Nano bạc tiêu diệt vi khuẩn kháng đa kháng sinh Staphylococcus aureus trên bò sữa bị viêm vú.
Bối cảnh: Kháng kháng sinh là vấn đề nổi bật trong việc điều trị viêm vú ở bò, do đó, nghiên cứu này được thực hiện tại khu vực địa lý xung quanh thị trấn Shirwal thuộc huyện Satara, miền Tây Maharashtra, Ấn Độ để điều tra sự xuất hiện của tình trạng kháng đa thuốc ở Staphylococcus aureus (MDRSA) phân lập từ các mẫu sữa bò bị viêm vú. Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chế phẩm hạt nano bạc (GAgNPs) tổng hợp từ Azadirechta indica chống lại MDRSA gây viêm vú.
Phương pháp: Tổng cộng 250 mẫu sữa từ bò nghi ngờ bị viêm vú được sàng lọc bằng xét nghiệm viêm vú California (CMT). Các mẫu dương tính với CMT được tiến hành điều tra vi khuẩn học để xác định sự hiện diện của S. aureus như một tác nhân gây bệnh. Các chủng phân lập được xác định là S. aureus được xác thực thêm bằng phương pháp phân tử nhắm mục tiêu vào gen 16s-rRNA và gen nuc. Tất cả các chủng S. aureus đều được tiến hành thử nghiệm độ nhạy kháng sinh. Các chủng MDRSA được chọn ngẫu nhiên đã được thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh với chế phẩm nano bạc được điều chế từ bạc nitrat bằng cách khử với chiết xuất lá Azadirachta indica .
Kết quả: Trong số 250 mẫu sữa bò nghi ngờ bị viêm vú được sàng lọc bằng CMT, 170 mẫu cho kết quả dương tính. Từ các mẫu sữa này, 145 chủng S. aureus đã được phân lập và xác định vi khuẩn học. Khi được xử lý để kiểm tra độ nhạy cảm kháng sinh, 60 chủng được phát hiện có khả năng kháng đa thuốc. Khả năng kháng thuốc cao nhất được thể hiện đối với kháng sinh beta-lactam. Nano bạc được tổng hợp và đặc trưng bằng hình thái học, quang phổ và TEM (kính hiển vi điện tử truyền qua) và được thử nghiệm hiệu quả kháng khuẩn in vitro chống lại MDRSA cho thấy đặc tính kháng khuẩn đáng kể.
GIỚI THIỆU
Viêm vú ở động vật nuôi lấy sữa là một trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể cho quốc gia về sản lượng kinh tế. Viêm vú chiếm khoảng 38% tổng chi phí trực tiếp của các bệnh nhiễm trùng công nghiệp phổ biến trên toàn cầu (Kossaibati và Esslemont, 1997) . Tại Ấn Độ, tổn thất kinh tế liên quan đến viêm vú đã tăng khoảng 115 lần trong năm thập kỷ qua (Dua, 2001) . Vi khuẩn là nguyên nhân chính và thường xâm nhập vào ống dẫn sữa qua lỗ núm vú, sinh sôi nhanh chóng và tạo ra độc tố và các enzyme khác, gây ra phản ứng viêm. Tụ cầu khuẩn là một trong những chi vi khuẩn chính gây viêm vú ở bò sữa. S. aureus là một trong những nguồn gây nhiễm trùng tuyến vú hàng đầu ở bò sữa (Dufour và cộng sự , 2012), gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe vật nuôi và năng suất nói chung. Thuốc kháng sinh đã được sử dụng rộng rãi và sẽ tiếp tục được sử dụng trong thú y và y học người để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên, vi khuẩn kháng thuốc là một trong những mối đe dọa mới nổi trên thế giới hiện nay. Vi khuẩn đa kháng thuốc lan rộng trong cộng đồng là một xu hướng nghiêm trọng liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh, tử vong, chi phí chăm sóc sức khỏe và việc sử dụng kháng sinh cao hơn. Để khắc phục khủng hoảng kháng thuốc, các giải pháp thay thế khác đang được nghiên cứu và một trong số đó là sử dụng các hạt nano. Tuy nhiên, các hạt nano có nguồn gốc kim loại đi kèm với một số rủi ro đối với sức khỏe và môi trường. Do đó, phương pháp nhanh chóng, an toàn cho môi trường, không gây bệnh và tiết kiệm chi phí bằng cách sử dụng thực vật để sản xuất các hạt nano xanh đã thu hút sự quan tâm trong những năm gần đây, vì nó cung cấp một kỹ thuật một bước cho