Nano bạc chống lại virus gây bệnh Dịch tả lợn châu Phi

Dịch tả heo châu Phi hay còn gọi là ASF, từ lúc được phát hiện cho đến nay các nhà khoa học vẫn chưa tìm ra vacxine điều trị. Virus có khả năng tồn tại lâu trong môi trường, đường lây truyền đa dạng và rất khó kiểm soát. Gây ra những thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi. Nano bạc đã được nghiên cứu và cho thấy hiệu quả như một chất kháng virus tiềm năng để chống lại virus gây bệnh Dịch tả lợn châu Phi.

TỔNG QUAN

Virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (ASFV) là nguyên nhân gây ra một căn bệnh rất dễ lây lan và gây tử vong ở lợn nuôi, nhưng cho đến nay vẫn chưa có vắc-xin hoặc thuốc hiệu quả, do đó, việc tìm kiếm một chất chống ASFV mới và hiệu quả là một nhiệm vụ rất cấp thiết. Các hạt nano bạc (SNP) gần đây đã được nổi lên như một tác nhân kháng vi-rút mới chống lại nhiều loại vi-rút, nhưng hoạt tính kháng vi-rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, khả năng kháng vi rút của SNP đối với ASFV đã được báo cáo. Sự ô nhiễm vi sinh vật trong chuồng lợn đã giảm đáng kể khi phun dung dịch SNP 25 ppm. Dung dịch SNP với nồng độ 0,78 ppm không có bất kỳ độc tính nào đối với tế bào đại thực bào phế nang của lợn; trong khi hoàn toàn ức chế ASFV ở mức 10³ HAD50 (Liều hấp phụ hồng cầu). Nghiên cứu này xác nhận rằng nano bạc có khả năng kháng virus cao đối với ASFV và là một chất khử trùng đầy hứa hẹn có thể được sử dụng để ngăn ngừa sự lây truyền ASFV.

(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)

GIỚI THIỆU

Virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (ASFV) là một thành viên của giống Asfivirus trong họ Asfarviridae, là một loại virus DNA sợi đôi có cấu trúc phức tạp theo hình thái hình tứ diện [1]. ASFV gây ra bệnh do vi-rút ở lợn với tỷ lệ tử vong rất cao ở lợn nhà, trong khi bệnh này không có triệu chứng ở các vật chủ chứa chất béo tự nhiên. Vi rút có thể lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp với động vật bị nhiễm vi rút, do vết cắn của động vật chân đốt bị nhiễm bệnh, đặc biệt là bọ ve mềm thuộc giống Ornithodoros, và khi tiếp xúc với vật liệu hoặc vật bị nhiễm vi rút như thịt, máu hoặc dịch chưa nấu chín của lợn bị nhiễm bệnh [2 -4]. Virus này tồn tại lâu trong máu và các mô sau khi chết nên dễ dàng lây truyền qua đường vận chuyển sản phẩm thịt lợn. Virus có thể được tìm thấy trong tất cả các chất bài tiết, đặc biệt là trong dịch mũi. Sự lây truyền qua đường không khí cũng xảy ra trong chuồng nuôi lợn [3]. Sự bùng phát của dịch bệnh có thể gây ra một hậu quả kinh tế đáng kể cho vùng bị ảnh hưởng, tiêm chủng là biện pháp kiểm soát tốt nhất, nhưng rất tiếc là cho đến nay vẫn chưa có vắc xin nào được bán trên thị trường. Sự phát triển vắc-xin đã bị cản trở bởi những khoảng trống lớn trong sự hiểu biết về nhiễm ASFV, khả năng miễn dịch và cơ chế mà vi rút điều chỉnh phản ứng của vật chủ đối với sự lây nhiễm [5]. Không có vắc-xin chống lại ASFV, chẩn đoán sớm và các biện pháp vệ sinh hiệu quả là những chiến lược rất quan trọng để loại bỏ bệnh ở vùng bị ảnh hưởng.

Do chưa có vắc xin nên việc thực hiện các biện pháp an toàn sinh học vẫn là chìa khóa để kiểm soát và phòng chống dịch bệnh. Bên cạnh các quy định nghiêm ngặt về vận chuyển động vật và sản phẩm động vật, quản lý chất thải liên quan đến thịt lợn và giám sát khu vực nhiễm bệnh, biện pháp khử trùng hiệu quả đóng một vai trò rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh lây lan [6-8].

ASFV bị bất hoạt bởi pH <3,9 hoặc> 11,5 và một số chất khử trùng truyền thống như canxi hydroxit, hypochlorite, formalin, ortho-phenylphenol, Glutaraldehyde và các hợp chất iốt [6, 9]. Các chất khử trùng truyền thống thường gây ra một số nhược điểm như có mùi hôi, nhanh chóng làm mất hoạt tính kháng vi-rút và khả năng gây ung thư; do đó, chỉ có một số chất khử trùng được Cơ quan Bảo vệ Môi trường tại Hoa Kỳ khuyến cáo sử dụng trong cuộc chiến chống lại ASFV [9].

Gần đây, người ta đã dành nhiều nỗ lực đáng kể để tìm ra các tác nhân kháng vi rút hiệu quả hơn, đặc biệt là các chất có nguồn gốc tự nhiên, với hy vọng phát triển một loại thuốc hiệu quả để điều trị bệnh hoặc tác nhân kháng vi rút để khử trùng [5, 10, 11]. Resveratrol và Oxyresveratrol do thực vật sản xuất (có trong vỏ nho, việt quất, mâm xôi và đậu phộng) để đối phó với stress sinh học và phi sinh học có thể ức chế sự lây nhiễm vi rút bằng cách phá vỡ các chức năng của tế bào [1].

