Nano bạc – zanamivir có khả năng tiêu diệt virus cúm A H1N1 kháng thuốc

Là một trong những loại thuốc hiệu quả nhất để điều trị nhiễm vi rút cúm, ứng dụng lâm sàng của zanamivir bị hạn chế khi có sự xuất hiện của vi rút cúm kháng thuốc. Điều quan trọng là sản xuất các loại dược phẩm mới chống lại sự lây nhiễm vi rút cúm. Trong những năm gần đây, các hạt nano bạc (AgNPs) đã thu hút được sự chú ý rộng rãi trong lĩnh vực kháng vi-rút. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh phủ bề mặt của AgNPs bằng cách sử dụng zanamivir (ZNV) tạo ra một hợp chất có các đặc tính kháng vi rút. Tóm lại, các AgNPs (Ag @ ZNV) biến đổi của zanamivir đã ức chế hoạt động của neuraminidase của vi rút H1N1. Hơn nữa, hiệu ứng tế bào cho thấy Ag @ ZNV đã chống lại đáng kể quá trình chết rụng do vi rút H1N1 gây ra đối với các tế bào MDCK, liên quan đến sự phân mảnh DNA, cô đặc nhiễm sắc và hoạt hóa caspase-3. Ag @ ZNV làm giảm hiệu quả sự tích tụ của các loại oxy phản ứng (ROS) do vi rút H1N1 gây ra và kích hoạt cả hai con đường tín hiệu p38 và p53. Tổng hợp lại, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng Ag @ ZNV là một dược phẩm mới đầy hứa hẹn chống lại sự lây nhiễm vi rút cúm H1N1.

(Bản quyền NanoCMM Technology)

1 Giới thiệu

Vi rút cúm gây ra mối đe dọa lớn cho cộng đồng đang phổ biến trên hệ thống y tế toàn cầu. ¹ Có ba loại vi rút cúm A, B và C, gây bệnh cho người. Tuy nhiên, các ca nhiễm cúm A, thuộc về H1N1, chiếm phần lớn các ca nhập viện. ² Đại dịch cúm H1N1 bùng phát vào năm 2009 ở Mexico và Mỹ, lây lan nhanh chóng ở người và dẫn đến hơn 280 000 ca tử vong trên toàn thế giới, phát triển thành đại dịch cúm ở người đầu tiên trong 40 năm qua. ^3–5Cúm A được phân loại theo hai loại protein bề mặt chính là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). NA đóng một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus. Nó làm sạch axit sialic khỏi bề mặt HA, NA và tế bào, đồng thời giúp virus thế hệ con cháu tách khỏi tế bào chủ. ⁶ Các nghiên cứu đã chứng minh rằng vi rút A (H1N1) 2009 là kết quả của một loạt các sự kiện tái phân loại liên quan đến các chủng vi rút cúm A ở lợn, gia cầm và ở người, với gen NA có nguồn gốc từ dòng A / H1N1 giống lợn Á-Âu giống gia cầm. ^7,8 Chất ức chế NA là một loại hợp chất kháng vi-rút chống lại vi-rút cúm, nhắm mục tiêu vào vị trí enzym được bảo tồn cao của NA glycoprotein. ⁹Zanamivir và oseltamivir thường được sử dụng làm chất ức chế NA liên kết trong túi hoạt động của NA và làm rối loạn phản ứng enzym. ¹⁰ Chúng là những lựa chọn đã được chấp thuận hiện nay ở Mỹ để can thiệp tức thì đối với sự lây nhiễm vi rút cúm. ^11,12 Tuy nhiên, sự đề kháng đối với các chất ức chế NA thường phát sinh do đột biến axit amin trong các vị trí hoạt động của NA, hoặc trong các gốc khuôn khổ hoặc trong các dư lượng xúc tác. ⁹ Vi rút cúm kháng thuốc ức chế NA có thể được lựa chọn nhanh chóng ở những bệnh nhân được điều trị hoặc đôi khi xuất hiện mà không có mối liên hệ riêng biệt với các phương pháp điều trị. ¹³ Phương pháp điều trị và dự phòng mới chống lại vi rút cúm đã thu hút được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học.

