Nano đồng kết hợp với nano kẽm trị bệnh mốc sương trên khoai tây

Bệnh mốc sương, do Phytophthora infestans gây ra , là một bệnh khoai tây lớn trên toàn cầu, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể là 6,7 tỷ đô la. Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hạt nano kẽm ZnO và nano đồng CuO (NP) đối với P. infestans lần đầu tiên trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà kính. Các hạt nano được tổng hợp thông qua phương pháp kết tủa hóa học và được đặc trưng bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Kết quả XRD cho thấy các hạt nano ZnO tổng hợp có cấu trúc tinh thể wurtzite lục giác tinh khiết, trong khi các hạt nano CuO có cấu trúc tinh thể đơn nghiêng. Hình ảnh TEM xác nhận sự tổng hợp các hạt nano gần như hình cầu với kích thước trung bình là 11,5 nm đối với các hạt nano ZnO và 24,5 nm đối với các hạt nano CuO. Báo cáo phổ UV-Vis cho thấy các đỉnh tương ứng với ZnO NP ở 364 nm và 252 nm đối với CuO NP. Trong một nghiên cứu trong ống nghiệm, cả ZnO và CuO NP đều ức chế đáng kể ( p  < 0,05) sự phát triển theo hướng xuyên tâm của P. infestans ở tất cả các nồng độ đã thử nghiệm so với đối chứng không được xử lý. Hiệu ứng ức chế cao nhất là 100% được quan sát thấy với ZnO và CuO NP ở mức 30 mg/L. Hiệu ứng ức chế thấp hơn là 60,4% được quan sát thấy với CuO NP 10 mg/L. Trong điều kiện nhà kính, ZnO NP 100 mg/L là phương pháp xử lý hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh mốc sương khoai tây, với hiệu quả là 71%. CuO NP ở mức 100 mg/L theo sát, với hiệu quả là 69%. Dựa trên những kết quả này, ZnO và CuO NP được khuyến nghị là thuốc diệt nấm thân thiện với môi trường đầy hứa hẹn để quản lý và kiểm soát bệnh mốc sương khoai tây sau khi nghiên cứu thêm.

NANOCMM TECHNOLOGY

Giới thiệu

Cây khoai tây có tầm quan trọng đáng kể về mặt lịch sử, xã hội và kinh tế ở nhiều khu vực trên thế giới [ 1 ]. Nó đã đóng một vai trò quan trọng về mặt an ninh lương thực, dinh dưỡng và tăng trưởng dân số. Tuy nhiên, năng suất khoai tây có thể bị giảm đáng kể do nhiều loại bệnh khác nhau. Trong số các bệnh này, bệnh mốc sương khoai tây do Phytophthora infestans gây ra , ước tính gây thiệt hại lên tới 10 tỷ đô la về mất mùa và chi phí quản lý [ 2 ]. Thuốc diệt nấm hóa học thường được sử dụng để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh do nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng quá mức đã dẫn đến những tác động có hại cho con người, thực vật và môi trường (Hình  1 ) [ 3 ]. Sự xuất hiện của tình trạng kháng thuốc diệt nấm của mầm bệnh đã trở thành một vấn đề thách thức, đe dọa đến hiệu quả của các loại thuốc diệt nấm thương mại có hiệu lực cao [ 4 ]. Do đó, điều quan trọng là phải khám phá các tác nhân chống nấm thay thế có cơ chế hoạt động mới.

Công nghệ nano có tiềm năng cách mạng hóa nông nghiệp bằng cách cung cấp một loạt các lợi ích như cải thiện sức khỏe đất, tăng năng suất cây trồng, giảm sự phụ thuộc vào hóa chất độc hại và tăng cường tính bền vững của hệ sinh thái nông nghiệp [ 5 , 6 ]. Các hạt nano, do các đặc tính lý hóa đặc biệt và hiệu quả tăng cường chống lại các mầm bệnh thực vật, có tiềm năng biến đổi thuốc diệt nấm thông thường [ 7 ]. Chúng mang lại một số lợi thế về hoạt động kháng khuẩn, chẳng hạn như khả năng thâm nhập vào màng tế bào và nhắm mục tiêu và tiêu diệt trực tiếp vi khuẩn do kích thước nhỏ của chúng [ 8 ]. Hơn nữa, hiệu quả của chúng có thể được tăng thêm bằng cách tùy chỉnh kích thước, hình dạng và thành phần hóa học của chúng cho các ứng dụng cụ thể [ 9 ].

Các hạt nano oxit kim loại sở hữu một số ưu điểm khiến chúng trở thành vật liệu đầy hứa hẹn cho sự phát triển của các tác nhân kháng khuẩn mới [ 10 ]. Những lợi ích này bao gồm tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cao, các đặc tính quang học, điện tử và từ tính độc đáo, độ ổn định cao, phương pháp chế tạo đơn giản và dễ dàng điều chỉnh theo kích thước, hình dạng và độ xốp mong muốn [ 11 ]. Chúng đã được chứng minh là có khả năng gây chết một loạt các sinh vật gây bệnh, bao gồm vi khuẩn [ 12 ], nấm [ 13 ], nấm oomycetes [ 14 ] và vi rút [ 15 ]. Các hạt nano oxit kim loại thể hiện hoạt tính kháng nấm đầy hứa hẹn bằng cách sản xuất quá mức các loài oxy phản ứng (ROS) [ 16 ], chẳng hạn như nhóm hydroxyl, anion superoxide và hydrogen peroxide, trong tế bào. Quá trình này làm hỏng protein và DNA của vi khuẩn và gây ra sự sụp đổ màng vi khuẩn [ 17 , 18 ]. Do đó, điều này có khả năng làm giảm khả năng phát triển khả năng kháng thuốc kháng khuẩn.

Trong số nhiều loại hạt nano oxit kim loại như bạc (Ag), selen (Se), niken (Ni), vàng (Au), titan dioxit (TiO ₂ ) và oxit sắt (Fe ₃ O ₄ ). Tuy nhiên, kẽm oxit (ZnO NP) và nano đồng oxit (CuO NP) đã thu hút sự chú ý trong lĩnh vực nông nghiệp vì các đặc tính điện tử, hóa học và vật lý độc đáo, chi phí thấp, độc tính thấp và đặc tính kháng khuẩn, cũng như là các vi chất dinh dưỡng quan trọng trong nông nghiệp [ 19 ]. Các hạt nano có thể được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như phương pháp sol-gel, thủy nhiệt, cơ hóa học, dung môi nhiệt và hóa học ướt [ 20 ]. Phương pháp kết tủa hóa học được chọn làm phương pháp tiếp cận cho nghiên cứu của chúng tôi vì nó nhanh, tự phát và yêu cầu các công cụ đơn giản và dung môi rẻ tiền [ 21 ].

Đã có một số nghiên cứu về việc sử dụng hạt nano CuO trong nấm gây bệnh thực vật, trong môi trường nuôi cấy (trong ống nghiệm ) như Alternaria citri [ 22 ], điều kiện nhà kính (trong cơ thể sống ) chống lại P. infestans [ 23 ] hoặc điều kiện ngoài đồng như Rhizoctonia solani [ 24 ]. Hoạt tính kháng nấm của ZnO đối với nấm đã được đánh giá trong ống nghiệm [ 25 ], trong cơ thể sống [ 26 ] và ngoài đồng ruộng [ 27 ]. Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, tác dụng của ZnO NP đối với sự phát triển của P. infestans vẫn chưa được nghiên cứu.