Genistein thể hiện hoạt tính kháng ASFV-Ba71V mạnh nhất với mức giảm 3,8 log hiệu giá virus ở nồng độ 50 mM và 8 hpi [12]. Hoạt tính kháng vi rút của Genistain trên chủng ASFV Ba71V được xác định bằng một số cách bao gồm làm suy giảm sự tổng hợp DNA của vi rút, ức chế các giai đoạn sau xâm nhập của vòng đời ASFV và ức chế hoạt động của enzym ASFV loại II topoisomerase. Các polysaccharid đã được sulfat hóa có thể ức chế sự hấp phụ của virus trên tế bào chủ [13].

Apigenin, một flavonoid tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loại thực vật có thể ức chế sự tổng hợp protein đặc hiệu ASFV và gây giảm sự hình thành 99,99% của virus ASFV bằng cách thêm vào sau khi cấy 1 giờ [14]. Fluoroquinolones được phát hiện có tác động đến quá trình sao chép DNA của virus và sự tổng hợp protein ASFV làm gián đoạn quá trình lây nhiễm virus [15]. Một nhóm chất ức chế HDAC có thể loại bỏ sự sao chép của ASFV-Ba71V và quá trình tổng hợp protein muộn [16]. Mặc dù đã dành nhiều nỗ lực nhưng không có loại thuốc hiệu quả nào được bán trên thị trường để điều trị bệnh; do đó, vẫn còn là một thách thức để tìm ra chất khử trùng hiệu quả với khả năng kháng virus cao.

Các hạt nano bạc (SNP) đã được sử dụng rộng rãi như một chất khử trùng trong các ứng dụng khác nhau từ vệ sinh hàng ngày đến thuốc [17-21]. Gần đây, vật liệu nano bao gồm các hạt nano bạc đã nổi lên như một loại tác nhân điều trị mới có thể ức chế sự nhân lên của virus [22-24]. Người ta tin rằng SNP, đặc biệt là các hạt có đường kính dưới 10 nm, có thể tương tác với các nhóm lưu huỳnh hoạt động trong các nút gp120 glycoprotein gây ra sự ức chế lây nhiễm vi rút suy giảm miễn dịch ở người (HIV-1) [25-27] và tương tác tương tự có thể được tìm thấy trong vi rút herpes simplex loại 1 (HVS-1) [28], vi rút cúm A H1N1 [29-31], và vi rút cúm H3N2 [32].

SNPs mạnh hơn các hạt nano vàng, nhưng không cho thấy độc tính tế bào cấp tính đối với Hut / CCR5 và các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người, đồng thời ức chế sự nhân lên của HIV-1 [33]. Chất ổn định được sử dụng để tổng hợp SNP cũng ảnh hưởng đến hoạt động kháng virus của chúng; có thể nhận được hoạt tính kháng vi rút cao hơn chống lại RSV khi SNP được ổn định bởi curcumin so với axit citric [34]. Sau HIV-1, người ta đã chứng minh rằng SNP có thể tương tác và ức chế nhiều loại vi rút khác gây ra các bệnh do vi rút ở người như HVS-1 và 2 [28, 35], viêm gan B [36], vi rút hợp bào hô hấp (RSV ) [37], cúm A H1N1 [29] [31], và cúm H3N2 [32], parainfluenza ở người loại 3 [38], poliovirus [39], và adenovirus loại 3 [40].

Một số nghiên cứu đã điều tra hoạt động kháng vi-rút của nano bạc đối với bệnh vi-rút ở động vật và chỉ ra rằng SNP có thể ức chế hiệu quả vi-rút Tacaribe ở dơi [41], vi-rút bệnh bursal truyền nhiễm gây ra bệnh gumboro ở gà [42] và vi-rút viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV) có thể gây tiêu chảy nặng cho lợn [43]. SNP được đính lên grapheme oxide cũng chứng tỏ khả năng kháng vi rút cao chống lại vi rút gây hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV) được gọi là bệnh lợn tai xanh và vi rút tiêu chảy dịch lợn (PEDV) [44].

Sự lan rộng của bệnh ASFV xảy ra ở Châu Âu, Trung Quốc và một số quốc gia khác gây ra thiệt hại lớn về kinh tế và đe dọa an ninh lương thực trên toàn thế giới [45-52], tuy nhiên, việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh vẫn dựa trên các biện pháp an toàn sinh học do thiếu vắc xin và thuốc điều trị. Do đó, nhu cầu về một tác nhân kháng vi-rút hiệu quả để chống lại căn bệnh đang lan rộng là rất cao và cấp thiết. SNP đã tạo ra hoạt tính kháng vi rút cao trên nhiều loại vi rút, nhưng khả năng chống vi rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu. Do đó, trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng vi rút của nano bạc chống lại ASFV sẽ được kiểm tra để đánh giá khả năng sử dụng của chúng trong việc kiểm soát lây truyền bệnh ASFV.