Dựa trên các tính chất vật lý và hóa học đặc biệt, vật liệu nano đã trở thành vật liệu mới trong y học, công nghiệp thực phẩm và công nghệ môi trường. ^14–16 Trong số đó, các hạt nano bạc (AgNP) đã thu hút được sự chú ý rộng rãi trong lĩnh vực y sinh. Bên cạnh các hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư, AgNPs đang được khám phá như là chất chống vi rút trong những năm gần đây. ^17–19 Dữ liệu tích lũy đã báo cáo rằng AgNPs ngăn chặn sự sao chép của vi rút hợp bào hô hấp, vi rút sốt xuất huyết 2, vi rút sốt thung lũng rift, vi rút khảm vàng đậu, vi rút herpes simplex, vi rút parainfluenza 3 và vi rút cúm H3N2. ^20–25Do đó, chúng tôi đang mong đợi xác minh rằng các AgNP được biến đổi của zanamivir (Ag @ ZNV) có hoạt tính nổi bật để hạn chế lây nhiễm vi rút H1N1. Các loại oxy phản ứng (ROS) đóng một vai trò thiết yếu trong quá trình sinh lý bệnh của cơ thể chúng ta. ^{26 Sự} lây nhiễm của vi rút ảnh hưởng đến sự cân bằng oxy hóa khử, gây ra sản xuất quá mức ROS và dẫn đến quá trình chết rụng của tế bào vật chủ. ^27,28 Nghiên cứu trước đây đã mô tả rằng nano bạc AgNPs kích thích sản xuất ROS để tiêu diệt tế bào ung thư, ¹⁷ nhưng ít được biết về mối quan hệ và cơ chế giữa hai trường hợp nhiễm virus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đang hướng tới việc khám phá cách thức các nano bạc đã biến đổi của zanamivir đối kháng với quá trình chết rụng tế bào MDCK do vi rút cúm H1N1 gây ra.

2 Thử nghiệm

2.1 Vật liệu

Dòng tế bào thận chó Madin Darby (MDCK) được sử dụng để nghiên cứu bệnh cúm được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Loại Hoa Kỳ (CCL-34 TM). Cúm A / Hubei / 74/2009 (H1N1) do Viện Vi-rút Vũ Hán, Viện Khoa học Trung Quốc tặng. Huyết thanh bò thai (FBS) và môi trường đại bàng biến đổi của Dulbecco (DMEM) từ Gibco được sử dụng để nuôi cấy tế bào. l -1-Tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl xeton (TPCK), zanamivir, vitamin C (VC), bạc nitrat (AgNO ₃), thiazolyl xanh tetrazolium bromide (MTT), 4 ′, 6-diamidino-2-phenyindole (DAPI), coumarin-6,2 ′, 7′-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) và propidium iodide (PI) đều đã được mua từ Sigma. Đầu dò phân tử màu đỏ đậm Lyso Tracker được thu nhận từ Invitrogen. Bộ dụng cụ xét nghiệm apoptosis tế bào chết theo phương pháp trung gian deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), bộ phát hiện neuraminidase, bộ xét nghiệm protein BCA và bộ xét nghiệm hoạt tính caspase-3 đã được mua lại từ Viện Công nghệ sinh học Beyotime (Thượng Hải, Trung Quốc). p38, p-p38, p53, p-p53, PARP, caspase-3 và kháng thể đơn dòng β-actin được cung cấp từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào. Nước Milli-Q cho tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này được thu thập từ máy lọc nước bằng milipore.

2.2 Tổng hợp nano bạc AgNPs và Ag @ ZNV

AgNPs được điều chế như (Li và cộng sự ): ¹⁷ trong thời gian ngắn, 0,1 ml dung dịch VC 400 μg ml ⁻¹ mới chuẩn bị được thêm từng giọt vào 4 ml dung dịch AgNO ₃ 400 μg ml ⁻¹ mới , sau đó khuấy từ liên tục trong 30 phút ở nhiệt độ phong. Sau đó, 32 μl zanamivir 100 nM được thêm vào. VC, AgNO ₃ và zanamivir dư thừa được loại bỏ bằng thẩm phân trong 24 giờ. Sau đó, nồng độ của Ag @ ZNV được phát hiện bằng ICP-AES (phép đo phổ phát xạ nguyên tử plasma kết hợp cảm ứng). ²⁹ Dung dịch hạt nano Ag @ ZNV được siêu âm trong nồi cách thủy trước khi đi qua bộ lọc kích thước lỗ 0,22 μm. Nồng độ cuối cùng của nano bạc AgNPs là 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM zanamivir và mẫu được bảo quản ở 4 ° C.

