Nano bạc trị bệnh lở loét, thối vây, thối đuôi, tụ huyết trùng trên cá

Dịch bệnh trên cá là một trở ngại lớn đối với sự phát triển bền vững của ngành thủy sản. Aeromonas hydrophila là một mầm bệnh thủy sinh truyền nhiễm chính, được cho là tác nhân gây bệnh loét, thối vây, thối đuôi, tụ huyết trùng ở cá và đã phát triển khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh hiện có. Để quản lý sức khỏe cho cá đề nghị phòng bệnh hiệu quả hơn là chữa bệnh. Kỹ thuật khử trùng không loại bỏ được tất cả các mầm bệnh tiềm ẩn trong vùng sinh thái của cá. Các điều kiện stress  như chất lượng nước dưới mức tối ưu, dinh dưỡng kém và ức chế miễn dịch tạo môi trường thuận lợi cho vi khuẩn cơ hội như A. hydrophila [ 6 ], và các chất chống vi trùng như kháng sinh thường được sử dụng để ngăn ngừa dịch bệnh bùng phát. Tuy nhiên, báo cáo gần đây về A. hydrophila từ các mô cá khác nhau cho thấy mầm bệnh đã phát triển khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh như amoxicillin, ampicillin, lincomycin, novobiocin, oxacillin, penicillin, rifampicin và tetracycline [ 7], và do đó, nỗ lực nghiên cứu để tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh đang đạt được động lực [ 8 ].Các hạt nano bạc (AgNP) là các hạt nano linh động về mặt y học và sinh học. Chúng đang được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thương mại để băng vết thương, chẩn đoán, điều trị, xúc tác, cảm biến sinh học, lọc không khí và nước, sơn, bao bì thực phẩm [ 9 – 14 ] v.v … Tổng hợp vật liệu nano là mối quan tâm chính và quan trọng nhất trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano .

Nhiều quy trình hóa học thông thường có sẵn để tổng hợp AgNP, nhưng nhiều hóa chất bổ sung và chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cũng như tăng cường độ ổn định đã được phát hiện là chất gây ô nhiễm môi trường và chất độc hại, do đó gây bất lợi cho hệ sinh vật.

Sự khuếch tán tốt các AgNP này cho các đặc tính kháng khuẩn của chúng cho thấy rằng, chiết xuất từ ​​lá đu đủ tổng hợp AgNPs có hoạt tính kháng khuẩn tối đa ở nồng độ 153,6 μg / ml, và từ lá bạch đàn có hiệu quả thấp nhất. Theo quan sát, hiệu lực của các hạt nano được tăng cường cùng với sự giảm kích thước hạt, từ 60–150 nm ở bạch đàn xuống 25–40 nm ở đu đủ. Do có nguồn gốc hoàn toàn tự nhiên, AgNP được tổng hợp thực vật có thể được áp dụng thay thế cho thuốc kháng sinh và các chất diệt khuẩn khác như một chất điều trị hiệu quả về chi phí và thân thiện với môi trường chống lại các bệnh do A. hydrophila kích thích ở động vật thủy sản.

(Bản quyền thuộc về nanoCMM Technology)

Giới thiệu

Thời gian gần đây, thủy sản tăng trưởng cao nhất trong tất cả các ngành nông nghiệp, được chấp nhận rộng rãi như một loại thực phẩm lành mạnh và giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein cao, chất béo chất lượng và các vi chất dinh dưỡng khác nhau [ 1 , 2 ]. Là một mặt hàng nông nghiệp quan trọng, cá tăng thêm giá trị cho sinh kế nông thôn, tạo việc làm, tạo doanh thu và trên hết là đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu. Thủy sản tạo ra lợi nhuận tài chính dồi dào so với bất kỳ hoạt động nuôi trồng nào trong các cơ thể thủy sinh, thậm chí chỉ thông qua đánh bắt và thu gom. Lĩnh vực này cũng phải đối mặt với nhiều thách thức bao gồm khai thác quá mức, ô nhiễm, biến đổi khí hậu và trên hết là dịch bệnh dẫn đến tăng trưởng chậm và tổn thất tài chính đáng kể.

