Nano bạc ứng dụng trong khử trùng máy ấp trứng
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng huyền phù của các hạt nano bạc với phổ kích thước hạt rộng, hình thái biến đổi, độ ổn định cao và tính chất hóa lý thích hợp để kiểm tra tính chất diệt khuẩn và diệt nấm của chúng đối với các vi sinh vật có trong các nhà máy chế biến gia cầm. Đồng thời, các hạt đã được thử nghiệm để ngăn chặn việc sản xuất các chất ô nhiễm gây mùi trong quá trình ủ và do đó làm giảm sự phát thải khí độc hại từ các loại phương tiện đó. Kết quả cho thấy việc sử dụng các chế phẩm nano để khử trùng trứng và máy ấp trứng làm giảm ô nhiễm vi sinh. Hiệu quả diệt khuẩn và diệt nấm của chế phẩm được áp dụng tương đương với bức xạ UV và hiệu quả của nó tăng lên trong quá trình ủ. Kết quả tốt đã đạt được về mức độ của các chất gây ô nhiễm khí hữu cơ, đã giảm 86% sau khi áp dụng chế phẩm nano.
(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)
- GIỚI THIỆU
Chăn nuôi gia cầm và các quá trình ấp nở gà có liên quan, dựa trên công nghệ sản xuất của chúng trên nguyên liệu sinh học, là một nguồn gây ô nhiễm vi sinh, bao gồm cả vi sinh vật và độc tố của chúng. Những yếu tố này là một trong những thành phần của bioaerosols, đặc biệt là bụi hữu cơ. Chúng bị đẩy ra bên ngoài thông qua một hệ thống thông gió và duy trì ở mức cao đến một km từ nguồn phát thải. Nhiều bệnh gia cầm, bao gồm nhiễm trùng đường hô hấp, được truyền qua không khí trên một khoảng cách dài, thậm chí đến các địa điểm cách nơi hình thành 3 km.
Nghiên cứu được thực hiện bởi Skorska et al. tại các nhà máy chế biến gia cầm trong những năm 1990 cho thấy mức độ ô nhiễm cao trong phòng sản xuất giống. Nồng độ trung bình của vi sinh vật trong không khí vượt quá 37.000 cfu/m3 và tăng lên tới 310.000 cfu / m3 khi gà con được đưa ra ngoài. Ngày nay, ngay cả các công nghệ mới được giới thiệu cho các nhà máy hiện đại hóa theo yêu cầu của Liên minh châu Âu cũng không loại bỏ hoàn toàn ô nhiễm không khí sinh học. Nghiên cứu của Tymczyna et al. đã chứng minh rằng nồng độ vi khuẩn trung bình trong không khí của một trại sản xuất giống lên tới 4.000 cfu / m3. Trong bioaerosol từ phòng sản xuất giống, một tỷ lệ tương đối cao (16%) vi khuẩn gram âm đã được quan sát, và các loại vi khuẩn sau đây đã được xác định: Acinetobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Pseudomonas , Xanthomonas, Agrobacterium và Pantoea.
Trong trại giống gà, que Acinetobacter calcoaceticus gram âm chiếm khoảng 40% tất cả các chủng vi khuẩn và là một trong những nguồn nội độc tố quan trọng nhất trong không khí. Alcaligenes faecalis, Erwinia Herbicola, Enterobacter spp., Và Pseudomonas spp. là những nguồn nội độc tố khác trong không khí. Trong một số trường hợp nhất định, một số loài vi khuẩn Gram negative có khả năng gây bệnh truyền nhiễm, chẳng hạn như Klebsiella pneumoniae gây viêm phổi hoặc que thuộc chi Salmonella là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn salmonella, có thể xâm nhập vào không khí. Một vi sinh vật khác được quan sát thấy trong trại giống gà là Alcaligenes faecalis, thể hiện các đặc tính nội độc tố và dị ứng.
Đặc biệt đáng chú ý là vi khuẩn gram âm của Erwinia Herbicola (đồng nghĩa: Pantoea agglomerans và Enterobacter agglomerans), là một nguồn gây dị ứng và nội độc tố mạnh. Vi khuẩn thuộc chi Pantoea là vi sinh vật gram âm nhiều nhất trong bụi sinh học có nguồn gốc thực vật. Các que gram âm Alcaligenes faecalis và Erwinia Herbicola, do khả năng kích hoạt cả hệ thống miễn dịch đặc biệt và không đặc hiệu, có thể gây ra tình trạng viêm trong phổi và gây ra các bệnh về hệ hô hấp (hội chứng nhiễm độc bụi hữu cơ) [1. Trong nghiên cứu được thực hiện bởi Stępien-Py ´ ´ sniaket al. [10], trong số các vi khuẩn thường xuyên bị cô lập nhất trong gia đình,
Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Và Citrobacter freundii đã được xác định. Trên bề mặt vỏ trứng, sự hiện diện của que Salmonella, nghĩa là S. enteritidis và S. arizonae, đã được quan sát. Phân tích định tính hệ vi sinh vật của trứng cũng cho thấy sự hiện diện của các vi khuẩn gram âm khác: Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Pseudomonas spp., Tatumella ptyseos, Providencia stuartii , Rahnella aquatilis, Proteus mirabilis và Achromobacter spp. Hơn nữa, người ta đã chứng minh rằng một tỷ lệ cao vỏ trứng được kiểm tra đã bị nhiễm vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus spp. Ngoài staphylococci, Enterococcus spp. và các que thuộc chi Bacillus thường được phân lập từ bề mặt của vỏ trứng. Ô nhiễm vi sinh vật của vỏ trứng có thể là nguyên nhân gây ô nhiễm các sản phẩm trứng hoặc các sản phẩm có chứa trứng và do đó, có thể dẫn đến nhiễm độc hoặc nhiễm trùng thực phẩm ở người. Điều này chủ yếu là kết quả của việc không tuân thủ các tiêu chuẩn vệ sinh. Do đó, độ tinh khiết vi sinh của vỏ trứng là một trong những tiêu chí chính để đánh giá giá trị của sản phẩm này trong tiếp thị và chế biến [10, 11].
