Nano kẽm oxit – chất bổ sung kẽm thay thế muối kẽm và kẽm chelate trong chăn nuôi

Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm điều tra tác dụng kháng khuẩn và độc tế bào của nano kẽm oxit (ZnO-NPs) trong ống nghiệm để ứng dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.

Vật liệu và phương pháp: Nano ZnO-NPs được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa hóa học ướt sử dụng kẽm axetat làm tiền chất và natri hydroxit được sử dụng để khử muối tiền chất. Các tính chất của bột tổng hợp được đặc trưng bằng cách sử dụng quang phổ nhìn thấy được bằng tia cực tím (UV), tia hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và nhiễu xạ tia X (XRD), tương ứng. Các hoạt động kháng khuẩn in vitro được phân tích chống lại vi khuẩn gây bệnh ở gia cầm Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae và Streptococcus aeruginosa. Thử nghiệm 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide được tiến hành để phân tích tác dụng gây độc tế bào của nano ZnO-NPs.

Kết quả: SEM cho thấy một hạt  ZnO-NPs hình cầu trong phạm vi 70-100 nm. Kích thước của hạt và độ tinh khiết của mẫu đã được xác nhận bằng XRD. Các hạt ZnO-NPs có kích thước nano thể hiện cực đại hấp thụ UV ở bước sóng 335 nm. Trong quang phổ FTIR, các hạt nano ZnO-NPs tinh khiết cho thấy dao động kéo dài ở 4000-5000 cm -1 . Các hạt nano ZnO-NPs thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với các chủng vi khuẩn E. coli , S. aureus , K. pneumoniae và S. aeruginosa . Khả năng sống sót của tế bào đã giảm đáng kể phụ thuộc vào liều lượng trong nghiên cứu độc tính tế bào.

Kết luận: Từ hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và độc tính tế bào thấp hơn quan sát được ở liều lượng quy định, kết luận rằng bột nano ZnO-NPs là một chất bổ sung kẽm thay thế tiềm năng cho vật nuôi.

Nano kẽm oxit - nguồn bổ sung kẽm thay thế muối kẽm, chelate kẽm trong chăn nuôi

(Bản quyền NanoCMM Technology)

Nhu cầu nano kẽm oxit 56000 ppm liên hệ 098.435.9664

Giới thiệu

Kẽm là nguyên tố vi lượng thiết yếu thứ hai trong mọi hệ thống sống từ động vật đến con người, đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình trao đổi chất của cơ thể [ 1 ]. Việc cung cấp kẽm trong chế độ ăn hàng ngày là cần thiết để điều chỉnh sự phân chia tế bào bằng cách điều chỉnh quá trình tổng hợp protein và DNA [ 2 ]. Hai nguồn chủ yếu của Zn được sử dụng trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi là ZnO-NPs và ZnSO 4 .H 2 O [ 3 ]. Thiếu kẽm ở gia súc dẫn đến tăng trưởng không phù hợp, giảm lượng thức ăn, giảm năng suất sữa, giảm chu kỳ và tỷ lệ thụ thai [ 4 , 5 ]. Năng suất sữa tăng lên khi bổ sung Zn dưới dạng kẽm methionin hoặc kẽm lysine cho gia súc [ 6]. Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia khuyến nghị 30 ppm (mg / kg) là nhu cầu ăn kiêng của kẽm trên cơ sở vật chất khô cho gia súc. Bổ sung kẽm nano làm giảm đáng kể số lượng tế bào soma trong sữa của bò bị viêm vú cận lâm sàng và cải thiện sản lượng sữa hơn so với bò được bổ sung kẽm oxit vĩ mô [ 7 , 8 ]. Thiếu kẽm ở cừu dẫn đến lông cừu bị tuột, giảm tốc độ tăng trưởng và tinh hoàn phát triển không đúng cách [ 9 ], giảm cân trong thời kỳ cho con bú, phát triển các tổn thương da và tiết nhiều nước bọt [ 10 ]. Tăng phytate do hấp thụ kẽm kém ở ruột do bổ sung kẽm không đúng cách dẫn đến viêm ruột kéo dài và bệnh da liễu [ 11]. Thường cần bổ sung kẽm liên tục dưới dạng kẽm sulfat (10 mg / kg / ngày) hoặc kẽm methionate (1,7 mg / kg / ngày) để duy trì [ 12 ]. Kẽm có tác dụng kháng bệnh, miễn dịch tế bào, phát triển lá lách và thay đổi cholesterol lipoprotein mật độ cao ở gia cầm [ 13 , 14 ]. Kẽm bổ sung được sử dụng cho gia cầm là kẽm sulfat hoặc kẽm clorua [ 15 ]. Kẽm ở dạng Zn methionine cho thấy tính khả dụng sinh học cao hơn kẽm từ các nguồn vô cơ [ 16 ]. Mức khuyến nghị của kẽm trong các khẩu phần ăn của gia cầm khác nhau là từ 40 đến 75 ppm [ 17 ].

