Nano kẽm oxit tác động đến việc loại bỏ phốt pho trong hệ thống SBR
Tác động của các hạt nano kẽm oxit (ZnO NPs) đối với việc loại bỏ phốt pho và cộng đồng vi sinh vật đã được nghiên cứu sau khi tiếp xúc lâu dài với SBR mô phỏng. Các NPN ZnO ở nồng độ thấp (1, 5 mg L −1 ) không gây ra tác động rõ ràng đến việc loại bỏ phốt pho, nhưng hiệu quả loại bỏ giảm tương ứng 20% và 75% khi có mặt 10 và 20 mg L −1 ZnO NPs. Ở những nồng độ này, nano kẽm oxit ức chế hoạt động của exopolyphosphatase (PPX) và polyphosphat kinase (PPK) và sản xuất chất cao phân tử ngoại bào (EPS) và phá hủy tính toàn vẹn của màng tế bào. Phân tích giải trình tự thông lượng cao cho thấy 20 mg L −1 Các NP của ZnO đã dẫn đến sự giảm độ đa dạng của quần xã một cách rõ ràng và sự thay đổi cấu trúc quần xã. Ngoài ra, việc tiếp xúc với 10 và 20 mg L −1 ZnO NP dẫn đến giảm tỷ lệ Betaproteobacteria và Rhodocyclales (sinh vật tích tụ polyphosphate, PAO) trong cộng đồng và dẫn đến sự thúc đẩy sự phát triển của Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria (glycogen sinh vật tích lũy, GAO). Những phát hiện này cho thấy một cách có ý nghĩa các tác động bất lợi của NP đối với bùn hoạt tính trong xử lý nước thải.
(Bản Quyền NanoCMM Technology)
1. Giới thiệu
Một lượng lớn vật liệu nano, ví dụ như kẽm oxit (ZnO), đã được sử dụng trong nhiều sản phẩm thương mại, công nghiệp và tiêu dùng. Không thể tránh khỏi, một số hạt nano kẽm oxit (ZnO NP) đi vào các nhà máy xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt (WWTPs). NP có thể độc hơn các hạt lớn hơn có cùng thành phần vì diện tích bề mặt riêng lớn và hiệu ứng kích thước duy nhất của chúng [1,2,3]. Nhiều nghiên cứu xác nhận rằng các NP ZnO có trong bùn thải và nước thải. Theo báo cáo do USEPA ban hành năm 2009, một cuộc kiểm tra 84 nhà máy xử lý nước thải cho thấy hàm lượng kẽm trong chất rắn sinh học nhà máy xử lý nước thải là 8,55 g / kg-SS [4]. Các cuộc điều tra ở Trung Quốc vào năm 2011 (tổng số 139 nhà máy XLNT) và năm 2009 (tổng số 107 nhà máy XLNT) cho thấy nồng độ trung bình của Zn trong chất rắn sinh học là 1,03 g / kg-SS và nồng độ tối đa là 9,14 g / kg-SS [ 5,6].
Loại bỏ phốt pho thường đạt được thông qua loại bỏ phốt pho sinh học tăng cường (EBPR). Trong điều kiện yếm khí, các sinh vật tích tụ polyphosphat (PAO) hấp thụ các hợp chất hữu cơ trong nước thải (chẳng hạn như axit béo chuỗi ngắn) và lưu trữ chúng dưới dạng polyhydroxyalkanoat nội bào (PHA) bằng cách sử dụng năng lượng và các chất khử tương đương (NADH2). Thủy phân polyphosphat, dẫn đến giải phóng phốt pho yếm khí và sự phân hủy glycogen tạo ra năng lượng và NADH2 tương ứng. Sau đó, PHA được lưu trữ sẽ bị oxy hóa bởi PAOs để tạo ra năng lượng cho sự phát triển, duy trì tế bào và hấp thụ phốt pho trong giai đoạn hiếu khí tiếp theo. Vì sự hấp thụ phốt pho hiếu khí lớn hơn sự giải phóng kỵ khí, nên việc loại bỏ phốt pho ròng đạt được bằng cách thải lượng bùn dư thừa.
Ai cũng biết rằng NP có khả năng kháng khuẩn [7]. Do đó, mối quan tâm về việc liệu các nano kẽm oxit có tác động tiêu cực đến chức năng của vi sinh vật trong các nhà máy xử lý nước thải hay không. Các nghiên cứu đã giải quyết vấn đề này [8,9,10] báo cáo rằng sự gia tăng của NP Ag cho thấy không có ảnh hưởng đáng kể đến EBPR trong cả thí nghiệm ngắn hạn và dài hạn. Tuy nhiên, quá trình loại bỏ photpho bị giảm do nồng độ Ag + tăng đột ngột, nhưng nó được phục hồi dần sau quá trình nuôi cấy lâu dài. Người ta cũng nhận thấy rằng hiệu suất loại bỏ phốt pho đã giảm xuống 48,8% ở 1 mg /L Ag +, và không có phốt pho ròng nào bị loại bỏ ở > 2 mg/L Ag + trong các thử nghiệm hàng loạt [11]. Sự hấp thụ của các nguồn cacbon trong nước thải và sự chuyển hóa kỵ khí và hiếu khí của phốt pho, PHA và glycogen bị ức chế bởi Ag + hơn là Ag NP. Ag + cho thấy độc tính mạnh hơn đối với PAO so với sinh vật tích lũy glycogen (GAO). Zheng và cộng sự. [12] nhận thấy rằng việc loại bỏ phốt pho không nhạy cảm với các NP SiO2 1 và 50 mg /L sau khi tiếp xúc cấp tính hoặc mãn tính. Các yếu tố quan trọng liên quan đến việc loại bỏ phốt pho sinh học không bị thay đổi đáng kể, chẳng hạn như hoạt động của exopolyphosphatase (PPX) và polyphosphate kinase (PPK) và sự biến đổi nội bào của PHA và glycogen. Người ta thấy rằng các NP 1 và 50 mg /L TiO2 không có tác dụng cấp tính đối với việc loại bỏ nitơ và phốt pho trong nước thải sau khi tiếp xúc ngắn hạn (1 ngày). Nồng độ 50 mg /L TiO2 NP không ảnh hưởng đến việc loại bỏ phốt pho sinh học sau khi tiếp xúc lâu dài (70 d), mặc dù hiệu suất loại bỏ nitơ tổng số (TN) đã giảm từ 80,3% xuống 24,4% [12].
