Nano bạc kết hợp chất dinh dưỡng giúp cải thiện khả năng miễn dịch và sức đề kháng chống lại virus gây bệnh Newcastle ở gà thịt

Các hạt nano bạc (AgNP) tương tác với hệ thống miễn dịch của vật chủ và vi khuẩn để bảo vệ chống lại bệnh tật. Trứng gà thịt đã thụ tinh ( n = 900) được phân bổ vào sáu nhóm: nhóm đối chứng không tiêm, giả dược (nước vô trùng), AgNP (50 μg), AgNP + Axit amin (Methionine-10 mg + Arginine-25 mg), AgNP + Vitamin (Vit B1-72μg + Vit B6-140μg) và AgNP + Nguyên tố vi lượng (Zn-80 μg và Se-0,3 μg) và ủ trong 18 ngày. Vào ngày phôi thứ 18, 0,6 ml dung dịch thử được tiêm vào đầu rộng của trứng bằng kim 25 mm và chuyển vào máy nở. Sau khi nở, một nửa số gà con từ mỗi nhóm được tiêm vắc-xin phòng bệnh Newcastle (ND), và một nửa còn lại được giữ như đơn vị chưa tiêm vắc-xin và nuôi trong 42 ngày với các biện pháp quản lý tiêu chuẩn. Tỷ lệ nở, trọng lượng cơ thể ngày thứ nhất và ngày thứ 42, lượng thức ăn tiêu thụ và tỷ lệ chuyển đổi thức ăn tương tự nhau giữa các nhóm điều trị ở cả đơn vị đã tiêm vắc-xin và chưa tiêm vắc-xin. Trọng lượng tương đối của túi Fabricius và tuyến ức tương tự nhau, nhưng trọng lượng lách cao hơn ( P ≤ 0,05) ở gà con AgNP, AgNP + Vits và AgNP + TEs so với nhóm đối chứng. Đáp ứng miễn dịch tế bào (chống lại mitogen phytohemagglutinin-P) cao hơn ( P ≤ 0,05) ở gà con AgNP + TEs, trong khi nồng độ HA chống lại kháng nguyên tế bào hồng cầu cừu, IgG huyết thanh, IgM và nồng độ HI chống lại vắc-xin ND rõ ràng cao hơn ở gà con nhóm AgNP + Vits so với nhóm đối chứng. Không có triệu chứng lâm sàng nào được quan sát thấy ở các nhóm đã tiêm vắc-xin ngoại trừ một số ít chim đối chứng 6 ngày sau thử thách (PC). Ba ngày sau PC, những con chim chưa tiêm vắc-xin có biểu hiện trầm cảm, bỏ ăn, tiêu chảy xanh lục và chảy nước mũi và nhóm đối chứng bắt đầu chết. Nhiễm trùng tích lũy cao nhất (CI) được quan sát thấy ở nhóm giả dược (79,17%) và nhóm đối chứng không tiêm (75%), nhưng thấp nhất ở những con chim AgNPs+AAs (58,33%) vào ngày thứ 3 sau khi tiêm vắc-xin. CI đạt 100% vào ngày thứ 5 sau khi tiêm vắc-xin ở nhóm đối chứng và nhóm AgNP, và lần lượt là 91,67% và 93,75% ở nhóm AgNPs+TEs và nhóm AgNPs+AAs. Những con chim ở nhóm AgNPs+TEs và AgNPs+AAs sống hơn 90 giờ so với 75 giờ ở nhóm đối chứng và cũng có biểu hiện gen IL-6 và IL-2 cao hơn ở thời điểm 24 giờ sau tiêm vắc-xin. Kết luận cho thấy 50 μg AgNP /trứng có chứa vitamin (B1 và ​​B6) và các nguyên tố vi lượng (Zn và Se) đã cải thiện hiệu suất, nhưng AgNP có chứa các nguyên tố vi lượng và axit amin đã tăng cường phản ứng miễn dịch và sức đề kháng chống lại thử thách của vi-rút ND ở gà thịt.

NANOCMM TECHNOLOGY

Giới thiệu

Gà thịt hiện đại có sự cải thiện đáng kể về hiệu suất tăng trưởng, nhưng lại có khả năng miễn dịch yếu hơn ( 1 , 2 ). Việc mất cân bằng miễn dịch là do tiêm vắc-xin quá nhiều, dùng thuốc sớm, căng thẳng khi vận chuyển, môi trường chuồng trại, điều kiện khí hậu, dinh dưỡng và bệnh tật ( 3 – 7 ). Do đó, để đạt được năng suất gia cầm cao hơn và hiệu quả hơn, sự cân bằng giữa dinh dưỡng và tình trạng miễn dịch của gà thịt sẽ đóng vai trò rất quan trọng.

Vật liệu nano đã trở thành lĩnh vực quan tâm hiện đại, vì ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực dinh dưỡng động vật, sức khỏe, sản xuất và nhiều yếu tố khác như vậy. Do tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cao hơn, các hạt này hoạt động tốt hơn so với các hạt cồng kềnh tương tự ( 8 – 11 ). Các nghiên cứu gần đây báo cáo rằng việc sử dụng các hạt nano bạc (AgNP) cải thiện quá trình phát triển và chuyển hóa phôi muộn ( 12 – 15 ), ảnh hưởng đến biểu hiện của gen VEGFA và FGF2 trong cơ ngực của gà thịt ( 16 ), phản ứng miễn dịch và tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch ( 17 ). Tuy nhiên, tác động của việc can thiệp bằng các hạt nano vẫn chưa được đánh giá đầy đủ đối với sự phát triển sau khi nở, tương tác dinh dưỡng-gen, khả năng miễn dịch và khả năng kháng bệnh ở gà. Hơn nữa, các hạt nano bạc cũng tương tác với vi-rút, vi khuẩn và hệ thống miễn dịch. Sự phát triển của tế bào lympho B và T bắt đầu trong quá trình phôi thai ở túi Fabricius và tuyến ức, tương ứng và trưởng thành ở lá lách cho đến sau khi nở ( 18 ). Tế bào được sản xuất trong các cơ quan này phân biệt thành loại Th1 (miễn dịch tế bào) và loại Th2 (miễn dịch dịch thể) và do đó truyền miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh khác nhau. Goel và cộng sự ( 17 ) đã báo cáo rằng tiêm AgNP vào trứng đã tăng cường đáp ứng miễn dịch trong cơ thể sống đối với phytohemagglutinin loại P (PHA-P ) , miễn dịch qua trung gian tế bào và hồng cầu cừu (SRBC), và miễn dịch dịch thể khi so sánh với nhóm đối chứng. Saki và Salary ( 19 ) cũng đã báo cáo về khả năng miễn dịch qua trung gian tế bào được tăng cường về độ dày trung bình của da nhạy cảm với phytohemagglutinin ở gà con được điều trị bằng AgNPS. Tương tự như vậy, việc sử dụng kem AgNP 1% (kích thước hạt <50 nm) ở chuột đã ức chế viêm da dị ứng tiếp xúc và điều chỉnh bài tiết cytokine trong ống nghiệm và trong cơ thể sống ( 20 ). Việc sử dụng AgNP (0,5 mg/Kg trọng lượng cơ thể) không có tác dụng đáng kể đến hiệu suất tăng trưởng nhưng cho thấy cholesterol huyết tương, triglyceride và khả năng chống oxy hóa thấp hơn nhưng malondialdehyde và glutathione peroxidase tốt hơn so với thỏ đối chứng ( 21 ).