Kẽm oxit là chất bổ sung kẽm được sử dụng phổ biến nhất với hoạt tính kháng khuẩn cao, kháng nấm và khả năng thúc đẩy tăng trưởng [ 18 ]. Kẽm oxit tạo ra hydrogen peroxide có thể đi qua thành tế bào, làm gián đoạn quá trình trao đổi chất và do đó ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Ái lực của oxit kẽm đối với tế bào vi khuẩn là yếu tố quan trọng nhất đối với hoạt động kháng khuẩn [ 19 ]. Nó làm giảm sự thiếu hụt kẽm và kết quả của nó là làm giảm sự chậm phát triển và giảm tỷ lệ vô sinh [ 20]. Tuy nhiên, khả dụng sinh học của ZnO-NPs có thể được tăng cường bằng cách thay đổi hiệu ứng kích thước. Kích thước giảm của ZnO-NPs ở kích thước nano sẽ tăng cường khả dụng sinh học bằng cách tăng ion hóa kẽm. Thông thường, nguồn kẽm hữu cơ mang lại kết quả tốt do sinh khả dụng cao hơn trong tất cả các hoạt động tăng trưởng và sản xuất của vật nuôi. Tuy nhiên, chi phí sản xuất và liều lượng bổ sung không đủ để tạo ra việc nuôi nhân tạo theo cách thức hiệu quả về chi phí. ZnO-NPs nano có thể tạo ra hiệu quả tích cực để khắc phục vấn đề thiếu kẽm với hiệu quả về chi phí và tỷ lệ liều lượng thấp hơn.

Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng tính khả dụng sinh học cao hơn của nano ZnO-NPs có thể dễ dàng hấp thụ từ ruột và can thiệp vào các cơ chế dưới tế bào. Hơn nữa, hiệu quả kháng khuẩn cao nhất với các loài vi khuẩn khác nhau đã được báo cáo trong các công trình gần đây. Nano ZnO-NPs trong hỗn hợp thức ăn chăn nuôi sẽ cung cấp chức năng kép của một chất bổ sung Zn và như một chất kháng khuẩn trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi. Để kiểm tra giả thiết này, chúng tôi đã tổng hợp nano ZnO-NPs bằng phương pháp kết tủa hóa học ướt ở 80 ° C sử dụng kẽm axetat. Việc xác nhận sự hiện diện, nồng độ, hình thái và kích thước hạt nano ZnO-NPs được đặc trưng bằng cách sử dụng quang phổ nhìn thấy được bằng tia cực tím (UV), tia hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và nhiễu xạ tia X (XRD), tương ứng. Tác dụng kháng khuẩn chống lại Escherichia coli ,Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , và Streptococcus aeruginosa ở mức độ in vitro được đánh giá bằng thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng khuẩn. Thử nghiệm độc tính tế bào MTT được thực hiện để xác định tính tương hợp sinh học và tác dụng gây độc tế bào của nano ZnO-NPs.

Nguyên liệu và phương pháp

Sự chấp thuận về mặt đạo đức

Không cần sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức cho nghiên cứu này vì chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trong ống nghiệm .

Phương pháp kết tủa

Các hạt nano kẽm oxit được tổng hợp bằng cách sử dụng kẽm axetat làm tiền chất và natri hydroxit làm chất khử. Hỗn hợp đồng nhất kẽm axetat 0,1 M được hòa tan trong nước cất hai lần ở pH 11 trong 2 giờ với sự hỗ trợ của máy khuấy từ. Nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0,1 M vào dung dịch kẽm axetat, khuấy liên tục. Dung dịch cuối cùng được khuấy trong 4 giờ ở pH bằng 7. Kết tủa cuối cùng được lọc bằng giấy lọc Whatman No.1 và sau đó keo kẽm oxit được đông khô. Sau đó, các hạt nano kẽm oxit dạng bột được thu thập và lưu trữ cho quá trình tiếp theo.

