Nano Astaxanthin tăng cường khả năng hấp thu tế bào, hoạt động chống oxy hóa và hạ đường huyết trong nhiều dòng tế bào
Astaxanthin là sắc tố caroten tự nhiên, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe và dinh dưỡng con người. Tuy nhiên, cơ thể con người có khả dụng sinh học thấp của astaxanthin do khả năng hòa tan kém trong pha nước. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều chế các hạt nano astaxanthin bằng phương pháp nhũ hóa/bay hơi dung môi và sau đó đánh giá khả dụng sinh học của nano astaxanthin cho các ứng dụng y sinh. Kết quả cho thấy việc sử dụng kết hợp cremophor RH40 làm chất hoạt động bề mặt và copolyme polylactic glycol–polylactic làm chất đóng gói đã tạo ra các hạt nano astaxanthin được xác định rõ ràng với hàm lượng astaxanthin 5%. Các hạt nano này thể hiện hình thái hình cầu với đường kính hạt trung bình là 90 nm. Nanoastaxanthin có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao và cải thiện đáng kể sự hấp thu của tế bào so với astaxanthin tự do. Các hạt nano Astaxanthin cho thấy không có độc tính tế bào đối với các tế bào HT29, HepG2 và RAW264.7 ở nồng độ lên tới 500 μg/mL và thậm chí còn cho thấy tác dụng bảo vệ tế bào mạnh hơn đối với tổn thương tế bào HepG2 oxy hóa do H2O2 gây ra ở nồng độ 50 và 100 μg/mL. Ngoài ra, hoạt động của các enzyme chống oxy hóa (catalase và glutathione peroxidase) và biểu hiện gen của Nrf2, HO-1 và NQO1 tăng lên phụ thuộc vào nồng độ, trong khi mức độ mRNA của Keap1 giảm đáng kể trong các tế bào được ủ bằng nanoastaxanthin so với nhóm astaxanthin và nhóm đối chứng. Hơn nữa, tế bào gan và đại thực bào RAW264.7 ở chuột được xử lý bằng nanoastaxanthin, nhưng không phải bằng astaxanthin tự do, được chứng minh là làm giảm sự tích tụ lipid trong tế bào so với các tế bào đối chứng thông qua việc thay đổi biểu hiện của các gen chủ chốt trong chuyển hóa lipid (LDLR, CYP7A1, FAS, PPARα, CPT- 1 và LXRα trong tế bào HepG2 và ABCA1 và G1 trong tế bào RAW264.7). Kết quả của chúng tôi nêu bật tiềm năng to lớn của nanoastaxanthin đối với các ứng dụng trong dinh dưỡng và sức khỏe con người.
Giới thiệu
Astaxanthin là chất màu được phân loại là carotenoid, có giá trị kinh tế cao. Nó có thể được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật dưới nước, bao gồm cá hồi, tôm, cua và thậm chí cả trứng cá. Astaxanthin cũng có thể được tổng hợp bởi một số vi sinh vật, đặc biệt là vi tảo nước ngọt Haematococcus pluvialis có thể tích lũy astaxanthin lên tới 4-6% sinh khối khô [1]. Astaxanthin là một chất chống oxy hóa và hoạt tính chống oxy hóa của nó có thể cao gấp 10 lần so với các carotenoid khác, cụ thể là zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và β-carotene [2].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin hoạt động như một chất bảo vệ chống lại các tổn thương do oxy hóa trong quá trình oxy hóa thông qua các cơ chế khác nhau như loại bỏ các gốc tự do để ức chế phản ứng dây chuyền, trung hòa oxy nhóm đơn, bảo vệ cấu trúc màng tế bào bằng cách ức chế peroxid hóa lipid, tăng cường hệ thống miễn dịch và điều hòa gen. biểu thức [3]. Choi và cộng sự. [4] đã công bố rằng việc bổ sung astaxanthin (5–20 mg/ngày) làm giảm các dấu ấn sinh học do stress oxy hóa bao gồm malondialdehyd và isoprostane, làm tăng superoxide dismutase và tổng khả năng chống oxy hóa ở người trưởng thành mắc tình trạng thừa cân và béo phì.
Trong nghiên cứu ex vivo trên 24 tình nguyện viên (tuổi trung bình 28,2 tuổi), tiêu thụ 3,6 mg/ngày astaxanthin trở lên giúp giảm quá trình oxy hóa LDL [5]. Ngoài ra, astaxanthin cũng được báo cáo là có tác dụng ức chế tăng lipid máu và hội chứng chuyển hóa trong các thí nghiệm in vitro và in vivo cũng như trên các thử nghiệm trên người [[6], [7], [8], [9]]. Ở chuột bị loại bỏ Apolipoprotein E được nuôi bằng chế độ ăn nhiều chất béo và cholesterol, việc bổ sung astaxanthin làm tăng nồng độ mRNA của thụ thể LDL (LDLR), Carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT-1), acetyl-CoA carboxylase β (ACC) và acyl-CoA oxydase (ACO), dẫn đến cải thiện chuyển hóa cholesterol và chất béo trung tính (TG) [6].