2.3 Đặc tính của Ag @ ZNV

Hình thái của các hạt nano Ag @ ZNV được đặc trưng bởi kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Theo quy trình này, các mẫu được chuẩn bị bằng cách phân tán các hạt bột lên màng cacbon lỗ trên lưới đồng. Các hình ảnh vi mô được thu thập bằng cách sử dụng Hitachi (H-7650) cho TEM hoạt động ở điện áp gia tốc 80 kV. Tia X phân tán năng lượng (EDX) được thực hiện bằng hệ thống EX-250 (Horiba) để phân tích thành phần nguyên tố của Ag @ ZNV. Sự phân bố kích thước và tiềm năng zeta của Ag @ ZNV được xác định bằng máy phân tích hạt Malvern Zetasizer Nano ZS. ³⁰

2.4 Nuôi cấy tế bào và nhiễm trùng tế bào

Tế bào MDCK được duy trì trong môi trường DMEM với 10% FBS, 100 U ml ^-1 penicilin và 50 U ml ^-1 streptomycin ở 37 ° C trong tủ ấm 5% CO ₂ . ³¹ Nhiễm vi rút H1N1 đã được thực hiện và 50% liều nhiễm vi rút nuôi cấy mô (TCID50) được tính là (Amatore và cộng sự ). ^{32,33 Một cách} ngắn gọn, các tế bào được gieo hạt trong các đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 × 10 ⁴tế bào mỗi giếng trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat (PBS) và bị nhiễm H1N1 trong DMEM không có FBS. Đối với thử nghiệm 50% liều lây nhiễm nuôi cấy mô (TCID50), vi rút được pha loãng theo 10 lần gradient từ 10-1 đến 10-10 trong bước này. Sau khi hấp phụ trong 2 giờ ở 37 ° C, phần nổi phía trên được loại bỏ và các tế bào được nuôi cấy bằng DMEM có chứa 2% FBS và 2 μg ml ^-1 TPCK trypsin đã được xử lý sau khi rửa hai lần để loại bỏ các vi rút không bị dính vào. Hiệu ứng tế bào (CPE) đã được quan sát và TCID 50 được tính toán bằng phương pháp Reed-Muench. Tất cả vi rút H1N1 được sử dụng trong nghiên cứu này đều ở mức 100 TCID 50 ml.

2.5 Xác định khả năng tồn tại của tế bào

Độc tính tế bào của các hạt nano Ag @ ZNV được xác định bằng xét nghiệm MTT. ^{34 Một cách} ngắn gọn, các tế bào MDCK được gieo vào đĩa nuôi cấy 96 giếng và bị nhiễm H1N1. Sau đó, các tế bào được xử lý với nồng độ chỉ định của zanamivir có hoặc không có AgNPs. Sau 72 giờ, 20 μl dung dịch 5 mg ml ^-1 MTT được thêm vào mỗi giếng và ủ ở 37 ° C. Dung dịch trong giếng được hút ra sau 5 giờ và DMSO được thêm vào 150 μl mỗi giếng. Độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm được ghi lại và khả năng sống sót của tế bào MDCK đối với Ag @ ZNV được đo bằng máy quang phổ vi tấm.

2.6 Bản địa hóa nội bào của Ag @ ZNV

Sự định vị nội bào của Ag @ ZNV được đánh dấu bằng 6-coumarin trong các tế bào MDCK được truy tìm bằng Lyso Tracker Red như một dấu hiệu của lysosome. ^{35 Một cách} ngắn gọn, các tế bào được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm với 80 nM Lyso Tracker trong 120 phút. Khi 70% hợp lưu bị nhuộm màu, 1 mg ml ^-1 DAPI được thêm vào trong 30 phút. Sau đó, 6-coumarin có nhãn Ag @ ZNV và Lyso Tracker Red được ủ ở 37 ° C trong các khoảng thời gian khác nhau. Cuối cùng, các tế bào được rửa bằng PBS ba lần và phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang.