Zn (CH 3 COO) 2 + 2NaOH → Zn (OH) 2 + 2CH 3 COONa

Zn (OH) 2 → ZnO-NPs + H 2 O

Đặc tính hóa

Các mẫu thu được được đặc trưng bởi phương pháp XRD dạng bột với bức xạ tia X CuKα (λ = 0,15496 nm). Hình thái bề mặt của mẫu được phát hiện bởi SEM (TESCAN, VEGA3 LMU). Thành phần của các nguyên tố được phân tích bằng cách sử dụng quang phổ FTIR (PerkinElmer Spectrum RX I) và phổ hấp thụ quang học của bột nano ZnO-NPs có nguồn gốc từ quang phổ nhìn thấy tia UV (quang phổ UV 1800, SHIMADZU).

Hoạt động kháng khuẩn

Các chủng vi khuẩn như E. coli , S. aureus , K. pneumoniae , và S. aeruginosa được mua từ Bộ sưu tập nuôi cấy loại vi sinh vật, Chandigarh, Ấn Độ. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm đang phát triển tích cực được lan truyền trên bốn giếng được làm trong đĩa thạch dinh dưỡng. Dung dịch oxit kẽm với các nồng độ khác nhau như 50, 100 và 150 µg / ml được nạp vào mỗi giếng, trong khi một giếng chỉ được lấp đầy với môi trường canh thang làm đối chứng. Sau đó, các đĩa được ủ ở 37 ° C trong 24-48 h. Hoạt tính kháng khuẩn được biểu thị bằng đường kính (mm) của vùng ức chế.

Thử nghiệm độc tính tế bào

Thử nghiệm độc tính tế bào của hạt nano kẽm oxit ZnO-NPs đã chuẩn bị được đo bằng thử nghiệm MTT. Nguyên bào sợi của chuột (L-929) ở mật độ 1 × 10 6 cellll được pipet vào nuôi cấy mô với 12 giếng, để ủ trong 24 giờ và được xử lý với các nồng độ khác nhau (50-500 µl / ml) hạt nano ZnO-NPs. Sau khi xử lý hạt nano ZnO-NPs, môi trường được thay đổi và các tế bào được rửa hai lần bằng (hỗn hợp 12 chất dinh dưỡng của Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium / Ham’s) mà không có huyết thanh bê thai nhi để loại bỏ tế bào chết. Các tế bào được ủ với 200 µl (5 mg / ml) thuốc thử MTT trong 6-7 giờ ở 37 ° C trong 5% CO 2tủ ấm thải độc tế bào. Muối tetrazolium MTT được chuyển đổi thành formazan có màu bởi các dehydrogenase của ty thể cho thấy sự hiện diện của các tế bào sống sót. Sự phát triển màu sắc được đo ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ. Trong thử nghiệm này, các tế bào không gắn hạt nano được sử dụng làm đối chứng. Khả năng tồn tại của ô được tính như sau:

Kết quả và thảo luận

Phân tích SEM

Ảnh SEM của mẫu được hiển thị trong Hình 1. Ảnh SEM của các mẫu ZnO-NPs thu được từ phương pháp kết tủa cho thấy sự hiện diện của các hạt nano hình cầu với sự kết tụ tối thiểu. Một cấu trúc tương tự đã được quan sát thấy trong các hạt nano ZnO-NPs bởi Kim và Park [  ], Ong et al . [  ]. Chất đóng nắp có thể được sử dụng để giảm kích thước hạt trong quá trình kết tủa. Kích thước hạt thay đổi từ 70 đến 100 nm như được quan sát từ hình ảnh SEM được hiển thị bên dưới. Giảm tốc độ bổ sung natri hydroxit với kẽm axetat có thể làm giảm sự hình thành kích thước hạt trong quá trình kết tủa.

Hình 1 Hình ảnh hiển vi điện tử quét các hạt nano ZnO.

Hình 1 Hình ảnh hiển vi điện tử quét các hạt nano ZnO.

