Nano bạc tiêu diệt virus gây bệnh lở mồm long móng FMDV ở heo, bò…

Nghiên cứu này điều tra hiệu quả kháng vi-rút của các hạt nano bạc ổn định bằng chitosan (AgNP) đối với vi-rút gây bệnh lở mồm long móng (FMDV), một tác nhân gây bệnh rất dễ lây lan ảnh hưởng đến động vật móng guốc. Các thí nghiệm trong ống nghiệm đã chứng minh rằng nano bạc ức chế hiệu quả sự sao chép của FMDV theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Ở nồng độ 1,56 μg/ml, AgNP không biểu hiện độc tính đối với tế bào thận 21 của chuột đồng con (BHK21) trong khi đạt được sự bất hoạt hoàn toàn của FMDV ở nồng độ 10³ TCID₅₀ và ức chế sự phát triển của vi-rút ở nồng độ 10⁴ TCID_50. Những phát hiện này cho thấy tiềm năng của các hạt nano bạc như một chất khử trùng mới để kiểm soát sự lây truyền của FMDV và ngăn ngừa các đợt bùng phát dịch bệnh.

NANOCMM TECHNOLOGY

Giới thiệu

Virus gây bệnh lở mồm long móng (FMDV) là một tác nhân gây bệnh do virus có khả năng lây lan cao, ảnh hưởng đến các loài động vật móng chẻ trong nước và hoang dã, chẳng hạn như gia súc, lợn, cừu và dê.[1] Bệnh này đặc trưng bởi sự hình thành các mụn nước và vết loét trên miệng, mũi và bàn chân của động vật bị nhiễm bệnh.[2] Sự lây truyền qua không khí cũng liên quan đến sự lây lan của bệnh trên cả khoảng cách xa (được coi là lên đến 50 km trên đất liền và 200 km trên mặt nước) và khoảng cách ngắn (trong khuôn viên và các khuôn viên lân cận trong phạm vi 2 km gần nhau).

FMDV, thuộc họ Picornaviridae, có cấu trúc tương tự như các loại virus RNA sợi đơn khác. Nó có bộ gen RNA sợi đơn được bao bọc bởi lớp vỏ protein.[6] Hạt FMDV có hình cầu gần đúng và đường kính khoảng 25–30 nm. Nó bao gồm bộ gen RNA được bao quanh bởi lớp vỏ protein hoặc capsid. Lớp vỏ bao gồm 60 bản sao của capsomer. Mỗi capsomer bao gồm bốn chuỗi polypeptide cấu trúc, VP1, VP2, VP3 và VP4. VP1, VP2 và VP3 được phơi bày trên bề mặt của virus trong khi VP4 nằm bên trong.[1] Cấu trúc đặc biệt của lớp vỏ protein giúp FMDV chống lại sự tấn công của hệ thống miễn dịch của vật chủ và có thể giải thích tại sao loại vi-rút này dễ lây lan trong quá trình bùng phát dịch bệnh. Điều kiện lý tưởng để vi-rút sống sót là nhiệt độ dưới 50°C, độ ẩm tương đối trên 55% và độ pH trung tính.[7–9]FMDV tồn tại ở bảy loại huyết thanh khác nhau. Các huyết thanh O và A ban đầu được Vallee và Carre phát hiện.[10] Công trình của họ được Waldmann và Trautwein mở rộng[11] với việc phát hiện ra huyết thanh loại thứ ba được đặt tên là huyết thanh loại C. Sau đó, ba huyết thanh loại bổ sung đã được xác định trong các mẫu có nguồn gốc từ Nam Phi và chúng được đặt tên là Lãnh thổ Nam Phi 1, 2 và 3 (SAT1, SAT2, SAT3).[12] Huyết thanh loại thứ bảy, Asia-1, ban đầu được phát hiện trong một mẫu thu thập từ một con trâu nước tại Okara, Punjab, Pakistan, vào năm 1954.[12] Ở khu vực Đông Nam Á, FMDV của các huyết thanh loại O, A và Asia-1 đã được xác định là nguyên nhân chính gây ra các đợt bùng phát lớn ở Campuchia, Lào, Malaysia, Myanmar, Philippines, Thái Lan và Việt Nam trong những năm gần đây.[13–17] Các nghiên cứu về FMDV đã chỉ ra rằng các phân lập thu được từ các quốc gia này có trình tự nucleotide tương đồng cao. FMDV lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp với động vật bị nhiễm bệnh, dịch tiết của chúng hoặc các vật thể bị nhiễm bẩn, cũng như qua đường không khí trong khoảng cách ngắn.