CÁC THỰC NGHIỆM NANO BẠC

• Tổng hợp hạt nano bạc

SNPs được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học như được mô tả ở những nơi khác [53]. Trong một thí nghiệm điển hình, 20 mL dung dịch chitosan 10000 ppm làm chất ổn định lần đầu tiên được thêm vào cốc 1000 mL chứa 180 mL nước cất trong điều kiện khuấy với tốc độ 300 vòng / phút. Sau khi dung dịch trở nên đồng nhất; Khoảng 10 phút khuấy liên tục, 250 mL dung dịch AgNO3 1000 ppm được thêm vào và hỗn hợp được khuấy với tốc độ như nhau trong 1 h. Sau đó, thí nghiệm được tiếp tục bằng cách tăng tốc độ khuấy lên 500 vòng / phút và thêm 200 ppm dung dịch NaBH4 (20 mL) làm chất khử bằng phương pháp nhỏ từng giọt. Ngay sau khi nhỏ dung dịch NaBH4, dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng và trở nên sẫm màu khi thêm chất khử vào. Thí nghiệm kết thúc khi việc bổ sung NaBH4 hoàn tất. Dung dịch nano bạc thu được được chuyển vào chai mẫu màu nâu và được giữ ở điều kiện phòng để phục vụ cho các cuộc điều tra sau này.

• Nghiên cứu khử trùng

Khả năng khử trùng của nano bạc được khảo sát trong phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn Salmonella và sử dụng chỉ số ô nhiễm không khí vi sinh vật trong chuồng lợn làm chỉ số tương ứng. Đối với thử nghiệm kháng khuẩn trong phòng thí nghiệm, Salmonella lần đầu tiên được phát triển bằng cách thêm 100 µL dự trữ vào môi trường BHI và ủ trong 6 giờ ở 37^oC sau đó bằng cách ly tâm để tách phần nổi phía trên. Viên tế bào vi khuẩn sau đó được phân tán trong nước cất khử trùng để thu được huyền phù Salmonella để sử dụng sau này. Sau đó, huyền phù Salmonella (0,5 mL) được trộn với 0,5 mL dung dịch SNPs có nồng độ khác nhau từ 0,025 đến 250 ppm trong một ống 1,5 ml.

Sau khi ủ ở 37^oC trong 1 giờ, huyền phù (100 µL) được lấy và pha loãng với nước cất đã khử trùng bằng các dung dịch pha loãng mười lần nối tiếp và sau đó 100 µL của mỗi dung dịch pha loãng được chiết và xếp trên đĩa NA, ủ trong 24 giờ ở 37^oC đối với khuẩn lạc. đếm. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện theo phương pháp tương tự nhưng nước cất khử trùng được thêm vào thay vì dung dịch SNPs.

Chỉ số ô nhiễm vi sinh vật trong chuồng nuôi lợn được khảo sát bằng phương pháp thụ động gọi là phương pháp đĩa lắng. Theo đó, môi trường PCA chứa các đĩa petri (đường kính 9 cm) được đặt ở 4 góc và tâm chuồng lợn, cách sàn 40 cm và cách tường hoặc chướng ngại vật 1 m và tiếp xúc với không khí trong 10 phút. Thí nghiệm bắt đầu với việc chuẩn bị mặt bằng, trong đó sàn được làm sạch bằng nước và để khô cho đến khi thử nghiệm tấm lắng. Khi sàn đã khô, thử nghiệm tấm lắng đối chứng được tiến hành bằng cách mở các tấm petri trong 10 min sau đó; dung dịch nano bạc với nồng độ 25 ppm được phun khắp bề mặt sàn và trên tường. Khi sàn khô lại, một thử nghiệm tấm lắng khác được tiến hành bằng cách mở các tấm trong 10 min. Sau khi thu thập, các đĩa được niêm phong để ngăn ngừa ô nhiễm sau và ủ trong 24 giờ ở 37^oC để kiểm tra số lượng khuẩn lạc.

• Nuôi cấy tế bào và chuẩn bị vi rút

Đại thực bào phế nang của lợn chính (PAM) được thu thập từ phổi của lợn 6–8 tuần, nặng 20–40 kg và lợn Trắng Lớn khỏe mạnh. Tế bào phế nang được nuôi cấy trong môi trường RPMI với 10% huyết thanh lợn và 1% kháng sinh. Đối với nuôi cấy đơn lớp, tế bào phế nang được cấy vào đĩa nhựa nuôi cấy mô ở khoảng 4 ∙ 10⁵ tế bào / cm2. Sau 24 giờ ở 37 ° C trong không khí ẩm với 5% CO2, các tế bào không kết dính được loại bỏ bằng cách rửa bằng môi trường.

VNUA / HY-ASF1, một loại vi rút p72 kiểu gen II có nguồn gốc từ lợn bị nhiễm bệnh tại một trang trại ở tỉnh Hưng Yên, Việt Nam, được chiết xuất và nuôi cấy đến mức 10⁶ HAD50 (Liều hấp phụ hồng cầu) như đã báo cáo trong một nghiên cứu trước đây, đã được sử dụng cho điều tra này [51 ].

• Kiểm tra độc tính tế bào

Nguồn nano bạc (500 ppm) được pha loãng thành các nồng độ khác nhau từ 0,024 ppm đến 50 ppm để thực hiện thử nghiệm độc tính tế bào. Tế bào PAM đã được gieo hạt trước đó trong đĩa 96 giếng được gạn lọc để loại bỏ môi trường, sau đó thêm 50 µL dung dịch SNP pha loãng và 50 µL môi trường RPMI vào mỗi giếng. Nồng độ nano bạc cuối cùng trong chất đồng nhất tế bào được tính bằng cách chia nồng độ SNP pha loãng được thêm vào giếng cho 2 do độ pha loãng (1: 1). Sau đó, đĩa được ủ trong khoảng 1 giờ ở 37^oC trong môi trường 5% CO2 và sau đó 200 µL môi trường tươi được bổ sung để theo dõi khả năng sống của tế bào. Các tế bào chết và sống được xác định bằng cách xác định sự biến đổi hình thái của chúng sau khi xử lý với nano bạc. Những con sống xuất hiện ở dạng hình cầu và rõ ràng như những con trong điều khiển, trong khi những con chết bị thu nhỏ lại và đôi khi có dạng không hình cầu hoặc bị vỡ vụn.