2.7 Thử nghiệm ức chế neuraminidase

H1N1 được trộn có hoặc không có Ag @ ZNV trong 2 giờ trước khi ủ ở 37 ° C. Sau đó, hoạt động của neuraminidase (NA) của vi rút cúm được xác định bằng cách sử dụng bộ phát hiện NA được đo bằng đầu đọc vi phiến huỳnh quang với bước sóng kích thích 360 nm và bước sóng phát xạ 460 nm như (Wang và cộng sự ). ³⁶

2.8 Phân tích tế bào dòng chảy

Ảnh hưởng của Ag @ ZNV đến sự phân bố chu kỳ tế bào được đo bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (Song và cộng sự ). ³⁷ tế bào MDCK bị nhiễm H1N1 và được xử lý có hoặc không có Ag @ ZNV được thu hoạch và cố định bằng etanol 70% ở -20 ° C qua đêm. Sau khi nhuộm PI, hàm lượng DNA được định lượng và phân tích chu kỳ tế bào bằng phần mềm MultiCycle. Tỷ lệ tế bào ở các pha G0 / G1, S, G2 / M được biểu diễn dưới dạng biểu đồ DNA.

2.9 Xét nghiệm nhuộm TUNEL và DAPI

Sự phân mảnh DNA và sự cô đặc nhân được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang bằng bộ kit phát hiện apoptosis TUNEL và DAPI như (Li et al. ). ^{38,39 Một cách} ngắn gọn, sau khi cố định với 3,7% formaldehyde và được làm thấm với 0,1% Triton X-100 trong PBS, các tế bào MDCK được đánh dấu bằng hỗn hợp phản ứng TUNEL trong 60 phút và với 1 μg ml ^-1 DAPI trong 15 phút ở 37 ° C. Các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2.10 Hoạt động Caspase-3

Hoạt động của caspase-3 được theo dõi theo hướng dẫn bằng bộ xét nghiệm hoạt tính caspase-3. ^{17 Một cách} ngắn gọn, protein của tế bào được chiết xuất sau khi xác định nồng độ bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA. Protein trộn với cơ chất caspase-3 cụ thể Ac-DEVD-pNA được thêm vào đĩa 96 giếng ở 37 ° C trong 1 giờ. Độ hấp thụ được ghi lại ở bước sóng 405 nm.

2.11 Đo lường sự tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS)

Sự tích tụ ROS bị ức chế bởi các tế bào MDCK được xử lý bằng Ag @ ZNV sau khi nhiễm H1N1 được xác định bằng cách nhuộm tế bào với xét nghiệm DCF như (Yang và cộng sự ). ⁴⁰ tế bào được thu thập và ủ với 10 μM DCF-DA trong PBS ở 37 ° C trong 30 phút. Sự tạo ROS được xác định bằng cường độ huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ ở bước sóng 488 nm / 525 nm.

2.12 Phân tích Western blot

Sự biểu hiện của các protein liên quan đến các con đường tín hiệu được xác định bởi Western blot là (Ren et al. ). ⁴¹ tế bào MDCK được xử lý có hoặc không có Ag @ ZNV trong 24 giờ sau khi nhiễm H1N1 được ly giải với đệm RIPA và thu được tổng số protein. Nồng độ protein được định lượng bằng bộ xét nghiệm BCA. Sau đó, lượng protein tương đương được tách trên gel natri dodecyl sulfat (SDS) –polyacrylamide, sau đó được chuyển lên màng PVDF. Sau khi được ngăn trong sữa tách kem 5%, các màng được ủ với các kháng thể sơ cấp cụ thể và kháng thể thứ cấp liên kết với peroxidase củ cải ngựa (HRP). Các bu lông được phát triển bằng thuốc thử phát quang hóa học (ECL) tăng cường.

2.13 Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. Phần mềm GraphPad Prism 5.0 được sử dụng để phân tích dữ liệu. Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng thử nghiệm t- test của Sinh viên hai bên để đánh giá sự khác biệt giữa hai nhóm hoặc phân tích phương sai một chiều (ANOVA) để so sánh nhiều nhóm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê với P <0,05 (*) hoặc P <0,01 (**).