quá trình sinh tổng hợp. Phương pháp đơn giản và ít tốn kém nhất để tạo ra các hạt nano là khử và ổn định các ion bạc kim loại bằng cách sử dụng hỗn hợp các phân tử sinh học đã có sẵn trong chiết xuất thực vật, chẳng hạn như protein, axit amin, polysaccharid, tecpen, ancaloit, phenolic, saponin và vitamin (Roy et al ., 2017). Quá trình khử có sự hỗ trợ của thực vật là cơ chế chính cho quá trình này do các chất phytochemical. Nồng độ tương đối cao của các chất khử (steroid, saponin, carbohydrate và flavonoid) và chất bao phủ (các hợp chất thực vật) đảm bảo tính ổn định của các hạt nano xanh (Sondi và Salopek-Sondi, 2004) .
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tổng cộng 250 con bò lai giống HF thuộc các trang trại nhỏ lẻ khác nhau nằm trong và xung quanh thị trấn Shirwal, huyện Satara, bang Maharashtra, Ấn Độ, đã được sàng lọc bệnh viêm vú bằng phương pháp thử nghiệm viêm vú California (CMT). Các mẫu dương tính với CMT được xem xét để xử lý tiếp. Các mẫu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá và xử lý ngay lập tức. Các mẫu sữa viêm vú thu thập được đã được tiến hành phân lập vi sinh vật theo các phương pháp tiêu chuẩn được mô tả trong Sổ tay Vi khuẩn học Hệ thống của Bergey, năm 1986. Các mẫu được cấy trên các môi trường như thạch máu và thạch dinh dưỡng và các môi trường chọn lọc và phân biệt khác như thạch muối Mannitol (MSA), thạch MacConkey và thạch Eosin methylene blue (EMB). Các đĩa cấy được ủ hiếu khí ở 37°C trong 24 giờ và được kiểm tra sự phát triển, sắc tố, tan máu và hình thái khuẩn lạc. Các khuẩn lạc tròn màu vàng nghi ngờ là S. aureus đã được xác nhận thêm bằng các xét nghiệm sinh hóa và xét nghiệm PCR. Việc chiết xuất và tinh chế DNA của S. aureus được thực hiện bằng phương pháp làm lạnh nhanh (Alwan và Talak, 2015) . Tóm lại, các khuẩn lạc thuần khiết được chọn từ thạch Mannitol Salt và trộn với 150 µl môi trường nuôi cấy. Sau đó, hỗn hợp này được đun sôi trong 10 phút ở 91°C và ngay lập tức được làm lạnh nhanh trong đá bào khoảng 10 phút. Sau khi làm lạnh, các ống nghiệm được ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 10 phút. Phần dịch nổi được sử dụng làm DNA khuôn mẫu. DNA tinh chế được xử lý để phát hiện gen 16s-rRNA đặc hiệu của S. aureus (Akindolire et al ., 2015) cũng như PCR gen nuc đặc hiệu loài (Zhang et al ., 2004). Trình tự mồi được sử dụng lần lượt là 16s-rRNA F 5’GTAGGTG GCAAGCGTTACC3′, 16s-rRNA R 5’CGCACATCAGCG TCAG3′ và nuc F 5’GCGATTGATGGTGATACGGTT3′ , nuc R 5’AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC3′. Phản ứng được thực hiện trong thể tích 25 µL. Mỗi hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm 12,5 µL hỗn hợp PCR Himedia, 1 µL mỗi loại mồi xuôi và mồi ngược, 3 µL DNA và được bổ sung nước không chứa nuclease đến thể tích 25 µL. Điều kiện khuếch đại PCR cho 16s-rRNA bao gồm: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; Tiếp theo là 30 chu kỳ khuếch đại gồm giai đoạn biến tính ở 94°C trong 30 giây, giai đoạn bắt cặp ở 64°C trong 30 giây và giai đoạn kéo dài ở 72°C trong 1 phút, bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút, trước khi làm nguội đến 4°C. Để thực hiện khuếch đại PCR cho gen nuc, hỗn hợp chính được sử dụng giống như mô tả ở trên. Điều kiện PCR như sau: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; tiếp theo là 30 chu kỳ khuếch đại gồm giai đoạn biến tính ở 94°C trong 1 phút, giai đoạn bắt cặp ở 50°C trong 1 phút và giai đoạn kéo dài ở 72°C trong 2 phút, bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10 phút, trước khi làm nguội đến 4°C (Bảng 1).
