tích được thực hiện bằng phần mềm thống kê SPSS 21.0 (21.0; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Ngưỡng ý nghĩa thống kê được đặt ở P <0,05.

Kết quả

Đặc tính của nano bạc

Dựa trên hình ảnh trong Hình 1A , các AgNP được ổn định bởi citrate có độ phân tán tốt. Sự phân bố kích thước hạt được thể hiện bằng cách đếm số lượng hạt AgNPs dựa trên ảnh TEM và biểu đồ phân bố kích thước hạt trong Hình 1B . AgNPs có đường kính 5-12 nm, với kích thước trung bình là 8,4 nm. Các hạt nano ổn định trong hơn 6 tháng, ngay cả ở 37 ° C. Thế zeta của các AgNP được tổng hợp được tóm tắt trong Hình 1C . Phổ tử ngoại nhìn thấy được (UV – vis) của các mẫu dung dịch được báo cáo trong Hình 1D. Một đỉnh mạnh duy nhất đã được quan sát ở bước sóng 392 nm, cho thấy sự tổng hợp của các hạt nano hình cầu. Trong thực tế, sự phân tán ổn định nếu điện thế zeta cao hơn 30 mV hoặc nhỏ hơn −30 mV. Ủng hộ tuyên bố trước đó, chúng tôi quan sát thấy rằng AgNPs phân tán trong nước rất ổn định với giá trị thế zeta là -44,5 mV.

Hình 1 Hình thức bên ngoài và các đặc điểm hóa lý của AgNPs. Ghi chú: ( A ) TEM của AgNPs. ( B ) Sự phân bố kích thước của AgNPs dựa trên ảnh TEM. ( C ) Phân tích thế Zeta của AgNPs. ( D ) Quang phổ hấp thụ nhìn thấy UV cho thấy độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 392 nm đối với AgNP.

Hoạt động kháng khuẩn của các phương pháp điều trị kết hợp nano bạc

Liệu pháp kháng sinh kết hợp là một chiến lược thường được áp dụng trong điều trị A. baumannii đa kháng thuốc (MDR) . Bởi vì PMB, rifampicin, và tigecycline đều thường được sử dụng chống lại MDR A. baumannii trong sự kết hợp với các kháng sinh khác, ^25 – 27 , chúng tôi chọn ba loại thuốc kháng sinh để đánh giá tác động tổ hợp tiềm năng với nano bạc . Người ta thấy rằng AgNPs thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với A. baumannii , với MIC khoảng 2,5 μg/mL, tương tự như của AgNO₃ . MIC của thuốc điển hình, được tóm tắt trong Bảng 2 , là 0,25 μg/mL đối với PMB, 3,12 μg/mL đối với rifampicin và 3,12 μg/mL đối với tigecycline.

Bảng 2 Chỉ số FIC của sự kết hợp giữa bạc và kháng sinh chống lại Acinetobacter baumannii. Lưu ý: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD, trừ khi có quy định khác.

FIC của AgNPs và các kết hợp kháng sinh khác nhau đã được nghiên cứu và được tóm tắt trong Bảng 2 . Các thí nghiệm này cho thấy PMB và rifampicin tác dụng hiệp đồng ( P <0,5) với AgNPs và AgNO₃ , trong khi tigecycline không thể hiện sự hiệp lực ( P > 0,5) với AgNPs hoặc AgNO₃

Độc tính tế bào của nano bạc in vitro

Nhiều cuộc điều tra đã báo cáo về tác dụng ức chế của AgNPs đối với tế bào. Ví dụ, Beer và cộng sự nhận thấy rằng AgNPs ức chế sự tăng sinh của tế bào A549 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, ²⁸ trong khi Foldbjerg và cộng sự báo cáo rằng AgNPs gây ra sự gia tăng mức độ oxy phản ứng (ROS) trong tế bào A549. ²⁹ Ở đây, chúng tôi sử dụng phương pháp được mô tả bởi Foldbjerg và cộng sự để đánh giá độc tính tế bào của AgNPs. ²⁹

Như trong hình 2 , nồng độ cao của AgNO ₃ ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của tế bào. Để so sánh, việc tiếp xúc với AgNPs ở nồng độ cao hơn 10 μg / mL không biểu hiện độc tính tế bào đáng kể ở các tế bào A549 và HL-7702. Những kết quả này chứng minh rằng độc tính tế bào của AgNPs thấp hơn so với AgNO₃

Hình 2 Tỷ lệ sống tương đối của các tế bào A549 và HL-7720 tiếp xúc với AgNPs. Lưu ý: Sự sống sót tương đối của các tế bào khi bị ảnh hưởng bởi các liều lượng khác nhau AgNPs hoặc AgNO ₃ . ( A ) Kết quả xét nghiệm MTT xác nhận độc tính tế bào in vitro của AgNPs và AgNO ₃ đối với tế bào A549. ( B ) Ảnh hưởng của AgNPs hoặc AgNO ₃ lên sự phát triển của tế bào HL-7720. Kết quả được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập. * P <0,05, ** P <0,01 và *** P <0,001 so với đối chứng.

