Nano kẽm oxit và hạt kẽm oxit thông thường được so sánh hiệu quả diệt khuẩn và nấm

Công nghệ nano ngày càng trở nên phổ biến trong dược phẩm và mỹ phẩm và có ý nghĩa quan trọng như một phương pháp tiếp cận để tiêu diệt hoặc làm giảm hoạt động của nhiều vi sinh vật. Các vật liệu kháng khuẩn tự nhiên, chẳng hạn như kẽm và bạc, được cho là có đặc tính kháng khuẩn tốt. Các hạt kích thước nano của kẽm oxit đã được khẳng định là có hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt hơn các hạt lớn. Khả năng kháng khuẩn / kháng nấm của nano kẽm oxit ZnO đối với năm mầm bệnh (Escherichia coli MTCC 443, Staphylococcus aureus MTCC 3160, Bacillus subtilis MTCC 441, Aspergillus niger MTCC 281, Candida albicans MTCC 227) và ảnh hưởng của kích thước các hạt của bột vô cơ này lên khả năng kháng khuẩn / kháng nấm của nó hiệu quả đã được xem xét trong nghiên cứu này.

(Bản quyền NanoCMM Technology)

GIỚI THIỆU

Công nghệ nano đang được hình dung như một lĩnh vực đang phát triển rầm rộ, nó có tiềm năng cách mạng hóa dược phẩm và mỹ phẩm. Công nghệ nano, hoặc việc sử dụng các vật liệu có kích thước cấu thành ở quy mô nguyên tử hoặc phân tử, ngày càng được ứng dụng nhiều hơn vào dược phẩm và mỹ phẩm và được quan tâm nhiều như một phương pháp tiếp cận để tiêu diệt hoặc làm giảm hoạt động của nhiều vi sinh vật. Một số vật liệu kháng khuẩn tự nhiên, chẳng hạn như kẽm và bạc, được cho là có đặc tính kháng khuẩn tốt. Sự hư hỏng do vi sinh vật trong công thức mỹ phẩm luôn được ngành mỹ phẩm đặc biệt quan tâm. Việc sử dụng các chất bảo quản được phép của quy định mới 1123/209 là bắt buộc để ngăn ngừa sự hư hỏng sản phẩm do vi sinh vật gây ra và để bảo vệ sản phẩm khỏi bị ô nhiễm không mong muốn bởi người tiêu dùng trong suốt thời hạn sử dụng. Tuy nhiên, kể từ vài năm nay, ngành công nghiệp mỹ phẩm đang phải đối mặt với một số hạn chế liên quan đến việc sử dụng một số chất bảo quản. Vì vậy, đã có sự quan tâm đáng kể đến việc phát triển các chất bảo quản mới. Trong số các nguyên liệu thô thể hiện đặc tính kháng khuẩn / chống nấm, bột vô cơ như oxit kẽm (ZnO) là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các chất bảo quản hóa học này [1, 2]. Kẽm oxit là chất bán dẫn II-VI không độc, có độ rộng vùng cấm rộng (3,37eV) và độ dẫn điện loại n tự nhiên [3, 4]. Kẽm oxit vì những đặc tính thú vị của nó, chẳng hạn như độ trong suốt quang học, độ dẫn điện, áp điện, phát xạ tia cực tím gần [5, 6, 7, 8, 9, 10] và các hình thái khác nhau, đã trở thành một trong những vật liệu nano hấp dẫn nhất cho các mục tiêu nghiên cứu . Các đặc tính quan trọng của nó đã làm cho nó có thể áp dụng trong bộ phát tia UV, biến thể, thiết bị điện tử công suất cao trong suốt, thiết bị sóng âm bề mặt, đầu dò điện áp, cảm biến khí, v.v. [11].