Các hạt nano bạc (AgNP) đã được đánh giá là một trong những chất khử trùng mạnh chống lại nhiều loại mầm bệnh bao gồm vi khuẩn, vi-rút”, nấm và nấm men. Nhờ khả năng ức chế và tiêu diệt vi-rút, AgNP được coi là một công cụ tuyệt vời để ngăn ngừa sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm. Theo các nghiên cứu trước đây, nano bạc có thể tấn công vi-rút bằng cách phá hủy lớp vỏ ngoài của chúng và ức chế sự bám dính của chúng vào thụ thể tế bào hoặc liên kết trực tiếp với DNA hoặc RNA của vi-rút để ức chế sự sao chép hoặc lan truyền của vi-rút bên trong tế bào vật chủ. Hoạt tính kháng vi-rút của AgNP không chỉ được nghiên cứu để loại bỏ các loại vi-rút lây nhiễm cho người, chẳng hạn như vi-rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV-1), vi-rút cúm A H1N1, vi-rút cúm H3 N2, Thử nghiệm độc tính tế bào vi-rút herpes simplex loại 1 và loại 2 (HSV-1, HSV-2,42,43] vi-rút vaccinia (VACV); vi-rút sốt xuất huyết và vi-rút SAR-COVID-2, mà còn cả vi-rút gây bệnh ở động vật như vi-rút sốt lợn châu Phi. Mặc dù hoạt tính kháng vi-rút của chitosan ổn định AgNP đã được chứng minh với một số loại virus, hiệu suất kháng virus của chúng đối với FMDV hầu như chưa được nghiên cứu. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu khả năng ức chế của AgNP ổn định bằng chitosan đối với FMDV và đánh giá ứng dụng tiềm năng của chúng để ngăn ngừa sự lây lan của FMD.

Vật liệu và phương pháp

Vật liệu

Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) được mua từ Gibco, và Huyết thanh bò thai nhi (FBS) để nuôi cấy tế bào được cung cấp bởi Roche. Bạc nitrat (AgNO3, độ tinh khiết >99%) và natri borohydride (NaBH, 99%) được mua từ Merck Chitosan có trọng lượng phân tử từ 50000 đến 190000 Da (dựa trên độ nhớt) được cung cấp bởi Sigma Aldrich.

Tổng hợp hạt nano bạc

AgNP được điều chế bằng phương pháp khử hóa học sử dụng AgNO, làm tiền chất bạc, chitosan làm chất ổn định và NaBH, làm chất khử. Thông thường, 20 ml dung dịch chitosan (10000 ppm) được thêm vào cốc thủy tinh 1000 ml chứa 210 ml nước cất trong điều kiện khuấy, sau đó thêm 250 ml AgNO, 1000 ppm. Dung dịch được khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút trong một giờ và sau đó tăng lên 500 vòng/phút trước khi thêm 20 ml NaBH, 200 ppm theo phương pháp nhỏ giọt. Dung dịch trong suốt chuyển sang màu vàng khi thêm dung dịch NaBH, cho thấy sự hình thành AgNP. Dung dịch thu được (500 ppm Ag) được chuyển vào một chai mẫu màu nâu và giữ ở nhiệt độ phòng để nghiên cứu sau mà không cần tinh chế thêm.

Đã tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào để đánh giá tác động của AgNP lên sự tăng sinh của tế bào BHK-21. Đầu tiên, dung dịch AgNP gốc (500 μg/ml) được pha loãng theo chuỗi hai lần trong môi trường DMEM. Sau đó, dung dịch đã chuẩn bị được thêm vào tế bào BHK-21 và gieo vào đĩa 96 giếng ở mức 100 μl/giếng. Ba giếng được thử nghiệm cho mỗi pha loãng AgNP và các thí nghiệm được lặp lại bốn lần. Các đĩa được ủ trong một giờ ở 37°C trong tủ ấm chứa 5% CO2. Sau đó, các mẫu được thay thế bằng 200 μl môi trường duy trì (môi trường DMEM chứa 1% kháng sinh-kháng nấm). Hình thái của tế bào BHK-21 được kiểm tra hàng ngày dưới kính hiển vi đảo ngược trong năm ngày tiếp theo để phát hiện bất kỳ tác dụng gây độc tế bào nào. Các tế bào sống xuất hiện hình thoi, trong khi các tế bào chết bị co lại và đôi khi không có hình thoi hoặc bị vỡ.