Ảnh hưởng của nano bạc đối với hoạt động kháng khuẩn in vivo

Độc tính cấp tính của AgNPs và AgNO ₃ được đo in vivo để thiết lập liều gây chết trung bình (LD ₅₀ ) ( Hình 3 ). LD ₅₀ của AgNPs được xác định là từ 20 đến 40 mg / kg, và LD ₅₀ của AgNO ₃ cũng được tìm thấy là từ 20 đến 40 mg / kg. Các giá trị LD _{50 này} đối với AgNO ₃ tương tự như các giá trị được báo cáo trong một nghiên cứu độc tính trước đó.

Hình 3 Độc tính của AgNPs và AgNO 3 ở chuột. Ghi chú: ( A ) Tỷ lệ sống sót của những con chuột được áp dụng các phương pháp điều trị sau: đối chứng, 10, 20, 40 và 80 mg / kg AgNO ₃ . ( B ) Tỷ lệ sống sót của những con chuột được áp dụng các phương pháp điều trị sau: đối chứng, 10, 20, 40, hoặc 80 mg / kg AgNPs. Các thử nghiệm sống còn được thực hiện với mười con chuột mỗi nhóm.

Sự lây nhiễm được hình thành ở chuột thông qua việc phân phối tế bào A. baumannii 5 × 10 ⁹ trong màng bụng lơ lửng trong dung dịch nước chứa 8% mucin. Trong vòng 24 giờ sau thời điểm tiêm, tất cả những con chuột bị nhiễm bệnh đã chết. Do đó, A. baumannii đã được sử dụng ở cùng nồng độ 5 × 10 ⁹ tế bào này cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.

Sự kết hợp PMB và AgNPs và sự kết hợp PMB và AgNO ₃ cho thấy cùng một tác dụng kháng sinh hiệp đồng mà chúng tôi đã quan sát trước đó trên in vivo ( Hình 4 ). Chúng tôi quan sát tình trạng sống của những con chuột trong 1 tuần, và tính toán tỷ lệ sống sót trong 2 ngày. Hỗn hợp AgNO₃ và PMB (tương ứng 3 mg / kg và 10 μg / kg) dẫn đến tỷ lệ sống là 40%. Khi một trong hai hợp chất này được sử dụng đơn lẻ dưới dạng điều trị đơn liều, tỷ lệ sống sót là 0%. Để so sánh, ngay cả một hỗn hợp liều lượng thấp của AgNPs và PMB (tương ứng là 2 mg / kg và 10 μg / kg) đã dẫn đến tỷ lệ sống cao là 60%.

Hình 4 Tỷ lệ sống sót của những con chuột được tiêm AgNPs hoặc AgNO 3 với PMB trong một mô hình nhiễm trùng viêm phúc mạc. Ghi chú: ( A ) Nồng độ điều trị PMB trong mô hình nhiễm trùng viêm phúc mạc. ( B ) Nồng độ điều trị AgNO ₃ và PMB trong mô hình nhiễm trùng viêm phúc mạc. ( C ) Mô hình nhiễm trùng viêm phúc mạc nồng độ điều trị AgNPs và PMB.

Hai ngày sau khi dùng thuốc trên chuột, chúng tôi mổ một phần chuột để làm xét nghiệm về sự xâm nhập của vi khuẩn. Hình ảnh đại diện về sự phát triển của vi khuẩn được trình bày trong Hình 5 , cho thấy rằng AgNO₃ và AgNPs đã tăng cường hoạt động của PMB chống lại A. baumannii trong mô hình nhiễm bệnh viêm phúc mạc. Hình 5A và B cho thấy có rất nhiều vi khuẩn hiện diện trong cả thận và phổi khi động vật được điều trị PMB một mình với liều 250 μg / kg. Với việc bổ sung AgNO ₃(3 mg / kg, 18 μM) hoặc AgNPs (2 mg/kg, 18 μM), không phát hiện thấy vi khuẩn trong thận hoặc phổi. Khi chúng tôi giảm liều PMB xuống 50 μg / kg, chúng tôi nhận thấy rằng các mô thận và phổi chỉ chứa một lượng nhỏ vi khuẩn. Việc giảm thêm liều PMB xuống 10 μg / kg sẽ kém hiệu quả hơn, để lại gánh nặng vi khuẩn đáng kể trong thận và phổi. Hơn nữa, chúng tôi cũng đã xét nghiệm máu và cổ trướng của những con chuột bị nhiễm bệnh và phát hiện ra rằng chúng không chứa vi khuẩn khi sử dụng kết hợp PMB (50 μg / kg) với AgNO ₃ (3 mg / kg, 18 μM) hoặc AgNPs (2 mg / kg, 18 μM) ( Hình 5C và D ). Những kết quả này không chỉ cho thấy rằng AgNO ₃ có thể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của thuốc kháng sinh nhưng AgNPs cũng có khả năng kháng khuẩn in vivo.