Theo các tiêu chuẩn sản xuất hiện nay, trong phần lớn các nhà máy chế biến thực phẩm, bao gồm cả ngành công nghiệp trứng và gia cầm, kiểm soát bắt buộc chất lượng vi sinh và hóa học của không khí và khu vực sản xuất, cũng như nghĩa vụ đảm bảo độ tinh khiết thích hợp, đã được đưa ra . Hệ thống đánh giá các điểm kiểm soát tới hạn trong sản xuất trên cơ sở phân tích mối nguy (Điểm kiểm soát quan trọng phân tích mối nguy, HACCP), đã được giới thiệu trong ngành công nghiệp thực phẩm, đảm bảo an toàn vi sinh của sản phẩm và bảo vệ hiệu quả chống nhiễm trùng.
Phương pháp này cho phép khoanh vùng những nơi và nguồn rủi ro đối với các mối nguy sinh học, vật lý và hóa học ở các giai đoạn sản xuất cụ thể và cũng cho phép các nhà máy thiết lập các điểm kiểm soát quan trọng trong đó các mối nguy này có thể được kiểm soát, theo dõi và loại bỏ (hoặc tối thiểu hóa). Trong các nhà máy sản xuất giống gia cầm, các điểm kiểm soát quan trọng này là các trại giống, nơi điều kiện nhiệt độ và độ ẩm và sự hiện diện của vật liệu sinh học gây ra một mối nguy vi sinh quan trọng. Do sự thay đổi mạnh mẽ bên trong các lò ấp, một loạt các hợp chất khí tích tụ, được giải phóng qua các lỗ nhỏ trong vỏ trứng là kết quả của sự biến đổi vi sinh trên bề mặt, cũng như bắt nguồn từ các chất khử trùng. Ở những nơi như vậy, không phải không có lý do, người ta chú trọng rất lớn vào việc duy trì độ tinh khiết của vi sinh vật, điều này chỉ đạt được bằng cách khử trùng trứng và được tiến hành đúng cách [1-8].
Ngoài các chất gây ô nhiễm vi sinh trong chăn nuôi gia cầm, một loạt các chất hóa học có nguồn gốc là kết quả của sự thay đổi trao đổi chất trong việc phát triển phôi thai (bên trong trứng). Môi trường khí của phôi là một yếu tố cực kỳ quan trọng trong quá trình ủ, đặc biệt là trong 96 giờ đầu tiên. Trong khoảng thời gian từ 38 đến 48 giờ của quá trình tạo phôi, sự phát triển của niệu nang xảy ra, dải mạch phát triển trên túi rốn và tất cả các cơ quan bắt đầu phát triển. Nếu bất kỳ cơ quan nào không phát triển do rối loạn chuyển hóa hoặc ảnh hưởng của các chất độc hại, rối loạn gây chết trong tuần hoàn thai xảy ra, dẫn đến sự hình thành cục máu đông trong màng. Cho đến ngày thứ 8 của thời gian ủ bệnh, túi rốn và các mạch niệu nang đóng vai trò là cơ quan hô hấp. Sự chuyển đổi hô hấp phổi xảy ra chậm, trong quá trình rút lại túi rốn trong giai đoạn cuối của quá trình ủ. Trong giai đoạn này, các hợp chất khí có thể vượt qua hàng rào vỏ trứng theo cả hai hướng, gây ra rối loạn phát triển và phân hủy phôi [1, 8]
Trong không khí của trại giống gà, ngoài amoniac, hydro sunfua, mercaptans, aldehyd và ketone, nồng độ cao của acrolein, acetaldehyd và chủ yếu là formaldehyd, chủ yếu được sử dụng để khử trùng phòng, đã được phát hiện. Các loại khí khác, chẳng hạn như p-tolualdehyd, benzaldehyd, isovaleric và butyl aldehyd, có mặt với lượng khá ít. Người ta đã chứng minh rằng 1 m3 không khí chứa trung bình khoảng 7,7 g ô nhiễm khí hữu cơ.
Chế độ tác động có hại của acetaldehyd được thể hiện qua tác dụng gây nghiện của nó đối với hệ thần kinh trung ương, kích thích da và niêm mạc, giảm huyết áp và tim đập nhanh. Tương tự, acrolein là một chất gây kích thích niêm mạc và kết mạc. Nó có tác dụng nhanh chóng và trực tiếp trên đường hô hấp. Trong hội trường trại giống, sự hiện diện của benzaldehyd, một chất nhờn có mùi đặc trưng của hạnh nhân đắng, cũng đã được phát hiện. Ở người, benzaldehyd gây kích thích niêm mạc và khi hít vào một lượng lớn qua đường hô hấp, gây ra các triệu chứng dị ứng và rối loạn hệ thần kinh trung ương và cũng có liên quan đến tác dụng kìm tế bào và gây ung thư. Trong nghiên cứu được thực hiện trước đây, người ta đã chứng minh rằng nồng độ của các hợp chất được chọn này thấp hơn so với TLV (giá trị ngưỡng giới hạn) đối với không khí.
Tuy nhiên, lượng khí độc hại vẫn có khả năng gây hại, vì những chất gây ô nhiễm này có thể tác động lên sinh vật một cách độc lập; họ có thể vô hiệu hóa hành động của mình hoặc tăng tác động có hại lẫn nhau [1-10]. Số lượng các sản phẩm hóa học được sử dụng để khử trùng trong chế biến thực phẩm bị hạn chế do tác động tiêu cực của các hợp chất này đối với cơ thể con người và do khó khăn trong việc hòa tan và khả năng ứng dụng trực tiếp. Hơn nữa, lối sống thân thiện với môi trường của nhiều người tiêu dùng buộc công nghệ thực phẩm chỉ sử dụng các hợp chất hóa học xảy ra trong tự nhiên. Trong số các chất phụ gia ưa thích làm hỏng hệ vi khuẩn, axit hữu cơ.
