Nano bạc ức chế virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IB virus)

Virus viêm phế quản truyền nhiễm ở gia cầm (IBV) đe dọa ngành công nghiệp gia cầm và gây ra thiệt hại kinh tế toàn cầu. IBV rất nhanh biến đổi. Do đó, không có loại thuốc hiệu quả nào có sẵn. Mục tiêu của nghiên cứu hiện tại là đánh giá các hạt nano bạc chống lại nó như một tác nhân kháng vi-rút. Phương pháp: Các hạt nano bạc (AgNP) đã được đánh giá là thuốc kháng vi-rút chống lại IBV. Chiết xuất lá P. betle sinh tổng hợp AgNP từ bạc nitrat. Hấp thụ UV/vis, nhiễu xạ tia X (XRD), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đã được sử dụng để mô tả đặc điểm của AgNP. TEM chỉ ra kích thước hạt từ 5–30 nm và XRD chứng minh cấu trúc AgNP đặc trưng của chúng. Hoạt động kháng vi-rút của AgNP được đo bằng liều gây nhiễm phôi logarit 50 (logEID50)/ml và số lượng bản sao bộ gen IBV.

Kết quả: Phân tích XRD cho thấy cấu trúc của AgNP và kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy kích thước từ 5–30 nm đối với AgNP. Nano bạc ở nồng độ không gây độc tế bào ức chế sự tương tác giữa virus và tế bào, ngăn virus xâm nhập vào tế bào và làm giảm số lượng bản sao bộ gen IBV (trên µl) trong trứng bằng cách ngăn chặn sự hình thành bộ gen RNA của IBV, dẫn đến giảm đáng kể nồng độ IBV.

Kết luận: AgNP sở hữu các đặc tính kháng vi-rút ức chế sự sao chép IBV trong trứng. Các phát hiện chỉ ra rằng AgNP là một ứng cử viên thuốc đầy hứa hẹn để điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm trùng IBV.

NANOCMM TECHNOLOGY

GIỚI THIỆU

Ngành công nghiệp gia cầm đóng vai trò quan trọng trong sản xuất lương thực và xóa đói giảm nghèo. Tuy nhiên, sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ở gia cầm, chẳng hạn như vi-rút viêm phế quản truyền nhiễm ở gia cầm (IBV), gây ra mối đe dọa đối với sức khỏe gia cầm và dẫn đến thiệt hại kinh tế [1]. Ngoài ra, các tác nhân gây bệnh này có thể gây ra các bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người, ảnh hưởng thêm đến sức khỏe con người [2]. IBV, loại vi-rút corona ở gà, là một họ vi-rút axit ribonucleic (+ssRNA) có vỏ bọc, không phân đoạn, sợi đơn, có hướng dương [3]. Các phương pháp điều trị kháng vi-rút truyền thống đối với IBV thường dẫn đến tình trạng kháng thuốc, tác dụng phụ và vi-rút tái phát [4]. Vắc-xin thường được sử dụng, nhưng sự xuất hiện và tái phát liên tục của các chủng vi-rút có thể làm giảm hiệu quả của vắc-xin [5-9]. Để giải quyết những thách thức này, các nhà nghiên cứu đang khám phá các chiến lược thay thế, bao gồm việc sử dụng các dẫn xuất từ ​​cây thuốc và công nghệ nano, để phát triển các loại thuốc kháng vi-rút mới. Lá cây P. betle đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ trong y học cổ truyền và các hoạt động văn hóa. Những chiếc lá này rất giàu các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm các polyphenol như acetyl eugenol, trans-isoeugenol, chavicol, chavibetol, chavibetol acetate và allyl pyrocatechol diacetate [10]. Các polyphenol này đã thu hút được sự chú ý đáng kể do các ứng dụng tiềm năng của chúng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, bao gồm cả việc điều chế các hạt nano bạc (AgNP) [10]. Polyphenol có trong lá P. betle có thể hoạt động như chất khử và chất đóng nắp trên bề mặt của AgNP. Điều này có nghĩa là chúng có thể ngăn chặn sự kết tụ của các hạt nano và mang lại nhiều lợi ích bằng cách giảm kích thước của AgNP. Polyphenol tăng cường độ ổn định và cải thiện hiệu suất tổng thể của chúng [10]. AgNP có thể bám vào bộ gen của vi-rút và phá vỡ lớp vỏ của vi-rút, khiến vi-rút không hoạt động và không thể lây nhiễm vào tế bào vật chủ hoặc sao chép. AgNP làm tăng tiếp xúc với các hạt vi-rút do kích thước nhỏ và diện tích bề mặt lớn của chúng [10]. Do đó, trong nghiên cứu này, chiết xuất nước của P. betle đã được sử dụng để sản xuất AgNP và được đặc trưng bằng hấp thụ UV/vis, nhiễu xạ tia X (XRD), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Ngoài ra, chúng tôi đã đánh giá tác dụng kháng vi-rút in ovo của AgNP đối với khả năng lây nhiễm và sao chép bộ gen của IBV.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu thực vật Lá P. betle được lấy từ các chợ rau chính của Malaysia. Khoa Thực vật học, Khoa Dược, Amman, Jordan, đã xác định và xác thực các lá. Một mẫu chứng từ (PJ 05) đã được gửi.