Nghiên cứu XRD

Hình 2 hiển thị các mẫu XRD của các mẫu ZnO-NPs. Phản xạ Bragg với 2θ A 32,18 °, 36,78 ° và 47,54 ° được quan sát ở các mặt phẳng (100), (101) và (102) xác nhận sự hiện diện của hạt nano ZnO-NPs. Hơn nữa, các đỉnh ít cường độ hơn ở các giá trị 48 °, 54 °, 57 °, 64 ° và 77 ° (2θ) cho thấy độ kết tinh cao của các mẫu ZnO-NPs và độ tinh khiết cao của bột nano ZnO-NPs. Kích thước tinh thể của các mẫu ZnO-NPs được tính bằng công thức của Scherrer. Kích thước hạt trung bình của mẫu thu được từ phương pháp kết tủa này được tính toán bằng cách sử dụng toàn bộ chiều rộng ở một nửa cực đại của đỉnh cường độ cao hơn tương ứng với 101 mặt phẳng nằm ở 32,18 ° theo công thức của Scherrer. Kích thước tinh thể trung bình được tìm thấy là 74,67 nm. Tương tự, mô hình XRD được báo cáo bởi Kim và Park [  ], Mohana và Renjanadevi [ ], và Jenkins và Snyder [  ].

Hình 2 Phổ của hạt nano kẽm oxit ZnO thu được bằng phương pháp quang phổ nhiễu xạ tia X.

Hình 2 Phổ của hạt nano kẽm oxit ZnO thu được bằng phương pháp quang phổ nhiễu xạ tia X.

Quang phổ FTIR

Phổ FTIR của các hạt nano kẽm oxit ZnO-NPs được tổng hợp cho thấy (Hình-3) chế độ rung cơ bản tại 3410,69 tương ứng với dao động kéo giãn OH, 2924,78 tương ứng với dao động kéo giãn CH, và 1377,13 tương ứng với dao động kéo giãn không đối xứng C = O. Các đỉnh 1647,58 và 619,27 tương ứng với dao động kéo dãn và biến dạng của ZnO-NPs. Sự hấp thụ ở 857 cm −1 là do sự hình thành phối trí tứ diện của Zn. Các tần số quan sát được đối với các oxit kẽm phù hợp với các giá trị tài liệu [  –  ] đã báo cáo phổ FTIR tương tự của các hạt nano oxit kẽm trong cuộc điều tra của họ.

Hình-3 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của hạt nano ZnO – NPs.

Hình-3 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của hạt nano ZnO - NPs.

Quang phổ hấp thụ nhìn thấy được của UV

Quang phổ hấp thụ khả kiến ​​UV là một kỹ thuật thường được sử dụng để kiểm tra các đặc tính quang học của các hạt nano. Đó là điều hiển nhiên từ Hình 4, bột kẽm oxit nano thể hiện dải hấp thụ mạnh ở khoảng 335 nm, nằm dưới bước sóng dải tần 388 nm của ZnO-NPs số lượng lớn. Sự hấp thụ kích thích của bột ZnO-NPs và vật liệu ZnO-NPs dạng khối xuất hiện ở bước sóng ~ 327 nm và ~ 373 nm đã được báo cáo. Cực điểm kích thích ở 335  Hình 4 tương tự như báo cáo trước đó [  ,  ].

Hinh 4 Sự hấp thụ tia cực tím nhìn thấy được của các hạt nano ZnO – NPs.

Hinh 4 Sự hấp thụ tia cực tím nhìn thấy được của các hạt nano kẽm oxit ZnO - NPs.

Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của đối chứng cùng với các hạt nano kẽm oxit ZnO-NPs đã được nghiên cứu chống lại các vi khuẩn gây bệnh như E. coli , S. aureus , K. pneumoniae và S. aeruginosa .Bảng 1tuyên bố rằng ZnO-NPs thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với các chủng vi khuẩn đã được thử nghiệm. Người ta đã chứng minh được rằng huyền phù ZnO-NPs có kích thước nano hoạt động trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, hạt nano ZnO-NPs được phát hiện có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng. Một tỷ lệ tác dụng ức chế đáng kể đã được quan sát thấy đối với các vi khuẩn được chọn theo thứ tự là E. coli , S. aureus , K. pneumoniae và S. aeruginosa . Có vẻ như các loại oxy hoạt tính được tạo ra bởi các hạt nano ZnO-NPs có thể chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng khuẩn. Hoạt động kháng khuẩn của nano ZnO-NPs chống lại E. coliđã được báo cáo và các loại oxy phản ứng được tạo ra bởi nano ZnO-NPs chịu trách nhiệm ức chế sự phát triển của vi khuẩn [  ,  ].