Mục đích của nghiên cứu này là tổng hợp và mô tả đặc điểm các hạt nano đồng CuO và ZnO và đánh giá hoạt động kháng nấm của chúng đối với chủng P. infestans Yemen (Pi Alharethi YEM 2021) [ 28 ] trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà kính.

Hình 1 Sơ đồ minh họa mối nguy hiểm của thuốc diệt nấm hóa học, đặc điểm lý hóa và tác dụng kháng khuẩn của hạt nano

2 Vật liệu và phương pháp

Việc chế tạo các hạt nano đồng CuO và ZnO và đặc tính của chúng được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Vật liệu tiên tiến và Công nghệ nano thuộc Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp, Ai Cập.

2.1 Chất phản ứng

Tất cả các thuốc thử được sử dụng trong nghiên cứu này đều đạt chuẩn phân tích và được sử dụng mà không cần tinh chế thêm. Kẽm sulfat heptahydrat (ZnSO4.7H2O ) _, đồng ( II) clorua dihydrat (CuCl2.2H2O ₎ và natri hydroxit ( NaOH ) được mua từ Sigma-Aldrich, Đức. Ethanol (loại HPLC, 99,99%) và nước khử ion được sử dụng để pha chế dung dịch và rửa trong suốt quá trình thí nghiệm. Tất cả các cốc thủy tinh đều được rửa nhiều lần bằng dung dịch Aqua Regia (HCl:HNO3 ₎ theo tỷ lệ 3:1. Quá trình rửa này được thực hiện để loại bỏ bất kỳ tác động nào còn sót lại của vật liệu hóa học.

2.2 Tổng hợp hạt nano

2.2.1 Tổng hợp hạt nano ZnO

Quá trình tổng hợp hạt nano ZnO được thực hiện bằng phương pháp kết tủa hóa học với quy trình được sửa đổi dựa trên công trình của Goyal và Verma [ 29 ]. Ban đầu, 36 g kẽm sulfat heptahydrat được hòa tan trong 250 ml nước cất khử ion bằng cách khuấy trong 5 phút. Trong một bình chứa riêng, 10 g viên natri hydroxit được hòa tan trong 250 ml nước khử ion, cũng bằng cách khuấy trong cùng thời gian.

Sau đó, dung dịch NaOH được thêm dần vào dung dịch kẽm sulfat heptahydrat cho đến khi pH đạt khoảng 12 ở nhiệt độ phòng, tạo thành dung dịch màu trắng trong suốt. Kết tủa thu được được rửa bằng nước khử ion và sau đó sấy khô trong lò nung không khí nóng ở 60 °C trong 24 giờ. Cuối cùng, kết tủa khô được nghiền mịn thành bột và nung trong lò nung muffle ở 400 °C trong hai giờ, sử dụng lò nung Nabertherm GmbH Model 369.396 từ Đức.

2.2.2 Tổng hợp CuO NP

Các hạt nano CuO được tổng hợp bằng quy trình kết tủa hóa học thông thường [ 30 ]. Ban đầu, 5,4 g viên natri hydroxit và 22,5 g đồng (II) clorua dihydrat được hòa tan riêng biệt trong etanol. Dung dịch natri hydroxit được khuấy liên tục ở 100 °C, trong khi dung dịch đồng (II) clorua dihydrat được khuấy ở nhiệt độ phòng. Khi đã hòa tan hoàn toàn, dung dịch natri hydroxit được nhỏ từng giọt vào dung dịch đồng (II) clorua dihydrat, đồng thời khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng. Màu của dung dịch chuyển từ xanh lục sang xanh lục lam và cuối cùng là đen khi phản ứng diễn ra.

Ngày hôm sau, kết tủa thu được được lọc bằng phương pháp lọc Buchner và sau đó rửa bằng etanol và nước khử ion cho đến khi đạt pH 7. Kết tủa sau đó được sấy qua đêm trong lò ở nhiệt độ khoảng 50 °C. Mẫu ủ được nghiền thành bột nano, sau đó được nung ở 500 °C trong bốn giờ. Quá trình này tạo ra bột tinh thể màu trắng chứa các hạt nano CuO.

2.3 Đặc tính của hạt nano

Các hạt nano tổng hợp được đặc trưng bằng một số kỹ thuật để xác định các tính chất vật liệu của chúng. Các kỹ thuật này bao gồm nhiễu xạ tia X (XRD), được sử dụng để phân tích cấu trúc tinh thể và kích thước tinh thể của các hạt nano; quang phổ UV, được sử dụng để nghiên cứu các đặc tính quang học của các hạt nano tổng hợp; phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), giúp xác định các nhóm chức năng có trong các hạt nano; và kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HRTEM), được sử dụng để kiểm tra hình thái bề mặt và các đặc điểm khác của các hạt nano tổng hợp. Các kỹ thuật này cung cấp những hiểu biết có giá trị về đặc tính cơ bản của các tính chất vật liệu của các hạt nano tổng hợp.

2.3.1 Khúc xạ tia X (XRD)

Nhiễu xạ tia X (XRD) được sử dụng để phân tích cấu trúc tinh thể và xác định kích thước tinh thể của các hạt nano tổng hợp. Cấu trúc tinh thể của oxit kẽm và oxit đồng được nghiên cứu bằng máy nhiễu xạ tia X (XPert PRO; PAN Analytical, Hà Lan) với bước sóng (λ) là bức xạ 1,5418 Å. Các mẫu bột được đặt cẩn thận trên một phiến kính và được quét trong phạm vi góc từ 4° đến 80°. Các mẫu nhiễu xạ thu được đã trải qua quá trình phân tích kỹ lưỡng bằng phần mềm X-pert HighScore Plus (phiên bản 3, Panalytical) [ 31 ] và Origin Pro (phiên bản 9.3, OriginLab) [ 32 ]. Các phân tích này nhằm xác định cấu trúc tinh thể và tạo điều kiện thuận lợi cho việc tính toán kích thước tinh thể trung bình cho cả hạt nano CuO và ZnO, sử dụng phương trình Scherrer.

D = K*(λ / b*cos 2θ)
trong đó D là kích thước tinh thể trung bình, K là hằng số bằng 0,94, λ là bước sóng của bức xạ tia X (0,154 nm), β là nửa cực đại toàn chiều rộng của đỉnh (tính bằng radian) và θ là góc Bragg (tính bằng độ).