Các NPN ZnO thể hiện độc tính đáng kể đối với bùn hoạt tính ở nồng độ thấp so với các NP khác [13] (Mu và cộng sự, 2011). Không giống như nhiều NP khác, khả năng hòa tan nhẹ của NPN ZnO có thể góp phần làm cho nó có độc tính cao hơn [14]. Người ta thấy rằng các NP ZnO gây ra khả năng lắng của bùn hoạt tính kém và việc loại bỏ nitơ và phốt pho giảm đáng kể theo thời gian. Cộng đồng vi khuẩn trong bùn hoạt tính cũng trở nên ít đa dạng hơn sau khi tiếp xúc với các NP ZnO. Nó cho thấy rằng mặc dù hiệu quả loại bỏ COD và NH4 + -N không bị giảm khi bổ sung ZnO NP hoặc chỉ giảm nhẹ, cộng đồng vi khuẩn chức năng đã thay đổi đáng kể. Zheng và cộng sự. [12] đã tiến hành nghiên cứu phơi nhiễm ngắn hạn để xác định xem liệu các NP ZnO có gây ra các tác động bất lợi đến việc loại bỏ nitơ và phốt pho sinh học trong SBR không khí hậu kỵ khí-oxy hòa tan thấp không. Phát hiện của họ cho thấy rằng, so với việc không có các NPN ZnO, sự có mặt của các NPN ZnO 10 và 50 mg /L làm hiệu quả loại bỏ TN giảm từ 81,5% xuống 75,6% và 70,8%, và nồng độ phốt pho trong nước thải tăng từ mức không thể phát hiện được lên 10,3 và 16,5 mg /L, tương ứng, cao hơn phốt pho đầu vào (9,8 mg /L). Người ta thấy rằng sự ức chế loại bỏ nitơ và phốt pho gây ra bởi nồng độ cao hơn của các NP ZnO chủ yếu là do sự giải phóng các ion kẽm từ sự hòa tan của các NP ZnO và sự gia tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS), làm giảm hoạt động của nitrat reductase. , PPX và PPK. Chen và cộng sự. [10] tập trung vào ảnh hưởng của các NP ZnO đối với cộng đồng vi khuẩn chức năng trong xử lý nước thải. Họ phát hiện ra rằng mặc dù hiệu quả loại bỏ NH4 + -N không hoặc chỉ giảm nhẹ, các loài liên quan đến quá trình khử nitơ đã bị ức chế bởi 5 mg /L ZnO NP, bao gồm các loài Diaphorobacter, các loài Thauera và những loài trong nhóm Sphaerotilus-Leptothrix. Tuy nhiên, các vi khuẩn liên quan đến hiện tượng phồng bùn (Haliscomenobacter hydrossis), kháng kim loại nặng (Zoogloea ramigera) và hấp thụ sinh học (Methyloversatilis Universalis) đã tăng lên khi xử lý bằng ZnONPs. Người ta cũng kết luận rằng các NP ZnO làm giảm nhẹ việc loại bỏ TN. Hơn nữa, trong các quy trình SBR mô phỏng, việc nhập liên tục các NP ZnO vào nước thải làm giảm sự loại bỏ NH4 + -N bằng cách ức chế quá trình hô hấp của vi sinh vật nitrat hóa [15].
Một số nghiên cứu đã báo cáo tác động tiềm tàng của các NP ZnO đối với việc loại bỏ phốt pho sinh học và cộng đồng vi sinh vật. Trọng tâm của nghiên cứu này là xác định ảnh hưởng của các NP ZnO đối với việc loại bỏ phốt pho sinh học và cộng đồng vi sinh sau khi tiếp xúc lâu dài bằng cách sử dụng kỹ thuật giải trình tự thông lượng cao trong lò phản ứng giải trình tự hiếu khí-yếm khí (SBR). Hoạt động của một số enzym quan trọng liên quan đến loại bỏ phốt pho sinh học và sản xuất EPS và tính toàn vẹn của màng sinh chất đã được đo lường thêm để khám phá các tác động tiềm tàng của các NP ZnO đối với bùn hoạt tính.