• Thử nghiệm ức chế virus

Để kiểm tra hoạt tính ức chế của SNP đối với vi rút, dung dịch nano bạc có nồng độ không độc cao nhất được chọn và trộn với dịch nổi của vi rút theo tỷ lệ thể tích 1: 1. Trong một thí nghiệm điển hình, vi rút có hiệu giá 106 HAD50 được pha loãng bằng môi trường sử dụng các dung dịch pha loãng mười lần nối tiếp trước khi trộn với dung dịch SNP. Phần nổi phía trên của virus sau khi trộn với SNPs được giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Các thí nghiệm sau đó được tiếp theo bằng cách thêm dung dịch 100 µL có cả SNP và virus ở các hiệu giá khác nhau vào các giếng chứa tế bào sau khi loại bỏ môi trường. Các đối chứng được chuẩn bị bằng cách chỉ nuôi cấy tế bào trong môi trường và chỉ bổ sung vi rút. Đĩa được ủ ở 37oC trong 5% CO2 trong khoảng 8 giờ để virus sống sót tái tạo. Sau khi ủ, hỗn hợp virus và SNPs được tách ra khỏi tế bào và rửa bằng dung dịch PBS 1X và sau đó môi trường 200 µL có bổ sung hồng cầu lợn 1% được thêm vào.

Cuối cùng, các tế bào được ủ ở 37oC trong 7 ngày và quan sát trên kính hiển vi để đánh giá sự phát triển của chúng dựa trên sự thay đổi hình dạng của chúng và sự hình thành hoa thị đặc trưng đại diện cho sự hấp thụ hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm bệnh. Hoạt tính kháng vi rút của SNP được xác định dựa trên khả năng tồn tại của các tế bào ở mức nghiên cứu trong trường hợp không có hiệu ứng tế bào (CPE).

• Kết quả và thảo luận

Dung dịch AgNO3 chuyển sang màu vàng ngay sau khi thêm dung dịch NaBH4 chứng tỏ có khả năng hình thành SNP. Hiện tượng này có thể liên quan đến cộng hưởng Plasmon bề mặt đặc trưng của nano bạc. Đặc tính trên máy quang phổ UV-Vis cho thấy sự hấp thụ đạt cực đại tại bước sóng tới 401 nm (Hình 1 A), trùng với bề mặt cộng hưởng Plasmon của SNP được báo cáo trong nhiều công trình trước đây [25, 54, 55]. Dung dịch tối màu quan sát được khi dung dịch NaBH4 thêm vào là do nồng độ SNP tăng, tỷ lệ với cường độ hấp thụ. Điều này đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây [56, 57], trong đó sự tiến hóa của SNP được theo dõi bằng cách sử dụng phổ UV-Vis được thu thập tại các thời điểm phản ứng khác nhau.

Vị trí của đỉnh hấp thụ có thể thay đổi một chút trong các nghiên cứu khác nhau do ảnh hưởng của kích thước và hình dạng hạt nano; tuy nhiên, đây là một phương pháp dễ dàng để đánh giá ban đầu và nhanh chóng về sự hình thành SNP. Để xác nhận thêm sự hiện diện của SNP, hình ảnh TEM có độ phân giải cao (Hình 1 B) đã được thực hiện để phân tích kích thước, hình dạng và độ kết tinh của chúng. Phân tích hình ảnh TEM cho thấy các hạt thu được có dạng hình cầu với đường kính trung bình xấp xỉ 14 nm. Các hạt này có tính kết tinh cao với khoảng cách d là 0,23 nm (Hình 1B bên trong), tương ứng với mặt phẳng (111) của bạc kim loại. Kết quả này chứng minh rằng SNP kim loại đã được tổng hợp thành công và có thể được sử dụng cho các thí nghiệm sau này.

Khả năng kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp đã được kiểm tra chống lại Salmonella ở các nồng độ khác nhau từ 0,025 đến 250 ppm và kết quả được thể hiện trong Hình 2 và 3. Mẫu đối chứng không bổ sung SNPs chứa 1,23×10⁸ CFU / mL, trong khi đó không tìm thấy vi khuẩn trong mẫu được xử lý bằng SNP ở nồng độ trên 25 ppm (Hình 2). Như đã thấy trong Hình 3, SNP có thể ức chế hơn 95% salmonella ở nồng độ SNP là 2,5 ppm và đạt 100% ở nồng độ SNP là 25 ppm. Hiệu quả kháng khuẩn dường như phụ thuộc vào nồng độ, giảm từ 100% xuống 44,7% khi nồng độ SNP giảm tương ứng từ 25 xuống 0,025 ppm. Cơ chế giải thích tính chất kháng khuẩn của SNP vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, nhưng có sự đồng thuận rộng rãi rằng SNP có thể ức chế vi khuẩn thông qua ba cơ chế: (1) Các ion Ag ⁺ làm gián đoạn quá trình sản xuất ATP và sao chép DNA, (2) SNP và các ion Ag ⁺ tạo ra dư thừa các loại gốc tự do oxy như O , OH  (ROS) phá vỡ màng và chức năng của ty thể hoặc gây tổn thương DNA, và (3) SNP tương tác và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn [18]. Kết quả cho thấy SNP là chất kháng khuẩn hiệu quả và có thể là chất khử trùng tiềm năng để chống ASFV.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NANO BẠC

Dung dịch AgNO3 chuyển sang màu vàng ngay sau khi thêm dung dịch NaBH4 chứng tỏ có khả năng hình thành SNP. Hiện tượng này có thể liên quan đến cộng hưởng Plasmon bề mặt đặc trưng của nano bạc. Đặc tính trên máy quang phổ UV-Vis cho thấy sự hấp thụ đạt cực đại tại bước sóng tới 401 nm (Hình 1 A), trùng với bề mặt cộng hưởng Plasmon của SNP được báo cáo trong nhiều công trình trước đây.