Tỷ lệ phần trăm tinh thể được tính toán bằng cách sử dụng diện tích đỉnh và phần mềm Origin lab, theo phương trình sau:

Tỉ lệ kết tính của hạt nano (%) = (Diện tích dưới các đỉnh/Diện tích dưới mẫu)*100

2.3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HR-TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HRTEM) được sử dụng để phân tích kích thước, hình dạng và hình thái bề mặt của các hạt nano tổng hợp. Hình ảnh HRTEM được thực hiện bằng HR-TEM (JEOL, JEM-2100, Hoa Kỳ) tại Công ty Nanotech, Ai Cập. Để chuẩn bị mẫu cho phân tích, một lượng nhỏ các hạt tổng hợp được phân tán trong nước và chịu tác động của sóng siêu âm để phân tán bất kỳ chất kết tụ nào. Sau đó, một vài giọt huyền phù đã được siêu âm được phân tán lên lưới đồng phủ carbon và để khô. Sau đó, các lưới được đưa vào thiết bị HRTEM và hình ảnh được thu thập ở nhiều độ phóng đại khác nhau. Hình ảnh HRTEM thu được được phân tích bằng phần mềm Image J [ 33 ] để đo kích thước hạt nano và quan sát bất kỳ đặc điểm cấu trúc nào, chẳng hạn như viền mạng hoặc khuyết tật.

2.3.3 Phổ tử ngoại-khả kiến ​​(UV-Vis)

Phổ UV-Vis được sử dụng để nghiên cứu tính chất quang học và đặc điểm hấp thụ của các oxit nano kim loại tổng hợp. Các phép đo UV-Vis được thực hiện bằng máy [VARIAN 5000 UV-VIS-NIR, Úc] được trang bị dải bước sóng 200–800 nm.

Trước khi phân tích, dung dịch loãng oxit nano kim loại tổng hợp được chuẩn bị bằng cách phân tán một lượng nhỏ các hạt trong môi trường trong suốt. Dung dịch nước thu được sau đó được đặt trong cuvet thạch anh để đo. Nước khử ion từ Milli-Q được dùng làm dung dịch trắng để hiệu chỉnh đường nền. Phổ UV-Vis được thu được bằng cách đo độ hấp thụ của các hạt nano ở các bước sóng khác nhau.

Phổ thu được được phân tích bằng phần mềm origin để xác định các đỉnh hấp thụ. Ngoài ra, năng lượng khoảng cách dải được tính toán bằng cách sử dụng mối quan hệ Tauc [ 34 ]

αhv= (hv-Eg)ⁿ

trong đó α là hệ số hấp thụ quang học, h là năng lượng photon, α là hằng số và n là số mũ xác định loại chuyển đổi điện tử gây ra sự hấp thụ và có thể lấy giá trị là 2 hoặc 1/2, tùy thuộc vào việc chuyển đổi là trực tiếp hay gián tiếp.

2.3.4 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) là một kỹ thuật phân tích có thể được sử dụng để xác định các nhóm chức năng hiện diện trong vật liệu. Kỹ thuật này bao gồm việc đo độ hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật liệu mẫu, cung cấp thông tin giá trị về thành phần hóa học và cấu trúc của vật liệu. Các phép đo FTIR được thực hiện bằng máy quang phổ FTIR Bruker của Đức, với quét hồng ngoại được thực hiện trong phạm vi 4000–400 cm ^-1 . Việc chuẩn bị mẫu bao gồm nghiền bột hạt nano thành dạng mịn và nén thành dạng viên. Các viên sau đó được gắn trên một cửa sổ IR trong suốt để đo phổ.

2.4 Chủng nấm và điều kiện nuôi cấy

Các mẫu bị cháy sém được thu thập từ các khu vực của Trung tâm sản xuất khoai tây giống (SPPC) tại Tỉnh Ibb ở Yemen. Chủng P. infestans Pi Alharethi YEM 2021, được xác định bằng số hiệu GenBank OQ119020, đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Nó đã trải qua quá trình xác định hình thái, vi mô và di truyền, và đã được thử nghiệm trên cả thạch V8 và thạch Rye [ 28 , 35 ]. Thạch V8, thể hiện các điều kiện phát triển thuận lợi, đã được chọn để nuôi cấy P. infestans . Sau đó, phân lập được chuyển lên thạch V8 bổ sung 100 mg/L ampicillin, 20 mg/L rifampicin và 50 mg/L nystatin [ 36 ].

2.5 Thử nghiệm in vitro về hoạt tính kháng nấm của NP tổng hợp

Phương pháp được Joshi et al . [ 37 ] sử dụng để đánh giá tính chất kháng nấm của các hạt nano ZnO và nano đồng CuO (NP). Nồng độ được chọn để đánh giá hiệu quả kháng nấm của các hạt nano ZnO và CuO trong ống nghiệm là 10, 20 và 30 mg/L. Các nồng độ này được thiết lập sau khi xem xét các tài liệu trước đây và các thí nghiệm sơ bộ về hoạt tính kháng nấm của các hạt nano ZnO và CuO [ 38 , 39 ]. Hoạt tính kháng nấm của các hạt nano ZnO và CuO được xác định bằng cách đo mức độ ức chế sự phát triển của P. infestans so với đối chứng chưa xử lý. Trong thí nghiệm này, môi trường V8 được làm tan chảy và kết hợp với các dung dịch NP kim loại ở các nồng độ khác nhau (10, 20 và 30 mg/L) trong các đĩa Petri, thu được thể tích cuối cùng là 15 mL. Sau đó, một ống nghiệm nuôi cấy thuần chủng P. infestans 10 ngày tuổi (Pi Alharethi YEM2021) có đường kính 0,5 cm được đặt riêng lẻ ở giữa mỗi đĩa Petri. Các đĩa được phủ parafilm và ủ ở nhiệt độ 18 °C [ 40 ]. Mỗi nồng độ NP được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy thống kê. Việc xác định sự lặp lại được hỗ trợ bởi chương trình GPower, chương trình này xem xét mức độ tin cậy 95% khi so sánh giá trị trung bình của một nghiên cứu trước đó. Sau hai tuần, đường kính tăng trưởng và tác dụng ức chế của NP đối chứng và NP oxit kim loại đã được đo. Tỷ lệ ức chế tăng trưởng được tính bằng công thức sau:

Ức chế tăng trưởng (/%) = (D1-D2)/D1 * 100

trong đó D1 và D2 ​​lần lượt là đường kính khuẩn lạc của mẫu đối chứng và mẫu chứa hạt nano oxit kim loại.

2.6 Thiết kế thí nghiệm nhà kính

Hiệu quả của hạt nano ZnO và nano đồng CuO đã được nghiên cứu trong chậu trong điều kiện nhà kính “in vivo” tại Khoa Khoa học Sinh học, Đại học Sana’a từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2022. Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại. Củ giống khoai tây được trồng trong chậu nhựa (đường kính 50 cm, cao 25 ​​cm) chứa đất thịt pha cát, mỗi chậu một củ.

Điều kiện nhà kính duy trì phạm vi nhiệt độ từ 18–22 °C và độ ẩm tương đối từ 80–85%. Thí nghiệm bao gồm ba nhóm: nhóm đối chứng được phun một loại vắc-xin P. infestans mà không tiếp xúc với các hạt nano, nhóm ZnO NP được sử dụng ba nồng độ ZnO NP khác nhau (25, 50 và 100 mg/L), với mỗi nồng độ có ba lần lặp lại và nhóm CuO NP được sử dụng ba nồng độ CuO NP khác nhau (25, 50 và 100 mg/L), một lần nữa với mỗi nồng độ có ba lần lặp lại.