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Điều chế và mô tả đặc tính của nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Hình thái của nano bạc AgNPs và Ag @ ZNV trước hết được đặc trưng bởi TEM. Như được thể hiện trong Hình 1A , Ag @ ZNV trình bày các hạt đơn phân tán và hình cầu với độ đồng đều cao. Bên cạnh đó, khi phân bố kích thước hạt trung bình trong Hình 1C , Ag @ ZNV đã giảm hiệu quả từ 3 nm xuống 2 nm so với nano bạc AgNPs. Kích thước nhỏ của Ag @ ZNV đã góp phần tạo nên cấu trúc nano có độ ổn định cao và nó giúp dễ dàng xuyên qua màng tế bào. Trong Hình 1B , thế zeta của riêng nano bạc AgNPs là -15,2 mV và tăng lên đến -24,7 mV sau khi nạp zanamivir, điều này giải thích cho độ ổn định cao hơn của Ag @ ZNV. Hơn nữa, phân bố kích thước của Ag @ ZNV trong Hình 1Dcho thấy kích thước trung bình của Ag @ ZNV nằm trong khoảng từ 2 nm đến 2,3 nm và giữ ổn định trong 30 ngày. Trong khi đó, chúng tôi cũng phát hiện sự phân bố kích thước của nano bạc AgNPs trong Hình 1E . Kích thước của AgNPs nằm trong khoảng từ 2,0 nm đến 3,0 nm và giữ ổn định trong 28 ngày. Trong Hình 1F , một phân tích thành phần nguyên tố sử dụng EDX cho thấy sự hiện diện của tín hiệu mạnh từ các nguyên tử Ag (59,5%), cùng với tín hiệu nguyên tử C (23%), N (8,6%) và O (8,9%) mà từ ZNV. Không quan sát thấy các đỉnh rõ ràng đối với các nguyên tố hoặc tạp chất khác. Sự hiện diện của nguyên tử N và O cho thấy ZNV đã tự tập hợp trên bề mặt của AgNPs. Dựa trên kết quả phân tích EDX, công thức hóa học đại diện của Ag @ ZNV được tính là (Ag ₇ ZNV) _n. Tỷ lệ hạt nano Ag / ZNV đã được báo cáo trước đó. ^35,42

Hình 1 Đặc điểm của nano bạc AgNPs và Ag @ ZNV. (A) Ảnh TEM của nano bạc AgNPs và Ag @ ZNV (vạch chia độ 2 nm). (B) Thế Zeta của AgNPs và Ag @ ZNV. (C) Sự phân bố kích thước của nano bạc AgNPs và Ag @ ZNV. (D) và (E) Quá trình phân bố kích thước theo thời gian của Ag @ ZNV và AgNPs trong dung dịch nước sử dụng máy phân tích hạt zetasizer nano-zs. (F) Phân tích EDX của Ag @ ZNV. Các thanh có các ký tự khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P <0,05 (*).

3.2 Hoạt tính kháng vi rút trong ống nghiệm của nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Hoạt tính kháng vi rút của nano bạc AgNPs, ZNV và Ag @ ZNV đã được khảo sát bằng xét nghiệm MTT. Khả năng tồn tại tế bào của nano bạc và ZNV được thể hiện trong Hình 2A và B , AgNPs và ZNV làm giảm khả năng sống sót của tế bào theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Như thể hiện trong Hình 2C , nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM. Khả năng tồn tại của các tế bào MDCK bị nhiễm vi rút H1N1 là 36,32%. Tế bào được điều trị bằng zanamivir và  nano bạc AgNPs đạt lần lượt là 63,23% và 61,87%. Tuy nhiên, các tế bào được xử lý bằng Ag @ ZNV đạt tới 82,26%. Trong khi đó, một đánh giá về sức mạnh tổng hợp đã được thực hiện bởi các báo cáo trước đó. ⁴³Dữ liệu được giải thích bằng cách tính toán chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FIC) như sau: FIC = (MIC _{thuốc A kết hợp} / MIC _{kết hợp thuốc A} ) + (MIC _{kết hợp thuốc B} / MIC _{kết hợp thuốc B} ). Trong nghiên cứu này, chỉ số FIC về cơ bản được hiểu như sau: FIC dưới 0,5, hợp lực; FIC từ 0,5 đến 2,0, thờ ơ, FIC cao hơn 2,0, đối kháng. Thuốc MIC Một sự kết hợp là nồng độ có trong Ag @ ZNV của Ag. Thuốc MIC kết hợp B là nồng độ hiện diện trong Ag @ ZNV của ZNV. Riêng thuốc MIC A và B tương ứng với AgNPs và ZNV “tự do”. Nồng độ kết hợp thuốc được phát hiện bằng ICP, sức mạnh tổng hợp được đánh giá bằng tính toán in vitrochỉ số nồng độ ức chế phân đoạn như sau: Thuốc MIC A kết hợp là nồng độ có trong Ag @ ZNV của Ag (0,5 μg ml ⁻¹ ). Thuốc MIC kết hợp B là nồng độ hiện diện trong Ag @ ZNV của ZNV (0,2 nM). Riêng thuốc MIC A tương ứng với AgNPs tự do (2,5 μg ml ^-1 ). Riêng thuốc MIC B tương ứng với ZNV tự do (0,8 nM). FIC = (MIC _{thuốc A kết hợp} / MIC _{kết hợp thuốc A} ) + (MIC _{kết hợp thuốc B} / MIC _{kết hợp thuốc B} ) = 0,5 μg ml ^{−1 /} 2,5 μg ml ⁻¹+ 0,2 nM / 0,8 nM = 0,45. FIC nhỏ hơn 0,5 cho thấy đánh giá là hợp lực. Kết quả cho thấy rằng Ag @ ZNV đã tăng cường hiệu quả hoạt động kháng vi rút. Như trong Hình 2D , các tế bào MDCK bị nhiễm H1N1 cho thấy sự co rút tế bào chất, giảm số lượng tế bào và mất liên lạc giữa tế bào với tế bào. Hiệu ứng tế bào giảm đi khi được xử lý bằng Ag @ ZNV. Khả năng tồn tại của tế bào và hình ảnh cho thấy rằng Ag @ ZNV đã ngăn chặn sự sinh sôi của vi rút H1N1 một cách hiệu quả.