Bảng 1: Trình tự oligonucleotide của các mồi được sử dụng trong nghiên cứu gen kháng kháng sinh của S. aureus.
Mẫu độ nhạy kháng sinh đồ của vi sinh vật mục tiêu S. aureus phân lập (n=170) từ sữa viêm vú được phân tích bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby Bauer (Bauer, 1966) sử dụng đĩa kháng sinh thương mại của Công ty TNHH HiMedia Laboratories, Ấn Độ, theo hướng dẫn của Viện Lâm sàng và Xét nghiệm (CLSI, 2018) (Bảng 2). Nghiên cứu nhằm mục đích phát hiện tình trạng kháng kháng sinh (AMR) ở S. aureus phân lập từ sữa viêm vú đối với nhiều loại kháng sinh, do đó, phân tích khả năng kháng đa kháng sinh và các gen biểu hiện khả năng này ở S. aureus được thực hiện bằng PCR với nhiều mồi trình tự oligonucleotide (Bảng 3). Các gen AMR như gen mec A đối với methicillin, tet K, tet M đối với Tetracycline, erm A, erm C đối với Macrolide, Lincosamide, aac A đối với Aminoglycosides, gen van A, van B đối với kháng Vancomycin, gen mrs A, mrs B đối với kháng Macrolide được đánh giá trong ba bộ PCR đa mồi khác nhau. Trong bộ I, PCR đa mồi được thực hiện cho các gen mec A, erm A, erm C, tet K, tet M, aac A. Trong khi đó, bộ II thực hiện PCR đa mồi cho gen van A và van B, và bộ III thực hiện cho gen mrs A và mrs B. Để nghiên cứu hiệu quả của GAgNP, 10 chủng phân lập kháng nhiều hơn ba loại kháng sinh được xác định là MDRSA đã được chọn ngẫu nhiên, có số lượng khuẩn lạc (CFU) cao hơn nhiều so với phạm vi tham chiếu cho phép (phạm vi trung bình từ 7,161±0,00866 đến 9,083333±0,025783) để nghiên cứu hiệu quả của GAgNP.
Bảng 2: Kết quả về độ nhạy cảm và mô hình kháng kháng sinh của các chủng MDRSA (n=60) gây viêm vú ở bò.
Bảng 3: Điều kiện PCR để khuếch đại các gen AMR.
