Nano bạc ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm

Mối quan tâm liên tục được đặt ra về tính an toàn của chất bảo quản, vốn rất quan trọng trong hầu hết các chế phẩm mỹ phẩm. Tác dụng kháng khuẩn của bạc (Bạc) đã được công nhận; tuy nhiên, Bạc có một số hạn chế như một chất bảo quản, chẳng hạn như sự ảnh hưởng của nó với các muối. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của  nano bạc mới được tổng hợp gần đây đối với vi sinh vật, khả năng thẩm thấu qua da người và độc tính tế bào của AgNPs trong tế bào sừng của người khi chiếu tia cực tím UVB. AgNPs được phát hiện là rất ổn định và chúng không bị lắng trong hơn 1 năm. AgNPs cho thấy hiệu quả bảo quản đủ chống lại vi khuẩn hỗn hợp và nấm hỗn hợp, đồng thời không xâm nhập vào da người bình thường. Ở nồng độ 0,002–0,02 ppm,  nano bạc không có tác dụng lên tế bào sừng HaCaT và không làm tăng quá trình chết tế bào do tia cực tím UVB gây ra. Những kết quả này cho thấy rằng AgNPs có tiềm năng được sử dụng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm.

Bản quyền thuộc về nanoCMM Technology

GIỚI THIỆU

Chất bảo quản là cần thiết để ngăn ngừa ô nhiễm vi sinh vật sơ cấp trong quá trình pha chế và sản xuất mỹ phẩm, và ngăn ô nhiễm vi sinh vật thứ cấp sau khi sản xuất khi người tiêu dùng mở và đóng hộp. Là chất bảo quản mỹ phẩm, các hợp chất như phenoxyethanol và paraben đã được sử dụng riêng hoặc kết hợp khác nhau.

Tuy nhiên, các hợp chất kháng khuẩn này không chỉ kích thích da tạm thời mà còn làm tăng độ nhạy cảm với tia cực tím (UV). Trên thực tế, chúng tôi đã chỉ ra rằng methylparaben (MP) trong phạm vi nồng độ được khuyến nghị có thể gây độc khi tiếp xúc với tia UVB. Mặt khác, hoạt tính kháng khuẩn của một lượng nhỏ kim loại, được công nhận lần đầu tiên vào thế kỷ 19, là cơ sở cho nhiều quy trình và sản phẩm kháng khuẩn.

Trong số này, các hợp chất dựa trên bạc (Bạc) và Bạc đã được sử dụng rộng rãi và được sử dụng để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn trong nhiều ứng dụng khác nhau. Những hiện tượng này cản trở đáng kể việc sử dụng Bạc làm chất bảo quản mỹ phẩm, vì các hoạt động kháng khuẩn của nó bị tổn hại khi Bạc bị tách ra khỏi các thành phần mỹ phẩm. Nhiều vấn đề trong số này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng nano bạc (AgNPs). Giảm kích thước hạt cũng cải thiện khả năng tương thích sinh học, và điều này đã dẫn đến sự chú ý ngày càng tăng tập trung vào các ứng dụng y tế của công nghệ nano. Bởi vì chúng tôi quan tâm đến việc sử dụng tiềm năng của nano bạc làm chất bảo quản trong dược phẩm hoặc mỹ phẩm, mục đích của nghiên cứu của chúng tôi là tìm hiểu xem AgNPs có hoạt động kháng khuẩn chống lại nhiều vi sinh vật hay không và liệu  AgNPs có an toàn cho da hay không.

Phương pháp thử nghiệm nano bạc

• Mẫu nano bạc

Hạt AgNPs được lấy từ Công ty TNHH Johzen (Kyoto, Nhật Bản). Nồng độ Bạc trong dung dịch ban đầu của  AgNPs là 50 phần triệu (ppm; nước tinh khiết 96,995%, natri bicacbonat 1%, gôm xenluloza 2%, Bạc 0,005%).

Điện thế zeta bề mặt, kích thước và sự phân bố kích thước của  AgNPs được phân tích bằng phương pháp tán xạ laser (ELS-Z; Otsuka Electronics Co., Ltd., Osaka, Japan).

• Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc

Hoạt tính kháng khuẩn của  AgNPs được đánh giá dựa trên hỗn dịch vi khuẩn (Escherichia coli, American Type Culture Collection [ATCC] 8739; Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027; Staphylococcus aureus, ATCC 6538), hỗn dịch nấm (nấm men và nấm mốc) (Candida albicans, ATCC 10231; Aspergillus niger, ATCC 16404; Penicillium citrium, ATCC 9849; Aureobasidium pullulans, IFO 6353), và huyền phù chất thải (hệ thống thoát nước nhà bếp được lọc). Mỗi chủng đều được cấy trên bề mặt của thạch nghiêng. Môi trường thạch tiêu hóa casein đậu nành được sử dụng để phát triển vi khuẩn và môi trường thạch dextrose khoai tây để phát triển nấm men và nấm mốc. Các mẫu cấy vi khuẩn được cấy ở 30 °C trong 20 giờ, nuôi cấy nấm men ở 25 ° C trong 48 giờ, và cấy nấm mốc ở 25 °C trong 1 tuần. Các vi sinh vật được thu hoạch vô trùng bằng cách sử dụng một vòng platin, sau đó là huyền phù trong nước muối sinh lý vô trùng, và số lượng vi sinh vật sống sót được điều chỉnh thành khoảng 10⁸ vi sinh vật trên mỗi ml. Những huyền phù này được sử dụng làm chất cấy, trong khi hệ thống thoát nước của bếp đã lọc được sử dụng trực tiếp làm nguồn cấy.

Đối với thử nghiệm, 20 g AgNPs (1,0 ppm, được tạo thành từ nano 50 ppm Bạc bằng cách pha loãng với nước tinh khiết) được chuyển vô trùng vào từng lọ trong số ba lọ đã khử trùng, và mỗi lọ được cấy 0,2 mL huyền phù vi sinh vật. Sau đó, các lọ đã cấy huyền dịch vi khuẩn được ủ ở 30 ° C, và những lọ đã cấy huyền dịch nấm được ủ ở 25 ° C. Số lượng vi sinh vật sống sót được xác định ở 7, 14 và 21 ngày bằng phương pháp tấm đổ.

• Sự thâm nhập vào da của nano bạc

Nano bạc được đánh giá trong một thử nghiệm đi qua da chuyên dụng bằng cách sử dụng da người. Việc chuẩn bị mẫu được thực hiện bởi BIOalternatives (Gençay, Pháp). Các mảnh da người (4 cm × 4 cm) được chuẩn bị từ một đối tượng khỏe mạnh trong quá trình phẫu thuật thẩm mỹ (người hiến tặng nữ, 49 tuổi).

Chất lượng da được quan sát bằng mắt thường và các vùng bị thay đổi được loại bỏ. Mỗi mảnh da được đặt như một rào cản giữa hai nửa của tế bào khuếch tán, với lớp sừng đối diện với buồng hiến tặng. Khoang thụ thể chứa đầy 8 mL chất lỏng thụ thể (nước muối đệm phosphat, PBS), đậy nắp và để đạt đến nhiệt độ chính xác.

Mẫu da được giữ ở 32 ° C bằng cách lưu thông chất lỏng được kiểm soát nhiệt độ trong áo khoác xung quanh buồng thụ cảm. Nano bạc có nồng độ 0,5 ppm hoặc 50 ppm được đưa lên bề mặt da (55 μL / cm2). Thử nghiệm được thực hiện trong 24 giờ trong ba lần. Ở 1, 6, 12 và 24 giờ, môi trường bên dưới da được thu hoạch và ngay lập tức được làm đông lạnh ở -80 ° C cho đến khi đo được nồng độ Bạc.

Nồng độ Bạc được xác định bằng phương pháp khối phổ huyết tương kết hợp cảm ứng (ICP-MS) sau khi phân hủy mẫu bằng vi sóng. Thiết bị được sử dụng trong ICP-MS là SPI-9000 (SII NanoTechnology Inc., Tokyo, Nhật Bản)

Sau khi kiểm tra xét nghiệm thâm nhập da, da được đông lạnh ở -80 ° C cho đến khi đo nồng độ Bạc trong mô da. Nồng độ Bạc của da được xác định bằng phép đo phổ phát xạ nguyên tử ICP (ICP-AES) sau khi phân hủy mẫu bằng vi sóng. Thiết bị được sử dụng trong ICP-AES là ICPS8000 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan).