Trong số một số lượng lớn các mầm bệnh thủy sinh, vi khuẩn Aeromonas hydrophila gram âm đã được ghi nhận từ nhiều loại cá nước ngọt, và có khả năng phát triển trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí [ 3 ]. Đẩy nhanh sự bùng phát các bệnh cho cá khác nhau như loét, thối vây, thối đuôi, tụ huyết trùng, v.v. [ 3 , 4 ]. Ở người, nó được báo cáo là gây ra các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa qua trung gian nước khác nhau ở trẻ em và những người bị suy giảm miễn dịch [ 5 ]. Khả năng lây nhiễm của nó tăng lên khi ô nhiễm môi trường, nhiệt độ nước cao và sự bổ sung của các yếu tố gây stress trong môi trường thủy sinh.

Để quản lý sức khỏe cho cá đề nghị phòng bệnh hiệu quả hơn là chữa bệnh. Kỹ thuật khử trùng không loại bỏ được tất cả các mầm bệnh tiềm ẩn trong vùng sinh thái của cá. Các điều kiện stress  như chất lượng nước dưới mức tối ưu, dinh dưỡng kém và ức chế miễn dịch tạo môi trường thuận lợi cho vi khuẩn cơ hội như A. hydrophila [ 6 ], và các chất chống vi trùng như kháng sinh thường được sử dụng để ngăn ngừa dịch bệnh bùng phát. Tuy nhiên, báo cáo gần đây về A. hydrophila từ các mô cá khác nhau cho thấy mầm bệnh đã phát triển khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh như amoxicillin, ampicillin, lincomycin, novobiocin, oxacillin, penicillin, rifampicin và tetracycline [ 7], và do đó, nỗ lực nghiên cứu để tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh đang đạt được động lực [ 8 ].

Các hạt nano bạc (AgNP) là các hạt nano linh động về mặt y học và sinh học. Chúng đang được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thương mại để băng vết thương, chẩn đoán, điều trị, xúc tác, cảm biến sinh học, lọc không khí và nước, sơn, bao bì thực phẩm [ 9 – 14 ] v.v … Tổng hợp vật liệu nano là mối quan tâm chính và quan trọng nhất trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano.

Nhiều quy trình hóa học thông thường có sẵn để tổng hợp AgNP, nhưng nhiều hóa chất bổ sung và chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cũng như tăng cường độ ổn định đã được phát hiện là chất gây ô nhiễm môi trường và chất độc hại, do đó gây bất lợi cho hệ sinh vật. Sinh tổng hợp AgNPs liên quan đến các chất sinh học lành tính với môi trường là một cách tiếp cận tương đối mới [ 15– 17 ], có thể cách mạng hóa nhiều lĩnh vực công nghệ. Sinh tổng hợp các hạt nano là một kỹ thuật từ dưới lên, có thể mở rộng dễ dàng, thân thiện với môi trường và kinh tế. Khai thác thực vật để tổng hợp như vậy là một thủ tục mới, kinh tế, đơn giản và nhanh chóng.

Nghiên cứu hiện tại sử dụng chất chiết xuất từ ​​lá của bốn loại cây cận nhiệt đới, viz., Mangifera indica (Xoài), Musa paradisiaca (Chuối), Carica đu đủ (Đu đủ) và Eucalyptus terticornis(Bạch đàn) để tổng hợp AgNPs. Việc lựa chọn các loài thực vật dựa trên ba cân nhắc, chẳng hạn như tính sẵn có dễ dàng tại địa phương của chúng, chiết xuất của chúng không phải là chất diệt vi khuẩn đã biết, và chúng thuộc bốn nhóm phân loại đa dạng. Xoài thuộc họ bồ hòn, chuối thuộc họ Zingiberales, đu đủ thuộc họ Brassicales và bạch đàn thuộc họ Myrtales. Hai mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá tiềm năng của chiết xuất từ ​​4 lá trong quá trình tổng hợp AgNPs và đánh giá tiềm năng kháng khuẩn của các hạt nano được tổng hợp chống lại A. hydrophila .