Trong nghiên cứu về việc sử dụng astaxanthin có đối chứng giả dược trên 61 đối tượng không béo phì có TG huyết thanh lúc đói là 120–200 mg/dl và không mắc bệnh tiểu đường và tăng huyết áp, việc bổ sung astaxanthin 12 và 18 mg/ngày làm giảm đáng kể nồng độ TG, và ở mức 6 và 18 mg/ngày. 12 mg, lượng HDL-cholesterol tăng lên đáng kể. Nồng độ adiponectin trong huyết thanh cũng tăng do tác dụng của astaxanthin (12 và 18 mg/ngày), và sự thay đổi của adiponectin tỷ lệ thuận với sự thay đổi của TG và HDL-cholesterol [7]. Hơn nữa, các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng astaxanthin đóng vai trò then chốt trong phòng ngừa và điều trị gan nhiễm mỡ không do rượu, xơ gan, ung thư gan, tổn thương gan do thuốc và thiếu máu cục bộ [8]. Ngoài ra, một đặc điểm đặc biệt quan trọng là astaxanthin không có dấu hiệu hoạt động như một tiền vitamin A ở người và động vật có vú; do đó, những cơ thể này không có nguy cơ bị ngộ độc do tích tụ quá nhiều astaxanthin [10].
Kết quả thí nghiệm trên cả chuột đực và chuột cái cho thấy không có tác dụng có hại khi sử dụng astaxanthin ở mức 12 g/kg thể trọng/ngày trong 14 ngày cũng như 256, 513 và 1033 mg/kg thể trọng/ngày trong 13 ngày [11, 12]. Đối với con người, liều an toàn để sử dụng có thể đạt tới 14,4 mg astaxanthin/ngày trong vòng 2 tuần. Vì vậy, trong những năm gần đây astaxanthin ngày càng trở nên phổ biến như một thành phần dinh dưỡng và dược phẩm cho con người. Mặc dù astaxanthin mang lại nhiều lợi ích sức khỏe khác nhau và dễ tiếp cận, nhưng tiềm năng sử dụng astaxanthin trong thuốc và các sản phẩm thực phẩm gốc nước phần lớn bị hạn chế do nó thực tế không tan trong nước dẫn đến sinh khả dụng thấp (sinh khả dụng qua đường uống dưới 10%) [13] .
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các đồng phân Z của astaxanthin có khả năng sinh khả dụng và hoạt tính sinh học cao hơn (all-E)-astaxanthin [14]. Tuy nhiên, độ ổn định của đồng phân Z thấp hơn so với đồng phân toàn E, đây là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến việc sử dụng thực tế của chúng [15]. Ngoài ra, astaxanthin ở dạng trans hoặc cis có nhược điểm là hòa tan trong nước kém (7,9 × 10-10 mg/l ở 25°C) nên sinh khả dụng không cao [16]. Hiện nay, công nghệ nano là giải pháp hữu hiệu trong việc cải thiện độ phân tán, hấp thu, tăng cường dược tính và nâng cao độ bền của hoạt chất. Các công thức dựa trên hạt nano là một trong một số phương pháp nhằm cải thiện khả dụng sinh học của các thực thể ưa mỡ như astaxanthin.
Trong nghiên cứu này, các hạt nano astaxanthin được điều chế thông qua quá trình bay hơi dung môi nhũ tương [17,18] và đông khô để cải thiện khả năng hòa tan và hoạt tính sinh học của astaxanthin. Phương pháp nhũ hóa/bay hơi dung môi là phương pháp thông thường, thông thường, đơn giản, không tốn năng lượng cao và khả thi trong chế tạo hạt nano bao gồm hai pha hữu cơ/nước. Trong nghiên cứu này, astaxanthin được tạo ra ở dạng hạt nano bằng quy trình hai bước. Bước đầu tiên, dung dịch nước của nano astaxanthin được điều chế bằng phương pháp nhũ hóa/bay hơi dung môi, trong đó sự thành công của quá trình nhũ hóa phụ thuộc vào việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt [19].
Các chất hoạt động bề mặt ổn định nanoastaxanthin bằng cách tự định vị tại bề mặt phân cách giữa các hạt nano và nước với các nhóm đầu ưa nước nhô vào trong nước và nhóm đuôi kỵ nước trong astaxanthin. Do đó, nó làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và astaxanthin để tạo thành chất keo ổn định [20]. Hầu hết các chất hoạt động bề mặt được sử dụng trong y học là chất hoạt động bề mặt không ion (ví dụ: cremophor RH40, Tween 80, spans và axit béo) [21]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển các chất mang nano dựa trên chất hoạt động bề mặt chứa astaxanthin bằng cách sử dụng kỹ thuật bay hơi nhũ hóa và phương pháp đông khô, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của nano astaxanthin như khả năng hấp thu tế bào, độc tế bào, chống oxy hóa và tác dụng hạ lipid.