Tổng hợp Nano bạc

Chiết xuất nước P. betle đã được mô tả trước đây (10), bằng cách trộn 10 g mẫu lá khô với 100 ml nước tinh khiết cao trong bình. Trong 72 giờ ở 8 °C, bình được bịt kín bằng bông gòn. Lọc hỗn hợp bằng giấy lọc Whatman 25 mm để loại bỏ cặn thực vật [9]. Các viên được sấy chân không và bảo quản ở nhiệt độ phòng để phân tích. Các viên được bảo quản ở -20 °C cho đến khi sử dụng. AgNP được tạo ra theo phương pháp sinh học [5, 10]. Tóm lại, 10 ml chiết xuất lá P. betle dạng nước (10 g/100 ml) được trộn với dung dịch bạc nitrat 5 mmol và để ở nhiệt độ phòng (25 °C) trong bốn giờ trước khi ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong mười phút. Sau khi loại bỏ phần nổi, phần cặn được rửa bằng nước cất (7000 vòng/phút, 2 phút) và sấy chân không. Trước khi phân tích, các viên khô cần phải ở nhiệt độ phòng [10]. Sau khi loại bỏ phần nổi, phần cặn được rửa bằng nước cất ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 2 phút và sấy chân không. Trước khi phân tích, các viên khô phải được bảo quản ở nhiệt độ phòng [10].

Đặc tính của Nano bạc

Đặc tính của AgNP đã được mô tả trước đây [10]. Tóm lại, phương pháp quang phổ tử ngoại/khả kiến ​​đã kiểm tra AgNP tổng hợp. AgNP hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt ở 420 nm. Chúng tôi đã phân tích hỗn hợp AgNP khô bằng XRD X’Pert Pro 40 kV (PANalatical Empyrean-2012). Mô hình MMA GBC-Difftech đã phân tích thành phần cấu trúc của AgNP khô. Bức xạ là 34,2 mA và Cu Ka được lọc Ni 35 kV (k = 1,54 A °). TEM đo kích thước AgNP. AgNP phủ giọt lên lưới TEM bằng đồng phủ carbon đã chuẩn bị cho các mẫu. Thấm các màng trên lưới TEM sau hai phút để loại bỏ dung dịch dư thừa [10]. Lưới được sấy khô trước khi đo.