Hình 2 Ảnh hưởng của Ag @ ZNV trong tế bào MDCK bị nhiễm H1N1. (A – C) Hoạt tính kháng vi rút của nano bạc AgNPs, ZNV và Ag @ ZNV được đo bằng xét nghiệm MTT. (D) Những thay đổi hình thái của tế bào MDCK được quan sát bằng kính hiển vi tương phản pha (độ phóng đại, × 40). Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM. Các thanh có các ký tự khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P <0,05 (*) hoặc P <0,01 (**).

3.3 Bản địa hóa nội bào của nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Quá trình sinh nội bào chống lại các hạt nano có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu truyền tải các hệ thống nano được nạp vào thuốc. ⁴⁴ Trong nghiên cứu này, sự định vị của Ag @ ZNV được đánh dấu bởi coumarin-6 trong các tế bào MDCK được theo dõi bằng cách nhuộm đồng thời. Như Hình 3 gợi ý, vùng màu vàng phủ lên màu xanh lục và đỏ huỳnh quang chứng tỏ sự đồng bản địa hóa của Ag @ ZNV và lysosome. Sự kết hợp tích lũy trên màng tế bào MDCK, sau đó Ag @ ZNV thoát ra khỏi lysosome và được giải phóng vào tế bào chất sau 60 phút. Sự phát huỳnh quang được tăng cường dần dần cho thấy khả năng thâm nhập tế bào phụ thuộc vào thời gian đối với hoạt tính kháng vi-rút của Ag @ ZNV.

Hình 3 vận chuyển nội bào của Ag @ ZNV trong các tế bào MDCK. Các tế bào được xử lý bằng Ag @ ZNV được nạp coumarin-6 trong hơn 120 phút, và nhuộm bằng Lyso Tracker để tìm lysosome và DAPI cho nhân. Các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở các thời điểm khác nhau (độ phóng đại, × 100).

3.4 Hoạt động của Neuraminidase

Hoạt tính Neuraminidase (NA) được sử dụng để ước tính ảnh hưởng của virus từ các tế bào bị nhiễm. Zanamivir thường được sử dụng như chất ức chế NA để điều trị lâm sàng chống lại nhiễm vi rút cúm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi so sánh ảnh hưởng của nano bạc AgNPs, zanamivir và Ag @ ZNV đối với hoạt động của H1N1 NA. Dữ liệu trong Hình 4 cho thấy vi rút H1N1 được điều trị bằng Ag @ ZNV có hoạt tính NA thấp hơn (42,68%) so với được điều trị bằng zanamivir (72,42%) hoặc AgNPs (58,37%), cho thấy rằng các hợp chất này có hiệu quả hơn trong việc ức chế Hoạt động NA của vi rút H1N1.