Vào ngày thứ 34 sau khi trồng, trước khi tiêm chủng, toàn bộ cây được phun ZnO và CuO NP ở nồng độ 25, 50 và 100 mg/L bằng bình xịt cầm tay (30 ml/cây). Vào ngày thứ 37 sau khi trồng, toàn bộ cây được phun chủng P. infestans (Pi Alharethi YEM 2021) với nồng độ 5 x 10⁴ bào tử/ml. Vào ngày thứ 40 sau khi tiêm chủng, toàn bộ cây được phun ZnO và nano đồng CuO NP cho đến khi lá ướt hoàn toàn, cho phép dung dịch chảy ra khỏi lá.

Tất cả các chậu đều được tưới ba lần trong suốt bảy ngày và các túi nhựa trong suốt được đặt lên trên các cây đã tiêm chủng trong 48 giờ để duy trì độ ẩm tương đối cao và thúc đẩy nhiễm nấm [ 41 ]. Mức độ nghiêm trọng của bệnh được xác định vào ngày thứ 7, 14 và 21 sau khi tiêm chủng dựa trên thang ước tính bệnh đã được sửa đổi của Henfling đối với bệnh mốc sương ở khoai tây [ 42 ] (Bảng  1 ).

Bảng 1 Thang ước tính bệnh sửa đổi của Henfling đối với bệnh mốc sương ở khoai tây

Mức độ nghiêm trọng của bệnh đã được sử dụng để xác định chỉ số mức độ nghiêm trọng của bệnh (DSI) theo tỷ lệ phần trăm,

DSI(%) = Tổng số xếp hạng riêng lẻ/(số cây được kiểm tra×thang bệnh tối đa)*100

Diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) được tính theo Madden et al . [ 43 ] như sau:

AUDPC = S_I=1^n-1 (y_i + y_i+1)*(t_i+1 – t₁)/2

trong đó “t” là thời gian tính bằng ngày tại lần quan sát thứ i, “y” là đánh giá về bệnh tại lần quan sát thứ i và “n” là tổng số lần quan sát.

Hiệu quả của ZnO và CuO NP được tính toán bằng công thức của Rewal và Jhooty [ 44 ].

Hiệu suất = (Control -T)*100/C

C là tỷ lệ nhiễm trùng ở nhóm đối chứng và T là tỷ lệ nhiễm trùng ở nhóm điều trị.

2.7 Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu đo được đều được phân tích thống kê bằng phần mềm thống kê SPSS phiên bản 25. Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) được tính toán bằng cách sử dụng chênh lệch ít có ý nghĩa nhất (LSD) ở mức xác suất 5% để so sánh các giá trị trung bình, tiếp theo là kiểm định Tukey sau thử nghiệm.

3 Kết quả

3.1 Phân tích XRD

Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) đã được thực hiện để nghiên cứu các tính chất cấu trúc của các hạt nano ZnO và CuO tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa hóa học. Phổ XRD của ZnO (Hình  2a ) cho thấy các đỉnh riêng biệt ở các góc sau: 31,8°, 34,46°, 36,29°, 47,65°, 56,6° và 62,9°. Các đỉnh này tương ứng với các mặt phẳng mạng (100), (002), (101), (102), (110), (103) và (112). Đỉnh nhiễu xạ ZnO (101) mạnh hơn nhiều so với các đỉnh khác. Điều này cho thấy các tinh thể nano ZnO được tạo thành có định hướng tinh thể (101) ưu tiên. Những phát hiện này khẳng định rằng các hạt nano ZnO tổng hợp có cấu trúc tinh thể wurtzite với hằng số mạng a = b = 3,2499 Å và c = 5,2066 Å. Các mẫu này phù hợp với các mẫu trong thẻ số 36–1451 của Ủy ban Tiêu chuẩn Nhiễu xạ Bột Liên hợp (JCPDS). Ngược lại, mẫu XRD của CuO (Hình  2 b) cho thấy các đỉnh sắc nét ở 35,6° và 38,7°, tương ứng với các mặt phẳng mạng (002) và (111). Các đỉnh nhiễu xạ CuO (002) và (111) mạnh hơn nhiều so với các đỉnh khác. Điều này chỉ ra rằng các tinh thể nano CuO được hình thành có định hướng tinh thể ưu tiên (002) và (111). Điều này chỉ ra rằng các hạt nano CuO tổng hợp có cấu trúc tinh thể đơn nghiêng với hằng số mạng a = 4,68 Å, b = 3,42 Å và c = 5,13 Å, theo thẻ JCPDS số 45–0937. Sự hiện diện của các đỉnh cường độ cao trong cả hai mẫu ZnO và CuO cho thấy rằng cả hai vật liệu đều được hình thành trong các cấu trúc tinh thể cao. Hơn nữa, không có đỉnh bổ sung nào được phát hiện trong phân tích XRD, xác nhận sự hình thành của các pha ZnO và CuO tinh khiết. Sử dụng phương trình Debye Scherrer, kích thước tinh thể trung bình được xác định là 9,7 nm đối với các hạt nano ZnO và 19 nm đối với các hạt nano đồng CuO. Độ tinh thể quan sát được của các hạt nano ZnO là 99%, trong khi độ tinh thể của các hạt nano đồng CuO là 91%, cho thấy rằng cả hai vật liệu đều thể hiện cấu trúc tinh thể cao.

Hình 2 Mẫu nhiễu xạ XRD cho a : NP ZnO và b NP CuO

3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HR-TEM)

Phân tích HR-TEM cung cấp thông tin chi tiết về kích thước, hình dạng và độ tinh thể của các hạt nano ZnO và nano đồng CuO tổng hợp. Hình ảnh TEM trong (Hình  3 a và b) cho thấy các hạt nano này có dạng hình cầu và nằm trong phạm vi kích thước từ 4–25 nm đối với ZnO và 11–25 nm đối với CuO. Biểu đồ tần suất trong (Hình  3 c và d) mô tả sự phân bố kích thước hạt tương ứng của các hạt nano ZnO và các hạt nano CuO. Kích thước trung bình của các hạt nano tổng hợp là 11,5 nm đối với ZnO và 24,5 nm đối với các hạt nano CuO. Đáng chú ý, các hạt nano ZnO có kích thước lần lượt là 9 nm, 11 nm và 12,5 nm chiếm 18%, 19% và 22% tổng số. Ngược lại, các hạt nano ZnO lớn nhất được đo có đường kính khoảng 25,5 nm, chỉ chiếm 4% tổng số. Đối với hạt nano CuO, phần lớn có kích thước nằm trong khoảng 17,5 nm, 22,5 nm và 27,5 nm, chiếm lần lượt 13%, 35% và 30% tổng số. Các hạt nano CuO lớn nhất có kích thước khoảng 42,5 nm, chỉ chiếm 2% tổng số hạt nano.

Hình 3 Phân tích TEM: a Ảnh TEM của ZnO NP; b Ảnh TEM của nano đồng CuO NP; c Biểu đồ phân bố kích thước hạt của ZnO NP; d Biểu đồ phân bố kích thước hạt của CuO NP

Hình  4a và b cho thấy ảnh TEM (HRTEM) có độ phân giải cực cao của các hạt nano ZnO và nano đồng CuO tinh khiết. Khoảng cách giữa các mặt phẳng (d-spacing) xấp xỉ 0,21 đối với các hạt nano ZnO (Hình  4c ) và 0,19 đối với các hạt nano CuO (Hình  4d ). Cường độ tương đối của các vòng SAED tương ứng với các đỉnh phổ XRD, cho thấy các hạt nano ZnO sở ​​hữu cấu trúc lục giác wurtzite.