Bảng 1 Hoạt tính kháng khuẩn của nano ZnO-NPs.

Bảng 1 Hoạt tính kháng khuẩn của nano ZnO-NPs.

Thử nghiệm độc tính tế bào

Tác dụng gây độc tế bào của hạt nano ZnO-NPs được xác định bằng cách sử dụng tế bào biểu mô chuột L-929 bằng thử nghiệm MTT. Tỷ lệ độc tế bào được tăng lên khi tăng nồng độ nano ZnO-NPs (Hình-5). Tác dụng gây độc tế bào đáng kể bắt đầu từ nồng độ 180 µg / ml, trong khi lên đến 180 µg / ml, mức độ độc tối thiểu có thể chấp nhận được là 30%. Do đó, hạt nano ZnO-NPs có thể được sử dụng làm chất bổ sung thức ăn chăn nuôi với tốc độ liều lượng lên đến 180 µg / ml.

Thử nghiệm độc tính tế bào

Tác dụng gây độc tế bào của hạt nano ZnO-NPs được xác định bằng cách sử dụng tế bào biểu mô chuột L-929 bằng thử nghiệm MTT. Tỷ lệ độc tế bào được tăng lên khi tăng nồng độ nano ZnO-NPs (Hình-5). Tác dụng gây độc tế bào đáng kể bắt đầu từ nồng độ 180 µg / ml, trong khi lên đến 180 µg / ml, mức độ độc tối thiểu có thể chấp nhận được là 30%. Do đó, hạt nano ZnO-NPs có thể được sử dụng làm chất bổ sung thức ăn chăn nuôi với tốc độ liều lượng lên đến 180 µg / ml.

Hình-5 Độc tính tế bào của các hạt nano kẽm oxit ZnO-NPs trên dòng tế bào L-929 (nguyên bào sợi của chuột).

Hình-5 Độc tính tế bào của các hạt nano kẽm oxit ZnO-NPs trên dòng tế bào L-929 (nguyên bào sợi của chuột).

Sự kết luận

ZnO dạng hạt lớn hơn không thường được sử dụng trong bổ sung thức ăn chăn nuôi do sinh khả dụng thấp. Tuy nhiên, ZnO-NPs phân tử nano có thể cung cấp tỷ lệ bề mặt trên thể tích tốt hơn cho cơ chế tiêu hóa sinh lý của kẽm. Do đó, khả dụng sinh học của kẽm có thể được tăng cường khi bổ sung ZnO-NPs nano so với các chất bổ sung ZnO-NPs hoặc kẽm methionine dạng hạt lớn hơn. Trong bối cảnh này, các hạt nano ZnO-NPs được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa sử dụng kẽm axetat. Các phân tích SEM cho thấy ZnO-NPs được tổng hợp có dạng hình cầu với đường kính 70-100 nm. XRD có cùng kích thước và độ tinh khiết của mẫu. Các hạt ZnO-NPs có kích thước nano thể hiện cực đại hấp thụ UV ở bước sóng 335 nm. Trong quang phổ FTIR, các hạt nano ZnO-NPs tinh khiết cho thấy dao động kéo giãn ở 4000-5000 cm −1. Thử nghiệm kháng khuẩn đã chứng minh rằng ZnO-NPs được chuẩn bị có thể chống lại sự phát triển của vi khuẩn được thử nghiệm. Nghiên cứu về độc tính tế bào cho thấy liều gây chết chỉ trên 180 µg / ml. Do đó, hoạt tính kháng khuẩn (150 µg / ml) và mức liều lượng khả năng sống của tế bào (lên đến 180 µg / ml) là duy nhất trong thí nghiệm đã tiến hành. Do đó, người ta đề xuất tiến hành các đường ăn ở động vật bằng hạt nano ZnO-NPs để đánh giá giá trị ăn của chúng.

Nguồn tham khảo: Nano zinc oxide – An alternate zinc supplement for livestock

K. Geetha,1 M. Chellapandian,2 N. Arulnathan,2 and A. Ramanathan3