2. Chất liệu và phương pháp
2.1. Huyền phù hạt nano
Huyền phù ZnO NP được sản xuất thương mại (1,7 g /L, kích thước hạt <100 nm) được mua từ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Hoa Kỳ). Trước khi sử dụng, huyền phù ZnO NP được chuẩn bị bằng cách pha 1 mL ZnO NP (1,7 g /L) vào 1 L nước đã khử ion, sau đó là 1 giờ sonication (25 ℃, 250 W, 40 kHz). Kích thước hạt trung bình trong huyền phù dự trữ được đo nằm trong khoảng từ 30 đến 60 nm bằng phương pháp phân tích tán xạ ánh sáng động (DLS) thông qua Malvern Autosizer (4700, Malvern Instruments, UK). Theo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM), các NP của ZnO có hình cầu.
2.2. Hoạt động SBR
Lò phản ứng được cấy bùn hoạt tính thông thường lấy từ Nhà máy xử lý nước thải thành phố Taiping Harbin, Cáp Nhĩ Tân, Trung Quốc. Tất cả các lò phản ứng đều được cấp nước thải tổng hợp chứa các thành phần sau: NH4 + -N (NH4Cl), 30-50 mg /L; COD (đường sucrose), 350-450 mg /L; KH2PO4, 30 mg /L; MgSO4⋅7H2O, 50 mg / Đất; CaCl2⋅2H2O, 10 mg /L. Bùn hoạt tính đã được nuôi cấy thành công với nước thải tổng hợp. Bùn hoạt tính được nuôi trong SBR với thể tích làm việc là 4 L, được vận hành để loại bỏ nitơ sinh học. SBR được vận hành ở 25-28 ℃ với ba chu kỳ mỗi ngày. Mỗi chu kỳ (8 giờ) bao gồm 5,6 giờ sục khí, sau đó là 1 giờ lắng, 15 phút để gạn và 1 giờ không tải. PH đầu vào được điều chỉnh đến 7,5 bằng cách thêm NaOH, NaHCO3 và HCl. Không khí được cung cấp không liên tục bằng cách sử dụng bộ điều khiển bật / tắt với bộ dò DO trực tuyến để duy trì DO ở mức thích hợp. Bùn thải được lãng phí để giữ thời gian lưu chất rắn (SRT) ở khoảng 22 ngày để duy trì tỷ lệ chất rắn lơ lửng dễ bay hơi ở dạng lỏng (MLVSS) và chất rắn lơ lửng dạng lỏng hỗn hợp (MLSS). Cụ thể là MLVSS / MLSS, ở mức 0,75. Lò phản ứng được trộn liên tục với máy khuấy ngoại trừ trong giai đoạn lắng, gạn và không tải. Sau khoảng ba tháng, hiệu suất loại bỏ phốt pho ổn định (> 90,0%) đã đạt được.
2.3. Nano kẽm oxit tiếp xúc với bùn hoạt tính
Một đối chứng và bốn nồng độ thử nghiệm (1, 5, 10 và 20 mg /L) của các NP ZnO đã được kiểm tra trong các thí nghiệm phơi nhiễm. Nồng độ liên quan đến môi trường của tổng số NP trong các nhà máy xử lý nước thải là từ 1 đến 5 mg /L theo đó [16]. Bởi vì việc giải phóng NPs ra môi trường có thể tăng lên khi sản xuất quy mô lớn, ảnh hưởng tiềm tàng của các NP ZnO nồng độ cao hơn 10 và 20 mg /L cũng đã được nghiên cứu. Hai bình phản ứng SBR có thể tích làm việc là 4 L mỗi bình được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm. Mỗi chu kỳ (8 giờ) bao gồm 2 giờ kỵ khí và 4 giờ hiếu khí, tiếp theo là 1 giờ lắng, 10 phút để gạn và 50 phút không tải. Bùn thải được lãng phí để giữ thời gian lưu chất rắn (SRT) ở khoảng 22 ngày. Mỗi lò phản ứng SBR được thiết lập ba lần để đảm bảo kết quả đáng tin cậy. Sau khi bổ sung các NP ZnO, tất cả đều đo được xu hướng thay đổi của phốt pho trong mỗi chu kỳ hoạt động (8 giờ) và thời gian dài hạn (10 ngày).
2.4. Phương pháp phân tích
2.4.1. Các phương pháp phân tích.
Việc xác định photphat hòa tan (SOP) được thực hiện theo các phương pháp tiêu chuẩn. Việc đo lường các hoạt động của enzym Polyhydroxyalkanoate (PHA), Exopolyphosphatase (PPX) và Polyphosphate kinase (PPK), và glycogen, tốc độ hô hấp, sản xuất EPS và tính toàn vẹn của màng sinh chất được tiến hành theo tài liệu [7,17].