Số lượng các sản phẩm hóa học được sử dụng để khử trùng trong chế biến thực phẩm bị hạn chế do tác động tiêu cực của các hợp chất này lên cơ thể con người và do khó khăn trong việc hòa tan và khả năng ứng dụng trực tiếp. Hơn nữa, lối sống thân thiện với môi trường của nhiều người tiêu dùng buộc công nghệ thực phẩm chỉ sử dụng các hợp chất hóa học xảy ra trong tự nhiên. Trong số các chất phụ gia được ưa thích làm hỏng hệ vi khuẩn, axit hữu cơ và muối của chúng, thường được coi là an toàn.
Axit citric thuộc nhóm này và được chấp thuận sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Các nghiên cứu liên quan đến việc tiêu diệt vi sinh vật đã được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, với việc sử dụng nhiều hợp chất hóa học bao gồm axit hữu cơ, hexadecylpyridinium clorua, natri orthophosphate, hydro peroxide và natri bicarbonate. Không phải tất cả các phương pháp này đều có hiệu quả, vì vậy cần phải liên tục tìm kiếm các phương pháp tiêu diệt vi khuẩn và nấm hiệu quả. Formaldehyd thường được sử dụng trong các nhà máy sản xuất giống vì chi phí thấp và tác dụng diệt khuẩn hiệu quả, ít chú ý đến tác dụng gây độc và gây ung thư khi sử dụng [1-10].
Hợp chất này có khả năng làm hỏng hầu hết các vi sinh vật tồn tại trên lớp vỏ trứng bên ngoài. Nó được sử dụng ở dạng khí hoặc dưới dạng dung dịch 40% được gọi là formalin. Formaldehyd là một chất khử trùng dễ sử dụng và hiệu quả nhưng gây kích ứng mắt và màng nhầy của hệ hô hấp. Nó là một chất độc protoplasmic mạnh, gây ra những thay đổi thoái hóa đến các tế bào nhu mô gan, thận và tim. Ở mắt, những thay đổi thoái hóa không chỉ ảnh hưởng đến võng mạc mà còn ảnh hưởng đến thần kinh thị giác và biểu mô giác mạc. Các hạt nano bạc, theo tài liệu cho thấy các đặc tính diệt khuẩn tốt, có thể là một sự thay thế. Các chế phẩm được đề xuất cũng có thể là một phương tiện hiệu quả để trung hòa các chất gây ô nhiễm khí được tạo ra trong quá trình ủ [12 cạn14]. Do đặc tính diệt khuẩn của nó, nano bạc đã trở thành một sản phẩm thương mại quan trọng và có giá trị trong ngành công nghiệp thực phẩm (ví dụ, bao bì và hộp đựng thực phẩm), ngành công nghiệp quần áo (ví dụ, quần áo kháng khuẩn), ngành y tế (ví dụ, băng gạc), và những người khác [15-17].
Các hạt nano bạc là yếu tố gây tổn hại hiệu quả cho một loạt các vi khuẩn gram âm và gram dương, không loại trừ các chủng kháng kháng sinh [18]. Vi khuẩn gram âm bao gồm các chi Acinetobacter [19], Escherichia [20], Pseudomonas [21], Salmonella và Vibrio [22], trong khi các vi khuẩn gram dương bao gồm các chi như Bacillus [23], Clostridium [24], Enterococcus [25], Listeria [26], Staphylococcus [27] và Streptococcus [28]. Vi khuẩn kháng kháng sinh thường kháng với metacycline và vancomycin, bao gồm một số chủng Staphylococcus aureus và Enterococcus faecium. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các hạt nano bạc có đường kính 22,5nm làm tăng hoạt động kháng khuẩn của một số loại kháng sinh, như penicillin G, amoxicillin, erythromycin, clindamycin và vancomycin [29]. Nhiều nghiên cứu gần đây đã tiết lộ các đặc tính rất hứa hẹn của nanosilver chống lại virus, thậm chí là virus HIV-1. Sun và cộng sự. quan sát thấy rằng các hạt nano bạc ức chế sự nhân lên của virus này [30, 31]. Áp dụng nanosilver để diệt trừ nấm cũng cho kết quả hài lòng. Các nghiên cứu đã xác nhận rằng các hạt nano bạc là một yếu tố hiệu quả và nhanh chóng chống lại nhiều loại nấm thông thường, bao gồm các chi như Aspergillus [32], Candida [33] và Saccharomyces [18]. Hơn nữa, người ta đã chứng minh rằng các hạt nano bạc cho thấy hoạt động rõ rệt chống lại nấm men phân lập từ bầu vú bò bị nhiễm bệnh [34]. Nano bạc đã được sử dụng trong chăn nuôi như một chất khử trùng được sử dụng để vệ sinh buồng vận chuyển hoặc hoặc không gian được sử dụng để lưu trữ động vật. Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định mức độ phát thải amoniac từ phân cừu sau khi áp dụng chế phẩm dựa trên các hạt nano bạc với việc bổ sung chất hấp thụ khoáng. Nó đã được kết luận rằng việc sử dụng các chế phẩm dẫn đến giảm phát thải amoniac từ mặt đất [35]. Mục đích của nghiên cứu này là phát triển các phương pháp thu được huyền phù của các hạt nano bạc với phổ rộng về kích thước và hình thái hạt, với độ ổn định cao và tính chất hóa lý thích hợp, cũng như kiểm tra tính chất diệt khuẩn và diệt nấm của chúng đối với các vi sinh vật có trong các nhà máy chế biến gia cầm . Đồng thời, các hạt đã được kiểm tra khả năng ngăn chặn việc tạo ra các chất ô nhiễm gây mùi trong quá trình ủ, do đó dẫn đến giảm phát thải khí độc hại từ loại cơ sở này. Vì vậy, nó có thể ngăn chặn sự phát sinh mùi tại nguồn sản xuất của nó.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đăc điểm của hạt nano bạc.
