Nano bạc có tác dụng kháng vi rút mạnh mẽ đối với vi rút gây bệnh Newcastles
- Giới thiệu về virut gây bệnh NewCasltle và nano bạc
Virus gây bệnh Newcastle (NDV) tạo nên danh sách dài vô tận các bệnh gia cầm nguy hiểm và nó cũng gây ra thiệt hại kinh tế nặng nề (Rima và cộng sự, 2019). ND do paramyxovirus ở gia cầm thuộc chi Orthoavulavirus thuộc phân họ Avulavirinae , họ Paramyxoviridae gây ra . Ngoài ra, còn được gọi là NDV, đây là một loại virus có vỏ bọc. NDV có bộ gen 15 kb với RNA sợi đơn âm tính. Hơn nữa, nhiễm trùng do virus không phân đoạn (Alexander và cộng sự, 2012). Gà bị nhiễm NDV ở mọi lứa tuổi đều có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong lên tới 100%. Chủng NDV cực độc ở các nước phát triển phần lớn đã bị tiêu diệt khỏi gia cầm, nhưng lệnh cấm vận và hạn chế thương mại đã gây ra thiệt hại kinh tế đáng kể trong các đợt bùng phát (Rabiei và cộng sự, 2021).
Hiện nay, nhiều loại vắc-xin ND sống và bất hoạt đã có trên toàn thế giới, nhưng dịch bệnh do ND vẫn xảy ra (Rabiei và cộng sự, 2021). Sự đột biến ở các chủng NDV dẫn đến tình trạng kháng thuốc và khó kiểm soát. Do đó, chúng ta cần phát triển các biện pháp thay thế. Đợt bùng phát ND gần đây ở Đông Nam Á chủ yếu là do NDV-GVII độc lực cao gây ra, gây ra tỷ lệ tử vong từ 70% đến 80% ở gà thương phẩm (bao gồm cả đàn đã tiêm vắc-xin) (Rabiei và cộng sự, 2021,Xiao và cộng sự, 2013). Chỉ có một số ít thuốc kháng vi-rút được phát triển và cần có các hợp chất kháng vi-rút mới an toàn, hiệu quả, ít độc hại hơn và có khả năng khắc phục tình trạng kháng thuốc (Ngono và cộng sự, 2011).
Do các tính chất lý hóa của hạt nano , chúng đã được sử dụng với hy vọng phát triển các tác nhân kháng khuẩn và phương pháp điều trị kháng vi-rút mới (Xiang và cộng sự, 2011,Saadh, 2021a,Saadh và cộng sự, 2021). Các hạt nano bạc có thể liên kết với các hạt virus, ức chế virus liên kết với các tế bào vật chủ. Hơn nữa, chúng có thể ức chế sự sao chép RNA hoặc DNA của virus (Lu và cộng sự, 2008,Saadh và Aldalaen, 2021). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng của hoạt động kháng vi-rút của hạt nano bạc đối với NDV.
Vật liệu và phương pháp
2.1 . Tổng hợp Nano bạc
Nano bạc được tổng hợp sinh học như đã mô tả trước đây (Singh và cộng sự, 2010). Tóm lại, 10 mL chiết xuất lá trà xanh dạng nước (5 g/100 mL) được trộn với dung dịch AgNO3 5 mM và giữ ở nhiệt độ phòng (25 °C) trong 4 giờ, sau đó ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi loại bỏ phần chất lỏng trong, kết tủa được rửa hai lần bằng nước cất (7000 vòng/phút, 2 phút) và sấy khô trong máy sấy chân không. Các viên khô được bảo quản ở nhiệt độ phòng để phân tích khác nhau (Singh và cộng sự, 2010,Saadh, 2021b).
Đặc tính của Nano bạc
Bất kỳ ứng dụng hạt nano (NP) nào cũng đòi hỏi phải lựa chọn cẩn thận các vật liệu nano để có được các chức năng cần thiết. Ví dụ, trong quá trình sản xuất Nano bạc, nhiều hình thái khác nhau như các quả cầu nano phân tán đơn sẽ được triển khai để đảm bảo điều kiện phản ứng tương ứng trong quá trình tổng hợp. Bằng cách thay đổi môi trường của trường điện từ cục bộ thông qua khuếch đại, NPS cũng có thể được sử dụng như một chất hấp thụ nhiệt.