Nguyên liệu và phương pháp tổng hợp nano bạc

Tổng hợp nano bạc

Lá tươi của xoài, chuối, đu đủ và bạch đàn được thu gom tại địa phương và rửa kỹ trong nước máy sau đó là nước cất hai lần. Nước dùng lá được chuẩn bị bằng cách lấy 2 g lá trong 50 ml nước đã khử ion và đun nóng trong 45 phút ở 55 ° C. Dịch chiết lá được thu thập bằng cách gạn và lọc nước dùng. 2 ml mỗi thứ được thêm riêng biệt vào 20 ml dung dịch nước 1 mM của bạc nitrat, và hỗn hợp phản ứng được duy trì ở nhiệt độ môi trường xung quanh cho đến khi quan sát thấy sự thay đổi màu sắc của hỗn hợp thành màu vàng-nâu như một xác nhận của sự hình thành hạt nano.

Đặc tính của AgNP bằng phân tích quang phổ UV – Vis

Sự khử và chuyển đổi ion Ag ⁺ thành AgNPs được đánh giá bằng cách ghi lại độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 380–520 nm sử dụng máy quang phổ UV – Vis (UV-1800, Shimadzu).

Đặc điểm của HR-TEM và EDX

Kích thước của các AgNP được xác định bằng HR-TEM (JEM 2100, JEOL) hoạt động ở 300 kV và các thành phần nguyên tố của chúng được xác định bằng quang phổ EDX (INCAx-Sight, Oxford Instruments) kết nối với HR-TEM.

Thử nghiệm kháng khuẩn của AgNPs

Nano bạc đã được thử nghiệm về khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán tốt. Việc nuôi cấy A. hydrophila được lấy từ Phòng Quản lý Sức khỏe Cá của Viện Nuôi trồng Thủy sản Nước ngọt Trung ương (CIFA), Kausalyaganga, Bhubaneswar. Vi khuẩn được hồi sinh và nuôi cấy trong môi trường LB. Năm giếng có đường kính 6 mm được tạo thành hai bản sao trên mỗi đĩa thạch LB chuyên dụng. Bốn giếng được nạp 50 μl AgNP, với nồng độ 153,6, 76,8, 30,7 và 15,3 μg / ml của dung dịch hạt nano ban đầu, và giếng thứ năm có thể tích tương đương của dịch chiết lá nguyên chất (như đối chứng). Các mẫu cấy được ủ ở 37 ° C trong tủ ấm ổn nhiệt trong 48 giờ, và đường kính (tính bằng mm) của các vùng rõ ràng được đo cho thấy kết quả hoạt động định tính cũng như định lượng.

Kết quả và thảo luận về hiệu quả của nano bạc

Tổng hợp AgNPs

Thực nghiệm mô tả rằng tất cả các công thức thể hiện sự phát triển màu sắc với các thời gian ủ bệnh khác nhau. Khoảng thời gian để màu sắc chuyển sang nâu hoặc nâu vàng biểu thị sự hình thành nano bạc trong dung dịch nước thay đổi trong khoảng từ 3 đến 4 giờ ở bạch đàn và đu đủ; 4–5 giờ với xoài và trên 6 giờ với chuối. Mô hình thay đổi màu sắc này đánh dấu sự chuyển đổi vật liệu bạc số lượng lớn thành dạng AgNPs xảy ra do cộng hưởng plasmon bề mặt [ 18 ]. Sự khác biệt về thời gian mà các hỗn hợp phản ứng này quan sát được đối với sự phát triển màu sắc có thể là do sự khác nhau về khả năng khử của các chất chiết xuất từ ​​lá do các thành phần khác nhau của chúng.