Dung dịch tối màu quan sát được khi dung dịch NaBH4 thêm vào là do nồng độ SNP tăng, tỷ lệ với cường độ hấp thụ. Điều này đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây [56, 57], trong đó sự tiến hóa của SNP được theo dõi bằng cách sử dụng phổ UV-Vis được thu thập tại các thời điểm phản ứng khác nhau. Vị trí của đỉnh hấp thụ có thể thay đổi một chút trong các nghiên cứu khác nhau do ảnh hưởng của kích thước và hình dạng hạt nano; tuy nhiên, đây là một phương pháp dễ dàng để đánh giá ban đầu và nhanh chóng về sự hình thành SNP.

Để xác nhận thêm sự hiện diện của SNP, hình ảnh TEM có độ phân giải cao (Hình 1 B) đã được thực hiện để phân tích kích thước, hình dạng và độ kết tinh của chúng. Phân tích hình ảnh TEM cho thấy các hạt thu được có dạng hình cầu với đường kính trung bình xấp xỉ 14 nm. Các hạt này có tính kết tinh cao với khoảng cách d là 0,23 nm (Hình 1B bên trong), tương ứng với mặt phẳng (111) của bạc kim loại. Kết quả này chứng minh rằng SNP kim loại đã được tổng hợp thành công và có thể được sử dụng cho các thí nghiệm sau này.

Khả năng kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp đã được kiểm tra chống lại Salmonella ở các nồng độ khác nhau từ 0,025 đến 250 ppm và kết quả được thể hiện trong Hình 2 và 3. Mẫu đối chứng không bổ sung SNPs chứa 1,23×10⁸ CFU / mL, trong khi đó không tìm thấy vi khuẩn trong mẫu được xử lý bằng SNP ở nồng độ trên 25 ppm (Hình 2). Như đã thấy trong Hình 3, SNP có thể ức chế hơn 95% salmonella ở nồng độ SNP là 2,5 ppm và đạt 100% ở nồng độ SNP là 25 ppm.

Hiệu quả kháng khuẩn dường như phụ thuộc vào nồng độ, giảm từ 100% xuống 44,7% khi nồng độ SNP giảm tương ứng từ 25 xuống 0,025 ppm. Cơ chế giải thích tính chất kháng khuẩn của SNP vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, nhưng có sự đồng thuận rộng rãi rằng SNP có thể ức chế vi khuẩn thông qua ba cơ chế: (1) Các ion Ag ⁺ làm gián đoạn quá trình sản xuất ATP và sao chép DNA, SNP và các ion Ag ⁺ tạo ra dư thừa các loại gốc tự do oxy như O , OH  (ROS) phá vỡ màng và chức năng của ty thể hoặc gây tổn thương DNA, và (3) SNP tương tác và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Kết quả cho thấy nano bạc là chất kháng khuẩn hiệu quả và có thể là chất khử trùng tiềm năng để chống ASFV.

Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của SNPs chống lại Salmonella; khuẩn lạc từ mẫu đối chứng được pha loãng ở 10⁶ lần (A) và mẫu được xử lý bằng SNPs 25 ppm pha loãng ở 10 lần (B), và độ nhiễm vi sinh vật được kiểm tra bằng phương pháp đĩa lắng; các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển trên đĩa thạch tiếp xúc với không khí trong 10 phút trước (C) và sau khi (D) phun SNPs 25 ppm

Hình 3. Hiệu quả kháng khuẩn của SNPs chống lại Salmonella

• Độc tính tế bào

Để đánh giá độc tính của nano bạc trên tế bào PAM, SNPs ở các nồng độ khác nhau đã được thêm vào các giếng chứa tế bào để quan sát sự phát triển của chúng. Bố cục của thử nghiệm độc tính tế bào trong một đĩa 96 giếng được mô tả trong Hình 4. Mỗi cột có 7 giếng cho mỗi nồng độ SNP (hàng A đến G) và giếng thứ 8 (hàng H) là một ô trống không có SNP để đối chứng. Hiệu ứng độc hại được quan sát thấy ở nồng độ SNP 1,56 ppm với khoảng 70% tế bào bị vô hiệu hóa. Trên 1,56 ppm, SNPs cho thấy độc tính cao với 100% tế bào bị vô hiệu hóa, trong khi ở nồng độ loãng hơn (≤0,78 ppm), tác dụng độc hại không được quan sát thấy với hơn 80% tế bào phát triển bình thường. Quan sát trên kính hiển vi (Hình 5) cho thấy các tế bào trong mẫu đối chứng có hình cầu rõ ràng, tương tự như các mẫu được xử lý với nồng độ SNP từ 0,78 ppm trở xuống, trong khi các tế bào trong các mẫu được xử lý bằng nano bạc 1,56 ppm trở lên bị chia nhỏ rõ ràng . Điều này khẳng định rằng SNP ở nồng độ 0,78 ppm trở xuống không độc đối với tế bào PAM.