Cho ăn sớm sau khi nở hoặc trong thời kỳ phôi ( In ovo) có ích trong việc cải thiện tình trạng dinh dưỡng của gà con. Trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển phôi, việc sử dụng các axit amin như Lys, Arg, Gly và Pro cao hơn. Các axit amin được cho ăn trong thời kỳ in ovo cũng giúp các kháng thể của mẹ không bị sử dụng làm nguồn protein. Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng cho ăn Met và Arg trong thời kỳ in ovo có tỷ lệ nở, trọng lượng cơ thể và phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cao hơn ( 22 , 23 ). Việc cung cấp kết hợp các axit amin Lys + Met + Cys và Thr + Gly + Ser trong thời kỳ in ovo đã cải thiện cả khả năng miễn dịch tế bào và dịch thể ( 24 ). Thiamin (vitamin B1) giúp chuyển hóa carbohydrate và cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và chức năng của tế bào. Pyridoxine (vitamin B6) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein cần thiết cho phản ứng miễn dịch. Cho ăn vitamin B1 trong thời kỳ in ovo đã cải thiện sự tăng trưởng và khả năng miễn dịch, trong khi vitamin B6 điều chỉnh khả năng miễn dịch ở gà thịt ( 25 ). Kẽm (Zn) và selen (Se) đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như một thành phần của nhiều enzyme và cũng cần thiết cho sự phát triển, cơ chế bảo vệ chống oxy hóa ( 26 ), miễn dịch qua trung gian tế bào và biểu hiện cao hơn của gen tăng trưởng và miễn dịch ( 27 – 29 ). AgNP chủ yếu được nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn của chúng đối với vi khuẩn, nhưng cũng đã được chứng minh là có hoạt tính chống lại một số loại vi-rút, bao gồm vi-rút gây suy giảm miễn dịch ở người, vi-rút viêm gan B, vi-rút herpes simplex, vi-rút hợp bào hô hấp và vi-rút đậu khỉ ( 30 – 32 ). Cơ chế hoạt động của bạc được cho là phụ thuộc vào các ion dương của nó, có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của vi khuẩn thông qua việc ức chế các enzyme hô hấp và các thành phần vận chuyển điện tử và can thiệp vào chức năng DNA ( 33 ). Bạc cũng được phát hiện là không độc đối với con người ở nồng độ rất nhỏ. Các vi sinh vật không có khả năng phát triển khả năng kháng lại Ag so với kháng sinh, vì Ag tấn công nhiều mục tiêu trong vi khuẩn. Việc sử dụng quá nhiều kháng sinh trong các biện pháp quản lý tiêu chuẩn của hệ thống sản xuất gà thịt hiện đại đã dẫn đến sự gia tăng số lượng vi khuẩn kháng kháng sinh, gây ra mối đe dọa sắp xảy ra đối với sức khỏe con người. Do đó, các tác nhân thúc đẩy sức khỏe thay thế đang được tìm kiếm để tăng cường sự tăng trưởng và khả năng miễn dịch ở gà ( 10 , 11 , 34 ).

Mặc dù AgNP được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cho đến nay rất ít nghiên cứu được thực hiện để xác định tác động miễn dịch của AgNP khi đưa vào gà thịt, đặc biệt là trước khi nở thông qua việc cho ăn trong trứng. Do đó, nghiên cứu này được lên kế hoạch để chứng minh cách AgNP đơn lẻ hoặc kết hợp với các chất dinh dưỡng quan trọng khác có thể hoạt động như một chất kích thích miễn dịch bẩm sinh hoặc thích ứng ở gà thịt.

Vật liệu và phương pháp

Sự cho phép về mặt đạo đức

Tất cả các quy trình thử nghiệm trên chim đều được thực hiện theo khuyến nghị và sự chấp thuận của Viện nghiên cứu chim trung ương ICAR, Izatnagar, Ấn Độ, Ủy ban đạo đức động vật của Viện theo giấy phép số CARI/CPCSEA/2016/8 ngày 23.08.2016 cho mục đích kiểm soát và giám sát các thí nghiệm trên động vật tại Ấn Độ.

Thiết kế thử nghiệm

Trong thiết kế khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 900 trứng đã thụ tinh (58,0 ± 2,0 g) thu thập từ gà mái giống 35 tuần tuổi trong thời gian 4 ngày được phân bổ cho sáu nhóm. Trứng được ấp trong máy ấp áp lực ở nhiệt độ ấp tiêu chuẩn là 37,5 ⁰ C và độ ẩm tương đối là 60,0% trong 18 ngày.

Hạt nano bạc

Dung dịch AgNPs aXonnite (nước khử ion 100 mg/l, độ tinh khiết 99,9999%) được lấy từ Nano-Tech Poland Ltd (Warsaw, Ba Lan). Kích thước hạt trung bình là 3,5 nm, chiếm hơn 80% các hạt. Diện tích bề mặt trung bình của các hạt là 2,83 10 ⁻¹³ cm ² . Độ pH của dung dịch nằm trong khoảng từ 7,1 đến 8,1 và thế oxy hóa khử là 0,1 mV.

Nhóm điều trị và tiêm vào trứng

Sáu nhóm điều trị như sau: 1-Đối chứng không tiêm, 2-Đối chứng giả (Nước vô trùng), 3-AgNP (50 μg), 4-AgNP + Axit amin: Methionine-10 mg và Arginine 25 mg (AgNP + AA), 5-AgNP + Vitamin: Thiamine-72 μg và Pyridoxine-140 μg (AgNP + Vits) và 6-AgNP + Nguyên tố vi lượng: Kẽm 80 μg và Selen 0,3 μg (AgNP + TE). Nồng độ các chất dinh dưỡng quan trọng như axit amin, nguyên tố vi lượng và vitamin được tính toán tương ứng là 5, 50 và 100% theo khuyến nghị của Hội đồng nghiên cứu quốc gia ( 35 ) về lượng tiêu thụ của gà con thịt trong 4 ngày đầu tiên ( 22 ). Các dung dịch dinh dưỡng riêng biệt được chuẩn bị bằng cách hòa tan các axit amin, vitamin và các nguyên tố vi lượng trong nước vô trùng, sau đó, các dung dịch dinh dưỡng này (0,1 ml) được trộn với 0,5 ml dung dịch AgNP chứa 50 μg Ag. Vào ngày thứ 18, khoảng 0,6 ml dung dịch xử lý được tiêm vào trứng , vào mỗi quả trứng của nhóm xử lý (trừ nhóm đối chứng không tiêm) bằng cách sử dụng kim cỡ 24 ở đầu rộng hơn của quả trứng, theo quy trình do Bhanja và cộng sự mô tả ( 36 ).