Hình 1. Ảnh cho thấy một 1 mM bạc nitrat, AgNPs tổng hợp từ b Eucalyptus, c xoài, d đu đủ, e chuối chiết xuất lá

Phân tích độ hấp thụ

Các chất chiết xuất từ ​​lá xoài, bạch đàn, chuối và đu đủ tổng hợp các hạt nano có độ hấp thụ cực đại lần lượt ở 442, 465, 454 và 442 nm. Ngoại trừ chiết xuất lá đu đủ tổng hợp nano bạc được tổng hợp sau 72–96 giờ tổng hợp, các chất khác tương đối ổn định. Tất cả các AgNP được tổng hợp đều ổn định trong 24 giờ ngoài sự thay đổi màu sắc như được thể hiện bằng biểu diễn đồ họa của độ hấp thụ và độ dài sóng với các khoảng thời gian xác định (Hình. 2). Bước sóng so với đường cong hấp thụ cho thấy rằng theo thời gian, cực đại hấp thụ dịch chuyển đến dải 420–450 nm, do sự hình thành tiến bộ của nano bạc. Việc mở rộng các pic xác nhận bản chất đa phân tán của AgNPs.

Hình 2. UV-Vis quang phổ của AgNPs trong tổng hợp sử dụng một Eucalyptus, b xoài, c đu đủ và d chiết xuất lá chuối

Phân tích kích thước và thành phần nguyên tố

Trình bày hiển vi HR-TEM, phổ SAED, EDX của các AgNP được tổng hợp từ các chất chiết xuất từ ​​lá của xoài, bạch đàn, đu đủ và chuối tương ứng. Ảnh hiển vi HR-TEM của AgNPs chiết xuất từ ​​xoài, bạch đàn, đu đủ và chuối cho thấy kích thước và hình dạng của chúng là 50–65 và hình trứng, 60–150 và hình bầu dục, lần lượt là 25–40 và tròn, và 10–50 nm và không đều. Vì kích thước của nano bạc ‘chuối’ là nhỏ nhất (10–50 nm) và của ‘bạch đàn’ là lớn nhất (60–150 nm), kích thước thay đổi của chúng là do sự khác biệt về thành phần hóa học của phytoextracts. Chiết xuất vỏ chuối tổng hợp các hạt nano vàng (AuNPs) đã được báo cáo trong phạm vi 300 nm [ 19 ]. Một xu hướng đáng khích lệ trong nghiên cứu hiện tại là các AgNP ‘chuối’ được tổng hợp nhỏ hơn. Một nghiên cứu trước đó [ 20] đã báo cáo kích thước và hình dạng của chiết xuất lá Eucalyptus hybrida tổng hợp AgNPs là 50–150 nm và hình khối, trong khi dữ liệu tương tự trong nghiên cứu hiện tại là 60–150 nm và hình bầu dục. Quang phổ tia X phân tán năng lượng để xác định và xác nhận thành phần nguyên tố của nguyên tố cơ bản trong nano bạc cho thấy một đỉnh nhọn ở 2,9 keV trong tất cả bốn máy quang phổ EDX, do đó xác nhận các hạt nano là của bạc. Một đỉnh khác mô tả sự hiện diện của đồng, một vật liệu cơ bản trong lưới điện. Rõ ràng là các chất chiết xuất từ ​​phyto chứa các hợp chất khác nhau, ngoài việc là chất khử, còn hoạt động như chất đóng nắp. Hiệu ứng tập thể của các protein, enzym, cacbohydrat và vitamin cấu thành có thể làm giảm các ion bạc [ 15 – 17]. Các phân tích FTIR đã chỉ ra rằng các polyol như hydroxyl flavon và catechin, v.v. có sẵn trong lá làm giảm các ion bạc trong quá trình tạo hạt nano [ 21 ].

