Astaxanthin được so sánh với β-carotene đến hiệu suất tăng trưởng, khả năng chống oxy hóa và biểu hiện gen của tôm sú trong điều kiện bình thường và thiếu oxy

Hai thử nghiệm đã được tiến hành để xác định tác động của hai nguồn carotenoid khác nhau đối với tôm sú Penaeus monodon, trước tiên là đến hiệu suất tăng trưởng, thứ hai là đến phản ứng miễn dịch của tôm được nghiên cứu với thử thách trong không khí. Trong thử nghiệm 1, P. monodon (trọng lượng ướt ban đầu trung bình khoảng 2,07 g) được cho ăn 5 khẩu phần chia làm 3 lần; chế độ ăn cơ bản (D1) không có carotenoid; 2 chế độ ăn được xây dựng để cung cấp riêng 0,1% astaxanthin (D2), kết hợp 0,1% astaxanthin và 1% cholesterol (D3); chế độ ăn chỉ có 0,25% β-carotene (D4), kết hợp 0,25% β-carotene và 1% cholesterol (D5). Hiệu suất tăng trưởng (trọng lượng cuối cùng, FBW; tăng trọng, WG; tăng sinh khối, BG) và tỷ lệ sống của tôm được cho ăn D3 cho thấy giá trị cao nhất. Hệ số tiêu hóa biểu kiến (ADC) của carotenoid trong khẩu phần bổ sung carotenoid (D2–D5) ở mức cao (>90%) và việc bổ sung cholesterol không cải thiện đáng kể ADC carotenoid nữa. Tuy nhiên, việc bổ sung cholesterol đã nâng cao đáng kể hiệu quả lưu giữ carotenoid ở mô trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D3 so với D2) nhưng không tăng cường trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung β-carotene (D5 so với D4). Gan tụy malondialdehyd (MDA) và thời gian đông máu của tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung carotenoid (D2-D5) thấp hơn (P < 0,05) so với tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1). Ngược lại, tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1) thấp hơn (P < 0,05) so với tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung carotenoid (D2-D5). Không có sự khác biệt đáng kể (P> 0,05) được tìm thấy trong cấu hình biểu hiện của protein sốc nhiệt 70 (Hsp 70) mRNA và yếu tố gây thiếu oxy-1α (HIF-1α) mRNA trong gan tụy của tôm trong số tất cả các chế độ ăn. Trong thử nghiệm 2, tôm được tiếp xúc với không khí trong quá trình vận chuyển sống mô phỏng trong 36 giờ sau thử nghiệm nuôi 1. Không có trường hợp tôm chết trong tất cả các chế độ ăn sau 36 giờ vận chuyển sống mô phỏng. Tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản và bổ sung β-carotene (D1, D4 và D5) giảm đáng kể (P< 0,05) sau thử nghiệm 2 trong khi nó không thay đổi ở tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D2 và D3). Thời gian đông máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1) tăng đáng kể (P < 0,05) sau thử nghiệm 2 và không thay đổi ở tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung carotenoid (D2-D5). Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong gan tụy của tôm trong thử nghiệm 2 là mức cao kỷ lục (P < 0,05) so với hàm lượng trong thử nghiệm 1. Hồ sơ biểu hiện của Hsp 70 mRNA và HIF-1α mRNA của gan tụy của tôm được cho ăn khẩu phần cơ bản là đáng kể thấp hơn (P < 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác. Tóm lại, tất cả dữ liệu đều cho thấy rằng astaxanthin tốt hơn β-carotene cả về mặt sắc tố hoặc chất chống oxy hóa trong chế độ ăn thương mại của tôm sú P. monodon, và việc bổ sung cholesterol có thể nâng cao tích cực hiệu quả của astaxanthin chứ không phải β-carotene.