Hình 5 Gánh nặng do vi khuẩn ở chuột nhiễm Acinetobacter baumannii sau khi điều trị bằng PMB kết hợp với AgNO3 hoặc AgNPs. Ghi chú: gánh nặng do vi khuẩn ở chuột nhiễm Acinetobacter baumannii sau khi điều trị bằng PMB (250 μg / kg) (a); những con chuột bị nhiễm bệnh sau khi điều trị bằng PMB kết hợp với AgNO ₃ (3 mg / kg, 18 μM) (b1: 250 μg / kg; b2: 50 μg / kg; b3: 10 μg / kg), và với AgNPs (2 mg / kg, 18 μM) (c1 – c3). ( A ) thận; ( B ) phổi; ( C ) máu; ( D ) chất lỏng ascitic.

Để phân tích xem liệu AgNO₃ hoặc nano bạc kết hợp với kháng sinh có điều chỉnh tình trạng viêm trong quá trình nhiễm A. baumannii hay không , chúng tôi đã đánh giá các cytokine tiền viêm trong huyết tương chuột bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym. Mức độ yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và interleukin (IL) -6 giảm đáng kể trong huyết tương chuột của những con chuột được điều trị so với những con chuột mô hình lúc 18 giờ sau khi nhiễm bệnh ( Hình 6 ). AgNO ₃ và AgNPs có thể tăng cường hoạt động của PMB chống lại A. baumannii in vivo.

Hình 6 AgNO ₃ hoặc AgNPs kết hợp với phản ứng viêm do Acinetobacter baumannii điều chế bằng kháng sinh .
Ghi chú: ELISA được sử dụng để đo IL-6 ( A ) và TNF-α ( B ) trong huyết tương chuột 18 giờ sau khi nhiễm bệnh. Kết quả được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập. *** P <0,001 so với

Cơ chế tăng cường hoạt động kháng khuẩn của nano bạc kết hợp với kháng sinh

Để hiểu rõ hơn về cơ chế hỗ trợ tác động hiệp đồng của nano bạc kết hợp với kháng sinh, chúng tôi đã sử dụng chức năng làm im lặng gen do ARN phản ứng gây ra để ngăn chặn sự biểu hiện của một số gen ở E. coli ( Hình 7 ). Sự khác biệt về tỷ lệ ức chế giữa tập hợp các chủng vi khuẩn E. coli im lặng gen và chủng vi khuẩn E. coli DH5α / pHN678 đối chứng được biểu thị bằng màu sắc trong phân tích bản đồ nhiệt của chúng tôi; màu đỏ sẫm đại diện cho các chủng nhạy cảm nhất, trong khi màu xanh đậm đại diện cho các chủng ít nhạy cảm nhất, so với chủng mẹ. Chúng tôi nhận thấy rằng sự im lặng của rpoD, kdsA, kdsB, lpxC và mutL dẫn đến độ nhạy đối với cả AgNO ₃ và AgNPs. Im lặng củarpsR, rpsL, rpsA, murB, murA, leuS và dnaB chỉ dẫn đến độ nhạy với AgNO ₃ , điều này cho thấy rằng các nano bạc hoạt động ở độ chọn lọc cao hơn AgNO₃ .

Hình 7 Phân tích bản đồ nhiệt về độ nhạy cảm với AgNPs và AgNO ₃ ở các chủng Escherichia coli được khử gen so với chủng E. coli DH5α / pHN678 đối chứng.
Ghi chú: Mỗi đơn vị thể hiện sự khác biệt về tỷ lệ ức chế giữa một gen duy nhất gây ra sự im lặng của RNA đối kháng và chủng E. coli DH5α / pHN678 đối chứng. Các đơn vị màu đỏ đại diện cho các chủng nhạy cảm nhất với các hợp chất và màu xanh lam đại diện cho các chủng phát triển tương tự như chủng đối chứng E. coli DH5α / pHN678.