Nhà ở và quản lý

Sau khi nở, tất cả gà con đều được tiêm vắc-xin phòng bệnh Marek, đeo vòng cánh và cân. Những gà con nở ra từ các nhóm điều trị khác nhau được phân bổ thành hai đơn vị riêng biệt (theo từng nhóm điều trị), trong đó 50% gà con được tiêm vắc-xin phòng bệnh Newcastle (ND) (chủng F1) vào ngày thứ 4 sau khi nở và 50% gà con khác (có kết quả xét nghiệm âm tính với kháng thể chống lại ND trong huyết thanh) không được tiêm vắc-xin. Những con chim đã tiêm vắc-xin ND lại được tiêm vắc-xin chủng ND bất hoạt vào ngày thứ 24 sau khi nở. Hai nhóm gà con này (đã tiêm vắc-xin và chưa tiêm vắc-xin) được nuôi trong hai chuồng khác nhau nhưng có các biện pháp quản lý tương tự nhau. Đơn vị chưa tiêm vắc-xin được nuôi dưỡng hết sức cẩn thận để cách ly nghiêm ngặt và có một công nhân riêng chăm sóc. Những con gà con được nuôi trong lồng ấp pin 4 tầng. Chúng được nuôi trong một ngôi nhà hở, có đủ ánh sáng và thông gió. Các loài chim được cung cấp chế độ ăn uống và quản lý tiêu chuẩn cho đến khi được 42 ngày tuổi. Thức ăn và nước uống được cung cấp tự do .

Thông số hiệu suất

Các thông số khác nhau trước khi nở như trọng lượng trứng trước khi ấp, tỷ lệ chết phôi và tỷ lệ nở phần trăm đã được ghi lại. Trong quá trình sau khi nở, trọng lượng cơ thể của từng con chim và lượng thức ăn tiêu thụ của một nhóm gồm tám con chim (theo từng lần lặp lại) trong mỗi chuồng đã được ghi lại trong 42 ngày để ước tính mức tăng trọng trung bình hàng ngày (ADG), lượng thức ăn tiêu thụ trung bình hàng ngày (ADFI) và tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR).

Trọng lượng lympho và phản ứng miễn dịch

Sự phát triển tương đối của các cơ quan lymphoid được ghi lại vào ngày thứ 42 sau khi nở ở nhóm đã tiêm vắc-xin. Sáu con chim từ mỗi phương pháp điều trị (một con chim từ mỗi bản sao) được nhịn ăn trong 8 giờ trước khi bị giết. Trọng lượng của túi Fabricius, tuyến ức và lách được ghi lại và biểu thị dưới dạng g kg−1 trọng lượng cơ thể. Vào ngày thứ 22 sau khi nở, một ml hỗn dịch hồng cầu cừu (1% v/v) được tiêm tĩnh mạch cho 12 con chim từ mỗi phương pháp điều trị (hai con chim/bản sao) từ nhóm đã tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-xin (dữ liệu không được trình bày) để nghiên cứu phản ứng kháng thể chính chống lại kháng nguyên SRBC. Vào ngày thứ 7 sau khi tiêm chủng, 2 ml máu được lấy từ tĩnh mạch cánh và để đông để tách huyết thanh. Nồng độ kháng thể chống lại SRBC được xác định bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA) ( 37 ). Giá trị nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất cho thấy sự kết tụ rõ ràng được chọn làm điểm cuối của hiệu giá, và giá trị được biểu thị là log 2. Phản ứng in vivo với PHA-P được đánh giá bằng cách tiêm khoảng 0,1 ml PHA-P (1 mg/ml PBS) vào bên trong da vào màng chân trái của 12 con chim/phương pháp điều trị từ nhóm đã tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-xin (dữ liệu không được trình bày) vào ngày thứ 28 sau khi nở. Màng chân phải của cùng những con chim đó được tiêm 0,1 ml PBS vô trùng và do đó được dùng làm đối chứng. Độ dày da của màng chân (phải và trái) của những con chim được đo bằng micrômet tại thời điểm 0 và 24 giờ sau khi tiêm mitogen. Chỉ số màng chân (FWI) được tính bằng cách trừ đi sự khác biệt về độ dày tại thời điểm 0 và 24 giờ của màng chân được tiêm mitogen với sự khác biệt về độ dày của màng chân đối chứng ( 38 ).

Phản ứng kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên vắc-xin ND đã được nghiên cứu trong nhóm đã tiêm vắc-xin vào ngày thứ 7, ngày thứ 14 ^và ngày thứ 21 sau khi nở. Thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) đã được thực hiện trong huyết thanh. Các đĩa được đọc dưới ánh sáng mạnh. Độ pha loãng cao nhất, tại đó có sự ức chế hoàn toàn của ngưng kết hồng cầu, là giá trị hiệu giá HI. Kháng thể kháng mercapto-ethanol (MER hoặc IgG) chống lại SRBC được xác định theo phương pháp do Martin và cộng sự mô tả ( 39 ) với một chút sửa đổi. Kháng thể nhạy cảm với mercapto-ethanol (MES hoặc Ig M) chống lại SRBC được tính là sự giảm từ hiệu giá HA tổng thể của SRBC do hiệu giá kháng 2-ME.

Nghiên cứu thử thách virus bệnh Newcastle

Tám con chim từ mỗi nhóm đã tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-xin trong sáu phương pháp điều trị (tổng cộng 96 con chim) được chọn dựa trên phản ứng miễn dịch của chúng đối với SRBC và PHA-P (một con chim phản ứng thấp, hai con chim phản ứng trung bình và một con chim phản ứng cao từ mỗi nhóm điều trị) để loại trừ sự khác biệt cá thể cho nghiên cứu thử thách. Vào ngày thứ 43 sau khi nở, những con chim được chuyển đến chuồng thử thách tại IVRI, Izatnagar, Ấn Độ, để đánh giá phản ứng chống lại vi-rút ND độc lực (vNDV). Dịch niệu đạo bị nhiễm Vndv được thu thập từ Phân khoa Bệnh học, IVRI, nơi trước đó đã được thu hồi từ một ổ dịch thực địa. Để có được thể tích vi-rút mong muốn, dịch bị nhiễm đã được nhân giống trong trứng có phôi ngày thứ 9 theo giao thức chuẩn ( 40 ). Sự hiện diện của vi-rút ND trong dịch niệu đạo đã được xác nhận bằng các tổn thương điển hình ở phôi bị nhiễm/chết và xét nghiệm HA. Để tính toán liều NDV cần thiết, đã tiến hành pha loãng nối tiếp 10 lần các huyền phù vi-rút. Phạm vi pha loãng bao gồm ít nhất hai pha loãng gấp 10 lần trên hoặc dưới pha loãng dự kiến ​​chứa điểm cuối. Ít nhất năm trứng được tiêm chủng với mỗi pha loãng. Kim tiêm và ống tiêm riêng cho mỗi pha loãng được sử dụng. Trứng được ủ trong 4 ngày ở 38°C. Sau 4 ngày, dịch niệu đạo được thu thập từ mỗi trứng và thử nghiệm xem có hay không có NDV. Việc áp dụng kỹ thuật toán học Reed và Muench đã được sử dụng để tính toán hiệu giá khả năng lây nhiễm của huyền phù ban đầu là liều gây nhiễm hoặc gây chết phôi 50% (EID50/ELD50) như mô tả dưới đây:

Tỉ lệ = [(% bị nhiễm ở độ pha loãng trên 50%) – 50% ]/ (% bị nhiễm ở độ pha loãng trên 50% – % bị nhiễm ở độ pha loãng dưới 50%)