Đối với nghiên cứu này, các hạt nano bạc được tổng hợp từ bạc nitrat khử bằng chiết xuất lá Azadirachta indica theo Roy et al ., (2017) với một số sửa đổi nhỏ (Hình 1). Lá xanh tươi, trưởng thành được thu thập và rửa sạch, 20 gam lá được thái nhỏ, cho vào 100 ml nước cất hai lần và đun sôi trong 10 phút. Chiết xuất được làm nguội, lọc và bảo quản trong tủ lạnh ở 4°C-8°C cho đến khi sử dụng. Dung dịch bạc nitrat 0,1N (HiMedia Pvt. Ltd., Ấn Độ) được sử dụng để tổng hợp GAgNPs theo phương pháp xanh. Chuẩn bị 5 ống nghiệm sạch, vô trùng và được dán nhãn. Sau đó, lần lượt cho 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml và 5 ml chiết xuất neem vào các ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch bạc nitrat vào mỗi ống nghiệm. Các ống nghiệm được bọc bằng giấy bạc và toàn bộ được ủ trong buồng tối để giảm thiểu sự hoạt hóa quang học của bạc nitrat ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sự thay đổi màu từ không màu sang nâu xác nhận sự khử ion bạc. Mật độ quang học của dịch chiết được đo để xác định nồng độ GAgNP được hình thành bằng cách lấy 50 µL mỗi mẫu vào đĩa ELISA và sử dụng máy đọc ELISA ở các bước sóng khác nhau là 405 nm, 420 nm và 450 nm để ghi lại độ hấp thụ cực đại. Quá trình tổng hợp Nano bạc, kích thước của chúng và hoạt tính kháng khuẩn chống lại mười chủng phân lập ngẫu nhiên có MDRSA được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, MIC. Ngoài ra, hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của Nano bạc cũng được chụp bằng kính hiển vi điện tử (mẫu JEOL JEM-1011 100 kV) (Hình 2).
Hình 1: Tổng hợp Nano bạc từ dịch chiết lá neem (Azadirachta indica) trong dung dịch nước.
Hình 2: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt nano bạc (GAgNPs) được điều chế từ dịch chiết neem trong nước.
Để xác định GAgNP hiệu quả được điều chế từ tỷ lệ thích hợp giữa bạc nitrat và chiết xuất lá neem để ứng dụng trong các nghiên cứu hiệu quả thực tế, trước tiên hiệu quả của nó được đánh giá bằng thử nghiệm khuếch tán giếng thạch theo Roy et al ., (2017) với năm tỷ lệ khác nhau giữa chiết xuất neem và bạc nitrat: N1 (1:1), N2 (2:1), N3 (3:1), N4 (4:1), N5 (5:1).
Hoạt tính kháng khuẩn của Nano bạc đã điều chế được đánh giá bằng cách thực hiện MIC sử dụng phương pháp được mô tả bởi Loo et al ., (2018) với một số sửa đổi nhỏ. MIC được thực hiện trong đĩa vi giếng đáy phẳng 96 giếng bằng phương pháp pha loãng vi khuẩn trong môi trường lỏng. Nồng độ vi khuẩn được điều chỉnh đến 10^5 CFU/mL mẫu như mô tả trong hướng dẫn của Hiệp hội Vi sinh vật học Hoa Kỳ (2016) . Dung dịch gốc GAgNPs 100 µL được thêm vào hai đĩa riêng biệt, một đĩa dùng môi trường RPMI và một đĩa dùng môi trường MBC. Thuốc được pha loãng gấp đôi trong 100 µL dung dịch NB, bắt đầu từ nồng độ cao nhất ở cột 12 đến thấp nhất ở cột 03, trong khi cột 01 được dùng làm đối chứng âm (chỉ có môi trường) và cột 02 được dùng làm đối chứng dương (môi trường và dịch cấy vi khuẩn). Mỗi giếng của đĩa vi giếng được thêm 100 µL dịch cấy vi khuẩn, ngoại trừ đối chứng âm. Mỗi giếng được thêm 30 µL dung dịch Resazurin và tiến hành đo sau khi ủ ở 37°C trong 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ và 24 giờ. Hỗn hợp trong mỗi giếng được quan sát sự thay đổi màu sắc theo quy trình thử nghiệm, trong đó, màu xanh lam/tím cho thấy không có sự phát triển của vi khuẩn, trong khi màu hồng hoặc không thay đổi màu sắc cho thấy có sự phát triển của vi