Thử nghiệm ức chế vi-rút

Đánh giá hoạt động ức chế vi-rút đã được thực hiện để đánh giá khả năng ức chế vi-rút FMDV của nano bạc . Dung dịch FMDV có nồng độ 10⁶ TCID₅₀/ml được pha loãng mười lần trong môi trường DMEM. Mỗi lần pha loãng được trộn với một thể tích bằng nhau của dung dịch AgNP ở nồng độ không độc hại tối đa và ủ ở nhiệt độ phòng trong một giờ. Hỗn hợp thu được được pha loãng mười lần trong môi trường DMEM để chuẩn độ vi-rút trên tế bào BHK-21. Mỗi lần pha loãng được tiêm vào ba giếng tế bào BHK-21 trong đĩa 96 giếng để chuẩn độ vi-rút. Song song đó, dung dịch gốc FMDV (10⁶ TCID₅₀/ml) được pha loãng mười lần và được sử dụng làm đối chứng vi-rút, trong khi tế bào BHK-21 không bị nhiễm vi-rút FMDV được dùng làm đối chứng âm tính. Thí nghiệm này được lặp lại bốn lần. Sau khi tiêm hỗn hợp AgNP và FMDV, các tế bào BHK-21 được ủ ở 37°C trong 2 giờ, rửa sạch và thay thế bằng 200 μl môi trường duy trì. Các tác động gây bệnh tế bào (CPE) của vi-rút phục hồi được theo dõi hàng ngày trong năm ngày tiếp theo và hiệu giá (log TCIDs/ml) được xác định bằng phương pháp Reed-Muench.

Vi-rút và nuôi cấy tế bào

Nghiên cứu này sử dụng chủng vi-rút FMD thuộc dòng O/SEA/Mya-98 được phân lập trong các đợt bùng phát vi-rút FMD năm 2018 tại Việt Nam do Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ sinh học thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Các tế bào thận chuột lang con 21 (BHK21) được sử dụng để nuôi cấy vi-rút FMD. Các tế bào được duy trì trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh. Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào, các tế bào được gieo với mật độ khoảng 4×10 tế bào/cm2 trên các đĩa nuôi cấy mô nhựa. Sau 24 giờ, các tế bào chết được loại bỏ bằng cách rửa, và các tế bào còn lại được ủ ở 37°C và 5% CO2.

Đặc tính của các hạt nano bạc

Kính hiển vi điện từ quét (SEM) được thực hiện trên kính hiển vi phát xạ trường Hitachi S-4800. Các mẫu AgNP được lắng đọng trên màng carbon được hỗ trợ bởi lưới Cu, sấy khô ở điều kiện môi trường xung quanh, sau đó gắn trên kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Hình ảnh TEM được thu thập để phân tích hình thái, kích thước hạt và cấu trúc nano của AgNP. Hình thái của tế bào và sự hình thành mảng bám được kiểm tra trên kính hiển vi LED Leica DM IL (Leica Microsystem). Phổ UV-vis được phân tích trên máy quang phổ UV-vis Hitachi 5300 H để đánh giá sự hình thành AgNP. Thế Zeta của dung dịch AgNP được phân tích bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động SZ100-Hitachi.