Vật liệu và phương pháp
Nguyên vật liệu
Astaxanthin (độ tinh khiết >95%) được chiết xuất từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis. Poly(ethylene glycol) methyl ether-block-poly(D,L lactide) (PLA-PEG copolymer) được tổng hợp theo báo cáo trước đó và có trọng lượng phân tử là 8400 tương ứng với chỉ số PDI là 1,2 [17]. Cremophor RH40 và Tween 80 được mua từ Sigma-Aldrich và được sử dụng mà không cần tinh chế thêm. Tất cả các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu này đều thuộc loại sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc phân tích.
Phương pháp
Chế tạo hạt nano astaxanthin
Sử dụng phương pháp nhũ hóa/bay hơi dung môi, các hạt nano astaxanthin với hàm lượng astaxanthin 5% đã được điều chế. Quá trình tổng hợp chi tiết như sau: hỗn hợp astaxanthin và chất hoạt động bề mặt (Bảng 1) được hòa tan trong 20 ml dichloromethane (DCM), sau đó trộn kỹ và siêu âm trong 10 phút. Pha hữu cơ được thêm từng giọt vào 100 ml dung dịch nước chứa chất đồng trùng hợp PLA-PEG với chất đồng nhất Ultra-Turrax (T18 IKA, Đức) ở tốc độ 8400 vòng / phút trong 30 phút. Sau đó, huyền phù nano được đông khô để tạo ra bột nano astaxanthin màu đỏ tươi.
Đặc tính của hạt nano astaxanthin
Kích thước hạt của nano astaxanthin được đo bằng LitesizerTM 500 (của Anton Paar, Áo) sử dụng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS). Tất cả các hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được chụp bởi JEM 1400 (JEOL, Nhật Bản) với điện áp gia tốc ∼ 100 kV .
Xét nghiệm DPPH
Xét nghiệm 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) được thực hiện theo phương pháp sửa đổi của Xiao et al [18]. Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 517nm bằng đầu đọc vi bản (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Hiệu quả loại bỏ sự ức chế DPPH theo phần trăm (%) được tính theo phương trình:
% Tỷ lệ ức chế = [(A0 – A1)/A0] x 100
Trong đó A0 là độ hấp thụ của dung dịch DPPH trong metanol và A1 là độ hấp thụ của astaxanthin hoặc nano astaxanthin. Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần
Nuôi cấy và xử lý tế bào
Các tế bào HepG2 được nuôi cấy trong Môi trường thiết yếu tối thiểu (DMEM)/glucose cao của Dulbecco được bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bò bào thai (FBS) và 1% (v/v) penicillin/streptomycin. Tế bào HT29 được nuôi cấy trong DMEM/đường huyết thấp bổ sung 10 % (v/v) huyết thanh bào thai bò (FBS) và 1 % (v/v) penicillin/streptomycin. Tất cả các tế bào được nuôi cấy trong 5 % CO2 ở 37 oC. Sau khi đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và mức độ biểu hiện gen của enzyme chống oxy hóa, tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường DMEM/glucose cao trong đĩa nuôi cấy 6 giếng với mật độ 1 x 106 tế bào/giếng. Tế bào HepG2 sau đó được ủ với nano astaxanthin ở nồng độ 50 và 100 mg/mL trong 24 giờ. Nước cất được sử dụng làm đối chứng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.
Sau khi đánh giá hoạt động hạ lipid máu và mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến chuyển hóa lipid, tế bào HepG2 được ủ với 800 µM axit oleic để gây ra tình trạng tăng lipid máu trong vòng 4 giờ. Sau đó, tế bào được ủ với các nồng độ nano astaxanthin khác nhau (50 và 100 µg/mL) trong 24 giờ. Nước cất được sử dụng làm đối chứng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.
Khả năng sống của tế bào
Độc tính của nano astaxanthin ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 20, 50, 100 và 500 µg/mL) trên dòng tế bào HT29 và HepG2 được phân tích bằng thuốc thử 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) theo hướng dẫn của Nga và cộng sự [19].
Sự hấp thu nano astaxanthin của tế bào
Các tế bào HT29 được gieo vào đĩa petri 60 mm với mật độ 1 × 106 tế bào mỗi đĩa trong DMEM trong 24 giờ. Sau đó, môi trường nuôi cấy được thay thế bằng môi trường chứa astaxanthin tự do (5 µg/mL) hoặc nano astaxanthin (với nồng độ astaxanthin là 5 µg/mL và nồng độ polymer là 100 µg/ml) và ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau khi cân bằng, thí nghiệm được dừng lại bằng cách rửa tế bào ba lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát lạnh (PBS). Sau đó, tế bào được ly giải, ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút và bảo quản ở -20 oC cho đến khi sử dụng. Astaxanthin từ tế bào được chiết xuất bằng phương pháp được mô tả bởi Xiao et al [20]. Hàm lượng Astaxanthin trong tế bào được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (sê-ri Agilent 1260 Infinity Quanternary Pump VL) và cột ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm; Agilent Co.). Pha động bao gồm hai pha chính A (dung môi metanol) và B (nước và axit formic 0,1%) với tốc độ dòng 0,5 mL/phút. Bước sóng UV dao động trong khoảng 200 đến 400 nm, bước sóng UV-VIS dao động trong khoảng 400 đến 800 nm. Quá trình sắc ký và quy trình phân tích số liệu được thực hiện bằng phần mềm chuyên dụng của Agilent. Sắc ký đồ được ghi ở bước sóng 265 nm. Astaxanthin tiêu chuẩn được cung cấp bởi Sigma.