2.4.2. Tách chiết DNA và giải trình tự Illumina.
Hai mươi mililit hỗn hợp bùn hoạt tính từ lò phản ứng được ly tâm ở 12000 g trong 10 phút ở 6-10 ℃, và kết tủa được trộn lại thành 30 mL. Quá trình này được lặp lại hai lần. Bùn hoạt tính đã được xử lý trước được hòa tan trong 15 mL dung dịch đệm TE. Số lượng lớn DNA bộ gen được chiết xuất bằng cách sử dụng natri dodecyl sulfat (SDS) và hexadecyltrimethyl amoni bromide (CTAB), và các sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose (1% w / v) trong đệm Tris / borate / EDTA (TBE). Tổng số DNA bộ gen từ các mẫu vi sinh lần đầu tiên được chiết xuất và tinh sạch bằng Bộ phân lập DNA PowerSoil (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) theo quy trình của nhà sản xuất và sau đó được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1% và được bảo quản ở -20 ° C cho đến khi sử dụng . 16 gen S rRNA được khuếch đại bằng mồi mã vạch 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 ‘) / 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’) như sau: biến tính ban đầu ở 95 ° C trong 3 phút, 28 chu kỳ 95 ° C cho 30 giây, 55 ° C trong 30 giây, 72 ° C trong 45 giây, tiếp theo là phần kéo dài cuối cùng 72 ° C trong 10 phút và 10 ° C cho đến khi người dùng tạm dừng. Mỗi hỗn hợp phản ứng 20 μl bao gồm 4 μl dung dịch đệm FastPfu 5 ×, 2 μl hỗn hợp deoxynucleoside triphosphat (dNTP) (mỗi loại 2,5 mM), 10 ng DNA mẫu, 0,8 μl mồi mã vạch 5 μM 515F, 0,8 μl của 5 Mồi mã vạch μM 907R, với H2O được tăng gấp đôi được bổ sung thành 20 μl. Các sản phẩm PCR được hình dung trên gel agarose và được trộn theo tỷ lệ với nhau theo khối lượng trước khi giải trình tự trên máy sắp xếp trình tự để bàn Illumina Miseq sử dụng bộ dụng cụ 250 bp đầu cặp tại Thượng Hải (majorbio), Trung Quốc. Các trình tự thô đã được tối ưu hóa và các trình tự chất lượng thấp đã được loại bỏ bằng cách sử dụng Mothur (http://www.mothur.org). Tóm lại, Mothur được sử dụng để cắt các trình tự mã vạch và mồi, đồng thời loại bỏ các trình tự ngắn hơn 200 bp, có một hoặc nhiều cơ sở không rõ ràng và có điểm chất lượng thấp hơn 25. Các chuỗi được nhóm lại thành Đơn vị phân loại hoạt động (OTU) với mức độ giống nhau về trình tự 97% bằng cách sử dụng Mothur. Độ phong phú của loài, chỉ số đa dạng (tức là OTU được quan sát, công cụ ước tính Chao1, chỉ số Shannon, chỉ số Simpson và công cụ ước tính độ bao phủ dựa trên mức độ phong phú (ACE)) và các đường cong độ hiếm thu được bằng cách sử dụng Mothur, ở ngưỡng chênh lệch 3%. Để so sánh sự đa dạng của cộng đồng giữa các mẫu dựa trên thông tin phát sinh loài, công cụ trực tuyến Fast UniFrac (http://unifrac.colorado.edu/) đã được sử dụng để ước tính số liệu UniFrac có trọng số và thực hiện phân tích tọa độ chính (PcoA). Hơn nữa, một bản đồ nhiệt đã được thực hiện thông qua việc sử dụng bản đồ nhiệt gói R (http://www.r-project.org/). Trình tự gen 16S rRNA được lưu trữ trong Kho lưu trữ đọc trình tự NCBI theo số gia nhập.
2.4.3. Phân tích giải phóng lactate dehydrogenase (LDH).
Tính toàn vẹn màng tế bào của bùn hoạt tính được đo thông qua xét nghiệm giải phóng lactate dehydrogenase (LDH). Hoạt động LDH được xác định bằng cách sử dụng bộ phát hiện độc tính tế bào (Tiangen, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi xử lý phơi nhiễm, mẫu hỗn hợp được ly tâm ở 12 000 g trong 5 phút. Sau đó, phần nổi phía trên được gieo vào đĩa 96 giếng, tiếp theo là thêm 50 µL hỗn hợp chất nền (Tiangen). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút trong bóng tối, 50 µL dung dịch dừng (Tiangen) được thêm vào mỗi giếng, và độ hấp thụ được ghi lại ở bước sóng 490 nm bằng đầu đọc vi tấm (BioTek).
2.5. Phân tích thống kê
Tất cả các phép thử được thực hiện ba lần và kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Phân tích phương sai (ANOVA) được sử dụng để xem xét ý nghĩa của các kết quả và p <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit đối với việc loại bỏ Phốt pho sinh học
Ảnh hưởng của các NP ZnO đến hàm lượng PHA và glycogen trong quá trình loại bỏ phốt pho sinh học trong SBR được thể hiện trong Hình 1A và Hình 1B. Nó chỉ ra rằng hàm lượng (% / MLVSS) của PHA và glycogen đều giống với hàm lượng của đối chứng khi nồng độ tiếp xúc của các NP ZnO là 1 mg /L. So với đối chứng, khi tăng nồng độ các NP ZnO lên 5, 10 và 20 mg /L, thì hàm lượng PHA đã tăng từ 7,01% lên 7,33%, 7,42% và 7,59%, tương ứng khi kết thúc kỵ khí. và nó đã được tăng lần lượt từ 2,90% lên 3,07%, 3,22% và 3,39% vào cuối giai đoạn hiếu khí. Nó chỉ ra rằng nồng độ các NP ZnO cao hơn có thể làm tăng hàm lượng PHA. Như thể hiện trong Hình 1B, so với đối chứng, hàm lượng glycogen giảm từ 9,51% xuống 9,11%, 8,58% và 8,14%, tương ứng ở cuối giai đoạn yếm khí ở các nồng độ ZnO NPs là 5, 10 và 20 mg /L. Tuy nhiên, hàm lượng glycogen lần lượt tăng từ 12,02% lên 12,44%, 12,95% và 13,37% vào cuối giai đoạn hiếu khí. Nó chỉ ra rằng các NP ZnO ở nồng độ cao hơn có thể cải thiện hoạt động của PAO bằng cách thúc đẩy sự phân hủy và tổng hợp glycogen.