Kết quả và thảo luận

Đặc tính của hạt nano bạc

Dung dịch AgNO3 chuyển sang màu vàng ngay sau khi thêm dung dịch NaBH, cho thấy khả năng hình thành AgNP. Điều này có thể liên quan đến cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng của AgNP. Trong Hình 1A, phân tích trên máy quang phổ UV-vis cho thấy sự hấp thụ đạt cực đại ở bước sóng tới là 396 nm. Dung dịch sẫm màu hơn khi thêm nhiều dung dịch NaBH. Điều này là do sự gia tăng nồng độ AgNP, tỷ lệ thuận với cường độ hấp thụ. Mối quan hệ giữa nồng độ AgNP và cường độ hấp thụ đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây, trong đó quá trình tiến hóa của AgNP được theo dõi bằng cách sử dụng phổ UV-Vis thu thập tại các thời điểm phản ứng khác nhau. Ở đây, mối quan hệ này có thể được làm rõ hơn bằng cách pha loãng dung dịch ban đầu như thể hiện trong Hình 1A. Không có sự thay đổi nào trong đỉnh hấp thụ gây ra pha loãng với nước chứng tỏ rằng AgNP được ổn định tốt bởi chitosan, một polysaccharide tự nhiên. Các nhóm amino trong cấu trúc chitosan có thể tương tác với AgNP để tạo thành lớp bảo vệ chitosan trên bề mặt của các hạt nano và do đó ngăn ngừa AgNP kết tụ. Dung dịch AgNP được pha loãng với DMEM, đỉnh hấp thụ dịch chuyển sang 436 nm như thể hiện trong Hình S1. Lý do cho sự dịch chuyển này vẫn chưa rõ ràng, nhưng có khả năng là sự biến đổi của lớp hấp phụ trên bề mặt các hạt Ag đã xảy ra khi DMEM có nồng độ chất dinh dưỡng cao được thêm vào.

Để chứng minh sự tương tác giữa chitosan và các hạt Ag, phổ FTIR đã được thu thập và thể hiện trong Hình 1C. Như có thể thấy trong hình này, một số đỉnh riêng biệt ở 1415, 1559 và 1635 cm-1 đặc trưng cho các nhóm chức C-H, N-H và C-O có thể được quan sát thấy trên cấu trúc chitosan. Tuy nhiên, các đỉnh đặc trưng này thay đổi đáng kể khi chitosan tương tác với AgNP. Đặc biệt, đỉnh rung động được gán cho các nhóm NH ở 1559 cm-1 biến mất do sự tương tác giữa các nhóm chức này và AgNP. Điều này cho thấy chitosan ổn định AgNP bằng cách neo trên các hạt Ag thông qua tương tác giữa các nhóm N-H và bề mặt Ag. Điều này tương tự như cơ chế đã được đề xuất trong các nghiên cứu trước đây, trong đó chitosan được sử dụng làm chất ổn định và chất đóng nắp để tổng hợp AgNP.

Khi nồng độ AgNP tăng lên, khả năng cao là các hạt đó có thể kết tụ và lắng xuống trong quá trình bảo quản. Để đánh giá độ ổn định của dung dịch nano bạc đã chuẩn bị, đã đo điện thế zeta. Dung dịch các hạt nano có thể ổn định vì thế zeta của chúng có nhiều giá trị dương hoặc âm. Các nghiên cứu trước đây cho thấy thế zeta của dung dịch AgNP ổn định bằng chitosan có thể dương hoặc âm tùy thuộc vào nồng độ chitosan và độ pH như thể hiện trong Bảng 1. Thế zeta có giá trị dương vì chitosan được sử dụng ở nồng độ cao. Nó thay đổi từ 25 đến 52 mV khi nồng độ chitosan là 4400 đến 10000 ppm. Một nghiên cứu của Cinteza và cộng sự cho thấy thế zeta của dung dịch AgNP trần là -11,2 mV, nhưng tăng lên 50 mV khi chitosan được thêm vào ở nồng độ 0,5%. Vì chitosan được sử dụng ở nồng độ 400 ppm, Pansara và cộng sự đã nhận được dung dịch Ag-NP có thế zeta là -30,9 mV. Có khả năng là dung dịch chitosan pha loãng chỉ bao phủ một phần bề mặt của AgNP, dẫn đến thế zeta âm. Trong khi đó, khi nồng độ chitosan đủ cao, nó có thể bao phủ hoàn toàn bề mặt của Ag-NP, do đó làm cho nó tích điện dương. Trong nghiên cứu hiện tại, nồng độ chitosan là 400 ppm và thế zeta trung bình của Độc tính của AgNP là -59,4 mV (Hình S2). Điều này phù hợp với quan sát trong các nghiên cứu trước đây. Kết quả chứng minh rằng AgNP được phân tán cao trong dung dịch nước có thể ổn định trong thời gian dài và phù hợp cho mục đích khử trùng.