Hiệu suất hấp thu của tế bào được tính bằng cách áp dụng công thức sau:
Hiệu suất hấp thu (%) = Cb/Ca x 100%
Trong đó Ca là hàm lượng astaxanthin trong môi trường nuôi cấy và Cb là hàm lượng astaxanthin tổng số trong tế bào.
Tác dụng bảo vệ chống lại stress oxy hóa của nano astaxanthin chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào HepG2 Đánh giá khả năng bảo vệ chống lại stress oxy hóa bằng H2O2 của nano astaxanthin trên tế bào HepG2 được tiến hành bằng phương pháp của Wang và cộng sự [21]. Đầu tiên, tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường DMEM/glucose cao trong đĩa nuôi cấy 6 giếng với mật độ 1 x 106 tế bào/giếng. Sau đó, các tế bào được ủ với nano astaxanthin (50 và 100 µg/mL) hoặc ascobate làm đối chứng dương tính trong 24 giờ nữa, sau đó ủ trong 1 giờ với dung dịch H2O2 (5 mM). Tác dụng bảo vệ lạnh của nano astaxanthin chống lại thiệt hại do quá trình stress oxy hóa trên HepG2 được biểu thị bằng tỷ lệ sống sót của tế bào. Tỷ lệ sống sót của tế bào được xác định bằng phương pháp xét nghiệm MTT.
Đo enzyme chống oxy hóa
Tế bào HepG2 sau khi được nuôi cấy ở các nồng độ nano astaxanthin khác nhau được rửa hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS, pH 7.4), ly giải tế bào, chiết xuất bằng siêu âm và ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Huyền phù được sử dụng để xác định hoạt động của enzyme catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx) như được mô tả bởi Weydert et al [22].
Nhuộm dầu đỏ O (ORO)
Phương pháp nhuộm lipid bằng ORO được thực hiện theo hướng dẫn của Hoàng và cộng sự [23]. Hình ảnh Cell sau khi nhuộm được chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 70 (Canon, Tokyo, Nhật Bản). Lipid nội bào nhuộm màu được định lượng bằng Oil Red O trong isopropanol 100% và được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 500nm sử dụng đầu đọc vi bản (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA
Phân tích lipid
Tế bào HepG2 sau khi được ủ bằng nano astaxanthin hoặc nước cất đã bị PBS lãng phí hai lần. Sau đó, lipid nội bào được chiết bằng n-hexane: isopropanol (2:1, v:v) trong 30 phút theo mô tả của Hoàng và cộng sự [23]. Nồng độ cholesterol và chất béo trung tính nội bào được xác định bằng phương pháp enzyme với Máy phân tích hóa học lâm sàng Olympus AU400 (Máy phân tích Olympus, Tokyo, Nhật Bản). Tổng lượng protein được xác định bằng xét nghiệm protein Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) để chuẩn hóa.
Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)
RNA tổng số được chiết xuất từ HepG2 bằng thuốc thử TRIzol™ (Invitrogen, Singapore) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. PCR thời gian thực định lượng được thực hiện trong thiết bị PCR thời gian thực MyGo Pro (IT-IS Life Science Ltd., Dublin, Cộng hòa Ireland) bằng cách sử dụng Bộ công cụ RT-qPCR một bước LunaUniversal (New England BioLabs Inc., Vương quốc Anh). Trình tự mồi được thể hiện trong Bảng S1. Mức độ biểu hiện của gen mục tiêu đã được chuẩn hóa theo mức độ-actin bằng phương pháp chuẩn hóa biểu hiện (CT) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thống kê
Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê với P <0, 05.
Kết quả và thảo luận
Hóa lý của hạt nano astaxanthin
Các chất hoạt động bề mặt đóng vai trò quan trọng trong việc điều chế nano astaxanthin. Điều đó không chỉ tránh được sự kết tụ của các hạt nano mà còn giúp chúng phân tán tốt trong nước. Tác dụng của chất hoạt động bề mặt Tween 80 (A1) và cremophor RH40 (A2) trong việc điều chế hạt nano astaxanthin đã được nghiên cứu (Hình 1).
Hình 1a cho thấy sơ đồ phân bố kích thước hạt của mẫu A1 và A2 trong nước cho thấy sự hiện diện của các hạt nano đa phân tán hẹp có đường kính hạt trung bình lần lượt là 96 và 90 nm. Không có sự khác biệt đáng kể về hình thái của hai mẫu. Tuy nhiên, độc tính của cremophor RH40 thấp hơn Tween 80. Vì vậy, cremophor RH40 được chọn sử dụng làm chất hoạt động bề mặt cho chế phẩm nano astaxanthin. Sau đó, ảnh hưởng của tỷ lệ trọng lượng của astaxanthin/cremophor RH40 đến sự hình thành các hạt nano đã được nghiên cứu. Kích thước trung bình của hạt nano của các mẫu A2, A3 và A4 được đo bằng kỹ thuật DLS lần lượt là 90, 115 và 85 nm (Hình 1b).