NANOCMM TECHNOLOGY

1.Giới thiệu

Việc duy trì sắc tố da tự nhiên có tầm quan trọng lớn theo quan điểm thương mại, liên quan trực tiếp đến việc người tiêu dùng chấp nhận hay từ chối và giá cả thị trường của sản phẩm (Shahidi et al., 1988). Ở động vật giáp xác, màu sắc được cung cấp bởi carotenoids, sắc tố chính thường là astaxanthin ở dạng tự do hoặc ester hóa (Niu và cộng sự, 2012). Trong bộ xương ngoài của động vật giáp xác sống, màu đỏ cam của astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β,β-carotene4,4′-dione) có thể bị biến đổi thành màu nâu, xanh lục hoặc xanh lam thông qua sự hình thành phức hợp carotenoprotein, màu đỏ lộ ra khi nấu. Carotenoid được tổng hợp từ geranylgeranyl diphosphate bởi tất cả các sinh vật quang hợp, và trong con đường sinh tổng hợp của chúng, lycopene được báo cáo là chuyển đổi thành β-carotene, sau đó được chuyển hóa tiếp thành astaxanthin (Giuliano et al., 2000). Thực vật quang hợp có thể tổng hợp lycopene và β-carotene trong khi astaxanthin là một caroten không phải thực vật. Tôm sú không có khả năng sinh tổng hợp carotenoid de novo nhưng có thể chuyển đổi β-carotene và canthaxanthin tổng hợp trong thức ăn thành astaxanthin tích tụ trong cơ thể (Boonyarataplin và cộng sự, 2001). Màu sắc mong muốn đạt được bằng cách đưa astaxanthin vào thức ăn, đây là carotenoid tạo ra màu sắc tự nhiên. Giá thành của astaxanthin tổng hợp cao và làm tăng đáng kể chi phí thức ăn và sản xuất. Vì vậy, hiện nay mong muốn về mặt thương mại là cải thiện hiệu quả của astaxanthin hoặc xác định các phương tiện thay thế, tiết kiệm chi phí hơn để đạt được màu sắc mong muốn. Castillo (1980) chỉ ra rằng ốc mượn hồn Clibanarius erythropus latreille (1818) có khả năng chuyển hóa β-carotene trong thức ăn thành astaxanthin. Boonyarataplin và cộng sự. (2001) và Linan-Cabello và cộng sự. (2002) cũng báo cáo rằng Penaeus monodon có khả năng chuyển đổi β-carotene thành astaxanthin. Liao và cộng sự. (1993) đã báo cáo chế phẩm thức ăn của Spirulina, một loại vi khuẩn lam có β-carotene là caroten chính, dẫn đến sắc tố mai hiệu quả ở P. monodon.

Hơn nữa, dữ liệu chưa được công bố trước đây của chúng tôi cho thấy rằng astaxanthin có hiệu quả sử dụng nguồn carotenoid cao hơn khoảng 2,5 lần so với β-carotene trong sự phát triển và tồn tại của P. monodon. Điều này làm tăng khả năng rằng nếu quá trình chuyển đổi đủ hiệu quả thì việc cho ăn β-carotene hoặc các sản phẩm giàu β-carotene có thể cung cấp một phương pháp thay thế và rẻ hơn để đạt được màu sắc mong muốn ở động vật giáp xác. Cho đến nay, không có nghiên cứu nào được thiết kế để so sánh tác động của astaxanthin và β-carotene trong chế độ ăn đối với hiệu quả sắc tố ở P. monodon, và nghiên cứu chưa được công bố trước đây của chúng tôi chỉ so sánh hiệu quả của astaxanthin so với β-carotene đối với sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của P. monodon.