Hình 4 Ức chế hoạt động của H1N1 NA bởi Ag @ ZNV. Thử nghiệm ức chế NA được thực hiện bằng cách định lượng chất huỳnh quang bằng cách sử dụng một đầu đọc vi tấm. Các thanh có các ký tự khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P <0,05 (*) hoặc P <0,01 (**). Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM.

3.5 Ức chế quá trình apoptosis của nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Phân tích tế bào dòng chảy và xét nghiệm TUNEL – DAPI được thực hiện để đánh giá cơ chế kháng vi rút của Ag @ ZNV. Như được thể hiện trong Hình 5A , quần thể tế bào apoptotic phụ G1 đã tăng đáng kể lên 29,4% trong biểu đồ DNA. Tuy nhiên, Ag @ ZNV đã làm giảm đáng kể nó xuống còn 17,3%. Sự phân mảnh DNA được coi là một dấu hiệu sinh hóa quan trọng trong quá trình apoptosis của tế bào. Trong Hình 5B , các tế bào MDCK bị nhiễm vi rút H1N1 thể hiện các đặc điểm apoptotic điển hình với sự ngưng tụ nhân và phân mảnh DNA. Tuy nhiên, sự phân mảnh DNA và những thay đổi về hình thái hạt nhân do vi rút H1N1 gây ra đã được chống lại một cách hiệu quả khi được điều trị bằng Ag @ ZNV. Những dữ liệu này chỉ ra rằng các tế bào MDCK được Ag @ ZNV bảo vệ khỏi quá trình chết rụng do vi rút H1N1 gây ra.

Hình 5 Ag @ ZNV ức chế quá trình apoptosis ở các tế bào MDCK bị nhiễm H1N1. (A) Hàm lượng DNA được định lượng bằng phân tích tế bào theo dòng về quá trình apoptosis và những thay đổi trong phân bố chu kỳ tế bào. (B) Sự phân mảnh DNA và sự ngưng tụ hạt nhân bị khử bởi Ag @ ZNV được phát hiện bằng xét nghiệm đồng nhuộm TUNEL – DAPI. Tế bào MDCK được xử lý có hoặc không có Ag @ ZNV sau khi nhiễm vi rút H1N1 (độ phóng đại, × 100). Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM.

3.6 Ức chế hoạt hóa caspase-3 bởi nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Caspase-3 đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, vì nó chịu trách nhiệm phân tách protein của nhiều loại protein quan trọng, chẳng hạn như poly-ADP-ribose polymerase (PARP). Để điều tra sự hoạt hóa của caspase-3 và PARP trong quá trình ức chế vi rút H1N1 bởi Ag @ ZNV, chúng tôi đã thực hiện một xét nghiệm đo fluorometric và Western blot. Như được tiết lộ trong Hình 6A , hoạt động caspase-3 của các tế bào MDCK bị nhiễm vi rút H1N1 đạt 326%, trong khi nhóm Ag @ ZNV giảm đáng kể xuống còn 189%. Trong hình 6B, mức độ biểu hiện của caspase-3 và PARP trong các tế bào được điều trị bằng Ag @ ZNV được điều chỉnh giảm rõ ràng so với nhóm tế bào điều hòa tăng không được điều trị sau khi nhiễm H1N1. Kết quả chứng minh rằng Ag @ ZNV đã chống lại hoạt động của vi rút H1N1 thông qua việc ức chế quá trình tự chết của tế bào qua trung gian caspase-3.

Hình 6 Sự ức chế PARP và caspase-3 bởi Ag @ ZNV trong các tế bào MDCK bị nhiễm H1N1. (A) Tế bào được xử lý bằng Ag @ ZNV và hoạt động caspase-3 được phát hiện. (B) Biểu hiện mức độ PARP và caspase-3 bằng Western blot, β-actin được sử dụng làm kiểm soát tải. Các thanh có các ký tự khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P <0,01 (**). Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM.