Ghi lại các dấu hiệu lâm sàng và nhiễm trùng tích lũy

Dựa trên EID50/ELD50, tám con chim từ mỗi nhóm điều trị đã được thử thách với 0,1 ml (100 μl) vNDV. Một nửa liều được cung cấp dưới dạng thuốc nhỏ mắt và nửa còn lại được nhỏ mũi, cùng một bên. Các triệu chứng lâm sàng và thời gian chết của những con chim được ghi lại sau mỗi dpi (ngày sau khi tiêm chủng) và từng giờ bởi cùng một người quan sát sáu lần một ngày. Những con chim cực kỳ ốm yếu/yếu ớt (có triệu chứng thần kinh nghiêm trọng với chất nhầy dày trong miệng) đã được an tử và được ghi nhận là những con chim đã chết. Một mô hình chấm điểm được thực hiện theo mô tả của Oyebanji et al. ( 41 ) với một số thay đổi nhỏ. Dựa trên mức độ bệnh tật, những con chim được phân loại thành các loại nhẹ (Mi), trung bình (Mo), nghiêm trọng (S) và chết/an tử (D/E) vào mỗi dpi và được cấp “điểm mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu lâm sàng” lần lượt là 10, 20, 30 và 40. Số lượng chim từ mỗi loại cũng được thể hiện dưới dạng phần trăm so với tổng số chim sống ( n = L), vào cuối dpi trước đó hoặc vào đầu dpi đó. “Điểm thu được” được tính bằng tổng điểm mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu lâm sàng của chim nhân với số lượng chim trong mỗi loại. Nhiễm trùng tích lũy (CI), tức là phần trăm nhiễm trùng đạt được cho đến dpi đó do vi-rút gây nhiễm, được ước tính theo dpi và được thể hiện dưới dạng điểm thu được vào dpi đó / điểm tối đa có thể có vào dpi đó × 100. “Điểm tối đa có thể có” vào dpi đó được tính là tích của điểm mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu lâm sàng đối với chim chết ( 40 ) và tổng số chim sống vào đầu dpi đó. Khám nghiệm tử thi được thực hiện trên những con gà chết để xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Những con chim đã tiêm phòng đã bị giết vào ngày 2, 4 và 6 dpi để quan sát những thay đổi về bệnh lý.

Biểu hiện của gen miễn dịch

Trước và sau thử thách vNDV, các mẫu máu được thu thập theo các khoảng thời gian định kỳ (0/8/24 giờ). Các tế bào PBMC được tách ra để nghiên cứu kiểu biểu hiện của gen IL2 và IL6. Tổng mRNA từ các tế bào PBMC được phân lập bằng thuốc thử TRIzol ^® theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu RNA tinh khiết (sử dụng Hệ thống cô lập RNA tổng số SV, Promega Corporation, Madison, WI, Hoa Kỳ) được định lượng trong máy quang phổ NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Khoảng 2 μg RNA tổng số được phiên mã ngược, sau đó thực hiện PCR thời gian thực với DNA bổ sung và cặp mồi đặc hiệu gen ( 8 , 10 ) trong máy chu trình IQ5 (BioRad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Các mẫu đầu tiên được biến tính trong 5 phút ở 95 °C và sau đó được khuếch đại bằng 45 chu kỳ gồm 30 giây ở 95 °C để biến tính, 30 giây ở nhiệt độ gắn kết cụ thể và 30 giây ở 72 °C (kéo dài), sau đó là định lượng. Một đường cong nóng chảy được áp dụng để xác minh tính đặc hiệu của sản phẩm. Đối với mỗi DNA bổ sung, phản ứng được thực hiện ba lần. Việc định lượng biểu hiện gen (thay đổi gấp bội so với đối chứng) được thực hiện trong phần mềm REST 2009 bằng cách sử dụng các giá trị CT thu được trong nghiên cứu PCR Rt.

Phân tích thống kê

Dữ liệu được phân tích thống kê để phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm SPSS-16. Kiểm định phạm vi đa dạng của Duncan được sử dụng để xác minh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình của phương pháp điều trị và P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Kết quả

Các thông số ấp trứng và tăng trưởng sau khi nở

Không có sự khác biệt ( P ≥ 0,05) về khối lượng trứng đã thụ tinh dùng để tiêm trong trứng , khối lượng gà con một ngày tuổi, tỷ lệ khối lượng gà con/trứng và tỷ lệ nở (trên cơ sở trứng đã thụ tinh) giữa các nhóm điều trị ( Bảng 1 ). Khối lượng cơ thể ngày thứ 42, lượng thức ăn tiêu thụ trung bình hàng ngày (ADFI), mức tăng trọng trung bình hàng ngày (ADG) và tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (FCR) trong giai đoạn từ 0 đến 42 ngày cũng không khác biệt ( P ≥ 0,05) giữa các nhóm điều trị của những con chim đã được tiêm phòng ( Bảng 2 ). Năng suất của những con chim chưa tiêm phòng (dữ liệu không được trình bày) đối với khối lượng cơ thể ngày thứ 42, ADFI, ADG và FCR dao động trong khoảng từ 1.372,0 đến 1.479 g, 69,3 đến 73,5 g, 31,65 đến 34,25 g và 2,11 đến 2,22.

Bảng 1 Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên các thông số về khả năng nở của gia cầm đã được tiêm vắc-xin.

Bảng 2. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng đối với hiệu suất của gia cầm đã tiêm vắc-xin.

Cơ quan lymphoid và phản ứng miễn dịch ở chim đã tiêm vắc-xin

Trọng lượng tương đối của túi hoạt dịch và tuyến ức tương tự nhau ở các nhóm điều trị; tuy nhiên, trọng lượng lách cao hơn ( P ≤ 0,05) ở nhóm AgNPs+TEs khi so sánh với nhóm đối chứng và nhóm đối chứng giả. Nồng độ kháng thể chính chống lại SRBC tương tự nhau giữa các nhóm điều trị của những con chim đã được tiêm vắc-xin; tuy nhiên, chỉ số màng chân cao hơn đáng kể ở gà con nhóm AgNPs+TEs so với cả hai nhóm đối chứng ( Bảng 3 ). Tương tự như vậy, ở những con gà con chưa được tiêm vắc-xin (dữ liệu không được trình bày), nồng độ HA chống lại SRBC (log 2) và chỉ số màng chân (mm) lần lượt dao động từ 8,0 đến 9,5 và 0,39 đến 0,60.

Bảng 3. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên trọng lượng cơ quan miễn dịch ở gà thịt.

Kháng thể kháng 2-mercapto-ethanol (IgG) và nhạy cảm (IgM) tương tự nhau ( P ≥ 0,05) trong các nhóm điều trị; tuy nhiên, giá trị IgG và IGM cao hơn rõ ràng đã được nhìn thấy ở gà con nhóm AgNPs+TEs và AgNPs+AAs. Phản ứng kháng thể đặc hiệu chống lại vắc-xin ND đã được nghiên cứu ở nhóm được tiêm vắc-xin vào ngày thứ 7, ngày thứ 14 và ngày thứ 21 sau khi nở. Giá trị hiệu giá HI ở tất cả các giai đoạn đều tương tự nhau ( P ≥ 0,05) giữa các nhóm điều trị; tuy nhiên, gà con nhóm AgNPs+Vits có giá trị cao hơn rõ ràng vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 sau khi nở ( Bảng 4 ).

Bảng 4. Tác dụng của việc đưa các hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng đối với kháng thể kháng mercapto-ethanol (IgG) và kháng thể nhạy cảm (IgM).