Hình 1. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit NP ZnO đến hàm lượng PHA và glycogen trong bùn hoạt tính trong SBR trong một chu kỳ. PHA (A); glycogen (B)
Theo báo cáo, sự gia tăng hàm lượng PHA là do tổng hợp PHV [18], được tạo ra trong quá trình phân hủy glycogen bởi GAOs. Sự gia tăng PHV chứng tỏ sự gia tăng hoạt động của GAO, phù hợp với những thay đổi về glycogen đã nêu ở trên. Do đó, các PAO mất đi lợi thế cạnh tranh so với GAO, dẫn đến ảnh hưởng bất lợi của nồng độ các NP ZnO cao hơn đối với việc loại bỏ phốt pho. Ảnh hưởng của các NP ZnO đối với sự giải phóng phốt pho trong giai đoạn yếm khí và loại bỏ phốt pho trong nước thải được nghiên cứu như trong Hình 2A và Hình 2B. Có thể thấy rằng với sự hiện diện của 1 và 5 mg /L ZnO NP, sự giải phóng SOP trong giai đoạn kỵ khí là tương đối ổn định và tương tự như đối chứng.
Hình 2. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit NP ZnO đến sự giải phóng phốt pho trong giai đoạn yếm khí và loại bỏ phốt pho của SBR.
Hiệu quả loại bỏ phốt pho gần như là 100%, điều này cho thấy rằng nồng độ thấp của các NP ZnO (1, 5 mg /L) không có tác dụng phụ đáng kể đối với việc loại bỏ phốt pho. Tuy nhiên, việc giải phóng SOP trong giai đoạn kỵ khí đã giảm lần lượt 20% và 27% khi các nano kẽm oxit 10 và 20 mg /L tiếp xúc với SBR. Ngoài ra, SOP trong nước thải tăng từ mức không thể phát hiện lên lần lượt là 1,95 ± 0,3 mg /L và 6,20 ± 0,2 mg /L. Các kết quả trên cho thấy rằng các NP ZnO 10 và 20 mg /L dẫn đến hiệu suất kém của việc loại bỏ phốt pho sinh học.
3.2. Ảnh hưởng của các NP ZnO đến hoạt động của bùn hoạt tính
Sự loại bỏ phốt pho liên quan trực tiếp đến hoạt động của PPX và PPK. Như thể hiện trong Hình 3A, với sự gia tăng của nồng độ ZnO NPs, sự ức chế các hoạt động của PPX và PPK được tăng cường. Đối với 1, 5, 10 và 20 mg / L của ZnO NP, tỷ lệ ức chế đối với PPX tương ứng là 1,21%, 3,25%, 10,27% và 28,05%, và tỷ lệ ức chế đối với PPK là 1,32%, 4,13%, Lần lượt là 11,15% và 30,13%. Sự khác biệt về số lượng hoạt động của enzyme rất hạn chế vì đơn vị đo hoạt tính của enzyme rất nhỏ (0,006-0,00 OD / mg protein). Do đó, nó cho thấy rằng việc bổ sung các NP ZnO 1 và 5 mg / L không gây ra tác dụng ức chế PPX và PPK. Trong khi đó, các NP ZnO 10 và 20 mg / L ức chế đáng kể hoạt động của PPX và PPK bằng cách ảnh hưởng đến chức năng bình thường của PAO.
