Chú thích

Các NP Ag/AgCl được sinh tổng hợp cho thấy tác dụng kháng khuẩn in vitro quan trọng đối với ba chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm nuôi bị ảnh hưởng với bệnh hoại tử gan cấp tính (AHPND) ở tây bắc Mexico. Tôm Litopenaeus vannamei đã được tiếp xúc trong 7 ngày với thức ăn bổ sung NP Ag/AgCl ở 10, 100, 1000 hoặc 10.000 ppm (nồng độ nano bạc cho ăn). Bổ sung NP trong chế độ ăn uống không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, tăng trưởng hoặc tỷ lệ chuyển đổi thức ăn của tôm, nhưng nồng độ cao (1000 và 10.000 ppm) làm giảm đáng kể chỉ số gan.

Việc tiêu thụ ngắn hạn các NP Ag/AgCl tạo ra sự tích lũy sinh học đáng kể của Ag trong gan tụy và ở mức độ thấp hơn trong lớp biểu bì, trong khi tích lũy sinh học trong cơ không đáng kể. Nghiên cứu về sự lọc sạch đã xác nhận sự tiêu hóa nano bạc nhanh ở gan tụy tôm và cho thấy sự nhanh chóng suy giảm tỷ lệ trong gan tụy là tốt.

Nguyên liệu và phương pháp tổng hợp nano bạc

Thuốc thử hóa học, nước lọc vô trùng (W3500), bạc nitrat (209139), muối natri resazurine (R7017) và natri clorua (V000106) từ Sigma-Aldrich (Hoa Kỳ). Các môi trường vi khuẩn Tryptic Soy Agar (TSA), Tryptic Soy Broth (TSB), Mueller Hinton Agar (MHA), Mueller Hinton Broth (MHB) và Agar Agar (AA) được lấy từ Difco (Hoa Kỳ), Rong biển Ulva clathrata (Roth)

Các chủng vi khuẩn Các chủng Vibrio parahaemolyticus thu được từ các bộ sưu tập nuôi cấy trong phòng thí nghiệm tại CIAD Mazatlan, Sinaloa, Mexico. Các mẫu được phân lập từ dạ dày và gan tụy của tôm nuôi bị ảnh hưởng với AHPND ở tây bắc Mexico. Các chủng được duy trì trong bảo quản lạnh (- 80 ° C) cho đến khi được kích hoạt trong TSB bổ sung 2% NaCl.

Chuẩn bị và phân tích độc tố cấp tính ngắn hạn của nano bạc

• Chuẩn bị thức ăn bổ sung

Một loại thức ăn viên thương mại có hàm lượng protein 44% và 8% lipid (742 UANL, Nutrimar, Sinaloa, Mexico) đã được bổ sung bằng cách ngâm với dung dịch nano bạc Ag/AgCl để thu được nồng độ Ag 0, 10, 100, 1000 và 10.000 mg Ag kg-1. Các dung dịch gốc Ag/AgCl NP khác nhau được pha loãng hoặc cô đặc trong cùng một thể tích nước cất cuối cùng (40 mL) và phun vào 100 g thức ăn được cân trước đó và đặt vào khay nhôm. Chế độ ăn được trộn trong 5 phút để đảm bảo đồng nhất hóa hoàn toàn. Cuối cùng, thức ăn được sấy khô ở 50 ° C trong 1 giờ. Nồng độ Ag cuối cùng trong thức ăn bổ sung NP / AgCl được định lượng bằng AAS như mô tả ở trên.

• Nội dung đánh giá độc cấp tính ngắn hạn và phân phối nano bạc trong mô trong xét nghiệm vivo

Thử nghiệm in vivo đầu tiên đã đánh giá độc tính cấp tính bằng các thông số hiệu suất hành vi, tỷ lệ sống và tăng trưởng và phân tích phân bố của nano bạc Ag/AgCl sau 7 ngày tiêu thụ thức ăn với mức thấp (0, 10 và 100 mg Ag kg-1) và cao (1000 , 10.000 mg Ag kg-1) mức ăn kiêng. Trong thí nghiệm, 150 con tôm con [Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) được cung cấp bởi FITMAR, Sinaloa, Mexico (trọng lượng ban đầu 0,400 ± 0,02)] được phân bổ ngẫu nhiên trong 15 bể sợi thủy tinh hình chữ nhật 10L (10 con tôm trên mỗi bể, năm phương pháp xử lý và ba lần lặp lại). Các bể thí nghiệm có sục khí riêng liên tục và được duy trì hàng ngày với 100% trao đổi nước biển nhân tạo thủ công (Pro Aquatics, Fritz Industrial Inc., Mesquite TX, USA) và điều kiện tự nhiên của photoperiod. Nhiệt độ nước, độ mặn và pH, amoniac, nitrit và hàm lượng oxy hòa tan được theo dõi hàng ngày và duy trì trong giới hạn thuận lợi cho sự phát triển của tôm. Khẩu phần thức ăn hàng ngày là 5% tổng sinh khối trên mỗi bể.