Dấu hiệu lâm sàng, nhiễm trùng tích lũy ở chim bị nhiễm VNDV

Chim có vẻ bình thường về mặt lâm sàng và không có triệu chứng rõ ràng nào được ghi nhận vào ngày thứ 1 dpi ở tất cả các nhóm điều trị. Vào ngày thứ 2 dpi, các dấu hiệu lâm sàng như lông xù, trầm cảm, chán ăn và phù nề quanh hốc mắt đã được quan sát thấy. Năm con chim (62,5%), mỗi con từ nhóm đối chứng, nhóm đối chứng giả, AgNPs + AAs và AgNPs + Vits, cho thấy nhiễm trùng nhẹ vào ngày thứ 2 dpi và nhiễm trùng tích lũy (CI) được ước tính là 15,62% đối với các nhóm này. Tuy nhiên, trong nhóm AgNPs (37,5%) và nhóm AgNPs + TEs (50%), ba hoặc nhiều con chim bị bệnh nhẹ với CI lần lượt là 9,37 và 12,5%. Vào cuối ngày thứ 2 dpi, hai con chim từ mỗi nhóm điều trị (đã tiêm vắc-xin và chưa tiêm vắc-xin) đã được an tử để quan sát các tổn thương bệnh lý thô. Vào ngày thứ 3 dpi, những con chim bị bệnh từ các nhóm điều trị khác nhau (chưa tiêm vắc-xin) tiến triển thành trầm cảm hoàn toàn, bị bỏ ăn và đi tiêu chảy phân lỏng màu xanh lục, xương ức nằm nghiêng và đầu cúi xuống với dịch mũi/nước mắt. Ba con chim (50%), mỗi con từ nhóm đối chứng giả, nhóm AgNP, AgNP + Vits và nhóm AgNP + TEs, và hai con chim (33,33%), từ nhóm đối chứng và nhóm AgNP + AAs, biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng. Hai con chim chưa tiêm vắc-xin (33,33%) từ nhóm đối chứng và nhóm đối chứng giả chết vào cuối ngày thứ 3 dpi. Những con chim sống còn lại từ các nhóm chưa tiêm vắc-xin cho thấy mức độ bệnh vừa phải ( Bảng 5 ). CI cao nhất được quan sát thấy ở nhóm đối chứng giả (79,17%) và nhóm đối chứng (75%), trong khi CI thấp nhất ở nhóm AgNP + AAs (58,33) cho đến ngày thứ 3 dpi. CI giống nhau (62,5%) ở các nhóm điều trị còn lại ( Bảng 6 ).

Bảng 5. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng đối với việc phân loại các loài chim bị bệnh lâm sàng dựa trên mức độ nghiêm trọng (theo dpi) trong các nhóm điều trị là các loài chim chưa tiêm vắc-xin.

Bảng 6. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng đối với việc chấm điểm các loài chim bị bệnh lâm sàng dựa trên mức độ nghiêm trọng (dpi) từ mỗi nhóm điều trị của các loài chim chưa tiêm vắc-xin.

Vào ngày 4 dpi, các triệu chứng tiến triển dưới dạng liệt chân, co giật cơ, tiêu chảy và chán ăn đã dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng như thở há miệng, chảy nước dãi, bỏ ăn hoàn toàn, liệt hoàn toàn và tử vong. Vào ngày 4 dpi, hai con chim trong nhóm đối chứng, nhóm đối chứng giả (50%) và nhóm AgNPs+AAs (33,3%), ba con chim (50,0%) trong mỗi nhóm AgNPs và AgNPs+TEs, và bốn con chim từ nhóm AgNPs+Vits (66,6%) đã chết. Những con chim còn sống sót biểu hiện chán ăn hoàn toàn và liệt, và chúng được nhóm vào loại “bệnh nặng” ( Bảng 5 ). CI cao nhất ở nhóm AgNPs+Vits (91,67%), trong khi nhóm AgNPs+AAs duy trì CI thấp nhất (83,33) cho đến ngày 4 dpi. CI 87,5% được tìm thấy trong nhóm đối chứng, nhóm đối chứng giả, AgNPs và AgNPs+TEs ( Bảng 6 ). Tuy nhiên, hai con chim, mỗi con từ nhóm AgNPs+AAs và AgNPs+TEs, đã sống sót sau toàn bộ ngày thứ 5 dpi và chết vào ngày thứ 6 dpi. Do đó, CI đạt đến mức 100% ở hầu hết các nhóm xử lý, ngoại trừ nhóm AgNPs+AAs (93,75%) và nhóm AgNPs+TEs (91,67%) cho đến ngày thứ 5 dpi. Hai nhóm này, đặc biệt là nhóm AgNPs+AAs, đã thể hiện khả năng kháng NDV tối đa và đạt CI 100% vào ngày thứ 6 dpi ( Bảng 6 ).

Thời gian chết trung bình của những con chim bị thử thách trong nhóm không tiêm vắc-xin

Thời gian chết trung bình ước tính rõ ràng cao hơn ( P ≤ 0,01) ở những con chim trong nhóm AgNPs+AAs và AgNPs+TEs so với nhóm đối chứng và nhóm AgNPs+Vits ( Hình 1 ).

Hình 1. Tác dụng của việc tiêm trực tiếp hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên thời gian chết trung bình (giờ) của các loài chim được thử thách với virus ND độc lực (vNDV) trong nhóm chưa tiêm vắc-xin. Nhóm đối chứng = chưa tiêm, giả dược (nước vô trùng), AgNP = hạt nano bạc (50 μg), AgNP + AA = hạt nano bạc (50 μg) + axit amin (Methionine- 10 mg + Arginine- 25 mg), AgNP + Vits = hạt nano bạc (50 μg) + vitamin (Vit B1-72 μg + Vit B6-140 μg) và AgNP + TE = hạt nano bạc (50 μg) + khoáng chất (Zn-80 μg và Se-0,3 μg).

Tổn thương nghiêm trọng ở nhóm chim chưa tiêm vắc-xin

Các tổn thương thô ở các cơ quan nội tạng khác nhau xuất hiện theo trình tự thời gian tương tự ở các loài chim bất kể nhóm điều trị. Tuy nhiên, có sự khác biệt về mức độ nghiêm trọng và các loài chim được phân loại theo đó. Sự khác biệt về các tổn thương bệnh lý vĩ mô ở khí quản, túi hoạt dịch, não, ruột, amidan manh tràng, dạ dày tá tràng và thận đã được kiểm tra và chấm điểm tương ứng. Điểm cho các tổn thương đường ruột được đưa ra dựa trên các tổn thương quan sát được từ bên ngoài (các mảng đỏ), các tổn thương trong lòng ruột (xuất huyết có chứa máu) và amidan manh tràng (xuất huyết). Điểm 30, 20, 10 hoặc 0 được đưa ra cho các tổn thương ND điển hình nghiêm trọng (+++), trung bình (++), nhẹ (+) hoặc không có (-). Các tổn thương bệnh lý thô quan sát được ở các nhóm điều trị khác nhau được phân loại theo dpi và được trình bày trong Bảng 7. Điểm trung bình cho các tổn thương bệnh lý thô ở các nhóm điều trị khác nhau đã được trình bày trong Bảng 8 . Nhóm đối chứng tiếp tục cho thấy điểm tổn thương cao hơn (110) một cách nhất quán cho đến ngày thứ 4 dpi, và các tổn thương bệnh lý ít nghiêm trọng hơn ở nhóm AgNPs+AAs (105) và nhóm AgNPs+TEs (93,33). Điều thú vị là các nhóm được tiêm chất dinh dưỡng cho thấy các tổn thương ít nghiêm trọng hơn một cách nhất quán vào mỗi ngày thứ 4 so với gà con trong nhóm đối chứng.