Hình thái của AgNP được quan sát trên SEM và TEM như thể hiện trong Hình 2. Hình ảnh SEM cho thấy AgNP có xu hướng tập hợp thành các cụm lớn hơn, được phân tán đồng đều trong dung dịch nước (Hình 2a). Để hiểu rõ hơn về hình dạng và kích thước của AgNP, hình ảnh TEM đã được chụp và phân tích. Như thể hiện trong Hình 2b và Hình S3, các hạt nano có hình cầu với đường kính dao động từ 2 đến 13 nm. Kích thước và hình dạng của AgNP có tác động đáng kể đến hiệu quả của nó trong các ứng dụng y tế và công nghiệp. Với kích thước nhỏ dao động từ 2-12nm, các nano bạc này được kỳ vọng sẽ có hoạt tính kháng khuẩn cao.

Bảng 1. So sánh thế zeta của AgNP trong nghiên cứu này và các tài liệu tham khảo.

Hình 1. Phổ UV-Vis tương ứng với cộng hưởng plasmon bề mặt của dung dịch nano bạc pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau (A) và phổ FTIR của chitosan và AgNP ổn định bằng chitosan (B).

Hình 2. Ảnh SEM (a) và ảnh TEM của AgNP tổng hợp.

Độc tính của nano bạc

Để đánh giá độc tính của AgNP đối với tế bào BHK-21, các tế bào được tiếp xúc với nano bạc ở nhiều nồng độ khác nhau và sự phát triển của chúng được theo dõi. Thử nghiệm độc tính tế bào được minh họa trong Hình 3, trong đó mỗi cột bao gồm ba giếng (hàng A đến C) để thử nghiệm AgNP và giếng thứ tư (hàng D) đóng vai trò là đối chứng trống không có AgNP. Kết quả cho thấy tác dụng độc hại được quan sát thấy ở nồng độ 1/160 (3,13 ppm) với phần lớn các tế bào bị bất hoạt. Điều này có thể được xác minh bằng cách quan sát trên kính hiển vi như thể hiện trong Hình 4. Chỉ một số ít tế bào BHK-21 bị biến dạng trong đối chứng (Hình 4A), trong khi hầu hết các tế bào bị phá hủy do xử lý bằng dung dịch AgNP 3,13 ppm (Hình 4B). Ở nồng độ trên 1/160 (3,13 ppm), AgNP thể hiện độc tính cao, với tất cả các tế bào bị bất hoạt.

Điều thú vị là không có sự khác biệt về hình thái nào được quan sát thấy giữa các tế bào đối chứng (không được xử lý bằng AgNP) và các tế bào tiếp xúc trong 1 giờ với nồng độ AgNP là 1/320 tương đương với 1,56 ppm. Do đó, có thể kết luận rằng nồng độ AgNP là 1,56 ppm là an toàn đối với các tế bào BHK-21. Quan sát này phù hợp với các nghiên cứu trước đây rằng độc tính tế bào của AgNP phụ thuộc vào nồng độ và AgNP ổn định bằng chitosan không gây độc tế bào đối với tế bào hoặc DNA ở liều diệt khuẩn [27].

Hoạt động kháng vi-rút

Để nghiên cứu hoạt động kháng vi-rút của AgNP, nồng độ an toàn đã được kiểm tra là 1,56 ppm (pha loãng 1/320) đã được thử nghiệm với nhiều tải trọng và tầng FMDV khác nhau. Hình 5 cho thấy sơ đồ biểu diễn các thí nghiệm kháng vi-rút để đánh giá hoạt động của AgNP ở nồng độ 1,56 ppm. Nồng độ AgNP này được trộn với FMDV ở nồng độ 10⁴ TCID₅₀ để kiểm tra tác động của nó đối với sự phát triển của vi-rút. Kiểm soát vi-rút cho thấy sự xuất hiện của hiệu ứng tế bào bệnh lý (CPE) trên các tế bào BHK-21 không được xử lý bằng AgNP (vòng tròn màu đỏ) (Hình 5 hàng A). Ngược lại, không phát hiện thấy CPE trong kiểm soát tế bào không được xử lý bằng vi-rút và AgNP (vòng tròn màu xanh lam) (Hình 5B).