khuẩn trong giếng. Đồng thời, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được kiểm tra bằng cách cấy hỗn hợp dung dịch thuốc và hỗn hợp vi khuẩn vào từng giếng của đĩa ELISA trên đĩa thạch và quan sát sự phát triển của MDRSA sau khi ủ 24 giờ. Nồng độ pha loãng thấp nhất có hiệu quả của GAgNPs được coi là giá trị MBC hiệu quả. Các Nano bạc tổng hợp cũng được thử nghiệm so sánh về tính chất kháng khuẩn với các hạt nano thương mại có sẵn được mua từ GreenVision Life Sciences Pvt. Ltd., Pune, Ấn Độ, chống lại MDRSA.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập và định danh vi khuẩn:
Từ 250 con bò nghi ngờ mắc viêm vú có triệu chứng, 170 con được phát hiện dương tính với xét nghiệm CMT, trong đó 30 con bò bị viêm vú lâm sàng với phản ứng +++ và 140 con còn lại cho thấy sự giảm sản lượng sữa trung bình với các mẫu có phản ứng CMT ++ và +. Các vi sinh vật gram dương được phân lập là S. aureus 145/170 (85,29%), Bacillus spp. 40/170 (23,52%), tụ cầu khuẩn coagulase âm tính spp. 25/170 (14,70%), trực khuẩn gram dương không xác định 10/170 (5,88%) và Streptococcus spp. 02/170 (1,17%). Vi sinh vật gram âm chính được phân lập từ các mẫu sữa viêm vú của bò là E. coli 100/170 (58,82%). S. aureus là sinh vật mục tiêu của nghiên cứu hiện tại, tất cả 145 chủng phân lập được xác định về kiểu hình và sinh hóa đều được xác nhận lại bằng phương pháp PCR gen 16S-rRNA thông thường, cho thấy sản phẩm 228 bp (Hình 3A) tương tự như nghiên cứu của Andrade et al ., (2021) và sản phẩm 279 bp đặc trưng của loài từ gen nuc (Hình 3B).
Hình 3: Sản phẩm PCR khuếch đại của S. aureus.
Tính nhạy cảm kháng khuẩn của vi khuẩn S. aureus phân lập từ viêm vú bò.
Trong nghiên cứu này, chỉ có MDRSA được xem xét cho các nghiên cứu về hiệu quả kháng khuẩn chống lại nano bạc, do đó, kết quả của 60 chủng MDRSA được phát hiện cho thấy khả năng kháng các nhóm kháng sinh khác nhau đã được phân tích. Trong số 145 chủng S. aureus , 60 chủng được phát hiện có khả năng kháng kháng sinh (AMR) bằng phương pháp ABST như thể hiện trong Bảng 2. Hơn nữa, 60 chủng MDRSA thể hiện khả năng kháng đa thuốc đã được tiến hành phân tích kiểu gen của các gen kháng thuốc (Hình 4). Như thể hiện trong Bảng 4, nhìn chung, gen erm A được tìm thấy trong số lượng mẫu cao nhất, tiếp theo là aaca -D, tet K, erm C, mec A, van B và mrs B. Các gen tet A, mrs A và van A không có trong bất kỳ chủng nào được thử nghiệm. Do đó, có thể kết luận rằng ở MDRSA, khả năng kháng thuốc cao nhất được thể hiện đối với nhóm kháng sinh β-lactam, tiếp theo là nhóm kháng sinh macrolide. Điều này có thể là do nhóm kháng sinh β-lactam thường được sử dụng để điều trị viêm vú và viêm vú cận lâm sàng, trong khi kháng sinh macrolide được ưu tiên sử dụng để điều trị nhiễm trùng kháng penicillin trong khu vực. Kháng thuốc đáng kể được ghi nhận đối với nhóm tetracycline có thể là do việc sử dụng bừa bãi loại kháng sinh này để phòng ngừa viêm vú cùng với các bệnh nhiễm trùng không đặc hiệu khác, nhiễm ký sinh trùng/nguyên sinh trùng máu ở động vật nhai lại trong khu vực nghiên cứu. Vì glycopeptide không được sử dụng thường xuyên trong thú y, nên có rất ít báo cáo về tỷ lệ lưu hành của Staphylococcus aureus kháng Vancomycin (VRSA) ở động vật. Mặc dù vậy, khả năng VRSA lây nhiễm vào môi trường xung quanh hoặc đồng cỏ và sau đó xâm nhiễm động vật nuôi không thể hoàn toàn loại trừ (Bhattacharyya et al ., 2016) , đây có thể là lý do dẫn đến tình