Hình 4 Hình ảnh HRTEM của a ZnO NP; b CuO NP; c Khoảng cách giữa các mặt phẳng của ZnO NP; d Khoảng cách giữa các mặt phẳng của nano đồng CuO NP

3.3 Phân tích quang phổ UV-Vis

Phân tích UV-Vis đã được thực hiện trên các hạt nano ZnO và nano đồng CuO tổng hợp để nghiên cứu các tính chất quang học của chúng. Phân tích cho thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng ở 364 nm đối với hạt nano ZnO (Hình  5a ) và 252 nm đối với hạt nano CuO (Hình  5b ). Để xác định khoảng cách dải quang học (Eg) của các hạt nano, hệ thức Tauc [ 34 ] đã được sử dụng:

αhv= (hv-Eg)ⁿ

trong đó α là hệ số hấp thụ quang học, h là năng lượng photon, A là hằng số và n là số mũ xác định loại chuyển đổi điện tử gây ra sự hấp thụ và có thể lấy giá trị là 2 hoặc 1/2, tùy thuộc vào việc chuyển đổi là trực tiếp hay gián tiếp.

Hình 5 Phổ UV-Vis và đồ thị Tauc của: a hạt nano ZnO và b hạt nano CuO. Hình chèn trong a là đồ thị Tauc của hạt nano ZnO. Hình chèn trong b là đồ thị Tauc của hạt nano CuO.

Hệ thức Tauc là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định năng lượng khoảng cách dải từ phổ hấp thụ. Bằng cách biểu diễn hệ số hấp thụ (α) nhân với năng lượng photon (hν) theo hàm số của năng lượng photon, năng lượng khoảng cách dải có thể được ước tính từ giao điểm trên trục năng lượng, với dữ liệu chuyển tiếp cung cấp độ khớp tuyến tính chính xác nhất trong vùng biên dải với n = 2. Sử dụng hệ thức này, khoảng cách dải quang học của các hạt nano ZnO tổng hợp được tính toán là 3,86 eV (hình nhỏ trong Hình  5a ), trong khi đối với các hạt nano CuO, nó được xác định là 3,83 eV (hình nhỏ trong Hình  5b ).

3.4 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Phân tích FT-IR được tiến hành để nghiên cứu các rung động phân tử và nhóm chức năng có trong các hạt nano ZnO và nano đồng CuO tổng hợp.

Trong phổ FTIR của các hạt nano ZnO (Hình  6a ), một số đỉnh hấp thụ đáng kể đã được quan sát thấy. Chúng bao gồm các đỉnh ở 3724 cm ^-1 , 3607 cm ^-1 3400 cm^-1, 2967 cm ^– 1, 2875 cm^-1, 2273 cm ^-1, 1651 cm ^-1, 1516 cm ^-1, 1178 cm ^-1 và 582 cm ^-1

Hình 6Phổ FTIR của: a hạt nano ZnO và b hạt nano CuO

Các đỉnh hấp thụ tại 3724 cm ^-1 và 3607 cm ^-1 được quy cho dao động uốn O–H, chỉ ra sự hiện diện của một lượng nhỏ H ₂ O trong các hạt nano ZnO. Dải rộng tại 3400 cm ^-1 và đỉnh tại 1651 cm ^-1 có liên quan đến dao động kéo giãn OH. Các đỉnh hấp thụ tại 2967 cm ^-1 và 2875 cm ^-1 được gán cho dao động kéo giãn CH. Đỉnh hấp thụ tại 2273 cm ^-1 chỉ ra sự hiện diện của các phân tử CO ₂ trong không khí xung quanh. Các đỉnh tại 1516 cm ^-1 và 1178 cm ^-1 tương ứng với dao động kéo giãn của các liên kết C–C–C và C–O. Cuối cùng, đỉnh ở 582 cm ^-1 trong vùng vân tay đã xác nhận rung động kéo dài Zn–O, cung cấp bằng chứng cho sự hình thành cấu trúc wurtzite của ZnO NP.

Trong phổ FTIR của các hạt nano CuO (Hình  6b ), đặc điểm dải hấp thụ đã được quan sát. Đỉnh tại 599 cm ^-1 chỉ ra sự hình thành cấu trúc nano CuO. Các đỉnh xung quanh 3724 cm ^-1 và 3599 cm ^-1 được quy cho dao động uốn cong O-H do độ ẩm khí quyển. Đỉnh tại 2271 cm ^-1 biểu thị sự hiện diện của các phân tử CO2 _từ không khí xung quanh. Các dải dao động tại 2883 cm ^-1 và 1499 cm ^-1 được gán cho sự kéo giãn CH.

3.5 Hoạt tính kháng nấm trong ống nghiệm của ZnO và CuO NP đối với P. infestans

Hoạt tính kháng nấm của các hạt nano ZnO và CuO (NP) đối với chủng P. infestans (Pi Alharethi YEM2021) được nuôi cấy trên môi trường V8 đã được đánh giá bằng cách sử dụng các nồng độ khác nhau của hạt nano ZnO và CuO (10, 20 và 30 mg/L) so với đối chứng. Sau hai tuần ủ, khả năng ức chế sự phát triển của P. infestans đã được đánh giá, và kết quả được tóm tắt trong Bảng  2 và Hình  7 .

Bảng 2 Sự phát triển xuyên tâm trong ống nghiệm và sự ức chế của P. infestans bằng các hạt nano CuO và ZnO

Hình 7 Hiệu quả của CuO và ZnO NP ở nồng độ 30 mg/L đối với sự phát triển của sợi nấm của P. infestans phân lập so với đối chứng không xử lý. a Đối chứng, b ZnO NP và c nano đồng CuO NP

Nồng độ cao nhất (30 mg/L) của hạt nano ZnO và CuO đạt hiệu quả ức chế đáng kể 100% sự phát triển theo hướng xuyên tâm của P. infestans . Ở nồng độ 20 mg/L, hạt nano ZnO và CuO cho thấy tỷ lệ ức chế tăng trưởng đáng kể lần lượt là 79,1% và 76,3%. Tương tự, ở nồng độ 10 mg/L, hạt nano ZnO và CuO cho thấy tỷ lệ ức chế đáng kể lần lượt là 64,2% và 60,4%. Những phát hiện này cho thấy hoạt tính kháng nấm của hạt nano ZnO và CuO phụ thuộc vào nồng độ, với mối tương quan thuận giữa hiệu quả và nồng độ.

Phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa tất cả các nồng độ hạt nano ZnO và CuO khi so sánh với nhóm đối chứng. Hơn nữa, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) giữa nồng độ hạt nano ZnO 10 mg/L và hạt nano ZnO 20 mg/L, cũng như giữa hạt nano ZnO 20 mg/L và hạt nano ZnO 30 mg/L. Tuy nhiên, trong số tất cả các nồng độ hạt nano đồngCuO khác nhau, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nào được quan sát thấy giữa các nồng độ tương tự của hạt nano ZnO và hạt nano CuO.