Hình 3. Sơ đồ cấu trúc của thử nghiệm độc tính tế bào. Mỗi cột chứa 4 giếng từ hàng A đến C cho mỗi nồng độ AgNP và giếng thứ tư Trong hàng D là kiểm soát không có AgNP. Màu đỏ Biểu thị độc tính cao dẫn đến bất hoạt tế bào và màu xanh biểu thị nồng độ AgNP an toàn với hơn 90% tế bào vẫn còn sống.

Hình 4. Hình ảnh đại diện của tế bào BHK-21 phát triển bình thường (A) và tế bào chết (B) do nano bạc ở nồng độ 3,13 ppm gây ra. Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi LED Leica DM IL.

Sự khác biệt giữa các mẫu đối chứng này và các mẫu FMDV được xử lý bằng nano bạc ở nồng độ 1,56 ppm là đáng chú ý. CPE được quan sát thấy ở nồng độ 10⁴ TCID₅₀ (Hình 5) sau khi xử lý bằng AgNP ở nồng độ 1,56 ppm (vòng tròn màu đỏ) nhưng không được quan sát thấy ở nồng độ pha loãng 3 logarit trở lên (vòng tròn màu xanh) (Hình 5 hàng C, 5 hàng D và 5 hàng E).

Khả năng nhạy cảm của FMDV đối với AgNP có nồng độ 1,56 ppm cũng đã được thử nghiệm với nồng độ virus là 10³ TCID₅₀ tế bào BHK21 không được xử lý bằng AgNP cho thấy CPE, như mô tả trong Hình 6, hàng A cạnh các vòng tròn màu đỏ. Nếu không xử lý bằng virus và AgNP, mẫu đối chứng có các vòng tròn màu xanh (Hình 6, bảng B) không cho thấy CPE. Đối với hiệu suất kháng vi-rút, Trái ngược với các kết quả thu được trước đó bằng cách xử lý tế bào bằng AgNP ở nồng độ 1,56 ppm và FMDV ở 10 TCID không phát hiện thấy CPE với mức virus là 10 TCID ở bất kỳ độ pha loãng nào (các vòng tròn màu xanh). Những kết quả này cho thấy AgNP ở nồng độ 1,56 ppm có thể vô hiệu hóa hoàn toàn FMDV ở nồng độ 10³ TCID₅₀, trong khi chúng bị vô hiệu hóa một phần ở nồng độ 10⁴ TCID₅₀ Điều này cho thấy AgNP có thể giảm gấp ba lần FMDV ở 1,56 ppm. Điều này hiệu quả hơn so với các hạt nano vàng trong nghiên cứu trước đây khi chúng không có hiệu quả chống lại FMDV ở cùng nồng độ (1,56 ppm).

Hình 5. Thí nghiệm kháng vi-rút của FMDV với nồng độ 10⁴ TCID₅₀, được thể hiện sơ đồ, với các hàng A, B, C, D và E đại diện cho các mẫu khác nhau. Hàng A là đối chứng vi-rút trong đó BHK-21 được tiêm chủng bằng FMDV mà không xử lý bằng AgNP, trong khi hàng B là đối chứng tế bào không có AgNP và FMDV. Hàng C, D và E phản ứng với các mẫu vi-rút được xử lý bằng AgNP ở mức pha loãng 1/320 (1,56 ppm). Các cột từ 1 đến 4 biểu thị pha loãng sertal 10 lần của FMDV. Các vòng tròn màu đỏ biểu thị phát hiện CPE, trong khi các vòng tròn màu xanh biểu thị không có CPE.