Ngoài ra, chủng được kháng rpoD nhạy cảm với rifampicin, trong khi sự im lặng của kdsA, kdsB và lpxC làm tăng độ nhạy đối với PMB,  ⁴² làm tăng độ nhạy của E. coli đối với AgNPs và AgNO ₃ . Hầu hết các yếu tố được điều tra thuộc họ σ70 và tất cả các vi khuẩn biểu hiện một hoặc nhiều yếu tố σ70. Trình tự yếu tố σ70 được bảo tồn cao và đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của vi khuẩn. Rifampicin có cơ chế hoạt động phân tử liên quan đến việc ức chế RNA polymerase phụ thuộc DNA. ⁴³ Ở E. coli , enzym này là một oligomer phức tạp bao gồm bốn tiểu đơn vị: α, β, β ′ và σ, được mã hóa tương ứng bằng rpoA , rpoB , rpoC, và rpoD , và sự gián đoạn của chúng cản trở quá trình phiên mã. ⁴³ Cơ chế tiềm năng của cả rifampicin và AgNP đều liên quan đến tác động lên RNA polymerase phụ thuộc DNA, đây là bằng chứng hỗ trợ tác dụng hiệp đồng của chúng ( Hình 8 ).

Hình 8 Các cơ chế đề xuất về sự kết hợp giữa AgNPs / Ag ⁺ với kháng sinh chống lại vi khuẩn G ⁺ âm tính.
Lưu ý: AgNPs / Ag ⁺ có thể tăng cường tổn thương do PMB gây ra đối với lipid màng. AgNPs / Ag ⁺ và RIF cũng có thể liên kết với protein nội bào và RNA polymerase khi xâm nhập vào tế bào.

Bạc và các hợp chất có chứa bạc gần đây đã thu hút sự quan tâm ngày càng tăng như các chất kháng khuẩn để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn.Nano bạc cho thấy sức mạnh tổng hợp của việc ức chế màng sinh học P. aeruginosa khi kết hợp với mức MIC dưới của aztreonam. ⁴⁴ Sự kết hợp của AgNP với ceftazidime cũng cho thấy sức mạnh tổng hợp để ức chế P. aeruginosa . ⁴⁵ AgNP được điều chế theo mô tả của Tiwari và cộng sự thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ chống lại chủng A. baumannii kháng carbapenem . ³ Điều này đòi hỏi một phác đồ điều trị hiệu quả và sự kết hợp rifampin với imipenem đã được đánh giá trong các trường hợp nhiễm trùng lâm sàng do A. baumannii kháng imipenem .sự căng thẳng, quá tải. ⁴⁶ Yoon và cộng sự đã chỉ ra rằng sự kết hợp của PMB với imipenem có hiệu quả như PMB với rifampin đối với một chủng A. baumannii kháng carbapenem . ²⁶ Do đó, việc điều trị bằng thuốc với các loại thuốc kháng sinh mới hơn hoặc kết hợp các chất kháng khuẩn ngày càng trở nên quan trọng để loại trừ các bệnh nhiễm trùng này. Theo nghiên cứu của chúng tôi, sự kết hợp của AgNP với kháng sinh có thể là một giải pháp hiệu quả cho vấn đề các chủng A. baumannii kháng carbapenem , có khả năng ở liều thấp hơn và ít độc hơn so với những gì hiện nay thường được sử dụng trên lâm sàng.

Các nhà điều tra trước đây đã gợi ý rằng điều trị bằng thuốc kết hợp có thể là một công cụ hiệu quả để ngăn chặn sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là đối với những bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn Gram âm đã phát triển khả năng kháng với một liệu pháp duy nhất. ⁴⁷ Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tác dụng hiệp đồng của việc kết hợp AgNPs và PMB hoặc AgNPs và rifampicin chống lại vi khuẩn A. baumannii kháng thuốc được phân lập từ các bệnh nhân lâm sàng. Xem xét độc tính thấp hơn của AgNPs so với các lựa chọn điều trị khác, các kết hợp thuốc này có tiềm năng trở thành công cụ hữu ích cho phòng khám.

Nguồn tham khảo:

Effects of silver nanoparticles in combination with antibiotics on the resistant bacteria Acinetobacter baumannii

Guoqing Wan,^1,2 Lingao Ruan,^2,3 Yu Yin,^2,3 Tian Yang,^2,3 Mei Ge,² Xiaodong Cheng^1,4

¹School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing, ²Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D, ³School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, People’s Republic of China; ⁴Department of Integrative Biology & Pharmacology, The University of Texas Health Science Center, Houston, TX, USA