• Nội dung thử nghiệm in vivo sự đào thải nano bạc

Thử nghiệm in vivo thứ hai được thực hiện để đánh giá sự suy giảm NP Ag/AgCl bằng cách sử dụng thức ăn bổ sung ở mức 0 và 100 mg Ag kg-1 nồng độ danh nghĩa. Tôm vị thành niên Litopaneis vannnamei được cung cấp bởi FITMAR, Sinaloa, Mexico (trọng lượng ban đầu 1,9 ± 0,20 g) được phân bổ ngẫu nhiên trong chín bể sợi thủy tinh 10 L hình chữ nhật (19 tôm trên mỗi bể, hai lần xử lý và ba lần lặp lại). Các sinh vật được duy trì trong cùng điều kiện như thử nghiệm đầu tiên. Trong giai đoạn hấp thu (7 ngày đầu tiên), các sinh vật được cho ăn chế độ ăn thử nghiệm liều thấp, trong khi giai đoạn thoái hóa (14 ngày tiếp theo) bắt đầu vào ngày 8 của xét nghiệm bằng cách chuyển sang chế độ ăn không bổ sung NP (0 mg Ag/kg). Thời gian thử nghiệm là 21 ngày.

Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc

• Xét nghiệm khuếch tán đĩa

Thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện bằng khuếch tán đĩa cho thấy sự khác biệt đáng kể về đường kính vùng ức chế tăng trưởng giữa ba chủng V. parahaemolyticus (p = 0,001), đối với các sản phẩm (p = 0,001) và trong tương tác của chúng (p = 0,001) với một ANOVA hai chiều (Hình 6). Các đĩa được tẩm NP Ag/ AgCl tạo ra IZ tương ứng là 9,2 ± 0,2, 5,3 ± 0,1 và 5,8 ± 0,2 mm đối với các chủng M5-28, M5-06 và M9-04 V.parahaemolyticus. Dung dịch AgNO3 được thử nghiệm ở cùng nồng độ tạo ra IZ thấp hơn NP Ag/AgCl, với các giá trị lần lượt là 6,5 ± 0,6, 4,6 ± 0,1 và 4,5 ± 0,2 mm cho ba chủng. Ngược lại, chiết xuất rong biển (AEU) không gây ức chế.

• Xét nghiệm vi lọc

Thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện bằng xét nghiệm vi lọc chỉ được thực hiện với các sản phẩm thu được IZ trên xét nghiệm khuếch tán đĩa. Dung dịch nano bạc Ag/AgCl thể hiện nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 3,2 mg mL-1 cho tất cả các chủng được thử nghiệm, trong khi dung dịch AgNO3 cho thấy MIC là 1,6 μg/mL  đối với các chủng V. parahaemolyticus M5-28, M6-05 và 3,2 µg/ mL đối với V. parahaemolyticus M9-04.. Dung dịch NP Ag/AgCl cho thấy nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 6,3 μg/ mL cho ba chủng, trong khi dung dịch AgNO3 trình bày MIC là 3,2 μg/ mL cho các chủng M5-28 và M6-05 và 6,3 mg/ mL cho M9-04 (Bảng 1).

• Đánh giá ngắn hạn trong thử nghiệm vivo

Tính ổn định của hạt nano trong thức ăn bổ sung Ag trong thức ăn thử nghiệm được thể hiện trong Bảng 2. Thức ăn được loại bỏ nước có hàm lượng Ag cao hơn so với thức ăn ban đầu và hạt nano bạc bị mất từ bề mặt thức ăn vào nước biển sau 1 giờ nhỏ hơn 5%.