Thử nghiệm hoạt động kháng vi-rút trong cơ thể sống

Hoạt động kháng vi-rút đã được mô tả trước đây [11, 12]. Tóm lại, chúng tôi đã nhân giống IBV-H120 trong trứng gà không có mầm bệnh cụ thể (SPF) đã phôi. Sau khi có được hạt giống chính của chủng vắc-xin IBV-H120 (Trung tâm công nghiệp sinh học Jordan (JOVAC), Amman, Jordan) với 108 liều gây nhiễm phôi 50 (EID50)/ml, chúng tôi đã pha loãng nó trong 1 ml dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS; pH 7,2) và pha loãng liên tiếp cho đến khi đạt 105 EID50/ml. Vào ngày thứ 10, trứng gà SPF được tiêm 0,1 ml 105 EID50/ml khi có sự hiện diện của các nồng độ AgNP khác nhau và ủ ở 37 °C trong 1 giờ [11, 12]. Trứng gà SPF được ủ ở 37 °C với độ ẩm 60%. Trứng gà SPF được ủ hàng ngày dưới ánh nến trong 7 ngày. Tử vong vào ngày đầu tiên không đặc hiệu. Phần đầu của trứng được loại bỏ và dịch niệu quản được thu thập sau 7 ngày nhiễm trùng. Dịch niệu quản được hút mà không có albumin hoặc lòng đỏ. Chúng tôi ngay lập tức làm lạnh tất cả các chất lỏng ở 4 °C [11, 12]. Đối chứng (0,1 ml 10⁵ EID ₅₀ / ml vi-rút IBV-H120 không được xử lý) và các mẫu bị nhiễm IBV được chuẩn độ bằng cách sử dụng trứng gà SPF để tính giá trị EID50/ml [11, 12].

Chuẩn độ vi-rút cho IBV-H1 20

Để đo nồng độ EID50RESULTS /ml của vi-rút, chúng tôi đã tiêm 100 μl dung dịch pha loãng vi-rút gấp 10 lần (5 trứng/pha loãng) vào khoang niệu quản của trứng gà SPF 10 ngày tuổi [10].

Chiết xuất RNA virus và qRT-PCR

Bộ dụng cụ cô lập RNA virus NZY (NZY Tech, Lisbon, Bồ Đào Nha) được sử dụng để chiết xuất RNA từ chất lỏng allotonic. Hỗn hợp phản ứng của mỗi mẫu RNA được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bộ dụng cụ RT-qPCR một bước IBV, RUO (NZY Tech, Bồ Đào Nha), khuếch đại ORF1a. Phân tích định lượng sử dụng đường cong chuẩn.

Phân tích thống kê

GraphPad Prism và SPSS đã thực hiện tất cả các phân tích. Phân tích phương sai một chiều với các so sánh bội Tukey sau đó xác định sự khác biệt giữa các nhóm. P ˂ 0,05 là đáng kể.

KẾT QUẢ

Đặc tính của AgNP

Độc tính tế bào của AgNP Tiêm trứng gà SPF 10 ngày tuổi bằng 360 μg/ml AgNP không gây độc tính (hình 4). Do độc tính của dung môi, trứng có nồng độ cao rất khó tiêm. Vì vậy, tiêm trứng với hơn 1500 μg/trứng là không thực tế. Do đó, liều gây chết trung bình của AgNP (LD50 Hoạt tính kháng vi-rút của AgNP đối với IBV-H120 trong trứng) không được tính toán. LogEID 50 /ml được xác định bằng cách gộp dịch niệu từ tất cả các trứng đã được thu hoạch 7 ngày sau khi nhiễm trùng. AgNP ức chế sự sao chép của IBV-H 120 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, như thể hiện bằng sự giảm LogEID50AgNP ức chế tổng hợp bộ gen IBV /ml. In ovo, Hoạt động ức chế đáng kể chống lại IBV-H120 gây nhiễm trùng đã được quan sát thấy đối với AgNP ở mức 10, 20, 40, 80, 160 và 320 µg/trứng (p ˂ 0,001) (hình 5). Giá trị số bản sao (trên µl)/Chu kỳ định lượng (Cq) trong dịch niệu cho thấy sự giảm đáng kể trong quá trình tổng hợp bộ gen IBV in ovo (bảng 1).

Hình 1: Sự hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt Nano bạc ở 420 nm

Hình 2: Phổ FTIR của (A) chiết xuất lá của P. betle extractxt (B) AgNP tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất P. betle

Hình 3: (A) Phân tích TEM của AgNP (B) Mẫu XRD của Nano bạc tổng hợp

Hình 4: Độc tính tế bào của Nano bạc AgNP. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của các mẫu triplet

Hình 5: Hiệu quả kháng IBV của AgNPs in ovo: (A) Hiệu quả kháng IBV của AgNPs in ovo: Trứng gà SPF 10 ngày tuổi bị nhiễm IBV ở nồng độ 0,1 ml 10⁵ EID ₅₀ /ml với các nồng độ AgNPs khác nhau và được quan sát hàng ngày để phát hiện phôi chết trong 7 ngày. Gộp tất cả dịch niệu đạo trứng sau khi thu hoạch. Sử dụng Reed-Muench, tính EID 50 /ml. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn của các mẫu ba, *p < 0,01, **p < 0,001