Việc sử dụng kẽm oxit trong các loại kem và gel mỹ phẩm làm cho chúng có khả năng chống nắng và kháng khuẩn [12]. Hiệu quả của hoạt động của chúng phần lớn phụ thuộc không chỉ vào nồng độ của hoạt chất, kẽm oxit, mà còn vào kích thước của các hạt của nó, sự thay đổi của chúng và mức độ phân tán đa sắc. Hơn nữa, kẽm oxit (ZnO) được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ liệt kê là “thường được công nhận là an toàn” (GRAS) (21CFR182.8991). Các hạt ZnO có kích thước nano đã được khẳng định là có hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt hơn các hạt lớn, xét trên thực tế là kích thước nhỏ (dưới 100 nm) và tỷ lệ thể tích bề mặt cao của các hạt nano có thể cho phép tương tác tốt hơn với vi khuẩn. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các hạt nano này có độc tính chọn lọc đối với vi khuẩn nhưng lại thể hiện tác động tối thiểu lên tế bào người [1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]. Ngay cả khi ZnO đã được sử dụng trong một thời gian dài trong mỹ phẩm hoặc thuốc mỡ dược phẩm, các đặc tính kháng khuẩn của nó vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ trong bối cảnh bảo quản mỹ phẩm. Một nghiên cứu có hệ thống và chi tiết đã được thiết kế, có tính đến các tuyên bố ở trên, để điều tra các đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm nâng cao của oxit kẽm nano so với nghiên cứu thông thường. Do đó, mục đích của bài báo này trước hết là chứng minh tiềm năng kháng khuẩn / kháng nấm của ZnO trên 5 mầm bệnh (Escherichia coli MTCC 443, Staphylococcus aureus MTCC 3160, Bacillus subtilis MTCC 441, Aspergillus niger MTCC 281, Candida albicans MTCC 227) đó là được sử dụng cho các bài kiểm tra thử thách, và thứ hai để xác định ảnh hưởng của kích thước các hạt của bột vô cơ này đến hiệu quả kháng khuẩn / chống nấm của nó.

PHẦN THỰC NGHIỆM

Vật liệu

Các hạt nano kẽm oxit có đường kính ~ 65 nm đã được tổng hợp và sử dụng trong nghiên cứu này. Hình ảnh TEM đại diện của các hạt nano kẽm oxit ~ 65 nm được thể hiện trong hình. 1. Các hạt nano oxit kẽm thông thường có đường kính ~ 1000nm được sử dụng để so sánh.

Lựa chọn mầm bệnh thử nghiệm

Các vi sinh vật gây bệnh được lựa chọn cho nghiên cứu bao gồm ba vi khuẩn, viz., Escherichia coli (MTCC 443), Staphylococcus aureus (MTCC 3160), Bacillus subtilis (MTCC 441) và hai loại nấm, viz., Aspergillus niger (MTCC 281) và Candida albicans ( MTCC 227).

Chuẩn bị dung dịch pha loãng của các hợp chất tổng hợp

10 mg mỗi hạt (nano kẽm oxit và oxit kẽm thông thường) được cân chính xác và hòa tan trong 10 ml DMSO để tạo ra dung dịch có nồng độ 1mg / ml. 1 ml dung dịch trên lại được pha loãng thành 10 ml bằng DMSO để tạo ra dung dịch có nồng độ 100µg / ml.

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng Agar (cho vi khuẩn)

5,6g Agar được hòa tan trong 150ml nước cất và đun nóng. Môi trường được khử trùng bằng cách hấp ở 115oC trong 30 phút.

Chuẩn bị Sabouraud Dextrose Agar (cho nấm)

9.20g Sabouraud Dextrose Agar được hòa tan trong nước cất và đun nóng. Môi trường được khử trùng bằng cách hấp ở 115oC trong 30 phút.

Chuẩn bị môi trường canh dinh dưỡng

0,75 g môi trường (Vi khuẩn / nấm) được hòa tan trong 30 ml nước cất và đun nóng. Môi trường sau đó được khử trùng bằng cách hấp ở 115oC trong 30 phút.