Kết quả thử nghiệm nano bạc

• Độc tính cấp tính ngắn hạn in vivo và khả năng đào thải nano bạc trong các mô

Trong thử nghiệm tiếp xúc với thức ăn ngắn hạn đầu tiên, các sinh vật cho thấy không có thay đổi hành vi và tỷ lệ sống sót là 100% cho tất cả các phương pháp điều trị. Việc tiêu thụ thức ăn bổ sung trong 7 ngày không gây ra thay đổi đáng kể trong chuyển đổi thức ăn nhưng ảnh hưởng đến tăng trọng (%), được cải thiện đôi chút trong thức ăn tiêu thụ tôm được bổ sung 10 – 100 mg Ag kg-1 thức ăn, và hơi (nhưng không đáng kể) bị trầm cảm ở những con tiêu thụ thức ăn có 10.000 mg Ag kg-1 (Bảng 3). Ngược lại, chỉ số gan (HPI) cho thấy sự giảm đáng kể khi tiêu thụ thức ăn được bổ sung liều cao (1000 và 10.000 mg Ag kg − 1; Hình 7a).

• Kết luận

Trong thử nghiệm in vivo đầu tiên, tiêu thụ thức ăn được bổ sung ở nồng độ thấp (10 và 100 ppm) có tác động tích cực đến tăng trưởng. Kết quả này trùng khớp với kết quả sống sót và tăng trưởng được báo cáo bởi Sivaramasamy và Zhiwei (2016), người đã nuôi tôm L. vannamei (6,82 ± 2,16 g) với nồng độ AgNP tổng hợp 10.000 ppm Bacillus subtilis trong 65 ngày.

Ngược lại, thức ăn bổ sung ở nồng độ cao (1000 và 10.000 ppm) có thể dẫn đến tổn thương gan vừa phải (không thể nhìn thấy), như được đề xuất bằng cách giảm đáng kể HPI. Tác động tiêu cực này đối với HPI, sau đó là tổn thương mô học, đã được báo cáo trong cá hồi sau 8 tuần tiếp xúc với nước có NP ở nồng độ 3300 và 1000 mg Ag L-1 (Monfared và Soltani 2013).

Tuy nhiên, không có nghiên cứu tương tự trên tôm cho phép so sánh với kết quả của chúng tôi về việc giảm HPI và độc tính của nano bạc trong chế độ ăn uống. Về mặt tích lũy sinh học và phân phối sinh học, nồng độ Ag cao nhất được tìm thấy trong gan tụy là không đáng ngạc nhiên, vì tuyến gan tụy giáp xác có thể được coi là một cơ quan mục tiêu cho sự tích tụ của nhiều loại chất.

Ngược lại, cơ bắp cho thấy thực tế không có tích lũy sinh học, điều được mong muốn là nó đại diện cho phần ăn được nhất của tôm. Tuy nhiên, tích lũy sinh học ở cường độ trung bình trong lớp biểu bì cephalothorax cho thấy đuôi tôm có vỏ có thể chứa một số mức nhất định dư Ag. Về vấn đề này, một số nghiên cứu đã tìm thấy rằng phân phối sinh học và độc tính của hạt nano chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi kích thước hạt, hình dạng, điện tích bề mặt, lớp phủ bề mặt và độ hòa tan (Sivaramasamy và Zhiwei 2016).

Thời gian bán hủy nano bạc từ 4 đến 9 ngày đã được tìm thấy trong các mô được lấy mẫu trong nghiên cứu suy thoái (gan tụy, mang và cơ).

Điều này có nghĩa là chờ thêm một nửa thời gian bán hủy có thể loại bỏ 50% lượng Ag còn lại. Các giá trị này thấp hơn (nhưng khá phù hợp với) mà báo cáo trước đây của Metian et al. (2010), người đã cho thấy giá trị t½ là 10,8 ± 2 ngày đối với sự thoái hóa của Litopenaeus stylirostris sau khi tiếp xúc với chế độ ăn kiêng với Ag + được dán nhãn. ư

Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Silver nanoparticles against acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp and their depuration kinetics
Maribel Maldonado-Muñiz 1 & Carlos Luna2 & Raquel Mendoza-Reséndez 2 & Enrique Díaz Barriga-Castro3 & Sonia Soto-Rodriguez4 & Denis Ricque-Marie1 & Lucia Elizabeth Cruz-Suarez1