Quá trình thu được bạc cấu trúc nano bằng hóa chất khử ion bạc đã được nghiên cứu. Bạc nitrat (V) (POCh, p.a. grade) được dùng làm nguồn của các ion bạc. Để khử các ion Ag +, axit L (+) ascorbic (POCh, pa grade) hoặc glucose (POCh, pa cấp) đã được sử dụng, trong khi natri pyrophosphate (POCh, pa cấp), gelatine (POCh, pa grade), hoặc natri tripolyphosphate (SIGMA ALDRICH, pa grade) chịu trách nhiệm ổn định sự hình thành các chất kết tụ của bạc kim loại. Một dung dịch NaOH (0,1 M) được sử dụng để điều chỉnh pH. Việc áp dụng các chất nền này cho phép giảm việc sử dụng các chất độc hại trong quá trình tổng hợp nanosilver, làm cho quá trình này thân thiện với môi trường và phù hợp với các nguyên tắc của hóa học xanh. Một lò phản ứng áp suất PARR 4525 đã được sử dụng trong quá trình này. Một dung dịch nước của chất ổn định (50,0 cm3) đã được thêm vào dung dịch nước AgNO3 (100,0 cm3; 0,001 mol / dm3). Dung dịch được gia nhiệt trong lò phản ứng có nhiệt độ tới 110-150∘C. Sau khi đạt được nhiệt độ cài đặt, dung dịch nước của chất khử (50,0 cm3) được thêm vào thiết bị phản ứng bằng bơm. Phản ứng khử được thực hiện trong 2-30 phút. Các thông số của quá trình thu được hạt nano bạc được tóm tắt trong Bảng 1.
Phân tích quang phổ (UV-Vis) của huyền phù thu được của hạt nano được thực hiện trên máy quang phổ RAYLEIGH UV-1800 trong bước sóng nằm trong khoảng từ 300 đến 600nm với độ phân giải 2 nm. Xác định kích thước của các hạt nano thu được được thực hiện bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) với máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano-ZS. Thiết bị này cũng được sử dụng để nghiên cứu giá trị của thế điện động (𝜁). Các hạt nano bạc thu được được hiển thị bằng kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) trên thiết bị NanoScope V (Công ty Veeco, Hoa Kỳ). Dạng bột của sản phẩm, thu được bằng cách ly tâm (90000 vòng / phút) bằng cách sử dụng microultracentrifuge Thermo Science Sorvall MX 150 với rôto S140A, được đặc trưng với việc sử dụng kính hiển vi điện tử quét, được thực hiện trên một thiết bị VP LEO 1430 (Electron microscopy Ltd.). Phổ hấp thụ UV-Vis của huyền phù nano thu được được thể hiện trong Hình 1. Đỉnh ở 400-450nm tương ứng với cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng của hạt nano bạc. Các plasmon bề mặt là các dao động kết hợp của các electron hóa trị của các nguyên tử có trên bề mặt vật liệu.
Sự hấp thụ bức xạ bởi các hạt nano kim loại chủ yếu phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của chúng. Sự lắp ráp plasmon không đối xứng, có nghĩa là các giải pháp có chứa các hạt tổng hợp. Điều này đã được xác nhận bằng các hình ảnh kính hiển vi lực nguyên tử trong Hình 2. Các dải hấp thụ UV-Vis thu được rất rộng, lệch phải (với đuôi hấp thụ ở bước sóng dài hơn), có thể dẫn đến sự phân bố kích thước của các hạt nano được trình bày trên Hình 3 Cường độ cộng hưởng plasmon phụ thuộc vào kích thước của các hạt tổng hợp và do đó mối quan hệ giữa số lượng hạt và cường độ hấp thụ là phi tuyến. Kích thước hạt trung bình, thế năng điện động và hình dạng được tóm tắt trong Bảng 1.
Hình 1: Phổ hấp thụ thu được đối với huyền phù tương ứng của hạt nano bạc (pha loãng đến 50 mg/dm3)
2.2. Đánh giá tính chất diệt khuẩn và diệt nấm của Nanosilver.
Việc đánh giá tính chất khử trùng của các chế phẩm nano, khác nhau về kích thước hạt và hình thái, được thực hiện trong hai giai đoạn. Trong giai đoạn đầu tiên, phương pháp ống nghiệm thử nghiệm đã được sử dụng, trong đó ba chế phẩm có đặc tính diệt khuẩn và diệt nấm tốt nhất đã được chọn. Trong giai đoạn thứ hai, các đánh giá được thực hiện bằng phương pháp trung hòa pha loãng, theo PN-EN1040 và PN-EN1275. Trên cơ sở các kết quả thu được, việc chuẩn bị các đặc tính diệt khuẩn và diệt nấm tốt nhất đã được chọn. Năm chủng vi sinh vật thu được từ American Type Culture Collection (ATCC) đã được sử dụng trong nghiên cứu này: Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Candida albicans ATCC 10231.
2.2.1. Phương pháp treo ống nghiệm. Một huyền phù vi khuẩn thử nghiệm 0,5 trên thang McFarland đã được pha loãng trong nước cất vô trùng để thu được huyền phù pha loãng 𝑍−1, 𝑍−2, and 𝑍−3. Sau đó, 1 cm3 huyền phù vi khuẩn từ 𝑍-2 được thêm vào mỗi tám ống nghiệm chứa 9.0 cm3 chế phẩm nano (được đánh số từ 1 đến 8).
Huyền phù 𝑍-3 được dùng làm mẫu đối chứng. Thời gian tiếp xúc giữa huyền phù vi khuẩn và chế phẩm lên tới 5 phút và 30 phút. Sau đó, các mẫu 0,1 cm3 được lấy từ mỗi ống nghiệm và được cấy vào chất nền thạch thích hợp (MacConkey, TSA, SS hoặc Sabouraud). Sau 24 giờ ủ ở 37∘C, các khuẩn lạc được đếm. Tỷ lệ giảm cho chuẩn bị và kiểm tra từng chủng được tính toán liên quan đến mẫu đối chứng.