Các chất cao phân tử ngoại bào (EPS) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào. Kết quả chỉ ra rằng các NP ZnO 1 và 5 mg / L không có ảnh hưởng xấu đến năng suất EPS trong hệ thống bùn hoạt tính, và trên thực tế, năng suất EPS đã tăng lần lượt là 4,4% và 7,8% (Hình 3B). Việc bổ sung 10 và 20 mg / L ZnO NP làm giảm sản xuất EPS, và tỷ lệ giảm tương ứng là 13,3% và 27,7%. Sản xuất EPS và chuyển hóa tế bào có liên quan chặt chẽ với nhau. Việc bổ sung các NPN ở nồng độ cao hơn (10, 20 mg / L) làm giảm năng suất EPS, cho thấy các NP ZnO dẫn đến sự ức chế sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự phân hủy của chất nền bên ngoài, và nồng độ càng cao thì sự ức chế càng lớn. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit NP ZnO đến tính toàn vẹn của màng tế bào của bùn hoạt tính đã được nghiên cứu bằng cách xác định sự giải phóng LDH. Như thể hiện trong Hình 3C, việc tiếp xúc với các NPN ZnO 1 và 5 mg / L gây ra sự gia tăng nhẹ mức LDH, cho thấy rằng nồng độ thấp của các NPN ZnO gây ra một chút tổn thương cho màng tế bào và ít rò rỉ tế bào chất. Tuy nhiên, so với đối chứng (2,99U / L), việc tiếp xúc với các NP ZnO 10 và 20 mg / L dẫn đến sự gia tăng mức LDH tương ứng khoảng 300% và 600%, cho thấy rằng nồng độ các NP ZnO cao hơn gây ra làm hỏng tính toàn vẹn của màng tế bào và dẫn đến sự rò rỉ đáng kể của tế bào chất. Tốc độ hô hấp của bùn hoạt tính được xác định bằng đường lắp bình phương nhỏ nhất. Như trong hình 3D, nhịp độ hô hấp của mỗi hệ thống lần lượt là 77,54, 80,14, 85,53, 66,31 và 46,87 mg O2 / L / h. Kết quả chỉ ra rằng việc tiếp xúc với các NP ZnO 1 và 5 mg / L không gây ức chế tốc độ hô hấp của bùn hoạt tính. Ngược lại, hô hấp lại có chút tăng cường. Với sự hiện diện của 10 và 20 mg / L ZnO NP, hô hấp bị ức chế lần lượt là 14,5% và 39,6% so với đối chứng. Nó cho thấy rằng nồng độ thấp của các nano kẽm oxit NP ZnO (1, 5 mg / L) có thể cải thiện một chút tốc độ hấp thụ oxy, cho thấy rằng vi sinh vật có thể tự điều chỉnh để thích nghi và chống lại tác động độc hại của các nano kẽm oxit NP ZnO, nhưng 10 và 20 mg / L ZnO NPs rõ ràng có thể ức chế quá trình hô hấp sinh học của bùn hoạt tính bằng cách ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất bình thường của vi sinh vật.
Hình 3. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit đến hoạt động của bùn hoạt tính. (A) Hoạt động của PPX và PPK; (B) Sản lượng EPS; (C) Mức LDH; (D) Tốc độ hô hấp.
3.3. Ảnh hưởng của các NP ZnO đối với cộng đồng sinh vật
3.3.1. Ảnh hưởng của các VQG ZnO đến sự phong phú và đa dạng của các loài trong quần xã.
Nồng độ phơi nhiễm của các NP ZnO là 0, 1, 5, 10 và 20 mg / L và thời gian tiếp xúc là 10 ngày. Năm hệ thống tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của các NP ZnO được thêm vào được đánh dấu là P0, P1, P5, P10 và P20. Sau khi tiếp xúc lâu dài với các NP ZnO, các mẫu bùn được phân tích bằng trình tự thông lượng cao để đánh giá tác động của các NP ZnO đối với cộng đồng vi sinh vật. Trình tự 35507, 39105, 35258, 30013 và 35859 lần lượt thu được từ các hệ thống P0, P1, P5, P10 và P20, tất cả đều có chiều dài trên 400 base và có thể được sử dụng trong phân tích.
Hình 4. Biểu đồ OTU-VEEN dựa trên phân tích giải trình tự thông lượng cao. P0, P1, P5, P10 và P20 lần lượt đại diện cho hệ thống tiếp xúc với các NP ZnO 0, 1, 5, 10 và 20 mg / L.
Các trình tự này được nhóm lại theo sự giống nhau (0,97), và mỗi nhóm là một đơn vị phân loại hoạt động (OTU). Biểu đồ VENN (Hình 4) cho thấy số lượng OTU trong các mẫu khác nhau. Số OTU của các hệ thống P0, P1, P5, P10 và P20, lần lượt là 6255, 5029, 5359, 5979 và 4910.
Chỉ số đa dạng alpha phản ánh sự đa dạng của cộng đồng vi sinh vật trong bùn hoạt tính. Bảng 1 cho thấy thống kê đa dạng alpha cho năm mẫu. Các chỉ số Chao1 và Ace được sử dụng để ước tính tổng số loài sinh vật trong quần xã bằng cách sử dụng các phương pháp tính toán khác nhau. Số lượng OTU và độ phong phú của loài trong các mẫu có mối tương quan thuận. Các chỉ số Shannon và Simpson được sử dụng để ước tính sự đa dạng của vi sinh vật trong hệ thống bùn hoạt tính. Chỉ số Shannon càng cao thì độ đa dạng của quần xã vi sinh vật càng cao. Ngược lại, chỉ số Simpson thấp hơn thể hiện sự đa dạng cao hơn của cộng đồng. Ngoài ra, dựa trên phân tích trình tự thông lượng cao, độ hiếm của độ phong phú được lập biểu đồ để chỉ ra sự phong phú của các loài trong bùn hoạt tính (Hình 2, Dữ liệu bổ sung).
Như Hình S2, Hình 4 và Bảng 1 cho thấy, được sắp xếp theo thứ tự giảm dần, sự đa dạng cộng đồng của các hệ thống khác nhau là P10, P0, P5, P1 và P20 theo thứ tự. Chỉ số Simpson của P0, P1 và P5 rất gần nhau; do đó, việc bổ sung các NP ZnO 1 và 5 mg / L không gây ra ảnh hưởng bất lợi rõ ràng nào đến sự đa dạng của cộng đồng. Việc bổ sung 10 mg / L ZnO NP làm tăng tính đa dạng của cộng đồng sinh vật, điều này cho thấy rằng bùn hoạt tính có khả năng tự điều chỉnh để chống lại độc tính của các NP ZnO. Tuy nhiên, cú sốc của 20 mg / L ZnO NPs là quá lớn để vi sinh vật có thể chịu đựng được; do đó, sự đa dạng của cộng đồng sinh vật là thấp nhất khi tiếp xúc với 20 mg / L ZnO NP.