Hình 3. a Kích thước, b biểu đồ phân bố kích thước, c HEED và d EDX của AgNPs được tổng hợp từ chiết xuất lá Bạch đàn

Hình 4. a Kích thước, b biểu đồ phân bố kích thước, c HEED và d EDX của AgNPs được tổng hợp từ dịch chiết lá xoài

Hình 5.a Kích thước, b biểu đồ phân bố kích thước, c HEED và d EDX của AgNPs được tổng hợp từ chiết xuất lá đu đủ

Hình 6. a Kích thước, b biểu đồ phân bố kích thước, c HEED và d EDX của AgNP được tổng hợp từ dịch chiết lá chuối

Thử nghiệm kháng khuẩn

Chỉ riêng chiết xuất lá (không xử lý Ag ⁺ ) không có bất kỳ hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt nào đối với A. hydrophila khi mà các nano bạc cũng thể hiện như vậy (Hình. 7). AgNPs của ‘đu đủ’ cho thấy hoạt động cao nhất và từ cây bạch đàn thể hiện ít nhất. Các vùng ức chế các AgNP được đưa ra trong Bảng 1. Từ đó, rõ ràng là các hạt nano đã hoạt động đáng kể chống lại A. hydrophila , có thể do nhiều cơ chế. Ag ⁺ làm giảm sự hấp thu phosphat ở Escherichia coli và thúc đẩy dòng chảy của phosphat tích lũy cũng như của mannitol, succinat, glutamine và proline, đồng thời phá vỡ động lực proton do đó có thể gây chết tế bào vi sinh vật [ 22 ]. Các nghiên cứu cũng cho rằng AgNPs có thể tương tác với các protein chứa lưu huỳnh và làm bất hoạt các axit amin có liên kết disulfide. Ngoài ra, các hạt này có thể tạo thành các lỗ trên thành tế bào khiến nó dễ dàng thấm qua và do đó dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [ 23]. Các hạt nano nhỏ hơn với tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích lớn hơn có hại hơn vì diện tích bề mặt tương tác rộng [ 24 , 25 ]. Do đó, hoạt động kháng khuẩn của AgNPs phụ thuộc vào hình dạng và kích thước. Sự liên kết của AgNPs cũng phụ thuộc vào diện tích bề mặt có sẵn của nó. Nano bạc hình tam giác và cắt ngắn là chất diệt khuẩn mạnh nhất [ 26 ], tương tự như các phát hiện trong nghiên cứu hiện tại (Bảng 1) ở nồng độ 153,7 μg / ml. Do đó, sự thay đổi trong các hoạt động kháng khuẩn là do kích thước nhỏ hơn của AgNPs ‘đu đủ’ và kích thước lớn hơn của loại cây có nguồn gốc từ bạch đàn, phù hợp với báo cáo trước đó [ 27 ].

1. Việc điều chỉnh các yếu tố độc lực là rất quan trọng đối với quá trình lây nhiễm và lây truyền của mầm bệnh. Yếu tố độc lực của vi khuẩn được báo cáo là nằm dưới sự kiểm soát của các phân tử tín hiệu như acylated homoserine lactone (AHL) được tạo ra trong hiện tượng cảm nhận đại biểu (QS) phụ thuộc vào mật độ tế bào [ 28]. Aeromonas hydrophila cũng đã được phát hiện để tạo ra các phân tử như vậy để phát triển trong vật chủ [ 29 ]. Hơn nữa, nó ngày càng trở nên đề kháng với hầu hết tất cả các loại kháng sinh được khuyến nghị hiện có do sự phát triển của cơ chế bảo vệ chống lại kháng sinh bằng cách khai thác nguồn biến đổi gen lớn của chúng [ 27]. Vì vậy, điều quan trọng là phải nhắm mục tiêu các yếu tố độc lực này bằng vũ khí phân tử do các vi sinh vật khác tạo ra để ngăn ngừa nhiễm trùng do vi khuẩn này và các bệnh tiếp theo [ 30 , 31 ].