Màu sắc cơ của tôm là do sự hấp thu, tích lũy và chuyển hóa trao đổi chất của carotenoid trong chế độ ăn uống (Nickell và Bromage, 1998). Tuy nhiên, hiệu quả của carotenoid đối với sắc tố cơ là rất thấp, chỉ khoảng 5–15% lượng carotenoid trong khẩu phần ăn được sử dụng cho sắc tố cơ (Nickell và Bromage, 1998). Mức độ sử dụng thấp có thể một phần là do tỷ lệ hấp thụ thấp ở đường tiêu hóa, lắng đọng ở các cơ quan khác và chuyển hóa trao đổi chất thành các hợp chất không màu mà cuối cùng có thể được bài tiết (Niu và cộng sự, 2012). Hơn nữa, carotenoid là hợp chất hòa tan trong lipid, do đó, lượng và loại chất béo có trong chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đến khả dụng sinh học của carotenoid (Regost et al., 2004). Nhiều nghiên cứu khác nhau đã đánh giá tầm quan trọng của chất béo trong chế độ ăn so với sự vắng mặt hoàn toàn của chất béo tại thời điểm tiêu hóa β-carotene (Dimitrov và cộng sự, 1988; Prince và cộng sự, 1991). Borel và cộng sự. (1998) báo cáo rằng loại chất béo có trong chế độ ăn uống cũng ảnh hưởng đến khả dụng sinh học của carotenoid. Là lipid mạng, chất béo trung tính chuỗi trung bình hoặc chất béo trung tính chuỗi dài đều không thể cải thiện khả dụng sinh học của β-carotene (Borel và cộng sự, 1998). Tuy nhiên, Niu và cộng sự. (2012) chỉ ra rằng astaxanthin tốt hơn canthaxanthin vì là nguồn carotenoid trong chế độ ăn thương mại của P. monodon và việc bổ sung cholesterol có thể nâng cao tích cực hiệu quả của astaxanthin và canthaxanthin. Một thước đo phổ biến về sự hấp thu qua đường tiêu hóa là hệ số tiêu hóa biểu kiến (ADC), các giá trị điển hình của ADC của astaxanthin và canthaxanthin đối với cá hồi là từ 30% đến 60% (Kiessling và cộng sự, 2003), nhưng giá trị cao hơn hoặc thấp hơn có thể cao hơn hoặc thấp hơn. được tìm thấy tùy thuộc vào liều lượng thức ăn và sự khác biệt về loài. Niu và cộng sự. (2012) cho thấy ADC của astaxanthin đối với P. monodon khá cao (N98%), việc bổ sung cholesterol vào khẩu phần không thể cải thiện được ADC của astaxanthin nữa; tuy nhiên, việc bổ sung cholesterol trong khẩu phần đã cải thiện đáng kể khả năng tiêu hóa canthaxanthin từ 50% lên 77% đối với P. monodon. Astaxanthin và canthaxanthin là những hợp chất phân cực hơn, trong khi β-carotene thuộc về hydrocarbon carotene không phân cực (Yeum và Russell, 2002), là hai phân lớp khác nhau của carotenoid, không có dữ liệu nào về ADC của astaxanthin và β-carotene được so sánh ở tôm và liệu việc bổ sung cholesterol trong chế độ ăn uống có thể nâng cao hiệu quả của β-carotene hay không. Bên cạnh sắc tố, tăng cường tăng trưởng hoặc cải thiện các đặc tính năng suất của tôm bố mẹ của carotenoid, sự chú ý ngày càng tăng đang hướng tới việc xác định chức năng sinh học của carotenoid ở động vật thủy sản. Trong số các chức năng sinh học của carotenoid trong nuôi trồng thủy sản được chỉ ra bởi Niu et al. (2012), đặc tính chống oxy hóa có thể liên quan chặt chẽ đến khả năng chống stress. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng việc tăng cường khả năng chống lại stress suy giảm oxy hòa tan (Niu và cộng sự, 2009), độ mặn và stress nhiệt (Chien và cộng sự, 2003), amoniac và stress bệnh lý (Pan và cộng sự, 2003a,b) ở tôm he có liên quan đến sự gia tăng carotenoid trong chế độ ăn uống và cơ thể. Ngoài ra, việc tiếp xúc với không khí đã được sử dụng như một yếu tố gây căng thẳng phổ biến hơn để đánh giá sức khỏe của cua (Cancer pagurus) (Lorenzon và cộng sự, 2008), tôm hùm (Panulirus cygnus) (Fotedar và cộng sự, 2001), tôm vua phương Tây ( Penaeus latisulcatus) và tôm sú (Penaeus esculentus) (Sang và Fotedar, 2005). Tuy nhiên, ảnh hưởng của yếu tố gây căng thẳng này lên P. monodon vẫn chưa được nghiên cứu. Nghiên cứu này được thiết kế để đánh giá tác dụng của astaxanthin hoặc β-carotene đối với sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, sắc tố, khả năng chống oxy hóa và biểu hiện gen của P. monodon và liệu việc bổ sung cholesterol trong chế độ ăn uống có thể cải thiện hiệu quả của astaxanthin và β-carotene về mặt khả năng tiêu hóa, hiệu quả lưu giữ và hàm lượng carotenoid trong mô.