Mặt khác, biểu đồ cho thấy kích thước hạt tỷ lệ thuận với tỷ lệ astaxanthin/cremophor RH40. Đặc biệt, đường kính hạt trung bình giảm đáng kể từ 115 nm xuống 90 nm, tương ứng với việc tỷ lệ trọng lượng giữa astaxanthin và cremophor RH40 giảm từ 1:1 xuống 1:2. Tiếp tục giảm tỷ lệ từ 1:2 xuống 1:3, xu hướng kích thước hạt nano giảm đi là không đáng kể. Theo một số nghiên cứu, hàm lượng chất hoạt động bề mặt có trong công thức hạt nano phải ở mức vừa phải để tránh tác dụng phụ của sản phẩm cuối cùng như tăng lipid máu, mô hình lipoprotein bất thường, kết tập hồng cầu và bệnh lý thần kinh ngoại biên [24,25]. Ngoài ra, biểu đồ phân bố kích thước hạt cho thấy mẫu A2 có phân bố hẹp và kích thước hạt trung bình nhỏ hơn 100 nm. Kết quả này cho thấy vai trò của cremophor RH40 trong việc bảo vệ các hạt nano astaxanthin và tỷ lệ trọng lượng thích hợp của astaxanthin/cremophor RH40 là 1:2.
Ngoài ra, ảnh TEM được sử dụng để quan sát hình thái của hạt nano astaxanthin (Hình 1c). Các hạt nano này có dạng hình cầu rõ ràng và đặc biệt không có hiện tượng vón cục. Ảnh TEM của mẫu A2 cho thấy các hạt có kích thước nhỏ (khoảng 90 nm) và phân bố đồng đều nhất. Kích thước của các hạt này rất phù hợp với kích thước thu được từ DLS.
Hơn nữa, sự hình thành các hạt nano astaxanthin được kiểm soát bởi chất hoạt động bề mặt và chất đóng gói. Sự kết hợp của chất hoạt động bề mặt (Cremophor RH40) và chất đóng gói (chất đồng trùng hợp lưỡng tính PLA-PEG) tạo ra các hạt nano astaxanthin được xác định rõ ràng với khả năng phân tán nước cao (Hình S1 trong phần vật liệu bổ sung). Hơn nữa, tất cả các hợp chất được sử dụng trong nghiên cứu này đều tương thích sinh học với thực phẩm và dược phẩm.
Nano astxanthin cải thiện hoạt động dọn gốc tự do DPPH
Một trong những hoạt động nổi bật của astaxanthin là hoạt động chống oxy hóa [26]. DDPH là gốc tự do được sử dụng để đánh giá mức độ chống oxy hóa của các hợp chất nghiên cứu. Do đó, hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin và nanoastaxanthin (mẫu A2) bằng cách sử dụng xét nghiệm loại bỏ gốc tự do DPPH đã được so sánh. Cả astaxanthin và nano astaxanthin đều cho thấy hoạt động loại bỏ gốc tự do theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 2a). Phù hợp với các nghiên cứu khác [21,27], astaxanthin ở dạng hạt nano có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với astaxanthin ở dạng tự nhiên (Hình 2a). Ở nồng độ 4, 20, 100 và 250 µg/mL, tỷ lệ hoạt tính bắt gốc DPPH của nano astaxanthin lần lượt là 13,2, 18,3, 43,3 và 92,1 %, trong khi đó astaxanthin lần lượt là 2,9, 7,9, 25,8 và 49,5 % (Hình 2a). ). Điều này có thể được giải thích là do astaxanthin ít hòa tan ở dạng tự nhiên trong khi nó có thể hòa tan ở dạng hạt nano [27].
Tác dụng không độc của nanoastaxanthin trên tế bào HT9 và HepG2
Ảnh hưởng của nano astaxanthin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng sống sót của tế bào HT29 và HepG2 đã được thử nghiệm (Hình 2b và 2c). Kết quả cho thấy tế bào HT29 và HepG2 vẫn có thể tồn tại với tỷ lệ sống sót là 98% khi được ủ bằng nano astaxanthin ở nồng độ 10, 20, 50, 100 và 500 µg/mL trong 24 giờ (Hình 2b và 2c). Điều này cho thấy nano astaxanthin không gây ra bất kỳ tác dụng gây độc tế bào nào đối với tế bào HT29 và HepG2 ở nồng độ tối đa 500 µg/mL. 3.4 Nano astaxanthin cải thiện sự hấp thu của tế bào HT29 Sự hấp thu carotenoid, đặc biệt là astaxanthin, trong tế bào thường bị ảnh hưởng bởi tính kỵ nước, sự phân bố kích thước hạt và khả năng tiếp cận sinh học của chúng. Việc giảm kích thước phân tử của thành phần lipophilic có thể cải thiện khả dụng sinh học của các hợp chất hoạt động [28]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hệ thống phân phối dựa trên chất nhũ hóa và keo giúp tăng cường khả năng hòa tan, tốc độ hòa tan và khả dụng sinh học của các hợp chất có độ hòa tan trong nước kém [14,29]. HT29 là dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến đại tràng ở người, ngoài việc là mô hình khối u xenograft để nghiên cứu về ung thư đại trực tràng, nó còn được sử dụng làm mô hình in vitro để nghiên cứu sự hấp thu, vận chuyển và bài tiết của tế bào ruột [30]. Trong nghiên cứu này, khả năng hấp thụ nội bào của nano astaxanthin và astaxanthin được so sánh trên các tế bào HT29 (Hình 2d). Người ta nhận thấy rằng dạng hạt nano của astaxanthin đã cải thiện khả năng hòa tan của nó cũng như tăng lượng astaxanthin được phân phối vào các tế bào HT29 (Hình 2d). Hiệu suất hấp thu của astaxanthin tăng từ 2,5% lên 12,6% ở dạng hạt nano. Hình ảnh sắc ký HPLC (Hình S2 trong phần vật liệu bổ sung) cho thấy astaxanthin dạng hạt nano giúp tăng khả năng hấp thu vào tế bào HT29 cao gấp 5 lần so với dạng astaxanthin thông thường. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của Edelman et al [31].
Tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin đối với HepG2
Chống lại tổn thương do stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 là kết quả của việc tăng nồng độ và biểu hiện gen của các enzyme chống oxy hóa. Căng thẳng oxy hóa được coi là yếu tố quan trọng góp phần gây ra nhiều bệnh bao gồm bệnh tim mạch, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, bệnh thoái hóa thần kinh [32]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc bổ sung trực tiếp H2O2 vào môi trường nuôi cấy có thể dẫn đến stress oxy hóa và tiêu diệt tế bào [27]. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin chống lại các tổn thương oxy hóa do stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 trong tế bào HepG2 (Hình 3a). Kết quả trong Hình 3a cho thấy xử lý với 5mM H2O2 làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào tới 56,4% trong khi tỷ lệ này đạt 100% khi tế bào được nuôi cấy trong môi trường không bổ sung H2O2 (đối chứng). Ủ tế bào bằng nano astaxanthin trước khi bổ sung H2O2 đã ức chế đáng kể tác dụng gây tổn hại của H2O2 lên tế bào, khả năng sống sót của tế bào tăng từ 56,4% ở tế bào được xử lý bằng H2O2 lên 64,2% và 71,7% ở tế bào được xử lý trước bằng nano astaxanthin ở nồng độ lần lượt là 50 và 100 µg/mL. So với nhóm tế bào được xử lý trước bằng nano astaxanthin, nhóm axit ascorbic cũng đạt tỷ lệ sống sót là 71,9%. Lu và cộng sự [33] cho thấy khả năng sống sót của tế bào tăng đáng kể từ 63,9% lên 73,9% khi các tế bào này được xử lý trước bằng 316 nM astaxanthin tự do trước khi tiếp xúc với H2O2. Wang và cộng sự [21] và Oh và cộng sự [27] không tìm thấy bất kỳ tác dụng bảo vệ tế bào nào của astaxanthin tự do ở nồng độ từ 10 đến 40 µM đối với stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào Caco-2 và ARPE-19.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện ra rằng một lượng nhỏ astaxanthin (4,2 – 8,3 nM) ở dạng hạt nano có thể bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa do H2O2 gây ra. Việc giảm kích thước hạt và tăng khả năng hòa tan cũng như sự hấp thu của tế bào astaxanthin ở dạng hạt nano có thể được coi là sự cải thiện khả năng chống oxy hóa của nano astaxanthin. CAT và GPx là các enzyme chống oxy hóa quan trọng giúp duy trì sự cân bằng động của stress oxy hóa. Dưới áp lực oxy hóa, các enzyme này hoạt động như chất chống oxy hóa nội sinh chống lại các gốc tự do và loại bỏ các gốc tự do quá mức được tạo ra trong tế bào bằng cách xúc tác trực tiếp trong quá trình phân hủy H2O2 thành O2 [34]. Kết quả ở hình 3b và 3c cho thấy bổ sung Astaxanthin ở liều lượng 50 và 100 µg/mL đã kích thích hoạt động của các enzym này. Hoạt tính của CAT tăng lên lần lượt là 62% và 105% (Hình 3b), trong khi hoạt động của GPx tăng lên lần lượt là 37% và 60% trong các tế bào được ủ với 50 và 100 µg/mL nanoastaxanthin (Hình 3C). Các enzyme chống oxy hóa như Keap1 (mã hóa protein liên kết Epichlorohydrin giống Kelch) và Nrf2 (mã hóa yếu tố hạt nhân, giống erythroid 2) được sử dụng để duy trì sự cân bằng trong quá trình khử – oxy hóa. Khi tế bào cân bằng được quá trình khử – oxy hóa, Nrf2 kết hợp với Keap1 trong tế bào chất và không hoạt động. Khi bị tổn thương do stress oxy hóa, Nrf2 tự tách khỏi Keap1, di chuyển vào bên trong nhân và phản ứng với ARE, dẫn đến điều hòa các enzyme chống oxy hóa HO-1 (mã hóa heme oxyase 1) và NQO-1 (mã hóa NAD(P)H quinone dehydrogenase), dẫn đến tế bào được bảo vệ chống lại stress oxy hóa [35]. Trong nghiên cứu này, mức độ mRNA của Keap1 giảm 16% và 26% trong các tế bào được ủ bằng nano astaxanthin khi so sánh với nhóm đối chứng (Hình 3d). Sự biểu hiện gen của Nrf2 và các gen mục tiêu HO-1 và NQO-1 của nó tăng lên đáng kể trong các tế bào được ủ nano astaxanthin. Ở nồng độ nano astaxanthin là 100 µg/mL, các tế bào đã cải thiện sự biểu hiện của Nrf2, HO-1 và NQO-1 lần lượt là 119%, 89% và 133% so với đối chứng (Hình 3d).