Hình 6. Thí nghiệm kháng vi-rút của FMDV với nồng độ 10³ TCID₅₀, được thể hiện sơ đồ, với các hàng A, B, C, D và E đại diện cho các mẫu khác nhau. Hàng A là đối chứng vi-rút trong đó BHK 21 được tiêm chủng bằng FMDV mà không xử lý bằng AgNP, trong khi hàng B là một đối chứng coll không có AgNP và FMDV. Hàng C, D và E tương ứng với các mẫu virus được xử lý bằng nano bạc ở độ pha loãng 1/320 (1,56 ppm). Các cột từ 1 đến 4 biểu diễn pha loãng FMDV gấp 10 lần. Các vòng tròn màu đỏ biểu thị phát hiện CPE, trong khi các vòng tròn màu xanh biểu thị không có CPE.

Hình 7 cho thấy Hình ảnh đại diện về tác động của nano bạc lên FMDV Trong các tế bào BHK-21. nano bạc có thể trung hòa FMDV, dẫn đến các tế bào BHK-21 biểu hiện sự phát triển bình thường sau khi Ủ với hỗn hợp AgNP và FMDV như thể hiện trong Hình 7 A. Ngược lại, khi không có AgNP, các tế bào BHK-21 biểu hiện CPE theo thời gian (Hình 78). Điều này cung cấp bằng chứng vững chắc về hoạt động kháng vi-rút của AgNP đối với FMDV.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc tăng nồng độ nano bạc  có thể cải thiện hiệu quả của chúng. Nghiên cứu này chứng minh thêm rằng tác dụng kháng vi-rút không chỉ phụ thuộc về nồng độ AgNP mà còn về nồng độ vi-rút. Vẫn chưa rõ cơ chế hoạt động của hạt nano bạc cố định chitosan ảnh hưởng đến vi-rút như thế nào. Theo các nghiên cứu trước đây, AgNP ở nồng độ không độc hại có thể vô hiệu hóa FMDV trước khi xâm nhập vào tế bào hoặc trong quá trình thâm nhập. AgNP có khả năng liên kết với vi-rút thông qua tương tác với oligomer disulfide dẫn đến sự ngăn chặn bám dính tế bào, xâm nhập tế bào và tiêm protein/genome, ức chế sự lây nhiễm và sao chép của vi-rút. Hơn nữa, AgNP tạo ra các loài phản ứng có thể phân hủy thụ thể capsid của vi-rút và vật liệu di truyền gây ra sự phá vỡ capsid của vi-rút.

Thuộc tính độc đáo của AgNP là chúng có thể bám vào tường và sàn khi được phun vào trang trại chăn nuôi và do đó hoạt động kháng vi-rút của chúng có thể kéo dài trong thời gian dài. Do đó, thành công của công trình này có thể mở ra một cách mới để ngăn ngừa sự lây lan của FMDV dựa trên AgNP và do đó cung cấp nhiều lựa chọn hơn cho an toàn sinh học trong các trang trại chăn nuôi.

Hình 7. Hình ảnh vi mô đại diện của các tế bào BHK-21 không bị nhiễm (A) và bị nhiễm (B) với FMDV. Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi Leica DM ILLED. Vòng tròn đỏ chỉ ra việc phát hiện CPE.

Kết luận

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các hạt nano bạc (AgNP) có hoạt tính kháng vi-rút cao đối với FMDV. Hoạt tính kháng vi-rút của AgNP được phát hiện phụ thuộc vào nồng độ, với việc bất hoạt hoàn toàn FMDV được quan sát thấy ở nồng độ 10³ TCID₅₀ ở nồng độ an toàn là 1,56 ppm, trong khi ức chế một phần FMDV ở 10³ TCID₅₀ . Rõ ràng, việc sử dụng AgNP ở nồng độ 1,56 ppm có thể dẫn đến giảm ba lần nồng độ FMDV. Do đó, AgNP có tiềm năng cao để được sử dụng như một tác nhân kháng vi-rút mới chống lại FMDV. Sự thành công của công trình có thể cung cấp một biện pháp an toàn sinh học hiệu quả cho các trang trại chăn nuôi, tuy nhiên, có thể cần phải điều tra thêm về việc áp dụng AgNP trong các hệ thống trang trại khác nhau.

Tuyên bố đạo đức

Giao thức nghiên cứu trên động vật đã được Hội đồng đánh giá thể chế (hoặc Ủy ban đạo đức) của Học viện Nông nghiệp Việt Nam chấp thuận.

Nguồn tham khảo

Effective Foot‐and‐Mouth Disease Virus Control Using Silver Nanoparticles