Các loài đã được phân loại và sự phong phú của hệ thực vật được thu thập theo kết quả giải trình tự. Dựa trên ma trận phong phú, một bản đồ nhiệt lượng phong phú đã được vẽ. Bản đồ nhiệt phản ánh thông tin phong phú của hệ thực vật theo bóng của màu sắc. Như trong Hình S3 (Dữ liệu bổ sung), mỗi hàng đại diện cho một loại thực vật, mỗi cột đại diện cho một mẫu và khối màu thể hiện sự phong phú của loài. Màu đỏ biểu thị mức độ dồi dào thấp và màu xanh lam cho thấy mức độ dồi dào cao. Theo bản đồ nhiệt, mức độ phong phú của hệ thực vật đã được thể hiện trong Hình S4 (Dữ liệu bổ sung).
Hình 5 cho thấy sự khác biệt về cụm giữa các mẫu. Phần bên trái của hình thể hiện cây phân cụm của năm mẫu. Các vi khuẩn trong các mẫu này càng giống nhau thì khoảng cách trong cây cụm giữa các mẫu càng nhỏ. Từ khoảng cách giữa năm mẫu trong cây chùm, có thể kết luận rằng cộng đồng của hệ thống bùn hoạt tính đã thay đổi sau khi bổ sung các NP ZnO. Nồng độ các NP ZnO cao hơn có tác động mạnh hơn đến sự thay đổi cộng đồng.
Hình 5. Cây cụm ở cấp thứ tự cho năm mẫu. P0, P1, P5, P10 và P20 lần lượt đại diện cho hệ thống tiếp xúc với các nano kẽm oxit 0, 1, 5, 10 và 20 mg / L.
Theo Hình S3, Hình S4 và Hình 5, sự khác biệt về hệ thực vật giữa năm mẫu có thể được tìm thấy rõ ràng và cây bìm bịp được vẽ như Hình 6 cho thấy. Có thể thấy rằng có hai nhánh cộng đồng A và B. nhánh A chứa P0 và một nhánh con C (chứa P1 và P5) cũng như nhánh B chứa P10 và P20. Về mặt lý thuyết, vị trí gần hơn thể hiện sự giống nhau hơn về sự phân bố của hệ thực vật trong ô cây bray. Có thể quan sát thấy P1 có sự phân bố hệ thực vật tương tự với P5 ở nhánh phụ C và P0 có sự phân bố tương tự với nhánh phụ C. Ngoài ra, ở nhánh B, sự phân bố của hệ thực vật của P10 cũng tương tự như ở P20, nhưng khác nhiều so với P0, P1 và P5. Phân tích trên đã chứng minh rằng sự phân bố của hệ thực vật đã bị thay đổi khi bùn hoạt tính tiếp xúc với ZnO NP ở tất cả các nồng độ 1, 5, 10 và 20 mg / L so với đối chứng. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với các NP ZnO 1 và 5 mg / L gây ra ảnh hưởng nhẹ đến sự phân bố của hệ thực vật, nhưng việc tiếp xúc với các NP ZnO 10 và 20 mg / L dẫn đến ảnh hưởng đáng kể đến điều đó.
Hình 6. Cây Bray của quần xã bùn hoạt tính. P0, P1, P5, P10 và P20 lần lượt đại diện cho hệ thống tiếp xúc với các nano kẽm oxit NP ZnO 0, 1, 5, 10 và 20 mg / L.
3.3.2 Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit đến cấu trúc quần xã.
Kết quả của việc xác định trình tự thông lượng cao được thể hiện trong Bảng 1, Bảng 2 và Bảng 3, đại diện cho sự phân bố của cộng đồng vi sinh vật ở các cấp độ loài, lớp và thứ tự, tương ứng.
Bảng 1 Thống kê đa dạng alpha cho năm mẫu
Như Bảng 2 cho thấy, phân tích trình tự thông lượng cao trên trình tự cDNA của gen 16S rRNA cho thấy hai phyla phổ biến, đó là Proteobacteria và Bacteroidetes được lấy từ tất cả năm hệ thống bùn hoạt tính. Một số khác biệt có thể được quan sát thấy trong sự phân bố của vi khuẩn ưu thế trong các mẫu khác nhau. Với sự gia tăng của nồng độ ZnO NPs, tỷ lệ vi khuẩn Proteobacteria trong mẫu nhìn chung đã tăng lên. Proteobacteria là vi khuẩn quan trọng nhất trong hệ thống bùn hoạt tính, và nhiều vi khuẩn cố định nitơ và vi khuẩn tích tụ phốt pho là các chủng Proteobacteria [19]. Việc bổ sung các NP ZnO đã ức chế đáng kể hoạt động của Bacteroidetes. Người ta đã báo cáo rằng Bacteroidetes phân hủy các hydrocacbon thơm đa vòng (PAHs) và các phân tử sinh học chịu lửa [20]. Trong quần xã, tỷ lệ vi khuẩn giảm khi nồng độ của các NP ZnO tăng lên. Tỷ lệ Bacteroidetes là 22,13% trong thử nghiệm đối chứng, nhưng nó đã giảm xuống còn 12,37% trong hệ thống chứa 20 mg / L ZnO NPs. Có một số khác biệt giữa các mẫu về sự phân bố của các phyla khác nhau, trong đó sự khác biệt về vi khuẩn Actinobacteria là rõ ràng. Hoạt động của vi khuẩn Actinobacteria đã được tăng cường đáng kể khi bổ sung các nano kẽm oxit, và tỷ lệ của nó đã được tăng lên trên quy mô lớn, từ 2,25% lên 8,24%. Vi khuẩn Actinobacteria là vi khuẩn dị dưỡng, hầu hết các chủng tạo ra H2S trong môi trường nuôi cấy và có thể khử nitrat thành nitrit. Việc bổ sung ≤20 mg / L các NP ZnO có thể thúc đẩy quá trình khử nitơ, điều này phù hợp với các phát hiện trước đó [15]. Việc bổ sung các nồng độ thí nghiệm của ZnO NP gây ra tác động tối thiểu đến sự phong phú của Nitrospira.