Nano bạc được đo bằng phổ UV–vis, được quét ở độ phân giải 200–800 nm. Trong quá trình này, Milli Q là tham chiếu. Nano bạc được sấy khô. Thành phần của Nano bạc khô được thử nghiệm bằng máy nhiễu xạ tia X (XRD) X’Pert Pro (PANalati-cal empyrean – 2012) được vận hành ở điện áp 40 kV. Nhà nghiên cứu đã sử dụng mô hình MMA GBC-Difftech để xác định thành phần cấu trúc của Nano bạc khô. Bức xạ Cu Ka được lọc niken (k = 1,54 A˚) được sử dụng ở 34,2 mA và 35 kV.
3.1 . Sự lan truyền của virus
Sự tăng sinh của virus được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống trứng gà có phôi (ECE). Hạt giống chính của Bản sao NDV (Trung tâm Công nghiệp Sinh học Jordan (JOVAC), Amman, Jordan) chứa 108 liều gây nhiễm phôi 50 (EID50 ) / mL được pha loãng trong 1 mL dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS; pH 7,2). 0,1 mL huyền phù virus hạt giống ở độ pha loãng 105 EID50 / mL được tiêm bằng ống tiêm tuberculin vào khoang niệu quản của phôi SPF 10 ngày tuổi. Sau đó, trứng được ủ ở nhiệt độ 37° C và độ ẩm 80% trong khoảng 72 giờ sau khi tiêm (tất cả các phôi chết trong vòng 24 giờ đều bị loại bỏ vì cái chết cụ thể do nhiễm virus không xảy ra trong 24 giờ đầu tiên sau khi tiêm; tỷ lệ đào thải phải dưới 2%). Phần trên của quả trứng được loại bỏ và dịch màng ối được thu thập bằng cách hút, không chứa bất kỳ vật liệu lòng đỏ trứng hoặc albumin nào. Tất cả các chất lỏng được đặt ngay vào tủ lạnh ở 4 °C và được kiểm tra sự hiện diện của vi-rút bằng hoạt động ngưng kết hồng cầu và được chuẩn độ vi-rút (Parvin và cộng sự, 2015).
3.2 . Chuẩn độ virus
NDV (0,1 mL) được tiêm vào khoang niệu quản của trứng 10 ngày tuổi để đo EID 50. Để tính toán chuẩn độ chính xác, năm trứng được sử dụng cho mỗi pha loãng gấp 10 lần. Theo Reed và Muench, 14 điểm cuối 50% được tính cho liều trứng lây nhiễm 50% (EID50 ) và được biểu thị bằng log10 EID50 /ml (Reed và Muench, 1938).
3.3 . Thử nghiệm giảm diệt virus
Hỗn dịch hạt giống chính của NDV Clone ở độ pha loãng 105 EID50 /mL sử dụng PBS vô trùng (pH 7,2) được trộn và ủ ở 37 °C trong 1 giờ với các nồng độ Nano bạc khác nhau. Sau khi tiêm chủng 0,1 mL hỗn hợp NDV-Nano bạc, trứng được ủ và trải qua quá trình nhân giống vi-rút như mô tả ở trên. Như đã lưu ý ở trên, dịch niệu quản được thu thập và chuẩn độ được thực hiện bằng hệ thống ECE. Các giá trị EID50 /mL được tính toán và so sánh với đối chứng (0,1 mL 105 EID50 /mL NDV mà không có bất kỳ phương pháp xử lý nào) (Parvin và cộng sự, 2015).
3.4 . Chiết xuất RNA virus và qRT-PCR
RNA được chiết xuất từ dịch thu hoạch thô của dịch allotonic bằng bộ dụng cụ phân lập RNA virus NZY (NZYTech, Bồ Đào Nha) theo giao thức của nhà sản xuất.
Đối với mỗi mẫu RNA, hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong bộ dụng cụ. Gen M được khuếch đại bằng Bộ dụng cụ RT-qPCR một bước NDV, RUO (NZYTech, Bồ Đào Nha). Một đường cong chuẩn được đưa vào để phân tích định lượng, theo giao thức của nhà sản xuất.