Độc tính do Ag ⁺ gây ra đã được nghiên cứu trong hơn 50 năm qua và cơ chế của nó đã được biết đến với sự đồng thuận chung rằng ty thể là mục tiêu chính của Ag ⁺. Ti thể dễ bị tổn thương bởi “con đường chuyển tiếp tính thấm”, đặc trưng bởi sự hình thành các lỗ xốp protein trong màng ti thể. Mức thấp nhất đối với Ag⁺ có thể gây ra tác dụng phụ trong tế bào động vật có vú đã được quan sát là từ 222 đến 362 mg Ag/Kg*ngày [58]. Độc tính do SNPs gây ra không tương tự như độc tính của Ag⁺, có một số yếu tố cho phép SNP tạo ra các tác động độc hại cho tế bào và sinh vật. SNPs có thể thâm nhập vào thành và màng tế bào và sau đó giải phóng Ag ⁺ nội bào. Ag ⁺ ở đây có thể tương tác trực tiếp với DNA gây ra hiệu ứng độc tế bào và nhiễm độc gen do sự gián đoạn vận chuyển tế bào và làm cạn kiệt glutathione và các chất chống oxy hóa khác [59, 60]. SNPs có thể kích thích sản xuất ROS và giảm sản xuất ATP, gây ra stress oxy hóa và các tác động gây độc gen. Vì hầu hết các hiệu ứng độc hại xảy ra trong tế bào, người ta tin rằng độc tính của nano bạc phụ thuộc vào kích thước; có thể độc hơn ở các hạt có kích thước nhỏ hơn, đặc biệt là các hạt có kích thước ≤5nm [61].

Độc tính của nano bạc phụ thuộc vào nồng độ và ảnh hưởng của nó có thể khác nhau đối với loại tế bào [59]. Khả năng sống sót của tế bào RAW 246,7 giảm 20% và 40% ở nồng độ SNPs là 0,2 và 1,6 ppm, tương ứng [62]. Độc tính cũng được quan sát thấy trên dòng tế bào gan chuột (BRL 3A) ở khoảng nồng độ SNPs từ 1 đến 25 ppm [63]. Ngưỡng độc tính của SNPs đo được trên tế bào HeLa và U937 là 2 ppm sau 4 giờ xử lý [64]. Tuy nhiên, không tìm thấy độc tính trên tế bào HepG2 ở nồng độ SNPs từ 0,01 đến 5ppm [65]. Quan sát bằng kính hiển vi trên da heo được điều trị bằng SNP trong 14 ngày cho thấy độc tính của chúng trên da heo là một phản ứng phụ thuộc vào nồng độ [66]. Một chút phù nề nội bào và biểu bì gian bào đã được tìm thấy trên da được điều trị bằng SNPs 0,34 ppm (kích thước 20 nm) và viêm da khu trú nghiêm trọng được quan sát thấy khi nồng độ SNP tăng lên 34 ppm. Rõ ràng, độc tính của SNP thay đổi đáng kể với các dòng tế bào khác nhau, do đó, tùy thuộc vào mục đích ứng dụng của chúng; ngưỡng độc tính trên các dòng tế bào liên quan cần được điều tra. Trong nghiên cứu này, ngưỡng độc tính quan sát được (0,78 ppm) cho phép chúng tôi nghiên cứu sâu hơn hoạt động kháng vi rút của nano bạc trên vi rút ASF đồng thời tránh được sự phá hủy của các tế bào PAM (Tế bào đại thực bào phế nang).

Hình 4. Sơ đồ bố trí của thử nghiệm độc tính tế bào. Mỗi cột có 7 giếng từ hàng A đến G cho mỗi nồng độ SNP và giếng thứ 8 trong hàng H dành cho đối chứng không có nano bạc. Màu đỏ cho thấy độc tính cao, gây vô hiệu hóa tế bào, màu vàng cho thấy độc tính với tỷ lệ tế bào bị vô hiệu hóa cao và màu xanh lá cây cho thấy nồng độ SNP an toàn với hơn 80% tế bào còn sống

Hình 5. Hình ảnh đại diện của mẫu đối chứng với các tế bào bình thường (a) và tế bào chết trong mẫu được xử lý bằng SNPs ở 3,125 ppm (b). Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi LED Leica DM IL ở độ phóng đại 200x.

• Hoạt động chống vi-rút

Hoạt tính kháng virus của nano bạc trên ASFV được khảo sát ở nồng độ SNPs là 0,78 ppm, ngưỡng độc tính của SNPs. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kháng vi-rút được trình bày trong Hình 6.

Virus được phát hiện trong tất cả các dung dịch pha loãng khi virus đồng nhất ban đầu không được xử lý bằng SNP (vòng tròn màu xanh lá cây), ngược lại, không có virus nào được tìm thấy trong đối chứng không có virus và không có SNP (vòng tròn màu đỏ). Có thể thấy sự khác biệt trong mẫu được xử lý bằng SNPs 0,78 ppm. Không có vi rút nào được phát hiện khi chất đồng nhất gốc được pha loãng từ 3 log trở lên (Vòng tròn màu đỏ), trong khi nó được quan sát thấy ở tất cả các độ pha loãng dưới 2 log.