2.2.2. Phương pháp pha loãng-trung hòa.
Trước thí nghiệm, các chủng vi sinh vật được thử nghiệm đã được tăng sinh trên chất nền thạch thích hợp trong 24 giờ ở nhiệt độ 37∘C. Sau khi ủ, huyền phù của vi sinh vật từ môi trường nuôi cấy thu được được chuẩn bị trong nước cất vô trùng, để đạt được nồng độ tế bào từ khoảng 1,5 × 108 đến 5 × 108 cfu / cm3 đối với vi khuẩn và 1,5 × 106 cfu / cm3 đối với C.albicans. Một loạt các pha loãng thập phân được chuẩn bị từ huyền phù thu được, và sau đó 0,1 cm3 của huyền phù vi sinh vật từ bốn độ pha loãng cuối cùng được cấy vào hai đĩa với môi trường thạch thích hợp để xác định chính xác số lượng tế bào trong huyền phù ban đầu. Đồng thời, dung dịch trung hòa được chuẩn bị bằng cách thêm 1,0 cm3 nước cất vô trùng vào 8,0 cm3 chất trung hòa. Huyền phù các tế bào từ 𝑍-1 với lượng 1,0 cm3 đã được chuyển sang ba ống nghiệm chứa 9.0 cm3 huyền phù đã bổ sung các hạt nano bạc. Sau khi thời gian tiếp xúc được chỉ định trôi qua, hành động của chế phẩm được nghiên cứu đã được trung hòa bằng cách chuyển 1,0 cm3 huyền phù vi khuẩn trong chế phẩm thành 9.0 cm3 hỗn hợp trung hòa đã được chuẩn bị trước đó và nước cất. Sau 5 phút trung hòa, 0,1 cm3 huyền phù từ chất trung hòa được chuyển sang hai tấm Petri với môi trường thạch thích hợp. Thí nghiệm được thực hiện trong 5, 15, 30 và 60 phút tiếp xúc giữa các vi sinh vật và các chế phẩm nano. Việc xác nhận dung dịch trung hòa được thực hiện bằng cách tạo ra bốn hỗn hợp: 8,0 cm3 chất trung hòa, 1,0 cm3 nước cất vô trùng và 1,0 cm3 huyền phù của vi sinh vật được kiểm tra từ độ pha loãng 10−5, trong khi ba hỗn hợp còn lại chứa 8,0 cm3 của chất trung hòa, 1,0 cm3 của chế phẩm được nghiên cứu và 1,0 cm3 huyền phù của vi sinh vật được kiểm tra từ độ pha loãng 10−5. Nuôi cấy hai đĩa với môi trường thạch thích hợp được thực hiện từ mỗi ống nghiệm (0,1 cm3). Tất cả các đĩa được ủ ở 37∘C trong 24 giờ. Sau đó, tất cả các thuộc địa đã hình thành trên môi trường, có số lượng từ 15 đến 300, được tính để đánh giá lượng vi khuẩn khả thi [cfu].
2.3. Đánh giá hiệu quả khử trùng của máy ấp trứng bằng nano bạc.
Trứng đến từ một giống gà mái Ba Lan được gọi là gà mái chân xanh được chọn để nghiên cứu. Nhóm thử nghiệm (Nhóm D) bao gồm trứng gà đã được khử trùng bằng ống nano trước khi đưa chúng vào máy ấp trứng (Máy ấp trứng D). Nhóm đối chứng (Nhóm K) bao gồm trứng được khử trùng bằng cách chiếu tia UV trong 30 phút trước khi đưa chúng vào máy ấp trứng (Máy ấp trứng K). Trong nhóm thử nghiệm, máy ấp trứng và trứng được làm mờ bằng chế phẩm nano. Trong cả hai nhóm, hiệu quả khử trùng được đánh giá dựa trên các phân tích vi sinh của bề mặt trứng và máy ấp trứng. Các phân tích được thực hiện trước (loạt I) và 30 phút sau khi khử trùng (loạt II). Trong thời gian ủ, các thí nghiệm đã được thực hiện ba lần, tức là sau ngày thứ nhất (loạt III) và ngày thứ 7, vào ngày thắp trứng (loạt IV) và vào ngày thứ 17, trước khi bắt đầu nở (loạt V). Phân tích vi sinh của bề mặt trứng và máy ấp trứng bao gồm việc xác định tổng số lượng vi khuẩn, tổng số lượng Staphylococcus và tổng số lượng nấm. Trứng / phôi được thu thập trong các thùng chứa vô trùng và được phủ 50,0 cm3 nước cất vô trùng với Tween 80. Sau 15 phút lắc, nuôi cấy được thực hiện từ các lần rửa thu được bằng kỹ thuật mạ bề mặt trên môi trường thích hợp (Bảng 2) và được ủ 24 giờ ở 37∘C (vi khuẩn) và trong 5 ngày ở 25∘C (nấm). Sau khi ủ, số lượng vi sinh vật trên bề mặt trứng [cfu / trứng] đã được đếm, dựa trên số lượng khuẩn lạc. Vết bẩn từ thành các lò ấp Các bức được thu thập từ diện tích 10,0 cm2 bằng cách sử dụng mẫu vô trùng và tăm bông vô trùng (Copan, Ý). Sau khi thu thập, phết tế bào được đặt trong các ống vận chuyển chứa 20,0 cm3 nước muối. Các mẫu thu thập được lắc trong 2 phút. Từ huyền phù thu được, nuôi cấy được thực hiện trên môi trường thích hợp (Bảng 2) và được ủ trong 24 giờ ở 37∘C (vi khuẩn) và trong 5 ngày ở 25∘C (nấm). Sau khi ủ, số số lượng vi sinh vật trên tường lò ấp [cfu / 10 cm2] đã được tính, dựa trên số lượng khuẩn lạc.
2.4. Ảnh hưởng của hạt nano bạc đối với sự cô đặc của chất gây ô nhiễm khí được tạo ra trong quá trình ủ.