3.5 . Độc tính tế bào
Độc tính tế bào của dung dịch thử nghiệm được xác định bằng xét nghiệm Cell Titer 96 AQueous (Promega, Vương quốc Anh) và được thực hiện trong đĩa 96 giếng với các tế bào Vero có nồng độ đã biết trong mỗi giếng. Xét nghiệm độc tính tế bào được thực hiện như đã mô tả trước đây (Saadh và cộng sự, 2021,Saadh và Aldalaen, 2021).
3.6 . Phân tích thống kê
GraphPad Prism và phần mềm SPSS được sử dụng để phân tích dữ liệu. Phương sai được xác định dựa trên ANOVA một chiều theo sau là phép so sánh bội số Tukey như một phép thử hậu kiểm. Giá trị P < 0,05 được coi là có ý nghĩa.
Kết quả
4.1 . Đặc tính của Nano bạc
Mẫu hấp thụ nhiều hơn khi tăng sản xuất Nano bạc. Sản xuất Nano bạc được xác nhận thêm với sự thay đổi mạnh mẽ về màu sắc thành nâu sẫm (Hình 1a).
Hình 1. Đặc tính của Nano bạc (a). Phân tích phổ UV–vis của SNP sau 4 giờ bổ sung chiết xuất lá trà xanh (b). Mẫu hình XRD của Nano bạc tinh khiết.
Như thể hiện trong Hình 1b, mẫu hình XRD cho thấy cấu trúc lập phương và lục giác hỗn hợp của Nano bạc với các hạt có kích thước từ 10 đến 50 nm. Ngoài ra còn có ba đỉnh mạnh trong phổ có kích thước từ 10° đến 80°. Phản xạ Bragg nổi bật với các giá trị 2θ là 32,5°, 38,5° và 64,5°.
4.2. Độc tính tế bào
Sử dụng phương pháp đo màu (xét nghiệm tăng sinh tế bào MTS), độc tính tế bào của Nano bạc đã được đánh giá. Đối với 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160 và 320 µg/ml, không có tác dụng độc tế bào sau 48 giờ xử lý (Hình 2). Độc tính tế bào được quan sát thấy ở nồng độ rất cao giữa 640 và 1280 µg/ml Nano bạc.
(µg/ml = ppm = mg/kg = mg/L)
Hình 2. Độc tính tế bào của Nano bạc ở các nồng độ khác nhau trong tế bào Vero. Không quan sát thấy tác dụng độc tế bào nào trong tất cả các lần hòa trộn ngoại trừ 640 và 1280 µg/ml.
4.3. Tác động của Nano bạc lên NDV Clone
Đối với nhóm đối chứng, giá trị Log EID50/mL của NDV Clone trong trứng SPF là 9,8. Nano bạc cho thấy khả năng ức chế hiệu quả các virion tự do ngoại bào và ức chế sự nhân lên của vi-rút được đặc trưng bởi sự giảm của vi-rút NDV Clone. Chúng tôi quan sát thấy khả năng bảo vệ ECE đáng kể (P < 0,01) và giảm Log EID50/mL xuống 5,6 ± 0,6 ở 40 µg/ml Nano bạc. Hoạt động kháng vi-rút hiệu quả nhất (P < 0,001) đạt được ở 80, 160 và 320 µg/ml Nano bạc với mức giảm Log EID50/mL xuống lần lượt là 3,5 ± 0,4, 2,3 ± 0,6 và 2,1 ± 0,6 (Hình 3).
Hình 3. Hiệu quả kháng vi-rút trong trứng của nano bạc đối với dòng Virut gây bệnh Newcastle . Trứng gà có phôi SPF mười ngày được nhiễm NDV ở mức 0,1 mL 10 5 EID 50 /mL khi có sự hiện diện của các nồng độ AgNP khác nhau và được quan sát hàng ngày để xác định tỷ lệ tử vong của phôi trong 72 giờ sau khi nhiễm. Dịch niệu của tất cả trứng được thu thập. EID 50 /mL được tính bằng phương pháp Reed-Muench. * P < 0,01; ** P < 0,001.
4.4 . Nano bạc ức chế tổng hợp RNA
Số bản sao RNA (trên µL) bằng 3×105 làm đối chứng, việc định lượng số bản sao RNA của virus trong dịch niệu quản xác nhận tác dụng ức chế mạnh của Nano bạc đối với sản xuất NDV, với sự giảm tổng hợp RNA trong trứng . Hoạt động kháng vi-rút hiệu quả ( P < 0,001) đạt được ở 40, 80, 160 và 320 µg/ml Nano bạc với sự giảm số bản sao RNA (trên µL) xuống còn 9×103 , 3×103 , 1×10 3 và 5×102, tương ứng (Bảng 1), liên quan đến số lượng bản sao RNA (trên µL).