Bảng 7. Sự xuất hiện theo thứ tự thời gian của các tổn thương lớn ở những con chim chưa được tiêm phòng.

Bảng 8. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên điểm trung bình của các tổn thương bệnh lý nghiêm trọng ở các nhóm điều trị khác nhau (theo ngày sinh).

Các dấu hiệu lâm sàng và bệnh lý đại thể ở nhóm được tiêm vắc-xin

Tám con chim đã tiêm vắc-xin từ mỗi nhóm điều trị đã được thử thách theo cùng cách như đã mô tả đối với những con chim chưa tiêm vắc-xin. Không có triệu chứng lâm sàng nào được quan sát thấy ở các nhóm đã tiêm vắc-xin, ngoại trừ một số ít con chim bị các trường hợp lông xù nhẹ và tiêu chảy màu xanh lục. Không có con chim nào đã tiêm vắc-xin chết cho đến khi kết thúc thí nghiệm (ngày thứ 6 sau khi tiêm vắc-xin). Những con chim hoạt động hoàn toàn và không có bằng chứng nào về bệnh tật hoặc chán ăn. Hai con chim đã được an tử (về mặt điều trị) vào ngày thứ 2 và thứ 4 sau khi tiêm vắc-xin, và bốn con chim còn lại đã được an tử vào ngày thứ 6 sau khi tiêm vắc-xin, khi đó chỉ quan sát thấy mức độ xuất huyết ruột vừa phải.

Biểu hiện tương đối của IL6 và IL-2 trong tế bào PBMC của những con chim chưa được tiêm vắc-xin

Không có sự khác biệt ( P ≥ 0,05) trong biểu hiện tương đối của gen IL-6 hoặc IL-2 ngay trước khi thử thách với vi-rút vND trong các nhóm được xử lý bằng AgNps; tuy nhiên, biểu hiện giảm đáng kể ( P ≤ 0,05) trong nhóm đối chứng giả ( Hình 2A, B ). Sau 8 giờ thử thách với vi-rút vND, biểu hiện gen IL-6 giảm ở gà con nhóm AgNP và AgNps+TEs so với gà con không được tiêm, nhưng biểu hiện tăng ( P ≤ 0,05) của gen IL-2 được thấy ở tất cả các gà con nhóm AgNPs, đặc biệt là ở nhóm AgNps+Vits và AgNps+TEs ( Hình 3A, B ). Tương tự như vậy, sau 24 giờ thử thách với virus vND, biểu hiện tương đối của cả hai gen (IL-6 và IL-2) đều tăng đáng kể ( P ≤ 0,05) ở tất cả gà con nhóm AgNPs, ngoại trừ biểu hiện IL-6 ở gà con nhóm AgNps+AAs ( Hình 4A,B ).

Hình 2. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên biểu hiện tương đối của gen IL-6 (A) và IL-2 (B) trước khi thử thách với virus ND độc lực (vNDV). Đối chứng = không tiêm, giả dược (nước vô trùng), AgNP = hạt nano bạc (50 μg), AgNP + AA = hạt nano bạc (50 μg) + axit amin (Methionine- 10 mg + Arginine- 25 mg), AgNP + Vits = hạt nano bạc (50 μg) + vitamin (Vit B1-72 μg + Vit B6-140 μg) và AgNP + TE = hạt nano bạc (50 μg) + khoáng chất (Zn-80 μg và Se-0,3 μg). ^{a, b} Các giá trị trung bình có chữ cái khác nhau trong biểu đồ tần suất khác nhau đáng kể ( P < 0,05).

Hình 3. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên biểu hiện tương đối của gen IL-6 (A) và IL-2 (B) sau 8 giờ thử thách với virus ND độc lực (vNDV). Đối chứng = không tiêm, giả dược (nước vô trùng), AgNP = hạt nano bạc (50 μg), AgNP + AA = hạt nano bạc (50 μg) + axit amin (Methionine- 10 mg + Arginine- 25 mg), AgNP + Vits = hạt nano bạc (50 μg) + vitamin (Vit B1-72 μg + Vit B6-140 μg) và AgNP + TE = hạt nano bạc (50 μg) + khoáng chất (Zn-80 μg và Se-0,3 μg). ^{a, b} Các giá trị trung bình có chữ cái khác nhau trong biểu đồ tần suất khác nhau đáng kể ( P < 0,05).

Hình 4. Tác dụng của việc đưa hạt nano bạc (AgNP) và các chất dinh dưỡng quan trọng vào trứng lên biểu hiện tương đối của gen IL-6 (A) và IL-2 (B) sau 24 giờ thử thách với virus ND độc lực (vNDV). Đối chứng = không tiêm, giả dược (nước vô trùng), AgNP = hạt nano bạc (50 μg), AgNP + AA = hạt nano bạc (50 μg) + axit amin (Methionine- 10 mg + Arginine- 25 mg), AgNP + Vits = hạt nano bạc (50 μg) + vitamin (Vit B1-72 μg + Vit B6-140 μg) và AgNP + TE = hạt nano bạc (50 μg) + khoáng chất (Zn-80 μg và Se-0,3 μg). ^{a, b} Các giá trị trung bình có chữ cái khác nhau trong biểu đồ tần suất khác nhau đáng kể ( P < 0,05).

Cuộc thảo luận

Hiệu suất trước và sau khi nở ở những con chim đã được tiêm vắc-xin

Trọng lượng gà con tăng lên lần lượt là 2,6, 2,3 và 3,1% trong các nhóm AgNPs+AAs, AgNPs+Vits và AgNPs+TEs khi so sánh với nhóm đối chứng. Tương tự như vậy, tỷ lệ trọng lượng gà con/trứng cao hơn (lên đến 3,87%) trong các nhóm được tiêm in ovo so với nhóm đối chứng không được tiêm. Quan sát hiện tại phù hợp với các báo cáo trước đó cho thấy AgNP không ảnh hưởng đến các thông số ấp và nở như sự phát triển của phôi, khả năng nở và trọng lượng tương đối của gà con ( 17 , 42 – 44 ). Tương tự như vậy, các chất dinh dưỡng khác nhau khi được tiêm in ovo vào túi noãn hoàng hoặc màng ngoài phôi không có tác dụng phụ nào đối với phôi, với một chút ảnh hưởng đến khả năng nở ( 17 , 45 ).