Các đánh giá thành phần khí của máy ấp trứng đã khử trùng được thực hiện song song với các phân tích vi sinh. Các mẫu không khí được thu thập từ thiết bị thí nghiệm (Lò ấp nano) và thiết bị kiểm soát (Lò ấp UV) trước và 30 phút sau khi khử trùng. Trong thời gian ủ, các thí nghiệm được thực hiện ba lần, tức là sau ngày thứ nhất (loạt III) và ngày thứ 7-vào ngày thắp trứng (loạt IV) và vào ngày thứ 17, trước khi bắt đầu nở ( loạt V). Nồng độ của các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) và các hợp chất vô cơ, đặc biệt là các hợp chất lưu huỳnh có đặc tính tạo mùi mạnh, được xác định trong các mẫu không khí được thu thập. Các chất gây ô nhiễm không khí hữu cơ được xác định bằng sắc ký khí. Các mẫu không khí được thu thập bằng máy bơm điện vào túi Tedlar 2-3 lít (Sensidyne Inc., Clearwater, USA). Các hợp chất hữu cơ có trong các mẫu không khí được ngưng tụ và sau đó được giải hấp bằng thiết bị giải hấp nhiệt (TDV; Model 890, Dynatherm, Công cụ phân tích Inc., Oxford, Hoa Kỳ) cho hệ thống sắc ký khí (HP 5890 series II, Hewlett Packard, Santa Clara, Hoa Kỳ) được trang bị đầu dò trắc quang ngọn lửa chọn lọc (FPD) kết hợp với bộ lọc S có bước sóng 393nm. Việc xác định hàm lượng hợp chất vô cơ trong các mẫu được hút vào vòng đệm sủi bọt được thực hiện bằng phương pháp sắc ký ion với việc sử dụng sắc ký lỏng (Waters) kết nối với cột phân tích (IC-PAK Anion HR, Waters Corp, Milord, USA) đầu dò độ dẫn và chỉ thị UV.
Bảng 3: Phần trăm giảm lượng vi sinh vật so với mẫu đối chứng cho các chế phẩm nano được thử nghiệm
Bảng 4: Số lượng tế bào vi khuẩn và nấm phát triển sau năm phút tiếp xúc với nano bạc so với nhóm đối chứng.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN VỀ NGHIÊN CỨU NANO BẠC
3.1. Tính chất diệt khuẩn của nano bạc
Trên cơ sở phân tích vi sinh (Bảng 3) được tiến hành bằng phương pháp ống nghiệm, ba chế phẩm nano hiệu quả nhất, số 6, 7 và 8, đã được chọn. Các chế phẩm được đề cập đạt mức giảm cao chỉ sau 5 phút tiếp xúc (Bảng 4). Các huyền phù chứa các hạt có kích thước khoảng 10nm, được ổn định bằng natri pyrophosphate, đã chứng minh hoạt động diệt khuẩn và diệt nấm mạnh nhất. Đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của các chế phẩm được nghiên cứu là kích thước của các hạt nano bạc và các hợp chất được sử dụng để ổn định cấu trúc nanomet. Natri photphat phân ly trong môi trường nước, dẫn đến sự hình thành các anion photphat hấp phụ lên bề mặt của các hạt kim loại và ngăn chặn sự kết tụ của chúng bằng cách tích điện bề mặt cho các hạt ổn định. Kết quả là một Điện thế Zeta âm cao.
Trong các chế phẩm khác, mức độ giảm tương tự chỉ đạt được sau khi kéo dài thời gian tiếp xúc đến 30 phút (Bảng 5). Chuẩn bị số 1, chứa các hạt nano nhỏ hơn (8nm), đã chứng minh hoạt tính diệt khuẩn yếu hơn đối với Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Staphylococcus aureus so với các chế phẩm 6, 7 và 8. Đây có thể là kết quả của tiềm năng điện di dương. ảnh hưởng đến màng tế bào của các vi sinh vật được thử nghiệm, cũng như sự ổn định hóa mạnh mẽ đạt được do ứng dụng gelatine và do đó, hạn chế khả năng tác động trực tiếp của các hạt nano bạc. Gelatine là một protein ở nhiệt độ cao, liên kết collagen của nó bị phá vỡ. Một hệ keo sau đó hình thành, trong đó sự ổn định của các hạt kim loại được tạo điều kiện. Vào thời điểm đó, sự ổn định hình cầu xảy ra; đó là, các chuỗi protein, do cấu trúc phức tạp của chúng, là một yếu tố không gian hiệu quả, ngăn chặn sự kết tụ của các hạt kim loại bằng cách hấp phụ bề mặt. Người ta thấy rằng các chế phẩm chứa các hạt bạc có kích thước khoảng 50nm, được ổn định bằng gelatine (chế phẩm 2 và 3), cho thấy tác dụng kháng khuẩn yếu nhất. S. aureus là vi khuẩn kháng thuốc nhất đối với tất cả các chế phẩm được thử nghiệm trong số các vi sinh vật được thử nghiệm, trong khi đó nấm men C.albicans tỏ ra nhạy cảm nhất.
Kết quả đánh giá tính chất diệt khuẩn và diệt nấm của các chế phẩm nano 6, 7 và 8, được thực hiện bằng phương pháp trung hòa pha loãng (PN-EN 1040 và PN-EN 1275), được tóm tắt trong Bảng 6-8. Theo các yêu cầu có trong các tiêu chuẩn nêu trên, một chế phẩm đáp ứng các yêu cầu của hành động diệt khuẩn và diệt nấm cơ bản khi nó làm giảm 105 lần vi khuẩn khả thi và giảm 104 lần hoặc lớn hơn trong trường hợp nấm, trong các điều kiện thử nghiệm cụ thể, trong 60 phút hoặc ít hơn. Dựa trên các kết quả được trình bày, có thể kết luận rằng tất cả các chế phẩm đạt được mức giảm cần thiết cho phần lớn các chủng nghiên cứu chỉ sau 60 phút tiếp xúc. Sau 60 phút tiếp xúc, các chế phẩm được nghiên cứu đã đạt được kết quả 105 lần giảm cho phần lớn các chủng. Tình trạng này đã không chỉ đề cập đến vi khuẩn gram dương S. aureus, trong đó trường hợp đánh giá bằng phương pháp ống nghiệm, được chứng minh là có khả năng chống lại tác động mạnh nhất của các hạt nano bạc. Huyền phù số 6 đạt được mức giảm yêu cầu chỉ sau 15 phút trong trường hợp men C. albicans (Bảng 6). Một kết quả tương tự cho cùng một chủng đã thu được trong trường hợp chuẩn bị số 7 (Bảng 7), nhưng hành động diệt khuẩn mạnh nhất được hiển thị bằng huyền phù số 8 (Bảng 8). Sau 30 phút tiếp xúc, mức độ giảm mong muốn đã được ghi nhận đối với C. albicans, P. aeruginosa và S. enteritidis. Hai chế phẩm còn lại (6 và 7) cho thấy hành động khử trùng trong thời gian này chỉ đối với S. enteritidis. Trên cơ sở những kết quả này, chuẩn bị số 8 đã được chọn để kiểm tra ứng dụng.