• Tế bào sừng ở người bình thường

Tế bào sừng HaCaT là một dòng tế bào bất tử một cách tự nhiên của con người và được cung cấp bởi Tiến sĩ Kato thuộc Khoa Da liễu của Đại học Y khoa tỉnh Kyoto (Kyoto, Nhật Bản). Tế bào sừng HaCaT được nuôi cấy trong bình nuôi cấy tế bào 80 cm2 và được duy trì trong môi trường thiết yếu đã được sửa đổi của Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland) được bổ sung 5% huyết thanh bò mang thai (Equitech-Bio Inc., Kerrvill, Texas), 2 mM glutamine , và 100 U / mL penicillin / streptomycin (Gibco) ở 37 ° C trong môi trường ẩm có chứa 5% CO2. Các tế bào được phân chia 7 ngày một lần theo tỷ lệ 1:10.

• Chiếu tia UVB sau khi xử lý bằng nano bạc hoặc methylparaben

Nguồn UVB gồm sáu đèn chiếu sáng huỳnh quang (FL-20SE-30; Toshiba Medical Supply, Tokyo, Nhật Bản) với phổ phát xạ 275–375 nm, chủ yếu trong phạm vi UVB, đạt cực đại ở 305 nm và bao gồm một lượng nhỏ UVA và UVC (năng lượng: UVA, 30%; UVB, 54%; UVC, 0,2%). Bức xạ UVB được đo bằng máy đo bức xạ UV (UVR3036 / S2; Topcon Corp., Tokyo, Japan).

Tế bào sừng HaCaT được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm cho đến khi hợp lưu và được ủ trong 24 giờ trong điều kiện không có hoặc có mặt của  AgNPs hoặc MP tương ứng. Sau khi xử lý bằng  AgNPs hoặc MP, các tế bào được tiếp xúc với UVB (30 mJ / cm2).

Trước khi chiếu tia UVB, môi trường được gạn lọc và thay thế bằng PBS. Sau khi chiếu xạ, tế bào được ủ trong môi trường nuôi cấy tế bào không có hạt AgNPs hoặc MP trong 24 giờ.

• Phân tích tế bào chết bằng kính hiển vi

Tế bào chết (apoptosis) gây ra bởi  AgNPs hoặc MP có và không có UVB được xác định bằng kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm với Hoechst 33342 (HO342) và propidium iodide (PI). Sau 24 giờ chiếu tia UVB, tế bào được rửa hai lần bằng PBS và ủ với thuốc nhuộm 10 μg / mL HO342 trong 15 phút ở 37 ° C và với 10 μg / mL PI trong 10 phút ở 37 ° C. Tế bào nhuộm màu kép được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược IX70-23FL / DIC-SP (Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

Ảnh chụp (định dạng MPEG) được lấy từ bốn trường ngẫu nhiên. Tế bào sống, tế bào tồn tại và tế bào apoptotic giai đoạn đầu (vẫn giữ chức năng màng tế bào) tiếp nhận thuốc nhuộm màu xanh lam (HO342). Quá trình chết rụng được đặc trưng về mặt hình thái bởi chất nhiễm sắc cô đặc. Tế bào nhuộm đỏ (PI) được coi là tế bào apoptotic giai đoạn cuối (chất nhiễm sắc đặc) hoặc tế bào hoại tử.

Các kết quả về nghiên cứu nano bạc trong mỹ phẩm

• Đặc điểm của AgNPs tổng hợp

Dung dịch AgNPs có màu vàng nhạt, không đổi màu, không lắng cặn sau khi bảo quản trên 1 năm. Điện thế zeta bề mặt của  AgNPs được đo bằng ELS-Z (Otsuka Electronics Co., Ltd.). Các đỉnh điện thế cực đại của  AgNPs được đo ở -32,76 mV (Hình 1). Hình dạng và sự phân bố kích thước của  AgNPs được phân tích bằng phương pháp tán xạ laser.  được phân tán đơn sắc cao với đường kính trung bình là 730,5 nm và độ lệch chuẩn là 14,70 nm (n = 5, Hình 2).  được phủ bằng gôm xenlulo và các phân tử nước.