Trong nghiên cứu hiện tại, việc bổ sung AgNPs+Vits (B1: 72μg và B6:140 μg) và AgNPs+TEs (Kẽm 80 μg và selen 0,3 μg) vào trứng đã làm tăng 3,60–5,20% trọng lượng cơ thể vào ngày thứ 42 so với nhóm đối chứng không được tiêm. Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng như một cofactor (thiamine pyrophosphate) trong quá trình chuyển đổi glucose thành năng lượng, trong khi vitamin B6, dưới dạng pyridoxal phosphate, có vai trò trong quá trình chuyển đổi axit amin để tổng hợp protein. Cả hai loại vitamin này cũng góp phần vào quá trình chuyển đổi thức ăn hiệu quả ở gia cầm, giúp chúng tăng thêm trọng lượng cơ thể. Goel et al. ( 25 ) quan sát thấy rằng những con gà con được bổ sung vitamin B1, B2 hoặc E vào trứng đã có trọng lượng cơ thể cao hơn vào ngày thứ 42 với chênh lệch từ 50 đến 80g (3,6–5,8%) so với nhóm đối chứng không được tiêm. Tác dụng của việc tiêm vitamin (B1, B2 và E) rõ rệt hơn ở những con chim non (cho đến ngày thứ 21) với mức tăng từ 5,3 đến 13,3% trọng lượng cơ thể so với nhóm đối chứng ( 22 ). Không thể loại trừ vai trò của các nguyên tố vi lượng, đặc biệt là Zn như một chất tăng cường sinh trưởng. Goel et al. ( 27 ) đã báo cáo biểu hiện gen liên quan đến sinh trưởng cao hơn (tức là, gen Somatotropin, IGF-I, IGF-II và mucin) ở gà con được tiêm Zn in ovo . Zn được tìm thấy trong hơn 200 loại enzyme (Zn metalloenzyme) thực hiện các chức năng xúc tác hoặc đồng xúc tác. Các báo cáo trước đây cũng chỉ ra rằng biểu hiện gen IGF-I cao hơn có tương quan với tốc độ tăng trưởng sớm sau khi nở và hiệu quả thức ăn ở gà thịt ( 46 ) và tăng tốc phát triển cơ xương ở phôi chim cút ( 47 ), mặc dù nhiều nhà nghiên cứu đã khuyến cáo rằng AgNP có vai trò không đáng kể trong việc tăng cân, lượng thức ăn tiêu thụ và FCR ( 8 , 17 , 19 , 44 , 48 ) nhưng có thể đóng vai trò là chất mang các chất dinh dưỡng quan trọng ( 49 ). Gà con của các dòng gà thịt cải tiến ngày nay không có đủ năng lượng dự trữ để đáp ứng nhu cầu trao đổi chất lớn và sự chậm trễ trong quá trình vận chuyển từ trại giống đến trang trại, điều này ảnh hưởng thêm đến sự tăng trưởng và hệ thống miễn dịch ở những loài chim này. Cho ăn in ovo giải quyết những vấn đề này bằng cách cung cấp chất dinh dưỡng cho gà con thông qua việc bổ sung vào túi noãn hoàng hoặc màng ối của phôi đang phát triển ở giai đoạn sau của quá trình ấp, do đó bổ sung cho nguồn dự trữ chất dinh dưỡng của trứng và lượng thức ăn tiêu thụ sau khi nở.

Sự phát triển của cơ quan miễn dịch và phản ứng miễn dịch

Trong nghiên cứu này, trọng lượng lách cao hơn đáng kể (lên đến 30,4%) ở nhóm AgNPs+TEs, được tiêm Zn và Se kết hợp với AgNPs, so với nhóm đối chứng và các nhóm khác. Trọng lượng lách tăng đáng kể (18,71%) cũng được quan sát thấy ở cả nhóm AgNP và AgNPs+Vits so với nhóm đối chứng. Các báo cáo trước đó cũng ghi nhận trọng lượng lách cao hơn ở những con chim được xử lý bằng AgNPs ( 17 , 50 ). Ngược lại, trọng lượng mô lymphoid giảm đáng kể cũng được quan sát thấy khi tăng nồng độ AgNP trong chế độ ăn ( 19 , 50 ). Trong một nghiên cứu khác của Bakyaraj và cộng sự ( 22 ), trọng lượng tuyến ức cao hơn đáng kể ở gà con được tiêm nguyên tố vi lượng so với gà con được tiêm axit amin và vitamin. Goel và cộng sự ( 27 ) cũng quan sát thấy rằng trọng lượng lách cao hơn về mặt số lượng ở những gà con được bổ sung Se vào ngày thứ 21 sau khi nở. Trọng lượng lá lách cao hơn ở gà con được tiêm AgNP có thể là do tăng hoạt động đồng hóa và sau đó kích thích sự phát triển và tăng trưởng của các cơ quan lymphoid, vì cấu trúc của AgNP cho phép duy trì oxy nguyên tử bên trong các lỗ bát diện của nó để cung cấp oxy tốt hơn ( 51 ).

Ở những con chim đã được tiêm vắc-xin, phản ứng miễn dịch in vivo đối với PHA-P cao hơn đáng kể ở nhóm AgNPs+TEs, so với nhóm đối chứng. Kết quả này tương quan với các nghiên cứu trước đây trong đó việc bổ sung AgNPs vào trứng làm tăng đáng kể phản ứng miễn dịch in vivo đối với SRBC và PHA-P ( 17 , 19 , 27 ). Bhanja và cộng sự ( 15 ) cũng đã ghi nhận rằng biểu hiện của cytokine (Th1 và Th2) và gen TLR, rất quan trọng đối với khả năng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng ở gà, đã được điều chỉnh tăng ở gà con được tiêm AgNPs. Goel và cộng sự ( 27 ) đã báo cáo sự điều chỉnh tăng đáng kể các gen miễn dịch ở gà con được tiêm Zn hoặc Se so với gà con đối chứng không được tiêm. AgNPs có thể làm tăng hoạt động của khả năng miễn dịch của tế bào bằng cách kích thích tổng hợp protein sốc nhiệt (HSP), mà không kích hoạt con đường gây viêm như bằng chứng từ việc thiếu ảnh hưởng của AgNPs đối với biểu hiện của NF-kB, đây là một yếu tố phiên mã liên quan đến khả năng bảo vệ của cơ thể ( 52 ). Hơn nữa, các đặc tính kháng khuẩn và chống viêm và khả năng làm giàu tế bào bằng oxy cải thiện chức năng hệ thống miễn dịch của cơ thể được bổ sung AgNP. Selen được coi là tác nhân tăng cường miễn dịch để tăng cường hoặc phục hồi chức năng miễn dịch của cơ thể ( 53 ). Các nghiên cứu trước đây cũng đã báo cáo rằng Se đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch của tế bào bằng cách tăng phản ứng mitogen với PHA-P ( 54 ) và phản ứng màng cánh ở chim ( 55 ).

Không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy đối với nồng độ IgG và IgM trong huyết thanh giữa các nhóm. Tuy nhiên, nồng độ IgG cao hơn ở AgNPs+TEs và nồng độ IgM cao hơn ở AgNPs+AAs. Pineda và cộng sự ( 42 ) không tìm thấy tác dụng rõ rệt nào của việc tiếp xúc với hạt nano bạc trước và sau khi nở đối với nồng độ IgG và IgM trong huyết tương. Những con chim được điều trị bằng nano bạc tạo ra nồng độ IgM và IgG cao hơn, nhưng sự khác biệt là không đáng kể ( 19 ). IgG là kiểu kháng thể chính ở gà có chức năng trung gian phản ứng phản vệ, một chức năng tương tự như IgE ở động vật có vú ( 56 ). Ở chim, vùng Fc của IgG có chức năng trung gian hầu hết các chức năng tác nhân sinh học như cố định bổ thể, phản ứng phản vệ và opsonin hóa, trong khi vùng Fab chứa các vị trí liên kết kháng nguyên ( 57 ). Nồng độ IgG cao hơn rõ rệt trong AgNPs+TEs có thể tương quan với tổng lượng Ab sản xuất chống lại kháng nguyên SRBC nhưng không tương quan với vắc-xin ND.