Bảng 1: AgNP ảnh hưởng đến định lượng bộ gen IBV trong dịch niệu quản. Sau khi lây nhiễm trứng gà có phôi SPF (ngày 10) bằng IBV (0,1 ml 10⁵ EID ₅₀ (µg/ml) /ml) với các mức AgNP khác nhau, tỷ lệ tử vong của phôi được ghi lại hàng ngày trong 7 ngày. Chiết xuất tất cả các dịch niệu quản của trứng. qRT-PCR đo nồng độ bộ gen IBV trong dịch niệu quản. *p < 0,01; **p < 0,001

THẢO LUẬN

AgNP đã thu hút sự chú ý trong những năm gần đây do đặc tính kháng khuẩn của chúng. Các hạt nano này, thường có kích thước nhỏ hơn 100 nanomet, có diện tích bề mặt lớn giúp tăng cường tương tác của chúng với vi-rút [13]. Các đặc tính độc đáo của AgNP cho phép chúng tương tác với nhiều loại vi-rút, bao gồm cả vi-rút gây viêm phế quản. Chúng đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại vi-rút hợp bào hô hấp, vi-rút cúm và các loại vi-rút viêm phế quản thông thường khác [14]. Nghiên cứu này phù hợp với một số nghiên cứu chứng minh rằng AgNP có thể ức chế nhiễm trùng sớm thông qua tương tác trực tiếp giữa AgNP và lớp vỏ vi-rút [15-17]. AgNP có thể phá vỡ tính toàn vẹn của lớp vỏ vi-rút, ngăn vi-rút xâm nhập vào tế bào vật chủ và nhân lên [15]. Ngoài ra, AgNP được phát hiện có nguy cơ thấp gây ra tình trạng kháng vi-rút, khiến chúng trở thành giải pháp lâu dài có khả năng chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi-rút [16, 17]. Chúng tôi đã chứng minh rằng AgNP thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ quá trình tổng hợp RNA; lời giải thích hợp lý nhất là thông qua liên kết trực tiếp của Ag với RNA polymerase [18]. Tương tự như vậy, hoạt động kháng vi-rút của AgNP đã được nghiên cứu chống lại nhiều loại vi-rút khác nhau, bao gồm vi-rút cúm gia cầm (AI) H9N2 [15] và vi-rút bệnh Newcastle (NDV). Trong trường hợp của AI H9N2, các hạt nano đã cho thấy tiềm năng ức chế sự xâm nhập của vi-rút và làm giảm sự nhân lên của vi-rút [13]. Những cơ chế hoạt động khác nhau này khiến AgNP trở thành tác nhân kháng vi-rút mạnh có khả năng phá vỡ nhiều giai đoạn của vòng đời vi-rút. Các đặc tính lý hóa độc đáo của AgNP cho phép chúng tương tác với các hạt vi-rút theo cách khiến vi khuẩn khó thích nghi và phát triển khả năng kháng thuốc [18-20]. Điều này khiến AgNP xanh trở thành một công cụ có giá trị trong việc chống lại các bệnh nhiễm vi-rút kháng thuốc kháng vi-rút truyền thống.

KẾT LUẬN

Việc sử dụng Nano bạc tổng hợp bằng chiết xuất nước P. betle là một bước đột phá trong lĩnh vực liệu pháp kháng vi-rút. Các AgNP này thể hiện hoạt động kháng vi-rút mạnh đối với IBV. Bằng cách ức chế sự xâm nhập và nhân lên của vi-rút, AgNP cung cấp một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các loại thuốc kháng vi-rút truyền thống. Hơn nữa, khả năng vượt qua khả năng kháng thuốc của vi khuẩn khiến chúng trở nên có giá trị trong việc chống lại các bệnh nhiễm vi-rút kháng thuốc thông thường. Nghiên cứu và phát triển sâu hơn trong lĩnh vực này sẽ mở đường cho việc ứng dụng AgNP trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng do virus.

Nguồn:

SILVER NANOPARTICLES INHIBIT INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS REPLICATION