Hình 7 Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp sử dụng một Eucalyptus, b xoài, c đu đủ và d chiết xuất lá chuối, chống Aeromonas hydrophila . Giếng ii , iii , iv và v được nạp 153,6, 76,8, 30,7 và 15,3 μg / ml AgNP, trong khi giếng i (đối chứng) trong mỗi trường hợp được nạp một mình dịch chiết lá nguyên chất tương ứng.

AgNPs được báo cáo là ức chế sự hình thành màng sinh học bằng cách phá vỡ tín hiệu QS [ 32 ]. Nó cũng hoạt động nội bào trên nhiều vị trí để làm bất hoạt các chức năng sinh lý quan trọng như vận chuyển màng tế bào, tổng hợp và dịch mã axit nucleic, chức năng và gấp protein, và vận chuyển điện tử [ 22 , 23 ]. Do đó, vì nó phải trải qua các đột biến đồng thời ở mọi chức năng quan trọng trong một thế hệ duy nhất để thoát khỏi ảnh hưởng của chất kháng khuẩn, nên rất khó để bất kỳ vi sinh vật nào phát triển khả năng kháng lại nano bạc [ 33 ]. Một số chất phytochemical được biết đến như là chất khử túc số (QQ) được báo cáo là ức chế tín hiệu QS [ 34]. Vì vậy, các AgNP được tổng hợp phyto có thể có tác dụng tích lũy QQ tự nhiên và tổng hợp để được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản như một ứng cử viên tiềm năng làm thuốc và / hoặc chất khử trùng để điều trị nhiễm trùng A. hydrophila và các bệnh liên quan.

Nghiên cứu về các polyme phân hủy sinh học để giải phóng có kiểm soát các hạt nano trong điều kiện thực địa đang đạt được đà phát triển. Các quy trình tích hợp để sản xuất năng lượng sinh học và chất tạo màng sinh học cũng ngày càng trở nên quan trọng. Các công trình tiểu thuyết về sản xuất PHB bởi Bacillus không quang hợp trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau [ 35 ], và tạo ra các hạt nano bởi B. thuringiensis trong các điều kiện sinh lý đã được sửa đổi [ 14 ] đã được báo cáo gần đây. Một nghiên cứu gần đây khác so sánh các phương pháp xử lý kháng khuẩn của màng bao bì thông qua chiếu xạ gamma và ngâm tẩm AgNPs [ 36 ] báo cáo rằng tổng số vi khuẩn ưa khí hiếu khí, Enterobacteriaceae, E. coli vàClostridium perfringens cho thấy vùng ức chế lớn hơn khi được chiếu xạ ở 4 kGy mà không có AgNPs và ở 2 kGy với ngâm tẩm nano bạc, điều này càng củng cố thêm quan điểm kháng khuẩn về AgNPs.

Phần kết luận

Các nano bạc được tổng hợp bằng thực vật có hoạt tính diệt khuẩn chống lại mầm bệnh cho cá có thể trở thành tài sản cho ngành đánh bắt và nuôi trồng thủy sản như một giải pháp thay thế tiềm năng cho thuốc kháng sinh [ 37 ]. Việc sử dụng các AgNP sinh tổng hợp thân thiện với môi trường như vậy thay thế cho các AgNP được tổng hợp hóa học sẽ giúp kiểm soát độc tính hóa học trong môi trường. Các nano bạc được tổng hợp hữu cơ như vậy cũng có thể được nhúng trong các bể xi măng, hồ nhựa hoặc bất kỳ thiết bị lắp dựng nào khác được sử dụng trong ngành thủy sản để cung cấp một môi trường nuôi cấy bền vững không nhiễm trùng.

Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây

Nguồn tham khảo: Phytoextracts-Synthesized Silver Nanoparticles Inhibit Bacterial Fish Pathogen Aeromonas hydrophila

Arabinda Mahanty, Snehasish Mishra, Ranadhir Bosu, UK Maurya, Surya Prakash Netam, and Biplab Sarkar