Phản hồi nghiên cứu thách thức Vacxin virus ND

Tám con chim từ mỗi nhóm điều trị (cả đã tiêm vắc-xin và chưa tiêm vắc-xin) đã bị nhiễm 10 ^7,4 ELD ₅₀ /0,1 ml/con vi-rút thử thách ND vào ngày thứ 45 sau khi nở. Chỉ những con chim chưa tiêm vắc-xin mới biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và tổn thương nghiêm trọng. Hầu hết những con chim chưa tiêm vắc-xin đều chết trong vòng 5 ngày sau khi nhiễm bệnh (dpi), ngoại trừ hai con chim, mỗi con từ AgNPs+AAs và AgNPs+TEs, đã chết vào ngày thứ 6 dpi. Tuy nhiên, không có trường hợp tử vong nào được ghi nhận ở các nhóm đã tiêm vắc-xin.

Phát hiện của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Taylor và cộng sự ( 58 ), trong đó những con gà được tiêm vắc-xin đầy đủ đã được thử thách với liều cao virus ND hàng ngày trong 10 ngày. Mặc dù tất cả các con chim được tiêm vắc-xin giả đều chết vào ngày thứ tư sau thử thách, không có trường hợp mắc bệnh hoặc tử vong nào được báo cáo ở những con chim đã tiêm vắc-xin ND ngay cả khi lên đến 14 ngày sau thử thách. Họ cũng quan sát thấy rằng thử thách lặp lại với liều cao ND không khắc phục được khả năng miễn dịch của vắc-xin. Trong một thí nghiệm khác của Desingu và cộng sự ( 59 ), những con gà bị nhiễm vi-rút ND biểu hiện tỷ lệ tử vong 100% với các tổn thương rõ rệt ở dạ dày, ruột, lách và túi hoạt dịch. Tỷ lệ nhiễm trùng tích lũy (theo ngày), thời gian chết trung bình (tính bằng giờ) và điểm trung bình cho các tổn thương tổng thể cho thấy những con chim chưa được tiêm vắc-xin từ AgNP + AA và AgNP + TE chịu được khả năng kháng tối đa đối với vi-rút thử thách. Thời gian tử vong trung bình thấp nhất ở các loài chim đối chứng và tăng lên tới 13,0–24,0% ở các nhóm được tiêm in ovo . Điều này đảm bảo hiệu quả của việc bổ sung kết hợp AgNP và các chất dinh dưỡng khác nói chung, và nano bạc dạng keo nói riêng đối với khả năng miễn dịch và phản ứng kháng vi-rút ở gà thịt. Các nghiên cứu khác, xác nhận những phát hiện của chúng tôi, cho thấy rằng số lượng và độ đặc hiệu của kháng thể dịch thể do các loại vắc-xin khác nhau tạo ra ảnh hưởng đến sự sao chép vi-rút và khả năng bảo vệ lâm sàng ( 41 , 58 , 60 ). Hoạt tính kháng khuẩn và kháng vi-rút của các hạt nano bạc ( 30 – 32 ) được trung gian thông qua các ion Ag+, ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách ức chế các enzym hô hấp và các thành phần vận chuyển điện tử gây trở ngại cho chức năng DNA ( 33 ) hoặc thông qua tương tác với các protein bề mặt của vi-rút ( 30 ) và bộ gen vi-rút (DNA hoặc RNA).

Sự biểu hiện khác biệt của gen IL-6 và IL-2

Biểu hiện cao hơn đáng kể của gen IL-6 và IL-2 đã được thấy trong AgNP và sự kết hợp của chúng với AA, Vits và TE sau khi thử thách với vi-rút ND. Bhanja và cộng sự ( 15 ) cũng báo cáo sự biểu hiện tăng cường của gen miễn dịch dịch thể (IL-6) và gen miễn dịch qua trung gian tế bào (IL-12) trong phôi được xử lý bằng AgNP hoặc Cys+AgNP sau khi được kích hoạt bởi LPS. Ngoài ra, biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cũng tăng lên ở gà con được bổ sung nguyên tố vi lượng (Zn và Se) và AgNP ( 17 , 27 ). Ở gà, tế bào lympho T rất quan trọng đối với hệ thống miễn dịch, sau khi được kích hoạt sẽ biệt hóa thành tế bào T hỗ trợ ( 61 ), sản xuất kháng nguyên CD4 hoặc CD8 trong quá trình hình thành phôi ( 62 ). Các tế bào này hoạt động như một nguồn cytokine tiền viêm (IL-6) gây ra sự trưởng thành cuối cùng của tế bào B thành tế bào plasma tiết kháng thể ( 63 ) gây ra sự tăng sinh và biệt hóa của immunoglobulin hoặc bằng cách tăng sinh tế bào lympho T thông qua sản xuất IL-2 và tham gia vào quá trình hoạt hóa tế bào giết tự nhiên NK và tế bào ly giải tế bào T ( 64 ). Kẽm là một thành phần thiết yếu của thymulin, một loại hormone từ tuyến ức và tham gia vào quá trình trưởng thành và biệt hóa của tế bào T ( 65 ). Trong nghiên cứu này, nhóm gà con AgNP + AA và AgNP + TE sau khi thử thách với vi-rút ND có biểu hiện IL-6 và IL-2 cao hơn đáng kể và cũng có phản ứng tốt hơn với SRBC và PHA-P.

Phần kết luận

Việc bổ sung AgNP vào trứng cùng với các chất dinh dưỡng quan trọng như axit amin, vitamin và các nguyên tố vi lượng đã cho thấy kết quả khả quan trong việc cải thiện khả năng tăng trưởng và miễn dịch sau khi nở ở gà thịt, đặc biệt là 50 μg AgNP/trứng kết hợp với vitamin (B1 & B6) và các nguyên tố vi lượng (Zn & Se) đã cải thiện hiệu suất sản xuất và 50 μg AgNP/trứng với các nguyên tố vi lượng và axit amin đã tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng chống lại thử thách của vi-rút ND ở gà thịt. Tính chất kháng vi-rút của AgNP rõ ràng đã được chứng minh trong nghiên cứu thử thách chi tiết của chúng tôi. Tuy nhiên, AgNP được sử dụng trong điều trị dự phòng hoặc điều trị bệnh ở gà, cần có thêm nghiên cứu để xác định cơ chế kháng vi-rút chính xác và liều an toàn cao nhất ở gà thịt, để tăng khả năng chống lại vi-rút gây chết người ở gia cầm mà không tạo ra rủi ro mới cho con người hoặc môi trường.

Nguồn tham khảo: In ovo nano-silver and nutrient supplementation improves immunity and resistance against Newcastle disease virus challenge in broiler chickens

Subrat Kumar Bhanja, Pradeepta Kumar Rath, Akshat Goel, Manish Mehra, Sujoy K Dhara, Vinod K Paswan, Youssef A Attia, Abdulmohsen Hussen Alqhtani, Ahmed B A Ali, Abdelrazeq M Shehata