Chuẩn bị phương pháp xiên vi khuẩn và nấm

Năm chai Nessler được khử trùng bằng phương pháp khử trùng nóng trong tủ sấy ở 160oC trong 30 phút. Tủ thổi khí Laminar được lau bằng bông nhúng trong etanol và BẬT UV trong 15 phút. Môi trường vi khuẩn và nấm đã được sấy khô được đổ vào 5 ống trụ Nessler đã khử trùng (3 vi khuẩn, 2 nấm) và được để trong vị trí nghiêng cho đến khi môi trường trong xi lanh được đóng rắn. Dây vòng cứng được sử dụng để chuyển các chủng vi khuẩn và nấm sang các ống trụ nhỏ hơn. Sau đó, các hình trụ nessler được dán nhãn và các nút bông được gắn vào miệng của chúng và được ủ ở 37oC trừ aspergillus niger (được ủ ở 25oC) trong 24 giờ. Từ mỗi chủng, một phần nhỏ được chuyển sang 3ml môi trường canh dinh dưỡng riêng biệt và ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Người ta chuyển 0,1 ml của năm chất trung gian trên vào năm bình nón khác nhau có nắp đậy chứa dung dịch NaCl 0,9%.

Hoạt động kháng khuẩn: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn / diệt nấm tối thiểu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định đối với các hạt nano kẽm oxit thông thường và có kích thước nano cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm chống lại các mầm bệnh thử nghiệm bằng phương pháp pha loãng nối tiếp. Phương pháp pha loãng trong nước dùng được thực hiện để xác định giá trị MIC. 1ml môi trường được lấy vào ống nghiệm, trong đó, 1ml dung dịch thử (100µg / ml) được thêm vào. Sau đó, 0,1ml chủng vi sinh vật (vi khuẩn / nấm) đã chuẩn bị trong NaCl 0,9% được cho vào ống nghiệm chứa môi trường và dung dịch thử. Pha loãng nối tiếp được thực hiện năm lần cho các nồng độ 50, 25, 12,5, 6,25, 3,75, 1,5 µg / ml. Đậy ống nghiệm bằng bông và ủ ở 37oC. Thời gian ủ khác nhau đối với các chủng khác nhau (vi khuẩn / nấm), tức là 24 giờ đối với vi khuẩn và một tuần đối với nấm.

Các giá trị MIC được lấy là nồng độ thấp nhất của các hạt trong ống nghiệm không bị đục sau khi ủ. Độ đục của các thành phần trong ống nghiệm được hiểu là sự phát triển có thể nhìn thấy của vi sinh vật. Nồng độ vi khuẩn / diệt nấm tối thiểu (MBC / MFC) được xác định bằng cách cấy phụ 50µl từ mỗi ống nghiệm cho thấy không có sự phát triển rõ ràng. Nồng độ chất thử ít nhất cho thấy không có sự phát triển nhìn thấy được khi nuôi cấy con được lấy là MBC / MFC.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Các hạt nano kẽm oxit đã được đặc trưng đầy đủ. Hình ảnh TEM đại diện của các hạt nano ZnO (~ 65 nm) được thể hiện trong hình 1. Thứ hai, các đặc tính kháng khuẩn của các hạt ZnO thông thường và các hạt nano ZnO đã được nghiên cứu. Cả hai hạt thông thường và hạt nano đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại Escherichia coli MTCC 443, Staphylococcus aureus MTCC 3160 và Bacillus subtilis MTCC 441 với tác dụng phụ thuộc vào kích thước. Hình 2 & Hình 3 mô tả hành vi của các quần thể vi khuẩn sau khi ủ với các hạt ZnO thông thường và các hạt nano ZnO trong 24 giờ. Nồng độ ức chế tối thiểu của các hạt nano ZnO (như thể hiện trong bảng 1) chống lại

ba loại vi khuẩn, viz., Escherichia coli MTCC 443, Staphylococcus aureus MTCC 3160 và Bacillus subtilis MTCC 441 được tìm thấy lần lượt là 6,25µg / ml, 6,25µg / ml, 12,5µg / ml, nồng độ rất ít hơn so với của các hạt oxit kẽm thông thường (25µg / ml, 12,5µg / ml, 12,5µg / ml, tương ứng). Tương tự, số lượng vi khuẩn tối thiểu đối với các hạt nano ZnO trong mỗi trường hợp ít hơn so với các hạt ZnO thông thường (bảng 1 & 2). Hình 4 & hình 5 mô tả sự phát triển mạnh mẽ của vi khuẩn trên đĩa khi có mặt các hạt oxit kẽm thông thường và ít vi khuẩn phát triển hơn trên đĩa khi có mặt các hạt nano ZnO. Sự khác biệt về độ nhạy đối với cùng một chất thử nghiệm giữa ba chủng này có thể là do sự khác biệt về cấu trúc và hóa học