3.6 Hiệu quả của ZnO và CuO NP chống lại P. infestans trong điều kiện nhà kính

Hiệu quả của các hạt nano ZnO và CuO (NP) trong việc kiểm soát bệnh mốc sương ở cây khoai tây nhà kính đã được đánh giá và kết quả được trình bày trong Bảng  3. Việc xử lý bằng các hạt nano ZnO ở nồng độ 100 mg/L cho thấy hiệu quả ức chế cao nhất đối với P. infestans , với hiệu quả là 70,64%. Các hạt nano CuO ở nồng độ 100 mg/L cho thấy hiệu quả thấp hơn một chút là 68,8%. Tương tự, các hạt nano ZnO ở nồng độ 50 mg/L và các hạt nano CuO ở nồng độ 50 mg/L cho thấy tỷ lệ phần trăm hiệu quả lần lượt là 47% và 46% khi so sánh với nhóm đối chứng không được xử lý.

Bảng 3 Tác dụng của ZnO và CuO NP đối với chủng P. infestans (Pi Alharethi YEM) trên cây khoai tây về mức độ nghiêm trọng của bệnh, hiệu quả và AUDPC trong điều kiện nhà kính

Tuy nhiên, nồng độ thấp hơn (25 mg/L) của cả ZnO và CuO NP không ức chế đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh mốc sương so với nhóm đối chứng. Cần lưu ý rằng hiệu quả ức chế của cả ZnO và CuO NP đều tăng dần theo nồng độ, cho thấy phản ứng phụ thuộc vào nồng độ.

Phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào trong việc ngăn ngừa sự phát triển của P. infestans giữa nồng độ hạt nano ZnO và nano đồng CuO tương tự ở hai nhóm. Điều này cho thấy cả hai loại hạt nano đều thể hiện hiệu quả tương đương trong việc kiểm soát bệnh mốc sương.

Hơn nữa, nghiệm thức đối chứng có giá trị Diện tích dưới Đường cong Tiến triển Bệnh (AUDPC) cao nhất là 565,2, cho thấy mức độ nghiêm trọng của bệnh cao nhất. Ngược lại, giá trị AUDPC thấp nhất là 243,1 được ghi nhận ở nghiệm thức sử dụng ZnO NP ở nồng độ 100 mg/L. Tiếp theo là CuO NP ở nồng độ 100 mg/L, ZnO NP ở nồng độ 50 mg/L và nano đồng CuO NP ở nồng độ 50 mg/L, với giá trị AUDPC lần lượt là 249,2, 386,8 và 391,6.

4 Thảo luận

Do thách thức ngày càng tăng do nấm kháng thuốc diệt nấm truyền thống, nên việc tạo ra các phương pháp sáng tạo, thân thiện với môi trường để kiểm soát bệnh nấm ở thực vật là một động lực quan trọng. Các hạt nano oxit kim loại được coi là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn để kiểm soát nấm gây bệnh thực vật trong nông nghiệp [ 45 , 46 ].

Những phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh tính chất kháng nấm đầy hứa hẹn của các hạt nano oxit kẽm (ZnO) và nano đồng (CuO) tổng hợp trong bối cảnh quản lý bệnh mốc sương ở khoai tây. Cả nghiên cứu in vitro và in vivo đều cho thấy những kết quả khả quan, cho thấy các hạt nano này có thể đóng vai trò là tác nhân hiệu quả chống lại nấm Phytophthora infestans, tác nhân gây bệnh mốc sương.

Những quan sát của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu trước đây của Giannousi et al . [ 23 ] , những người đã chứng minh hiệu quả của các hạt nano đồng CuO trong việc giảm thiểu bệnh mốc sương ở cà chua. Hơn nữa, việc sử dụng các hạt nano ZnO làm chất chống nấm mới đã được nghiên cứu sâu rộng trong các tài liệu [ 47 , 48 , 49 ]. Đáng ngạc nhiên là, mặc dù mối quan tâm ngày càng tăng đối với các hạt nano ZnO, nhưng không có báo cáo nào được ghi chép cụ thể về hiệu quả của chúng đối với bệnh mốc sương khoai tây do P. infestans gây ra. Nghiên cứu của chúng tôi thu hẹp khoảng cách này bằng cách cung cấp bằng chứng về tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc quản lý bệnh.

Các hạt nano oxit kim loại đã thu hút sự chú ý nhờ hoạt tính kháng nấm của chúng, bao gồm cả P. infestans. Elsharkawy và cộng sự [ 39 ] đã chứng minh tác dụng ức chế của Ag2O _và Ag2O _/ TiO2 _đối với P. infestans trong nhiều điều kiện khác nhau, bao gồm phòng thí nghiệm, nhà kính và ngoài đồng ruộng. Tương tự, Khan và cộng sự [ 38 ] đã nhấn mạnh hiệu quả của hạt nano oxit sắt trong việc kiểm soát mầm bệnh trong ống nghiệm. Ngoài ra, Wang và cộng sự [ 50 ] đã báo cáo rằng các hạt nano oxit magie (hạt nano MgO) bảo vệ khoai tây hiệu quả khỏi mầm bệnh mốc sương ngay cả ở liều lượng thấp 50 µg/mL.

Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) đã xác nhận thành công bản chất tinh thể của cả hạt nano ZnO và CuO. Kết luận này xuất phát từ sự hiện diện của các đỉnh mạnh trong các mẫu hình XRD tương ứng của từng vật liệu. Điều quan trọng là kích thước tinh thể trung bình được xác định trong nghiên cứu này là 9,7 nm đối với hạt nano ZnO và 19 nm đối với hạt nano CuO. Các giá trị này phù hợp với các nghiên cứu trước đây, nhất quán với kết quả của Bhandari và cộng sự [ 51 ] đối với hạt nano ZnO và Amin và cộng sự [ 52 ] đối với hạt nano CuO.

Phân tích TEM cho thấy sự hình thành các hạt nano ZnO và CuO ổn định, chủ yếu ở dạng bán cầu, với một số mức độ kết tụ. Kích thước hạt trung bình được xác định là 11,5 nm đối với hạt nano ZnO và 24,5 nm đối với hạt nano CuO. Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây được thực hiện trên hạt nano ZnO của Raliya và Tarafdar [ 53 ] và Shamhari và cộng sự [ 54 ] , cũng như trên hạt nano CuO của Dagher và cộng sự [ 55 ] và Wongrakpanich và cộng sự [ 56 ].

Các vòng nhiễu xạ quan sát được trong ảnh SAED tương ứng với các đỉnh quan sát được trong giản đồ XRD, cung cấp bằng chứng cho cấu trúc lục giác wurtzite của các hạt nano ZnO và cấu trúc tinh thể đơn nghiêng của các hạt nano CuO. Hình dạng và kích thước của các hạt nano rất quan trọng đối với hoạt động chống lại các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn. Các hạt nano có kích thước nhỏ hơn có thể dễ dàng xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn và phá vỡ thành tế bào, sau đó ngăn chặn sự nhân lên của chúng[ 57 ].

Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) được thực hiện trên các hạt nano ZnO tổng hợp cho thấy đỉnh hấp thụ ở số sóng 582 cm ^-1 . Tương tự, phân tích FTIR của các hạt nano CuO cho thấy đỉnh hấp thụ ở số sóng 599 cm ^-1 . Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã khảo sát các hạt nano ZnO và CuO, trong đó cũng ghi nhận các đỉnh hấp thụ nằm trong phạm vi cụ thể này [ 58 , 59 ].