Những kết quả này chỉ ra rằng ASFV ở mức ≤10³ HAD50 có thể bị ức chế hoàn toàn bởi SNPs ở nồng độ 0,78 ppm. Các nghiên cứu trước đây cho thấy hiệu quả kháng vi rút của SNP phụ thuộc vào nồng độ [29, 33, 36, 43, 44], do đó, hiệu quả kháng vi rút của chúng có thể cao hơn khi nồng độ SNP tăng lên; tuy nhiên, nó có thể gây độc tế bào nhiều hơn ở nồng độ cao hơn. Hình ảnh của tế bào bị nhiễm và tế bào PAM bình thường được thể hiện trong Hình 7.

Rõ ràng, nếu không điều trị bằng SNPs, độc lực của nó sẽ gây ra nhiễm trùng và chết ở các tế bào PAM. Như có thể thấy trong Hình 7a, các tế bào trong mẫu, nơi virus không được xử lý bằng SNPs 0,78 ppm, có hình thái bị thay đổi và cho thấy sự hấp phụ hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm. Sự hấp phụ hồng cầu là do sự tương tác giữa hồng cầu và glycoprotein của virus [67]. Trong khi đó, các tế bào PAM được tìm thấy sống với hình dạng tròn trong và không hấp phụ hồng cầu trong mẫu trắng và trong dịch đồng nhất của virus được pha loãng bằng ≥3 log sau khi xử lý với 0,78 ppm SNPs (Hình 7b). Kết quả khẳng định thêm khả năng ức chế của SNP đối với ASFV.

Theo các nghiên cứu trước đây, nano bạc có thể tương tác với glycoprotein capsid gp120 của virus, đặc biệt là các nút glycoprotein, các phần tiếp xúc và dễ tiếp cận hơn trên capsid của virus và do đó ngăn chặn sự xâm nhập giữa virus và tế bào chủ và do đó tạo ra hoạt động ức chế hiệu quả chống lại virus [29- 31]. Cơ chế này có thể giải thích cho tác dụng ức chế vi rút đối với một số vi rút có glycoprotein trên màng hạt bao gồm vi rút cúm A H1N1 [29-31], vi rút cúm H3N2 [32], và vi rút parainfluenza loại 3.

SNPs cũng có thể ức chế sự hình thành RNA nội bào và virion ngoại bào bằng cách tương tác với DNA bị nghi ngờ hoặc các phần tử virus của HBV [36]. ASFV là một virus DNA được bao bọc với các hạt có đường kính từ 170 đến 190 nm được đóng gói với hơn 50 loại protein bao gồm cả glycoprotein [67]. Do đó, có khả năng SNPs có thể tương tác với các protein này, đặc biệt là glycoprotein trên màng ngoài, ngăn cản sự xâm nhập của virus vào tế bào hoặc sự nhân lên của virus và do đó gây ra sự ức chế virus.

Vì sự ức chế virus dựa trên sự tương tác giữa nano bạc và protein của virus, hiệu quả kháng virus phụ thuộc đáng kể vào sự tiếp xúc của các vị trí hoạt động trên cả virus và SNP. Do đó, kích thước của SNPs và chất giới hạn được sử dụng trong quá trình tổng hợp có thể đóng góp quan trọng vào hiệu quả kháng vi-rút của SNPs tạo thành. Gaikwad và cộng sự. đã chứng minh rằng SNP có đường kính trung bình 47 nm và 45 nm do nấm, loài Alternaria và loài Phoma tạo ra, có khả năng ức chế vi rút thấp (từ 0 đến 40%), trong khi SNP do F. oxysporum (24 nm) và C. Indicum (45 nm) có hiệu suất ức chế lên đến 80% (F. Oxysporium) và 90% (C. Indicum).

Hoạt tính kháng virus cao hơn chống lại RSV cũng có thể nhận được khi SNP được ổn định bởi curcumin so với axit citric [34]. Trong nghiên cứu này, SNPs có đường kính trung bình xấp xỉ 14 nm có thể ức chế hoàn toàn ASFV ở hiệu giá 10³ HAD50 trong ống nghiệm. Tuy nhiên, hiệu quả kháng virus trên thực tế có thể bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các chất gây ô nhiễm tồn tại trong môi trường. Tác động bất lợi có thể nghiêm trọng hơn khi SNPs được áp dụng để vệ sinh và khử trùng chuồng trại vì có rất nhiều hợp chất hữu cơ từ thức ăn thừa và chất bài tiết của lợn có thể tương tác mạnh với SNPs.

Để đánh giá ảnh hưởng này đến khả năng khử trùng của SNPs trong chuồng nuôi lợn, dung dịch SNPs 25 ppm đã được phun lên sàn, tường và vách ngăn của chuồng lợn và sau đó sự ô nhiễm vi khuẩn trong không khí trước và sau khi phun được theo dõi bằng phương pháp thụ động gọi là lắng tấm [68]. Các thử nghiệm được tiến hành ở 3 chuồng khác nhau đối với lợn con, lợn nái và lợn trưởng thành.

Trước khi phun dung dịch SNPs, vi khuẩn phát triển trên đĩa rất nhiều không thể đếm được như trong Hình 2 C và D, tuy nhiên, sau khi phun dung dịch SNPs, số lượng vi khuẩn trung bình trên đĩa là 34, 95 và 813 cfu / tấm tương ứng với 2674, 5760 và 63914 cfu / m3 không khí trong chuồng dành cho heo nái, heo con và heo trưởng thành, tương ứng. Kết quả cho thấy ô nhiễm vi sinh vật giảm đáng kể sau khi phun dung dịch SNP 25 ppm. Số lượng vi khuẩn nhận được nhiều hơn trong chuồng lợn con và lợn trưởng thành không có nghĩa là hiệu quả khử trùng của nano bạc giảm trong những trường hợp đó. Có khả năng là nồng độ vi khuẩn trong không khí thay đổi theo mức độ hoạt động của lợn trong nhà; hoạt động của lợn tạo ra và bơm nhiều khí dung có vi khuẩn vào bầu khí quyển.