2.Vật liệu và phương pháp

2.1. Chuẩn bị chế độ ăn kiêng và điều trị chế độ ăn kiêng

Trong nghiên cứu này, hai thử nghiệm (thử nghiệm 1 và thử nghiệm 2) đã được tiến hành. Công thức và thành phần gần đúng của 5 khẩu phần ăn thử nghiệm (D1: khẩu phần cơ bản; D2: 0,1% astaxanthin; D3: 0,1% astaxanthin + 1% cholesterol; D4: 0,25% β-carotene; D5: 0,25% β-carotene +1% cholesterol) với các nguồn carotenoid khác nhau (Carophyll® Pink, 10% astaxanthin và 10% β-carotene, DSM Nutritional Products France SAS) được trình bày trong Bảng 1 và 2. Phương pháp chuẩn bị chế độ ăn uống giống như mô tả của Niu et al. (2012). Tóm lại, tất cả các thành phần khô của khẩu phần thử nghiệm đã được cân, kết hợp và trộn kỹ để đồng nhất trong máy trộn kiểu Hobart. Sau đó, dầu được thêm vào và trộn kỹ trong 5 phút. Nước khử ion (40% hỗn hợp nguyên liệu khô) được thêm vào và trộn thêm 5 phút nữa. Hỗn hợp ướt được đặt trong máy đùn trục vít đơn (Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc, Quảng Châu, PR Trung Quốc) và được ép đùn qua khuôn 1,2 mm. Y2O3 được sử dụng làm chất đánh dấu trơ ở nồng độ 0,01% trong khẩu phần ăn. Các viên thu được được sấy khô ở 25°C với sự trợ giúp của máy điều hòa không khí và quạt điện. Tất cả các khẩu phần ăn được bảo quản ở -20°C cho đến khi sử dụng.

Bảng 1 Thành phần của khẩu phần ăn cơ bản

Bảng 2 Công thức và thành phần gần đúng của từng khẩu phần (% chất khô)

2.2. Tôm và mô hình thử nghiệm 1

Trong thử nghiệm 1, hậu ấu trùng P. monodon (30.000 con), thu được từ một trại giống thương mại gần Vịnh Hongsha, Tam Á, tỉnh Hải Nam, được thả trong bể bê tông trong nhà nặng 5 tấn và cho ăn chế độ ăn thương mại không bổ sung carotenoid. 1–2 tháng hoặc cho đến khi đạt trọng lượng khoảng 2 g. Hơn nữa, tôm đã được làm quen với điều kiện thí nghiệm và cho ăn chế độ ăn cơ bản hiện tại trong hai tuần trước khi thí nghiệm bắt đầu. Tổng cộng 600 con tôm khỏe mạnh với trọng lượng cơ thể ban đầu là 2,08 g được phân ngẫu nhiên vào 15 bể bằng sợi thủy tinh (500 L, 3 bể mỗi khẩu phần, 40 con tôm mỗi bể). Việc thay nước trong mỗi bể cá được điều chỉnh ở khoảng 1,0 L/phút với hệ thống lọc nước chảy. Mỗi bể nuôi đều được đậy bằng nắp lưới nhựa để ngăn tôm nhảy ra ngoài. Tôm được nuôi ngoài trời với mái che bằng thép và trải qua chu kỳ sáng tự nhiên (12 giờ sáng/12 giờ tối). Trong thời gian thử nghiệm, nhiệt độ nước, độ mặn, oxy hòa tan và tổng nitơ amoniac dao động từ 26,0 đến 28,0 °C, 29,0 đến 32,0 g L−1, 6,8 đến 7,5 mg L⁻¹ và tương ứng là 0,22 đến 0,51 mg L^-1.

Tất cả tôm trong mỗi bể ban đầu được cho ăn 6% tổng trọng lượng cơ thể hàng ngày theo Shiau et al. (1991). Tần suất cho ăn là ba lần mỗi ngày vào lúc 07:00, 13:00 và 21:00 và kéo dài trong 74 ngày. Trong quá trình thử nghiệm cho ăn, lượng thức ăn được cung cấp đã được thay đổi dần dần và điều chỉnh theo khẩu vị của tôm bằng cách kiểm tra đáy bể xem lượng thức ăn dư thừa còn lại 2 giờ sau khi cho ăn. Bằng cách này, việc cho ăn quá mức đã được giảm thiểu và tôm được cho ăn gần đến mức no. Mỗi buổi sáng và buổi chiều, trước mỗi giờ cho ăn, toàn bộ thức ăn thừa/thừa, phân, lột xác và tôm chết đều được hút ra khỏi bể. Hai tuần một lần tôm từ mỗi bể được cân và đếm để đánh giá sự tăng trưởng và tỷ lệ sống. Trong 14 ngày cuối cùng, phân được hút ra khỏi mỗi bể cá hai lần mỗi ngày vào lúc 08:00 và 14:00 trong vòng 30 phút sau khi thải ra ngoài. Nếu có, các mảnh thức ăn thừa được nhuộm màu đỏ sẽ dễ dàng được phân loại khỏi các sợi phân và loại bỏ. Phân sau đó được rửa sạch bằng nước cất hai lần để tránh nhiễm muối và đông lạnh ở −20 ° C. Các mẫu được đông khô chờ phân tích (Merican và Shim, 1995).