Bảng 6: Kết quả đánh giá bằng phương pháp pha loãng-trung hòa đối với huyền phù số 6.
Bảng 7: Kết quả đánh giá bằng phương pháp pha loãng-trung hòa đối với huyền phù số 7.
Bảng 8: Kết quả đánh giá bằng phương pháp pha loãng-trung hòa đối với huyền phù số 8.
3.2. Kiểm tra ứng dụng.
Trong phần này của nghiên cứu, sự ô nhiễm vi sinh đáng kể của vỏ trứng được thiết kế để ấp (Bảng 9) đã được quan sát. Trên bề mặt của trứng, trung bình tổng số vi khuẩn lên tới 9,8 × 104 cfu / trứng, trong khi số lượng nấm trung bình là 2,1 × 102 cfu / trứng. Do đó, duy trì độ tinh khiết của vi sinh vật là có thể với việc khử trùng trứng và máy ấp trứng được tiến hành đúng cách. Trong các thử nghiệm này, hiệu quả của việc chuẩn bị bạc được nghiên cứu trong trường hợp tổng số vi khuẩn ở mức tương tự như hiệu quả khử trùng UV (Bảng 9). Sau 30 phút, số lượng vi khuẩn trên trứng đối chứng và trên trứng được khử trùng bằng hạt nano bạc lên tới × 104, trong khi vào ngày thứ hai của quá trình ủ, nó thậm chí còn lớn hơn trên trứng được xử lý bằng chế phẩm. Những thay đổi có thể nhìn thấy trong tổng số vi khuẩn được quan sát thấy vào ngày thứ 7 của quá trình ủ, khi số lượng vi khuẩn trung bình trên trứng đối chứng cao hơn gần sáu lần so với trứng thí nghiệm. Vào ngày thứ 17 của quá trình ủ, sự gia tăng đáng kể số lượng vi khuẩn trung bình trên bề mặt của tất cả trứng đã được quan sát, so với các giai đoạn ủ trước đó. Nguyên nhân của tình trạng này có lẽ là sự ô nhiễm thứ cấp do hậu quả của việc đốt trứng vào ngày thứ 7. Sự khác biệt trung bình giữa lượng vi khuẩn trên trứng đối chứng và trứng được thử nghiệm khác nhau và là một nửa số lượng trên trứng thử nghiệm. Trong trường hợp tổng số lượng Staphylococcus, sự ô nhiễm vẫn ở mức tương tự như tổng số vi khuẩn (Bảng 9). Không có sự khác biệt về số lượng staphylococci trung bình đã được quan sát giữa trứng đối chứng và trứng thử nghiệm cho đến ngày thứ 17 của quá trình ủ, khi sự hiện diện của cầu khuẩn không được phát hiện trên phôi thí nghiệm.
Tổng số lượng nấm vẫn ở mức ổn định trên trứng đối chứng và thử nghiệm (Bảng 9). Vào ngày thứ 17 của quá trình ủ, ở cả hai nhóm, sự hiện diện của nấm đã không được quan sát. Những kết quả này cho thấy rằng hoạt động khử trùng của nano bạc đối với tất cả các nhóm vi sinh vật được nghiên cứu đã được quan sát thấy từ ngày thứ 7 của quá trình ủ. Sự gia tăng tổng số vi sinh vật vào ngày thứ 7 của quá trình ủ có thể được kết nối với sự ô nhiễm thứ cấp trên bề mặt của trứng do hậu quả của quá trình đốt trong quá trình ấp.
Bảng 9: Ô nhiễm vi sinh của trứng trước và sau khi xử lý nano bạc [cfu / trứng].
Bảng 10: Ô nhiễm vi sinh vật trên thành của máy ấp trứng trước và sau khi xử lý nano bạc [cfu / cm2].
Trước khi khử trùng, sự khác biệt đã được phát hiện ở mức độ ô nhiễm của các lò ấp. Máy ấp trứng thí nghiệm (nano bạc) bị ô nhiễm vi khuẩn nghiêm trọng hơn so với Máy ấp trứng đối chứng (UV) (Bảng 10). Sau 30 phút khử trùng và đưa trứng vào lồng ấp, sự ô nhiễm của lò ấp kiểm soát (UV) tăng lên, chắc chắn là do ô nhiễm thứ cấp, trong khi đó ô nhiễm của lò ấp thực nghiệm (Nano Bạc) đã giảm đáng kể. Vào ngày thứ 2 của quá trình ủ, ô nhiễm trung bình của vi khuẩn đã giảm ở cả máy ấp trứng đối chứng và thực nghiệm, nhưng số lượng vi khuẩn trung bình trong lò ấp thử nghiệm thấp hơn đáng kể so với đối chứng. Vào ngày thứ 17, tổng số vi khuẩn trung bình trên mỗi cm2 của lò ấp điều khiển giảm, cũng như số lượng vi khuẩn trong lò ấp thực nghiệm. Tổng số Staphylococcus thấp và dao động, có thể là kết quả của ô nhiễm thứ cấp từ không khí (Bảng 10).
Tổng số lượng nấm thể hiện xu hướng giảm trong suốt thời gian ủ bệnh. Sự khác biệt đáng kể giữa kiểm soát và Máy ấp trứng thử nghiệm tiếp tục từ khi bắt đầu ủ đến ngày thứ 17. Trên cơ sở tổng số lượng vi khuẩn trung bình và tổng số lượng nấm, có thể nói rằng chế phẩm nano được nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả diệt khuẩn và diệt nấm tốt trên bề mặt của máy ấp trứng. Sự dao động về số lượng staphylococci có thể được giải thích bằng sự nhiễm bẩn thứ cấp và có thể không được kết nối với hoạt động của nano bạc.