Dựa trên kết quả trên, chúng tôi cho rằng astaxanthin ở nồng độ thấp khi được chuyển hóa thành hạt nano có thể cải thiện hoạt động chống lại stress oxy hóa bằng cách bảo vệ sự sống của tế bào và điều hòa hoạt động cũng như biểu hiện gen của các enzyme chống oxy hóa.
Nano astaxanthin làm giảm hàm lượng lipid nội bào bằng cách điều hòa các gen tham gia chuyển hóa lipid trong tế bào HepG2
Một trong những tác dụng sinh học cơ bản được biết đến nhiều nhất của astaxanthin là làm giảm mức độ lipid. Nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của astaxanthin đã được báo cáo trong thử nghiệm in vitro, in vivo và trên người [6,7,36,37]. Jia và cộng sự [36] đã chỉ ra rằng astaxanthin ở nồng độ 10 µM có thể làm giảm cholesterol và chất béo trung tính trong tế bào xuống -14% và -20% trong tế bào HepG2. Hussein và cộng sự [37] cho rằng sử dụng astaxanthin làm tăng cholesterol tốt (HDL-C) và giảm hàm lượng axit béo không được este hóa và chất béo trung tính trong mô hình động vật.
Hơn nữa, chế độ ăn có bổ sung chiết xuất astaxanthin phong phú từ tảo xanh trong 4 tuần ở chuột có gen apoE đột biến đã làm giảm đáng kể nồng độ chất béo trung tính trong huyết tương [6]. Kết quả lâm sàng của Yoshida và cộng sự tiến hành trên 61 người mắc chứng rối loạn lipid máu nhẹ được điều trị bằng astaxanthin ở mức 6 và 18 mg/ngày cho thấy hàm lượng chất béo trung tính trong huyết tương giảm và hàm lượng HDL-C tăng lên khi bổ sung astaxanthin ở mức 6 và 12 mg/ngày [ 7]. Trong nghiên cứu này, tác dụng khử lipid của nano astaxanthin đã được thực hiện. Tác dụng tương tự cũng đạt được ở tế bào được điều trị bằng fenofibrate, nồng độ triglycerid và cholesterol nội bào trong tế bào được điều trị bằng nano astaxanthin giảm đáng kể cách thức phụ thuộc vào liều so với đối chứng. Điều trị bằng nano astaxanthin 100 µg/mL làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol và TG lần lượt là 28% và 17% so với đối chứng (Hình 4a và 4b). Kết quả nhuộm ORO cũng cho thấy kết quả tương tự khi phân tích hàm lượng lipid nội bào (Hình 4c). Do đó, nano astaxanthin ở nồng độ từ 1 đến 8,3 nM đã cho thấy khả năng giảm lipid ở mức tương đối tương tự hoặc cao hơn với các tế bào hấp thu astaxanthin trên 100 nM như mô tả trong Jia et al [36]. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất của cremophors thường liên quan đến sốc phản vệ nghiêm trọng, tăng lipid máu, lipoprotein bất thường [38]. Để giảm tác dụng phụ này, một số phương pháp đã được áp dụng, chẳng hạn như thay thế Ccremophor bằng solutol HS 15 (và thêm chất hoạt động bề mặt hoặc dung môi) [39]. Trong nghiên cứu này, các chất mang nano dựa trên chất hoạt động bề mặt không chứa astaxanthin (SWA), ở các nồng độ khác nhau (50 và 100 µg/mL) cho thấy không có sự thay đổi nào về nồng độ cholesterol và chất béo trung tính nội bào (Hình 4a và 4b). Phân tích ORO cũng cho thấy kết quả tương tự (Hình 4c). Kết hợp lại với nhau, chúng tôi cho rằng phương pháp chế tạo nano trong nghiên cứu này đã hạn chế những tác dụng phụ không mong muốn do hợp chất cremophors gây ra.