• Hoạt động kháng khuẩn của AgNPs

Các thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp dung dịch vi khuẩn, hỗn hợp dung dịch nấm và huyền phù chất thải (hệ thống thoát nước nhà bếp đã được lọc) được xử lý bằng  AgNPs ở nồng độ 1,0 ppm. Bảng 1 cho thấy số lượng vi sinh vật trong huyền phù chế phẩm.  AgNPs ở mức 1,0 ppm cho thấy hiệu quả bảo quản đủ (CFU / g b101) đối với vi khuẩn hỗn hợp và nấm hỗn hợp (Bảng 2).

• Sự thâm nhập vào da của AgNPs

Chúng tôi đã đánh giá xem liệu  AgNPs có thể thâm nhập vào da người hay không trong một thử nghiệm đi qua da chuyên dụng sử dụng da người. Nồng độ nano bạc được đánh giá là 0,5 ppm hoặc 50 ppm.  AgNPs được áp dụng trên bề mặt da người (55 μL / cm2), và nồng độ của Bạc được đo trong môi trường bên dưới da tại 1, 6, 12 và 24 giờ sau khi tiếp xúc. Bạc không được phát hiện tại bất kỳ thời điểm nào (Bảng 3). Hơn nữa, Bạc trong mô da không được phát hiện ở liều lượng 0,5 ppm hoặc 50 ppm tại bất kỳ thời điểm nào.

• Ảnh hưởng của AgNPs đối với quá trình chết tế bào do bức xạ UVB gây ra

Chúng tôi khẳng định rằng  AgNPs không xâm nhập vào da người. Tuy nhiên, khi chức năng bảo vệ của da người bị gián đoạn do vết thương hoặc cháy nắng,  AgNPs có thể xâm nhập vào da. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu tác động gây độc tế bào của  AgNPs có và không có chiếu tia UVB trong tế bào sừng. Để đánh giá loại tế bào chết trong tế bào sừng HaCaT, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm kép sử dụng HO342 và PI. Các hình ảnh thu được chỉ ra rằng có một lượng nhỏ apoptosis và hoại tử đã hiện diện, và  AgNPs ở nồng độ 0,002–0,02 ppm không có tác dụng làm chết tế bào. Sự chiếu xạ của tia UVB ở 30 mJ / cm2 gây ra quá trình chết (chủ yếu là quá trình chết ở giai đoạn cuối). Tuy nhiên,  AgNPs ở nồng độ 0,002–0,02 ppm không làm tăng khả năng chết tế bào do tia UVB của tế bào sừng HaCaT (Hình 3, A). MP ở nồng độ 0,003% đến 0,03% không có tác dụng làm chết tế bào; tuy nhiên, 0,003% MP tăng cường tế bào chết do tia UVB gây ra trong tế bào sừng HaCaT (Hình 3, B).

Hình 3. Tế bào sừng HaCaT được nhuộm bằng Hoechst 33342 (xanh lam) và propidium iodide (đỏ). Tế bào nhuộm xanh có chức năng màng tế bào còn nguyên vẹn. Tế bào có nhân đặc là tế bào apoptotic sớm (màu xanh) và tế bào apoptotic muộn (màu đỏ). Hình ảnh đại diện cho bốn thí nghiệm độc lập. (A) Quá trình chết HaCaT do tia UVB gây ra trong tế bào sừng được xử lý bằng hạt AgNPs (Bạc). (B) apoptosis do tia UVB gây ra trong tế bào sừng HaCaT được xử lý bằng methylparaben (MP).

Thảo luận

Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng nano bạc là một chất bảo quản an toàn và ổn định, và chúng có hiệu quả chống lại nhiều loại vi sinh vật. Người ta biết rằng các ion Bạc và các hợp chất gốc Bạc có tác dụng kháng khuẩn mạnh. 3,7 Tuy nhiên, các hợp chất gốc Bạc này dần dần kết tủa trong các dung dịch. Khi Bạc bị tách khỏi các thành phần mỹ phẩm, tác dụng kháng khuẩn của nó sẽ bị ảnh hưởng. Dung dịch hạt AgNPs được sử dụng trong nghiên cứu này rất ổn định và không bị lắng cặn sau khi bảo quản trong hơn 1 năm.