Ngoài ra, phân tích FTIR cho thấy sự hiện diện của tạp chất H2O _và CO2 _có nguồn gốc từ môi trường xung quanh. Sự xuất hiện này được cho là do quá trình oxy hóa bề mặt hạt nano, dẫn đến sự hình thành các hydroxit kim loại hoặc các loại oxit-hydroxit có khả năng hấp thụ các phân tử nước.

Việc phát hiện tạp chất CO ₂ , đặc biệt là gần 2273 cm-1 trong cả hạt nano ZnO và nano đồng CuO, cho thấy sự tiếp xúc với không khí hoặc độ ẩm, phù hợp với những phát hiện từ các nghiên cứu của Hlaing et al. [ 60 ] và Varghese et al. [ 61 ]. Ngoài ra, các đỉnh quan sát được xung quanh 3724 cm-1 trong cả quang phổ ZnO và CuO được cho là do dao động uốn cong O–H gây ra bởi độ ẩm trong khí quyển, như được hỗ trợ bởi các nghiên cứu trước đó [ 62 , 63 ].

Phân tích phổ tử ngoại-khả kiến ​​(UV-Vis) cho thấy các đỉnh hấp thụ ở 364 nm, tương ứng với hạt nano ZnO, và ở 252 nm, tương ứng với hạt nano CuO. Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã báo cáo các đỉnh hấp thụ tương đương trong dải bước sóng này.

Giá trị khoảng cách dải của các hạt nano đề cập đến sự chênh lệch năng lượng giữa dải hóa trị và dải dẫn của vật liệu. Các đỉnh hấp thụ sắc nét quan sát được ở 364 nm và 252 nm xác nhận sự hình thành các hạt nano ZnO và CuO (NP). Ngoài ra, có sự dịch chuyển xanh đáng kể trong sự hấp thụ excitonic của các hạt NP đã chế tạo so với các hạt NP khối. Sự dịch chuyển xanh này trong sự hấp thụ kích thích cho thấy rõ ràng tính chất giam cầm lượng tử của các hạt NP [ 64 , 65 ].

Đáng chú ý, các khoảng trống dải tính toán cho ZnO NP và CuO NP được xác định lần lượt là 3,86 eV và 3,83 eV. Các giá trị này lớn hơn các giá trị khoảng trống dải được báo cáo cho ZnO khối (3,37 eV) và CuO (3,5 eV) [ 66 , 67 ]. Sự gia tăng khoảng trống dải có thể là do sự giảm kích thước hạt của ZnO NP và CuO NP [ 68 ]. Hiện tượng này là do sự chuyển đổi electron từ dải hóa trị sang dải dẫn [ 69 ]. Giá trị khoảng trống dải cao hơn có lợi cho các ứng dụng quang xúc tác. Khi tiếp xúc với tia UV, cả ZnO và CuO NP đều thể hiện hoạt động quang xúc tác tăng lên, dẫn đến việc tạo ra các loài oxy phản ứng (ROS) [ 70 ].

Hình  8 cung cấp tổng quan toàn diện về các cơ chế hoạt động liên quan đến các hạt nano oxit kim loại. Các cơ chế này có thể được tóm tắt như sau: Thứ nhất, các hạt nano oxit kim loại can thiệp vào tính toàn vẹn của màng tế bào, có khả năng gây tổn hại đến chức năng tế bào [ 71 ]. Thứ hai, các hạt nano này tạo ra các loài oxy phản ứng (ROS) như superoxide, ion hydroxyl, gốc hydroxyl và hydrogen peroxide, góp phần gây ra stress oxy hóa và tổn thương tế bào [ 72 , 73 ]. Thứ ba, các hạt nano oxit kim loại có khả năng liên kết với protein và DNA, gây ra những thay đổi về cấu trúc và suy giảm chức năng [ 18 ]. Cuối cùng, các hạt nano oxit kim loại, chẳng hạn như ZnO NP và CuO NP, giải phóng các ion kim loại (Zn ²⁺ và Cu ²⁺ ), có thể ảnh hưởng thêm đến các quá trình của tế bào [ 74 ].

Hình 8 Sơ đồ cơ chế tác động có thể có của các hạt nano oxit kim loại chống lại P. infestans

Trong nghiên cứu in vitro của chúng tôi, cả hạt nano đồng CuO và hạt nano ZnO đều thể hiện hiệu quả kháng nấm đáng kể ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, ức chế hiệu quả sự phát triển xuyên tâm trung bình của P. infestans so với nhóm đối chứng. Đáng chú ý, hoạt tính kháng nấm cao nhất được quan sát thấy ở nồng độ 30 mg/L cho cả hai loại hạt nano, và hiệu quả giảm dần khi nồng độ giảm.

Việc đánh giá vật liệu nano trong các thí nghiệm nhà kính có ý nghĩa tối quan trọng. Những đánh giá này cung cấp những hiểu biết quý giá về tiềm năng ứng dụng thực tế và hậu quả môi trường của vật liệu nano. Các thí nghiệm nhà kính đóng vai trò là nền tảng thiết yếu để nghiên cứu tác động của vật liệu nano lên cây trồng trong điều kiện được kiểm soát chính xác. Bằng cách điều chỉnh các biến số như nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng, các nhà nghiên cứu có thể đánh giá toàn diện hiệu quả của vật liệu nano trong việc bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh và các tác nhân gây stress môi trường.

Trong các thí nghiệm nhà kính của chúng tôi, chúng tôi đã tiến hành ứng dụng các hạt nano ZnO và nano đồng CuO (NP) trước và sau khi tiêm chủng mầm bệnh. Kết quả cho thấy mức độ nghiêm trọng của bệnh giảm đáng kể khi sử dụng NP ZnO ở nồng độ 100 mg/L, thể hiện tỷ lệ hiệu quả là 70,64% đối với P. infestans so với nhóm đối chứng. Tương tự, NP CuO ở nồng độ 100 mg/L cũng cho thấy mức độ nghiêm trọng của bệnh giảm đáng kể, với hiệu quả là 69%. Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Elmer et al . [ 75 ], trong đó báo cáo về việc giảm thành công nhiều loại bệnh nấm khác nhau, bao gồm bệnh héo rũ do nấm Fusarium ở cà chua và bệnh héo rũ do nấm Verticillium, thông qua việc sử dụng NP ZnO và NP CuO.

Ngoài ra, Ritmontree và Kongtragoul [ 76 ] nhận thấy ZnO NP có hiệu quả chống lại Phytophthora palmivora . Hơn nữa, trong các thử nghiệm trong nhà kính, Chen et al . [ 77 ] đã chứng minh rằng việc sử dụng CuO NP ở mức 100 mg/L có hiệu quả làm giảm Phytophthora nicotianae.

Hơn nữa, như được chỉ ra trong Hình  9 , việc sử dụng ZnO NP ở mức 100 mg/L cho thấy tỷ lệ tăng thấp nhất về mức độ nghiêm trọng của bệnh theo thời gian, tiếp theo là CuO NP ở mức 100 mg/L, ZnO NP ở mức 50 mg/L, CuO NP ở mức 50 mg/L, ZnO NP ở mức 25 mg/L và CuO NP ở mức 25 mg/L.