Bảng 1. Tác động của Nano bạc lên định lượng RNA virus trong dịch niệu quản. Trứng gà có phôi SPF 10 ngày tuổi bị nhiễm NDV ở nồng độ 0,1 mL 105 EID 50 /mL khi có sự hiện diện của các nồng độ Nano bạc khác nhau và được quan sát hàng ngày để xác định tỷ lệ tử vong của phôi trong 72 giờ sau khi nhiễm. Dịch niệu quản của tất cả trứng được thu thập. RNA được định lượng trong dịch niệu quản bằng qRT-PCR.
4.4 . Nano bạc ức chế tổng hợp RNA
Số bản sao RNA (trên µL) bằng 3 × 10 5 làm đối chứng, việc định lượng số bản sao RNA của virus trong dịch niệu quản xác nhận tác dụng ức chế mạnh của Nano bạc đối với sản xuất NDV, với sự giảm tổng hợp RNA trong trứng . Hoạt động kháng vi-rút hiệu quả ( P < 0,001) đạt được ở 40, 80, 160 và 320 µg/ml Nano bạc với sự giảm số bản sao RNA (trên µL) xuống còn 9×103 , 3×103 , 1×10 3 và 5×102 , tương ứng (Bảng 1), liên quan đến số lượng bản sao RNA (trên µL).
Bảng 1. Tác động của Nano bạc lên định lượng RNA virus trong dịch niệu quản. Trứng gà có phôi SPF 10 ngày tuổi bị nhiễm NDV ở nồng độ 0,1 mL 105 EID50 /mL khi có sự hiện diện của các nồng độ Nano bạc khác nhau và được quan sát hàng ngày để xác định tỷ lệ tử vong của phôi trong 72 giờ sau khi nhiễm. Dịch niệu quản của tất cả trứng được thu thập. RNA được định lượng trong dịch niệu quản bằng qRT-PCR.
Thảo luận và kết luận
Nghiên cứu này đưa ra 3 phát hiện quan trọng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây. Đầu tiên, nghiên cứu phát hiện ra rằng AgNP có tính chọn lọc cao khi tấn công vi khuẩn và vi-rút, đặc biệt là khi được sử dụng như thuốc kháng vi-rút. Phát hiện này phù hợp vớiWong và Liu (2010)phát hiện ra rằng AgNP đã nêu có khả năng chọn lọc cao chống lại vi khuẩn và vi-rút và có ứng dụng y tế rộng rãi. Tuy nhiên, giống như Saadh, 2021a,Saadh, 2021b,Elechiguerra và cộng sự, 2005được tìm thấy, nghiên cứu này cũng khẳng định rằng cơ chế chính xác của việc tiêu diệt vi-rút bằng AgNP vẫn còn là một bí ẩn. Ngoài ra, nghiên cứu này đồng ý vớiSaadh, 2021a,Saadh, 2021b,Elechiguerra và cộng sự, 2005tuyên bố rằng AgNP có thể ức chế nhiễm trùng sớm bằng cách phá hủy các protein cấu trúc trên bề mặt của vi-rút ngoại bào và ảnh hưởng đến tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của các hạt vi-rút, do đó ngăn chặn sự liên kết và xâm nhập vào tế bào.
Phát hiện thứ hai của nghiên cứu này là AgNP ức chế hiệu quả NDV ngoại bào để bảo vệ các tế bào mục tiêu khỏi bị nhiễm trùng. Phát hiện này phù hợp vớiSaadh, 2021a,Saadh, 2021b,Elechiguerra và cộng sự, 2005, VàAlafeef và cộng sự (2020)phát hiện cho thấy AgNP liên kết ưu tiên với các protein bề mặt virus giàu sulfhydryl và cắt liên kết disulfide để làm mất ổn định protein, ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm virus . Hơn nữa, phát hiện của nghiên cứu này cũng đồng ý vớiJeremiah và cộng sự (2020)phát hiện rằng tác dụng kháng vi-rút nội bào của AgNP có thể được tạo ra bởi sự tương tác với các nhóm thiol , sulfide và các hợp chất phốt pho , chẳng hạn như axit nucleic của vi-rút.