Lưu ý: P0, P1, P5, P10 và P20 lần lượt đại diện cho hệ thống tiếp xúc với các NP ZnO 0, 1, 5, 10 và 20 mg/L.
Như được trình bày trong Bảng 3 và Bảng 4, trong các vi khuẩn Phylum Proteobacteria phong phú nhất, phân lớp beta đặc biệt chiếm ưu thế, chiếm khoảng 20%. Trong lớp vi khuẩn Betaproteobacteria chiếm ưu thế, loài Rhodocyclales chiếm ưu thế.
Người ta kết luận rằng các sinh vật liên quan đến nhóm giống Rhodocyclus trong phân lớp Proteobacteria beta là loài chiếm ưu thế nhất chịu trách nhiệm loại bỏ phốt pho sinh học trong SBR [21], phù hợp với các kết quả thí nghiệm này. Tỷ lệ Betaproteobacteria và Rhodocyclales đã giảm trong các hệ thống với việc bổ sung các NP ZnO 10 và 20 mg / L, điều này phù hợp với hiệu quả loại bỏ phốt pho kém. Các kết quả về sự phong phú của vi khuẩn cho thấy cácnano kẽm oxit đóng một vai trò trong việc thúc đẩy sự phát triển của Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria. Nhà nghiên cứu đã lưu ý rằng trong một lò phản ứng loại bỏ phốt pho sinh học đã xuống cấp, các trình tự chiếm ưu thế nhất được liên kết với phân lớp alpha và beta của Proteobacteria, được coi là GAO. Nó chỉ ra rằng các NP ZnO đã cải thiện sự phát triển của GAO ở một mức độ nhất định. Trong hệ thống loại bỏ phốt pho sinh học, có sự cạnh tranh giữa PAO và GAO cho chất nền carbon. Phù hợp với các kết quả thử nghiệm này, bùn hoạt tính tiếp xúc với các NP ZnO 10 và 50 mg / L cho thấy sự thay đổi lớn hơn về PHA tổng và glycogen trong cả giai đoạn kỵ khí và DO thấp, và sự chuyển hóa glycogen cao hơn cho thấy sự chuyển hóa của GAO có thể được kích hoạt.
Lưu ý: P0, P1, P5, P10 và P20 lần lượt đại diện cho hệ thống tiếp xúc với các nano kẽm oxit 0, 1, 5, 10 và 20 mg/L.
4. Kết luận
Việc bổ sung các NP ZnO 1 và 5 mg / L không cho thấy ảnh hưởng rõ ràng đến hiệu quả loại bỏ phốt pho sau khi tiếp xúc lâu dài. Tuy nhiên, sự hiện diện của các NP ZnO 10 và 20 mg / L đã ức chế sự giải phóng SOP kỵ khí trung bình và việc loại bỏ phốt pho của SBR bị giảm. Nó được tiết lộ rằng việc tiếp xúc với các nano kẽm oxit NP ZnO 10 và 20 mg / L gây ra sự ức chế đáng kể đối với hoạt động của PPX và PPK, và sản xuất EPS, tốc độ hô hấp cũng như phá hủy tính toàn vẹn của màng tế bào. Phân tích trình tự thông lượng cao cho thấy sự khác biệt đáng kể trong cộng đồng vi sinh vật ở cấp độ ngành, lớp và bậc khi có mặt các NP ZnO 10 và 20 mg / L. Một sự thay đổi đã xảy ra với sự phong phú của các loài chiếm ưu thế (Proteobacteria ， Bacteroidetes và Actinobacteria). Việc tiếp xúc với các nano kẽm oxit NP ZnO 10 và 20 mg / L dẫn đến giảm tỷ lệ Betaproteobacteria và Rhodocyclales (PAOs) trong cộng đồng và dẫn đến việc thúc đẩy sự phát triển của Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria (GAOs). Điều này giải thích hiệu quả loại bỏ phốt pho kém do các nano kẽm oxit NP ZnO gây ra.
Nguồn tham khảo: The impact of zinc oxide nanoparticles on phosphorus removal and the microbial community in activated sludge in an SBR
S.T. Wang*, W.Q. Wang, Z.R. Zhang and H. You