Do đó, nhiều hạn chế liên quan đến Bạc có thể được khắc phục thông qua việc sử dụng  AgNPs. Cơ chế tác dụng ức chế của nano bạc đối với vi sinh vật đã được nghiên cứu. Người ta báo cáo rằng hoạt động kháng khuẩn của  AgNPs chống lại E. coli phụ thuộc vào nồng độ và  AgNPs đã phá vỡ cấu trúc màng của E. coli.

Gần đây, Danilczuk và cộng sự đã báo cáo rằng  Bạc nhỏ tạo ra các gốc tự do, được phát hiện bằng cộng hưởng spin điện tử. Ngoài ra, Kim và cộng sự cũng báo cáo rằng cơ chế kháng khuẩn của AgNPs có liên quan đến sự hình thành các gốc tự do.

Vẫn chưa rõ liệu các hạt nano có được hấp thụ hoặc thâm nhập vào da người hay không. Nếu  AgNPs không thể xâm nhập vào da người, chúng có thể được coi là rất an toàn. Để xác nhận điểm này, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm đoạn xuyên qua da bằng cách sử dụng da người. Kết quả cho thấy  AgNPs không có khả năng xâm nhập vào da người, do đó có nghĩa là chúng chỉ có chức năng như một chất bảo quản và không kích thích tế bào sừng.

Tuy nhiên, khi chức năng rào cản của da người bị phá vỡ, AgNPs trên bề mặt da có thể xâm nhập vào da. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn về tác động của  AgNPs trên tế bào sừng. Trong nghiên cứu này, hạt AgNPs 1,0 ppm cho thấy rõ các hoạt động kháng khuẩn, và AgNPs 50 ppm không thể xâm nhập vào bề mặt da. Tuy nhiên, nếu da bị tổn thương bằng cách nào đó (ví dụ như dị ứng), có thể 0,2% đến 2% hạt AgNPs có thể xâm nhập vào da. Nano bạc nồng độ từ 0,002–0,02 ppm đã không cho thấy bất kỳ độc tính tế bào nào đối với tế bào sừng và không ảnh hưởng đến quá trình chết tế bào do tia UVB gây ra.

Ngược lại, mặc dù MP được coi là một chất bảo quản an toàn, nhưng nó làm tăng quá trình chết tế bào do tia UVB gây ra. Kết quả này hỗ trợ cho một báo cáo trước đây, trong đó chúng tôi đã chứng minh khả năng có hại của MP trong tế bào sừng da người bình thường tiếp xúc với tia UVB trong ống nghiệm.

Việc sử dụng MP trong các sản phẩm mỹ phẩm được phép ở nồng độ tối đa là 0,8% (wt / wt) Theo quy định của Cộng đồng Kinh tế Đan Mạch và Châu Âu, và nồng độ điển hình của MP trong mỹ phẩm là dưới 0,32%. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 1% lượng MP được áp dụng đạt đến lớp đáy của biểu bì da ở lợn mini Yucatan. Do đó, nồng độ thực tế của MP (0,003%) làm tăng khả năng sống của tế bào do tia UVB gây ra. Kết hợp với các báo cáo trước đây, nghiên cứu này khẳng định tiềm năng tuyệt vời của AgNPs để sử dụng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm so với MP.  AgNPs được điều chế bởi Công ty TNHH Johzen (Kyoto, Nhật Bản) rất hiệu quả ở nồng độ thấp, không dễ dàng xuyên qua hàng rào bảo vệ da và không có tác dụng bất lợi đối với tế bào xeton.

Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây

Nguồn tham khảo: Silver nanoparticles as a safe preservative for use in cosmetics
Satoshi Kokura, MD, PhD⁎, Osamu Handa, MD, PhD, Tomohisa Takagi, MD, PhD,
Takeshi Ishikawa, MD, PhD, Yuji Naito, MD, PhD, Toshikazu Yoshikawa, MD, PhD