Các nghiên cứu tương tự về cách AgNP ảnh hưởng đến hiệu quả của vi-rút cũng được nêu rõ trong Saadh và cộng sự, 2021, Saadh và Aldalaen, 2021 Các nghiên cứu về virus cúm A H9N2 và H5N1 cho thấy AgNP ức chế NDV ngoại bào bằng cách phá hủy các virion bảo vệ tế bào đích khỏi bị nhiễm trùng.Elechiguerra và cộng sự (2005) cũng phát hiện ra rằng AgNP ảnh hưởng đến HIV bằng cách liên kết với các liên kết disulfide gần miền liên kết CD4 của protein bề mặt gp120 khiến vi-rút không có hiệu quả.Khandelwal và cộng sự (2017)cũng phát hiện ra rằng AgNP có hoạt tính kháng vi-rút đối với SARS-CoV-2 bằng cách phá vỡ các liên kết disulfide trên protein gai và thụ thể ACE2. Phán quyết của nghiên cứu này về khả năng vô hiệu hóa vi-rút của AgNP cũng được sao chép trong Galdiero và cộng sự (2011)công trình nghiên cứu phát hiện ra rằng AgNP ức chế sự sao chép của vi-rút gây bệnh ở động vật nhai lại Peste des petits ở cấp độ vi-rút xâm nhập vào tế bào đích.
Phát hiện thứ ba và cuối cùng của nghiên cứu này là ảnh hưởng của nồng độ đến hiệu quả của AgNP. Nghiên cứu này phát hiện ra rằng AgNP ức chế NDV ở nồng độ từ 40 đến 1280 µg/ml và trở nên độc tế bào đối với tế bào Vero từ 640 µg/ml trở lên. Phát hiện này phù hợp với Pieren và Tigges (2012)phát hiện ra rằng hiệu quả của AgNP như thuốc kháng vi-rút trong phạm vi nồng độ từ 10 đến 100 ppm. Ở những nồng độ này, Saadh và cộng sự (2021) cũng khẳng định AgNP ức chế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn bằng cách làm cho khả năng thích nghi của vi khuẩn trở nên khó khăn thông qua việc ức chế vi khuẩn bằng cách nhắm vào nhiều cơ chế.
Dosoky và cộng sự (2021) đã tiến hành một nghiên cứu để xác định xem AgNP có thể được sử dụng như một chất thay thế kháng sinh hay không . Các nhà nghiên cứu đã sử dụng gà con cho thí nghiệm. Họ đã chuẩn bị AgNP ở dạng bột bằng cách sử dụng tinh bột thông qua quá trình khử hóa học và đặc tính đầy đủ. Họ đã thêm AgNP vào chế độ ăn của gia cầm với ba liều lượng; 2, 4 và 8 mg/kg chế độ ăn. Độ an toàn khi uống của việc bổ sung chế độ ăn đã được đánh giá thông qua hiệu suất tăng trưởng của gia cầm. Kiểm tra miễn dịch mô học của tất cả các bộ phận cơ thể cũng đã được tiến hành. Kết quả nghiên cứu cho thấy AgNP không có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tăng trưởng và phát triển của gia cầm. Tuy nhiên, phản ứng viêm tối thiểu đã được ghi nhận ở mức liều lượng 8 mg/kg. Nhìn chung, Dosoky và cộng sự (2021)phát hiện AgNPs là chất kích thích tăng trưởng nano hiệu quả ở gà thịt với liều lượng 4 mg/kg thức ăn.
Tóm lại, kết quả nghiên cứu ủng hộ giả thuyết cho rằng AgNP có tiềm năng như một tác nhân điều trị kháng vi-rút chống lại sự sao chép của NDV bằng cách ức chế sự xâm nhập của NDV vào tế bào vật chủ trong trứng và có thể làm giảm số lượng bản sao RNA. Nghiên cứu phát hiện ra rằng nó khiến NDV khó thích nghi, giúp hạn chế khả năng kháng nhiễm trùng và không bị ảnh hưởng bởi các đột biến của vi-rút.
Nguồn tham khảo:
Potent antiviral effect of green synthesis silver nanoparticles on Newcastle disease virus