trạng kháng vancomycin đáng kể được tìm thấy trong nghiên cứu hiện tại. Nhìn chung, mức độ kháng thuốc vừa phải được ghi nhận đối với aminoglycoside và quinolone, mặc dù streptomycin và norfloxacin cho thấy mức độ kháng thuốc cao hơn. Khả năng kháng thuốc thấp nhất được quan sát thấy ở nhóm kháng sinh phenicol vì việc sử dụng chloramphenicol không phổ biến lắm trong điều trị động vật ở khu vực nghiên cứu (Hình 5). Những phát hiện tương tự đã được Sharma et al ., (2015) ghi nhận, với tỷ lệ kháng Penicillin 100% ở S. aureus phân lập từ bò bị viêm vú, trong khi Ramasamy et al ., (2021) và Shrestha et al ., (2021) Đã ghi nhận tỷ lệ kháng Ampicillin 100% ở S. aureus phân lập từ bò bị viêm vú. Chandrasekaran et al ., (2014) đã phát hiện tỷ lệ kháng Methicillin 100% ở S. aureus phân lập từ bò bị viêm vú, cao hơn, trong khi tỷ lệ kháng penicillin mà họ phát hiện thấp hơn so với kết quả hiện tại. Đồng quan điểm với nghiên cứu của chúng tôi, Ramasamy et al ., (2021) và Ali et al ., (2021) đã báo cáo tỷ lệ kháng oxytetracycline từ hoàn toàn đến rất cao. Tương tự như kết quả của chúng tôi , Siddiki et al ., (2019) và Pu et al ., (2014) đã tìm thấy tỷ lệ kháng Streptomycin 70% và tỷ lệ kháng Gentamicin 11,17% ở S. aureus phân lập từ sữa bò. Trong mẫu ABST đối với Gentamicin, tỷ lệ kháng cao hơn so với nghiên cứu hiện tại đã được Brahma et al ., (2022) báo cáo. Tương quan với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, Mushtaq et al ., (2019) đã báo cáo độ nhạy 100% với Enrofloxacin. Độ nhạy với Chloramphenicol đối với S. aureus được Nelli et al ., (2022) báo cáo rất giống với nghiên cứu hiện tại. So với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, Sharma et al ., (2014) đã ghi nhận tỷ lệ kháng thuốc cao hơn trong khi Singh et al ., (2016) đã ghi nhận tỷ lệ kháng Vancomycin thấp hơn một chút trước đó.
Hình 4: Các chủng MDRSA phân lập từ sữa bò bị viêm vú cho thấy các gen kháng kháng sinh trong PCR đa mồi.
Hình 5: Mô hình độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng MDRSA phân lập từ bệnh viêm vú ở bò cho thấy mô hình kháng đa thuốc.
Bảng 4: Tỷ lệ phổ biến của các gen kháng kháng sinh trong (n=60) chủng MDRSA phân lập từ bò bị viêm vú.
Tổng hợp sinh học và đặc tính của GAgNPs:
Các hạt nano bạc (GAgNPs) đã được tổng hợp thành công trong nghiên cứu này từ bạc nitrat khử bằng chiết xuất lá Azadirachta indica theo phương pháp tương tự như Roy et al ., (2017). Nghiên cứu đặc tính của GAgNP được thực hiện bằng cách đánh giá giá trị OD của từng mẫu đã chuẩn bị và kết quả độ hấp thụ thu được của N1, N2, N3, N4 và N5 ở bước sóng 405 nm lần lượt là 0,533, 0,84, 1,146, 1,444 và 1,531. Ở bước sóng 420 nm, độ hấp thụ ghi nhận được là 0,192, 0,273, 0,357, 0,517 và 0,604. Và ở bước sóng 450 nm, độ hấp thụ được tìm thấy là 0,147, 0,187, 0,233, 0,279 và 0,477. Do đó, giá trị hấp thụ cực đại được ghi nhận ở bước sóng 405 nm. Việc đặc trưng hóa Nano bạc về hình dạng, kích thước và vẻ ngoài được thực hiện bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), cho thấy hình dạng cầu tổng quát với các hình ảnh hiển thị các cụm hạt nhỏ và một vài hạt phân tán, trong khi kích thước của chúng được đo nằm trong khoảng từ 10 đến 70 nm đường kính (Hình 2). Hình ảnh TEM thu được từ các môi trường nuôi cấy được sử dụng trong các nghiên cứu MIC cho thấy các hạt nano bám dính trên bề mặt tế bào MDRSA dẫn đến sự phân hủy thành tế bào và ly giải tế bào vi khuẩn.