3.7 Khả năng chống tạo ROS của nano bạc – zanamivir Ag @ ZNV

Bao gồm cả vi rút cúm, nhiễm một số loại vi rút phát triển đồng thời với việc tạo ra các loại oxy phản ứng dư thừa (ROS) có liên quan đến quá trình chết rụng của tế bào. Để tìm hiểu xem các hạt nano Ag @ ZNV có hạn chế quá trình chết rụng qua trung gian ROS do vi rút H1N1 gây ra hay không. Chúng tôi theo dõi mức ROS nội bào bằng cách kiểm tra cường độ huỳnh quang của dichlorofluorescein (DCF). Như thể hiện trong Hình 7A , thế hệ ROS của tế bào MDCK tăng cao rõ ràng sau khi nhiễm vi rút H1N1 mà không cần điều trị. Chỉ riêng Zanamivir hoặc nano bạc AgNPs đã ức chế một chút thế hệ khi Ag @ ZNV cắt giảm đáng kể. Từ ảnh trong Hình 7B, chúng tôi đã quan sát thấy cường độ huỳnh quang mạnh của DCF trong các tế bào MDCK bị nhiễm vi rút H1N1. Sự phát huỳnh quang trong các tế bào được xử lý chỉ bằng zanamivir hoặc nano bạc AgNPs trở nên yếu và tối sau khi được xử lý bằng Ag @ ZNV. Những kết quả này cho thấy rằng Ag @ ZNV đã hạn chế sự tạo ROS do nhiễm vi rút H1N1 gây ra.

Hình 7 Hạn chế sự tạo ROS bởi Ag @ ZNV trong các tế bào MDCK bị nhiễm H1N1. (A) Mức ROS được phát hiện bằng cường độ huỳnh quang DCF. (B) Tế bào được ủ với 10 μM DCFH-DA trong 30 phút sau đó được xử lý bằng Ag @ ZNV (độ phóng đại, × 100). Các thanh có các ký tự khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P <0,01 (**). Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM.

3.8 Đường dẫn tín hiệu qua trung gian ROS

Sản xuất quá mức ROS gây ra tổn thương DNA và tiếp tục dẫn đến quá trình apoptosis của tế bào thông qua việc điều chỉnh các con đường tín hiệu như p38 và p53. Do sự ức chế sự tạo ROS do vi rút H1N1 gây ra, chúng tôi đã kiểm tra thêm sự biểu hiện của các protein sau khi được xử lý bằng Ag @ ZNV bằng phương pháp Western blot. Như được trình bày trong Hình 8B , việc lây nhiễm H1N1 dẫn đến các quy định về biểu hiện của p38, p-p38, p53 và p-p53. Ngược lại, chúng được điều chỉnh một phần khi các tế bào được xử lý bằng Ag @ ZNV. Những kết quả này phản ánh rằng các con đường truyền tín hiệu p38 MAPK và p53 qua trung gian ROS có tác dụng ức chế quá trình chết rụng tế bào do vi rút H1N1 gây ra bởi Ag @ ZNV.

Hình 8 Ức chế các con đường truyền tín hiệu apoptosis qua trung gian ROS bởi Ag @ ZNV trong các tế bào MDCK bị nhiễm H1N1. (A) Ức chế sự biểu hiện của p38 và p53 được điều chỉnh bởi nhiễm H1N1. (B) Bản phác thảo các đường dẫn tín hiệu p38 và p53 qua trung gian ROS. Nồng độ của Ag @ ZNV, AgNPs và ZNV là 2,5 μg ml ⁻¹ , 2,5 μg ml ⁻¹ và 0,8 nM.

4 Kết luận hiệu quả nano bạc – zanamivir

Kết luận, nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh việc điều chế zanamivir được nạp bởi các hạt nano bạc (Ag @ ZNV). Ag @ ZNV thể hiện khả năng vượt trội trong việc cải thiện khả năng hấp thụ của tế bào và chống lại sự lây nhiễm vi rút H1N1. Hợp chất này rõ ràng làm suy giảm hoạt động neuraminidase của vi rút H1N1 và làm giảm quần thể tế bào apoptotic do nhiễm vi rút H1N1 gây ra. Các cơ chế phân tử tiềm năng cho thấy Ag @ ZNV ức chế quá trình apoptosis qua trung gian caspase-3 thông qua quá trình tạo ROS. Hơn nữa, chúng tôi phát hiện ra rằng các con đường tín hiệu p38 và p53 có liên quan đến việc điều chỉnh giảm quá trình tự chết qua trung gian ROS được kích hoạt bởi Ag @ ZNV trong các tế bào MDCK sau khi nhiễm vi rút H1N1. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng Ag @ ZNV có thể bảo vệ hiệu quả các tế bào MDCK khỏi quá trình apoptosis do nhiễm vi rút cúm H1N1.