Trong chuồng lợn nái, mỗi con được ngăn cách trong một vách ngăn với hoạt động rất hạn chế; nó dành nhiều thời gian hơn để nằm trên sàn và do đó gây ra ít khí dung hơn với vi khuẩn phát tán trong không khí. Kết quả là, ít vi khuẩn hơn lắng đọng trên đĩa thạch. Trong khi đó, lợn con và lợn trưởng thành được di chuyển tự do trong không gian chuồng trại gây ra nhiều sương vi khuẩn hơn với vi khuẩn cung cấp vào không khí và kết quả là, nhiều vi khuẩn hơn được tìm thấy trên đĩa thạch. Các kết quả thu được khẳng định rằng hoạt động khử trùng của SNPs không bị ảnh hưởng đáng kể bởi các chất gây ô nhiễm còn lại trên sàn.

Hình 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kháng vi rút. Hàng A, B, C, D tương ứng với mẫu trắng có vi rút và không xử lý SNPs (A), đối chứng không có SNP và không có vi rút (B), và mẫu vi rút được xử lý bằng SNP 0,78 ppm (C và D) tương ứng. Các cột từ 1 đến 7 tương ứng với sự pha loãng 10 lần nối tiếp của virus đồng nhất ở mức 10⁶ HAD50; số trừ trong vòng tròn đại diện cho nhật ký pha loãng. Vòng tròn màu xanh lá cây cho biết đã phát hiện vi-rút sống, trong khi vòng tròn màu đỏ cho biết không phát hiện vi-rút còn sống

Hình 7. Hình ảnh hiển vi đại diện của tế bào PAM được cấy ASFV (a) và tế bào PAM được cấy với ASFV được xử lý trong dung dịch SNP 0,78 ppm trong 1h (b). Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi LED Leica DM IL ở độ phóng đại 200x

SNPs đã được sử dụng rộng rãi như một chất kháng khuẩn trong nhiều ứng dụng từ công nghiệp dệt may, khử trùng nước, đóng gói thực phẩm đến y học [19]. SNPs có một số ưu điểm so với các chất khử trùng thông thường. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ và lâu dài chống lại nhiều loại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và vi rút. Chúng có thể dễ dàng kết hợp với các chất nền và vật liệu khác; do đó, chúng có thể được sử dụng ở dạng lỏng hoặc rắn. Do đó, SNP cung cấp nhiều ứng dụng khử trùng nước, lọc không khí, khử trùng bề mặt, kem dưỡng da hoặc thuốc mỡ cho da, miếng đệm hoặc vải để chăm sóc vết thương. Nhờ ứng dụng linh hoạt và hoạt động lâu dài, SNP có thể tạo ra một rào cản hiệu quả để phá vỡ sự truyền ASFV. Điều này cho thấy SNP có thể là một chất khử trùng tiềm năng và là một công cụ hiệu quả để ngăn chặn sự lan rộng nhanh chóng của ASFV.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng nano bạc là một chất khử trùng hiệu quả chống lại cả Salmonella và ASFV. Sự ức chế hoàn toàn vi khuẩn Salmonella và ASFV được quan sát thấy ở nồng độ SNP là 25 ppm và 0,78 ppm và ở nồng độ vi khuẩn là 10⁸ CFU / mL và hiệu giá của vi rút tương ứng là 10³ HAD50. SNPs không cho thấy độc tính tế bào đối với các tế bào PAM ở nồng độ 0,78 ppm. Kết quả xác nhận rằng SNP có khả năng kháng virus mạnh mẽ chống lại ASFV và có thể là một công cụ đầy hứa hẹn để chống lại căn bệnh này trên diện rộng. Để kiểm soát sự lan rộng của ASFV, bên cạnh nhu cầu về một loại vắc xin hiệu quả, đòi hỏi phải thực hiện nhiều biện pháp an toàn sinh học để cách ly khu vực ổ dịch, khử trùng khu vực nhiễm bệnh và tạo ranh giới bảo vệ cho khu vực không bị nhiễm bệnh. SNP có thể có đóng góp lớn trong việc thực hiện các biện pháp an toàn sinh học; tuy nhiên, việc sử dụng SNP nên được kết hợp với các biện pháp phòng ngừa hiện có để tối ưu hóa chi phí và hiệu quả của chúng. Do đó, các nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu thực địa cần được thực hiện để đạt được sự kết hợp hiệu quả giữa SNP với các biện pháp phòng ngừa hiện có và để giảm chi phí biện pháp phòng ngừa.

Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây

Nguồn tham khảo:

Các hạt nano bạc như tác nhân kháng vi rút tiềm năng chống lại vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi

Tran Thi Ngoc Dung ^a,*, Vu Nang Nam ^a, Tran Thi Nhan ^a, Trinh Thi Bich Ngoc^b, Luu Quang Minh ^c, Bui Thi To Nga ^b, Van Phan Le ^b,**, Dang Viet Quang ^d

a Viện Công nghệ Môi trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam

b Trường Cao đẳng Thú y, Đại học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội, Việt Nam

c Bộ Khoa học và Công nghệ (MOST), Việt Nam

d Khoa Công nghệ Sinh học, Hóa học và Kỹ thuật Môi trường, Đại học Phenikaa, Hà Nội 12116, Việt Nam