Hình 9 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý đến mức độ nghiêm trọng của bệnh mốc sương theo thời gian trong điều kiện nhà kính

Kết quả cho thấy tỷ lệ ức chế sự phát triển của P. infestans tăng lên khi nồng độ hạt nano ZnO và nano đồng CuO (NP) cao hơn. Ngoài ra, người ta còn quan sát thấy rằng hạt nano ZnO có kích thước hạt nhỏ hơn (11,5 nm) cho thấy khả năng ức chế cao nhất so với hạt nano đồng CuO (24,5 nm). Phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu của Sirelkhatim và cộng sự [ 71 ] và Lai và cộng sự [ 78 ], cho thấy kích thước của vật liệu nano đóng vai trò quan trọng trong tác dụng của chúng đối với vi khuẩn. Các hạt nano nhỏ hơn đã được phát hiện có hoạt tính kháng nấm mạnh hơn các hạt nano lớn hơn.

Điều này có thể là do tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích lớn hơn của chúng, giúp tăng cường liên kết tại nhiều vị trí mục tiêu trên màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến phá vỡ tính toàn vẹn của tế bào, giải phóng các ion kim loại (Zn ²⁺ và Cu ²⁺ ) [ 74 ] và tạo ra các loài oxy phản ứng (ROS) [ 16 ]. ROS được tạo ra có thể bao gồm các gốc hydroxyl (OH•), các ion superoxide (O2•) và oxy đơn (1O2), gây ra quá trình peroxy hóa lipid và cuối cùng dẫn đến chết tế bào [ 17 ]. Tryfon et al. [ 79 ] đã chứng minh rằng các NR ZnO@OAm tổng hợp dẫn đến giảm hiệu quả của phức hợp phát triển oxy (OEC), kèm theo sự gia tăng tạo ra các loài oxy phản ứng (ROS) và giảm hiệu quả quang hóa của Hệ thống quang hợp II (PSII).

Sự hòa tan của các hạt nano dẫn đến việc sản xuất các ion kim loại như Zn ²⁺ và Cu ²⁺ [ 74 , 80 ], liên kết nhanh với các phân tử sinh học như protein và carbohydrate, do đó ức chế các quá trình vi sinh vật quan trọng [ 81 ]. Joe et al. [ 82 ] đã phát hiện ra rằng hoạt động kháng khuẩn của ZnO NP trong điều kiện tối, loại trừ tác động của các loài oxy phản ứng (ROS), chủ yếu là do sự phá vỡ thành tế bào vi sinh vật bởi ZnO NP và sự gia tăng nồng độ ion Zn2+ trong tế bào chất của vi sinh vật.

Trong các thí nghiệm của mình, chúng tôi quan sát thấy hạt nano ZnO mạnh hơn hạt nano đồng CuO. Sự khác biệt này có thể là do kích thước hạt nano ZnO nhỏ hơn (11,5 nm) so với hạt nano đồng CuO (24,5 nm). Không giống như những phát hiện của Franklin và cộng sự [ 83 ] , những người không quan sát thấy tác động phụ thuộc vào kích thước, nhiều nghiên cứu đã chứng minh ảnh hưởng đáng kể của kích thước hạt lên hoạt tính kháng khuẩn.

Năng lượng khoảng cách dải của các hạt nano oxit kẽm (ZnO) và nano đồng (CuO) đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hoạt tính kháng nấm của chúng. Giá trị khoảng cách dải cao hơn đã được phát hiện có liên quan đến hoạt tính kháng nấm tăng lên, như Yassin và cộng sự đã ghi nhận [ 84 ]. Trong một nghiên cứu do Amuthavalli và cộng sự thực hiện [ 85 ], các hạt nano ZnO với khoảng cách dải trực tiếp là 3,4 eV đã được chế tạo và thể hiện cả đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm. Tương tự, Roy và Rhim đã tổng hợp các hạt nano đồng CuO với khoảng cách dải trực tiếp là 3,4 eV, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh [ 86 ].

Nhìn chung, có vẻ như có một mối quan hệ quan trọng giữa kích thước hạt nano và tác động của chúng đối với vi khuẩn, như Yamamoto [ 87 ] và Siddiqi et al . [ 71 ] đã nhấn mạnh. Theo quan điểm này, nghiên cứu của chúng tôi làm nổi bật hiệu quả của các hạt nano ZnO và CuO như những giải pháp thay thế khả thi cho thuốc diệt nấm độc thực vật để quản lý bệnh mốc sương.

Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi thừa nhận một hạn chế đáng kể liên quan đến việc thiếu nhóm đối chứng dương tính. Mặc dù chúng tôi đã so sánh chặt chẽ hoạt tính kháng nấm của ZnO và CuO NP với nhóm đối chứng âm tính, mục tiêu chính của chúng tôi là đánh giá hiệu quả của ZnO và CuO NP như một tác nhân kháng nấm. Đáng chú ý, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên về hiệu quả của ZnO NP đối với P. infestans , cả in vitro và in vivo. Bằng cách loại trừ nhóm đối chứng dương tính, chúng tôi muốn phân lập tác dụng của ZnO và nano đồng CuO NP mà không bị ảnh hưởng bởi các chất kháng nấm khác.

Đối chứng âm tính đóng vai trò là đường cơ sở, cho phép chúng tôi đánh giá liệu các hạt nano ZnO và nano đồng CuO có biểu hiện hoạt tính kháng nấm vượt trội so với hoạt tính kháng nấm thông thường hay không. Mặc dù thiết kế nghiên cứu của chúng tôi cố tình bỏ qua đối chứng dương tính, chúng tôi nhận thấy tầm quan trọng của các nghiên cứu trong tương lai có kết hợp đối chứng dương tính. Những nghiên cứu như vậy có thể cung cấp sự so sánh toàn diện hơn và xác nhận những phát hiện của chúng tôi.

5 Kết luận

Nghiên cứu này phát hiện ra rằng các hạt nano kẽm ZnO và nano đồng CuO có hoạt tính kháng nấm đáng kể đối với P. infestans , nguyên nhân gây bệnh mốc sương khoai tây. Cả hạt nano ZnO và nano đồng CuO đều có hiệu quả cả trong ống nghiệm và trong cơ thể sống. Do đó, các hạt nano này có thể được coi là một chất thay thế an toàn và thân thiện với môi trường cho thuốc diệt nấm hóa học trong việc quản lý bệnh mốc sương khoai tây. Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là nghiên cứu này chỉ mang tính chất ngắn hạn, giới hạn ở các thí nghiệm trong ống nghiệm và trong cơ thể sống. Do đó, việc tiến hành các nghiên cứu thực địa dài hạn cùng với việc so sánh với các loại thuốc diệt nấm hiện đang được sử dụng và đánh giá độc tính thực vật của hạt nano ZnO và nano đồng CuO trên cây khoai tây là những bước cần thiết để xác nhận độ tin cậy của các phát hiện của chúng tôi trong điều kiện thực tế.

Nguồn Zinc oxide and copper oxide nanoparticles as a potential solution for controlling Phytophthora infestans, the late blight disease of potatoes