Quá nhiều cholesterol và TG có thể dẫn đến xơ vữa động mạch, do đó việc kiểm soát nồng độ cholesterol và TG trong huyết tương là rất quan trọng. Gan đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng cholesterol trong huyết tương được quyết định chủ yếu bởi tốc độ loại bỏ lipoprotein mật độ thấp (LDL) khỏi tuần hoàn bởi thụ thể LDL (LDLR). Sau khi được gắn vào LDLR trên tế bào gan, LDL sẽ giải phóng cholesterol và chất béo trung tính. Một lượng đáng kể cholesterol được lưu trữ hoặc loại bỏ khỏi cơ thể bằng cách bài tiết vào mật dưới dạng cholesterol tự do hoặc sau khi chuyển đổi thành axit mật, một quá trình được điều chỉnh bởi enzyme cholesterol 7α358 hydroxylase (CYP7A1) của microsome [40]. Tổng hợp axit béo (FAS) là gen định lượng axit béo de novo được tổng hợp trong các mô. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng việc giảm quy định FAS dẫn đến giảm tổng hợp axit béo [41]. Yang và cộng sự [6] đã báo cáo rằng biểu hiện LDLR mRNA đã được điều chỉnh tăng đáng kể ở gan của những con chuột bị loại bỏ ApoE được cho ăn astaxanthin, dẫn đến giảm cholesterol trong huyết tương.
Cũng trong nghiên cứu này, sự biểu hiện mRNA của các gen đánh dấu quá trình oxy hóa β của axit béo peroxisomal và ty thể tương ứng là ACOX và CPT-1, đã tăng lên trong gan của những con chuột bị loại ApoE được cho ăn astaxanthin; gợi ý rằng việc tăng quá trình oxy hóa β của axit béo là nguyên nhân gây ra tác dụng hạ thấp TG của astaxanthin. Ngoài ra, Yao và cộng sự. [36] gợi ý rằng astaxanthin làm giảm sự tích tụ lipid ở gan ở chuột được nuôi bằng chất béo high367 thông qua kích hoạt thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-activated (PPAR) alpha, trong khi CPT-1 được coi là yếu tố phiên mã điều chỉnh bởi PPAR. Ở đây, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ astaxanthin thấp (<10nM) ở dạng hạt nano có thể điều chỉnh tăng mức độ mRNA của LDLR và CYP7A1, trong khi mức độ mRNA FAS giảm so với đối chứng. Nanoastaxanthin 100 µg/mL làm tăng đáng kể mức mRNA của LDLR và CYP7A1 lần lượt là 190% và 148%. Điều trị bằng nanoastaxanthin (50 và 100 µg/mL) làm giảm mức mRNA của FAS lần lượt là 23% và 41% (P < 0,1) so với đối chứng. Thụ thể-alpha kích hoạt tăng sinh peroxisome (PPARα), một thụ thể hormone hạt nhân, biểu hiện ở nhiều sinh vật như gan, thận, tim và cơ và đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chuyển hóa lipid ở gan. Chất chủ vận PPAR-α tự nhiên hoặc tổng hợp, bao gồm cả fenofibrate, hoạt động như tác nhân trị liệu tiềm năng trong điều trị tăng triglycerid máu. Chất chủ vận PPAR-α làm giảm rối loạn TG thông qua việc thúc đẩy các gen liên quan đến chuyển hóa lipid bao gồm hấp thu axit béo, oxy hóa axit béo, do đó điều chỉnh quá trình tổng hợp axit béo ở gan, dẫn đến giảm chất béo trung tính và cholesterol trong huyết tương [42]. Ở đây, chúng tôi thấy rằng nó có tác dụng kích thích sự biểu hiện của các gen được mã hóa cho PPARα và các gen mục tiêu của nó. Cụ thể, ở nồng độ 50 và 100 µg/mL, nano astaxanthin đã làm tăng hàm lượng mRNA của PPARα lên 37% và 73% so với đối chứng. CTP-1 và LXRα là gen mục tiêu PPARα, trong đó CPT-1 tham gia chuyển đổi axit béo tự do thành acyl CoA, cơ chất ban đầu cho quá trình oxy hóa- β ở màng ty thể [42]. Ở đây, các tế bào được ủ bằng nano astaxanthin đã làm tăng đáng kể sự biểu hiện của CTP-1 và LXR theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả của Yao et al [36]. Tuy nhiên, nồng độ astaxanthin có hoạt tính ở dạng hạt nano là 3-9nM, trong khi đó astaxanthin tự do là 5-100 mM.
Kết luận
Bằng việc áp dụng kỹ thuật bay hơi dung môi nhũ tương, chúng tôi đã chế tạo được nano asstaxanthin với hàm lượng astaxanthin 5% và kích thước hạt 90 nm. Nano astaxanthin có thể hòa tan dễ dàng trong nước, giúp cải thiện đáng kể khả năng hấp thu HT29 cũng như hoạt tính chống oxy hóa của nó so với dạng tự nhiên. Do đó, nó có thể cải thiện đáng kể hoạt động bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxy hóa do stress và giảm lipid nội bào thông qua việc tăng hoạt động và điều chỉnh biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình chống oxy hóa và chuyển hóa lipid mà không gây độc cho tế bào.
Hoang Thi Minh Hien a c, Ho Thi Oanh b, Quach Thi Quynh c, Ngo Thi Hoai Thu a, Nguyen Van Hanh a, Dang Diem Hong a, Mai Ha Hoang b c