Hình 4: Nồng độ VOC trong không khí bên trong lồng ấp khi xử lý UV và xử lý nano bạc trong thời gian ủ [𝜇g / m3]
Kết quả rất tốt đã đạt được trong trường hợp chất gây ô nhiễm khí hữu cơ VOCs. Sau khi áp dụng chế phẩm nano, các mức này giảm 86% (Hình 4). Trong thời gian ủ bệnh 17 ngày, sự gia tăng nồng độ VOC đã được quan sát thấy ở cả hai thiết bị. Vào cuối quá trình, mức độ chất gây ô nhiễm trong không khí bên trong Máy ấp trứng UV cao hơn 40% so với Máy ấp trứng NANO. Các nghiên cứu sắc ký không chứng minh sự tích tụ của các hợp chất vô cơ và hợp chất lưu huỳnh trong các thiết bị (Hình 5 và 6). Trong loạt nghiên cứu gần đây, nồng độ các hợp chất lưu huỳnh trong không khí bên trong Máy ấp trứng UV và NANO được xác định lần lượt là 11,0 𝜇g / m3 và 14,9 𝜇g / m3.
Hình 5: Nồng độ các hợp chất khí vô cơ trong không khí bên trong các lò ấp khi xử lý bằng UV và nano bạc
trong thời gian ủ [mg / m3]
Hình 6: Nồng độ các hợp chất lưu huỳnh trong không khí bên trong các lò ấp khi xử lý bằng UV và nano bạc
trong quá trình ủ [𝜇g / m3].
Trong số các hợp chất VOC đã được xác định, nồng độ cao nhất trong Máy ấp trứng UV đã được nhìn thấy đối với 2-pentanamine (284,3 𝜇g / m3) và cyclobutanol (247,1 µg / m3), trong khi đó, trong Máy ấp trứng NANO, nồng độ cao nhất được thấy cho hexanal (255,4 µg / m3). Trong thiết bị được khử trùng bằng nanosilver, sự hiện diện của 2-pentanamine, 2- methylpentane, 2-methyl-1-propanol, trichloroethylen, và toluene (Bảng 11) cũng như các hợp chất lưu huỳnh như carbonyl sulphide (COS) và methyl mercaptan (Bảng 12) đã không được phát hiện. Phương pháp khử trùng được áp dụng không có ảnh hưởng đến mức độ của các chất ô nhiễm vô cơ được xác định (Bảng 13).
Bảng 11: Nồng độ khi hữu cơ bay hơi VOCs trong không khí bên trong tủ ấp vào ngày ủ thứ 17 [𝜇g / m3].
Bảng 12 & Bảng 13: Nồng độ hợp chất sulphur và khí vô cơ trong không khí bên trong tủ ấm vào ngày ủ thứ 17 [𝜇g / m3].
- KẾT LUẬN
Theo tiêu chuẩn sản xuất hiện nay, trong phần lớn các nhà máy công nghiệp thực phẩm, bao gồm cả ngành chăn nuôi gia cầm trứng, việc kiểm soát bắt buộc đối với chất lượng vi sinh và hóa học của không khí và bề mặt sản xuất đã được đưa ra, có nghĩa là phải đảm bảo vệ sinh sạch sẽ. Trong trại giống gà con, các trại giống tạo thành một điểm quan trọng bởi vì điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cũng như sự hiện diện của vật liệu sinh học bên trong chúng gây ra một mối nguy vi sinh đáng kể. Ở những nơi như vậy, không phải không có lý do, người ta đã nhấn mạnh đến việc duy trì độ tinh khiết của vi sinh vật, điều này chỉ đạt được bằng cách khử trùng trứng và trứng được tiến hành đúng cách. Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng chế phẩm nano được áp dụng cho khử trùng trứng và máy ấp trứng làm giảm ô nhiễm vi sinh. Việc chuẩn bị được sử dụng cho thấy hiệu quả diệt khuẩn và diệt nấm tương đương với bức xạ UV và hiệu quả của nó tăng lên trong suốt thời gian ủ bệnh. Trong trường hợp nấm, vào ngày thứ 7 của quá trình ủ, phun sương bằng ống nano giúp bảo vệ bề mặt trứng tốt hơn so với chiếu xạ bằng tia cực tím.
Kết quả rất tốt đã đạt được trong trường hợp chất gây ô nhiễm khí hữu cơ. Sau khi áp dụng chuẩn bị nanosilver, các mức này giảm 86%. Mức độ các chất gây ô nhiễm trong không khí bên trong lò ấp được khử trùng bằng tia cực tím cao hơn 40% so với trong lò ấp được khử trùng bằng máy nano. Điều kiện ấp trứng thích hợp trong quá trình ấp nở là rất quan trọng và dẫn đến việc ấp nở hiệu quả và gà con khỏe mạnh. Chạy mạnh các quá trình trao đổi chất và hô hấp phôi đòi hỏi không khí bên trong lồng ấp chứa một lượng oxy vừa đủ. Khí thải ra trong quá trình ủ phải được loại bỏ khỏi thiết bị, bởi vì lượng quá mức có thể dẫn đến ngộ độc và phân hủy phôi, vì vậy trao đổi không khí thích hợp là rất quan trọng. Ứng dụng của nanosilver có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình ủ. Như nghiên cứu này cho thấy, nanosilver không thể thay thế thông gió hoạt động hiệu quả nhưng có thể là một yếu tố hỗ trợ loại bỏ các chất gây ô nhiễm khí.
Mua Nano bạc nguyên liệu tham khảo tại đây
Nguồn tham khảo: Nanosilver Biocidal Properties and Their Application in Disinfection of Hatchers in Poultry Processing Plants
Marcin Banach,1 Leszek Tymczyna,2
Anna Chmielowiec-Korzeniowska,2 and Jolanta Pulit-Prociak1
1Cracow University of Technology, Warszawska 24, 31-155 Krakow, Poland ´
2University of Life Sciences, Akademicka 13, 20-950 Lublin, Poland