Hiệu quả kháng khuẩn của GAgNP chống lại MDRSA:
Là điều kiện tiên quyết để xác định nồng độ kháng khuẩn hiệu quả tối ưu của thuốc nano cho các nghiên cứu thử nghiệm độ nhạy kháng sinh tiếp theo chống lại MDRSA, 50 µl các hạt nano màu xanh lá cây được điều chế và dán nhãn là N1, N2, N3, N4 và N5 được thêm vào năm giếng được chuẩn bị trên đĩa thạch đã được cấy MDRSA bằng kỹ thuật khuếch tán giếng. Các đĩa được ủ qua đêm và đường kính vùng ức chế được đo. Vùng ức chế lớn nhất (23 nm) được quan sát thấy xung quanh giếng chứa N5, tiếp theo là N4 (21 nm), N3 (18 nm) và N2 (13 nm), trong khi sự ức chế không đáng kể được ghi nhận xung quanh N1. Do đó, để nghiên cứu thêm về MIC, thuốc N5 đã được chọn dựa trên các quan sát của Roy et al ., (2017).
Kết quả MIC của GAgNP chống lại MDRSA in vitro
Nồng độ thuốc N5 được sử dụng trong MIC lần lượt là 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,06, 0,03 và 0,015 µl/mL. Hiệu quả kháng khuẩn đáng kể chống lại MDRSA đã được ghi nhận ở tất cả các nồng độ này. Khi so sánh với kết quả về hiệu quả kháng khuẩn của các hạt nano thương mại (NW: 50) chống lại MDRSA, kết quả tương đương đã được quan sát thấy ở tất cả các nồng độ thuốc được sử dụng. Việc xác nhận hiệu quả của thuốc cũng được thực hiện bằng cách tiến hành MBC trên tất cả các giếng có thêm MDRSA và được xử lý bằng các hỗn hợp pha loãng thuốc khác nhau, trong đó không quan sát thấy sự phát triển rõ rệt ngay cả ở nồng độ Nano bạc thấp nhất là 0,015 µl/mL, do đó, xác nhận tiềm năng ứng cử của Nano bạc cho hoạt tính kháng khuẩn chống lại MDRSA có trong các mẫu viêm vú của bò.
PHẦN KẾT LUẬN
Kết luận cho thấy S. aureus là vi khuẩn chủ yếu gây viêm vú ở bò sữa trong khu vực nghiên cứu. Các chủng phân lập này cho thấy khả năng kháng thuốc cao nhất đối với nhóm kháng sinh β-lactamase, tiếp theo là nhóm kháng sinh macrolide. Tuy nhiên, các hạt nano bạc (GAgNPs) được tổng hợp bằng cách khử với chiết xuất lá Azaderichta indica đã thể hiện đặc tính kháng khuẩn đáng kể chống lại MDRSA, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong tương lai chống lại MDRSA.
Nguồn tham khảo: Efficacy of Green Silver Nanoparticles (GAbNPs) against Multidrug Resistance in Staphylococcus aureus from Mastitis-infected Cows
M.D. Ramteke1, P.P. Mhase1,* D.M. Muglikar, M.S. Budhe, U.M. Tumlam, R.P. Kolhe, S.N. Jadhav, P.D. Pawar, L.D. Singla