thành tế bào vi khuẩn của chúng [20]. Theo một nghiên cứu của Yamamoto và cộng sự, 2000 [21], sự hiện diện của các loại oxy phản ứng (ROS) được tạo ra bởi các hạt nano ZnO chịu trách nhiệm cho hoạt động diệt khuẩn của chúng. Zhang và cộng sự, 2010 [22], đề xuất thêm rằng hành vi kháng khuẩn của các hạt nano ZnO có thể là do tương tác hóa học giữa hydrogen peroxide và các protein màng, hoặc giữa các loại hóa chất khác được tạo ra khi có mặt các hạt nano ZnO và lớp lipid kép bên ngoài của vi khuẩn. Hydrogen peroxide được tạo ra xâm nhập vào màng tế bào của vi khuẩn và giết chết chúng. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các hạt ZnO có kích thước nano có nhiệm vụ ức chế sự phát triển của vi khuẩn [22]. Hơn nữa, Padmavathy và Vijayaraghavan, 2008 [23], cho thấy hoạt động diệt khuẩn của các hạt nano ZnO. Theo phát hiện của họ, một khi hydrogen peroxide được tạo ra bởi các hạt nano ZnO, các hạt nano vẫn tiếp xúc với vi khuẩn đã chết để ngăn vi khuẩn tiếp tục hoạt động và tiếp tục tạo ra và thải hydrogen peroxide ra môi trường. Kết quả của nghiên cứu hiện tại tương ứng với kết quả của các tác giả ở trên, cho thấy các hạt nano ZnO có hoạt tính kháng khuẩn tuyệt vời. Kẽm oxit cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm nhưng ở mức độ nhẹ hơn chất kháng khuẩn vì không có hoạt tính diệt nấm nào được báo cáo. Các hạt nano ZnO đã cho thấy hoạt tính chống lại Aspergilllus Niger và Cadida ablicans ở nồng độ lần lượt là 12,5µg / ml và 6,25µg / ml. Một lần nữa nồng độ này cao hơn đối với các hạt ZnO thông thường, tức là 25 và 12,5, tương ứng (bảng 1). Số lượng nấm tối thiểu cho các hạt nano oxit kẽm được tìm thấy giống với Nồng độ ức chế tối thiểu, tức là 12,5µg / ml và 6,25µg / ml, tương ứng. Tương tự như trường hợp của các hạt ZnO thông thường trong trường hợp Aspergillus niger, trong đó MFC (25µg / ml) giống với MIC (25µg / ml). Nhưng hoạt tính kháng nấm chống lại nấm candida albicans cho thấy mô hình khác nhau khi cho rằng MFC (25µg / ml) nhiều hơn MIC (12,5µg / ml). Hình 6 & Hình 7 đại diện cho sự phát triển mạnh mẽ của nấm trên đĩa khi có mặt các hạt oxit kẽm thông thường và ít nấm phát triển hơn trên đĩa khi có mặt các hạt nano ZnO.

PHẦN KẾT LUẬN

Kết quả trong nghiên cứu này chỉ ra rằng các hạt nano oxit kẽm có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và kháng nấm tốt đối với các chủng vi khuẩn và nấm được chọn so với các hạt oxit kẽm thông thường. Tóm lại, nghiên cứu hiện tại cho thấy các hạt nano oxit kẽm có thể là một chất kháng khuẩn và kháng nấm để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm gây ra. Trong tương lai, các hạt nano này có thể thay thế các chất bảo quản thông thường trong mỹ phẩm. Tuy nhiên, tác dụng kháng khuẩn / kháng nấm, tính an toàn và cơ chế chi tiết của các hạt nano oxit kẽm cần được nghiên cứu thêm trong ống nghiệm và in vivo.