2.4. Lấy mẫu và bảo quản

Trước khi nuôi, số lượng tôm được thu thập ngẫu nhiên đủ để phân tích carotenoid toàn thân, cơ và vỏ. Khi kết thúc thử nghiệm cho ăn, sáu con tôm từ mỗi bể được thu thập ngẫu nhiên để lấy mẫu toàn thân, cơ, da và máu. Tham khảo Barbosa et al. (1999), thời gian từ bữa ăn cuối cùng đến khi lấy mẫu máu là trong vòng 2 giờ. Máu huyết được rút ra bằng cách đưa một cây kim vào khoang màng ngoài tim qua màng xen kẽ giữa phần đầu ngực và phần bụng. Các mẫu tan máu được chuẩn bị bằng cách trộn 400 μL dung dịch NaCl đẳng trương chứa 0,94 m mol/L EDTA với 100 μL tan máu ngay sau khi rút tan máu. Sau đó, huyết tương được tách bằng cách ly tâm (12.000 vòng/phút, Eppendorf 5810R) và nồng độ carotenoid được đo ngay lập tức. Các mẫu da, gan tụy và cơ được mổ xẻ và đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng và được bảo quản ở −70 ° C để phân tích sau.

2.5. Phân tích hóa học

2.5.1. Phân tích thành phần mẫu thức ăn và mẫu tôm

Các mẫu từ khẩu phần ăn và phân được đông khô (Advantage 2.0, VirTis, USA) và sau đó được nghiền nhỏ. Độ ẩm, protein thô, lipid thô và tro thô của khẩu phần và phân được xác định bằng các phương pháp tiêu chuẩn (AOAC, 2001). Độ ẩm được xác định bằng cách sấy khô ở 105°C trong 24 giờ và tro được xác định bằng lò múp ở 550°C trong 24 giờ. Protein thô được phân tích bằng phương pháp Kjeldahl sau khi phân hủy bằng axit (1030-Auto-analyzer, Tecator, Thụy Điển). Lipid thô được xác định bằng phương pháp chiết ether của Soxtec System HT (Soxtec System HT6, Tecator). Năng lượng của khẩu phần ăn và phân được xác định bằng nhiệt lượng kế quả bom cỡ nhỏ đoạn nhiệt (nhiệt lượng kế đoạn nhiệt HR-15A, Trường Sơn, Trung Quốc). Yttrium (Y) được phân tích bằng phương pháp quang phổ khối plasma cặp cảm ứng (ICP; model: IRIS Advantage (HR), Thermo Jarrel Ash Corporation, Boston, USA) như mô tả của Refstie et al. (1997).

2.5.2. Xét nghiệm malondialdehyd và protein carbonyl

Là một chỉ số của quá trình peroxid hóa lipid, chúng tôi đã sử dụng sự hình thành TBARS trong phản ứng đun nóng axit, đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi trước đây được mô tả bởi Draper và Hadley (1990). Kết quả được biểu thị dưới dạng tương đương malondialdehyde (MDA) (nmol/mg protein). Để cacbonyl hóa protein, chất nổi phía trên được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ với 10 mM 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNTP) hòa tan trong HCl 2 M để cho phép DNTP liên kết với các nhóm carbonyl (Levine et al., 1994).

Mẫu trắng chỉ được chạy với HCl. Sau đó, protein được kết tủa bằng axit trichloroacetic 6% (TCA) và ly tâm trong 10 phút ở mức 11.000 g. Các viên protein được rửa ba lần bằng etanol/ethylacetate (1:1), huyền phù lại trong guanidine hydrochloride 6 M, axit formic 50%, ủ ở 37°C cho đến khi huyền phù lại hoàn toàn. Hàm lượng carbonyl được đo bằng phương pháp đo quang phổ (Synergy HT, Bioteck) trong huyền phù thu được ở bước sóng 370 nm (hệ số tuyệt chủng mol 22.000 M−1 cm−1). Các kết quả được biểu thị dưới dạng nanomol của DNPH được kết hợp mg protein−1. Tổng hàm lượng protein được xác định cho từng mẫu theo Lowry et al. (1951).

2.5.3. Phân tích carotenoid mô

Các phân tích carotenoid được thực hiện ba lần và các biện pháp phòng ngừa chung được khuyến nghị để phân lập và xử lý carotenoid như Barbosa et al. (1999) đã được theo sau. Khẩu phần và chiết xuất caroten trong phân được thực hiện theo phương pháp của Schierle và Hardi (1994). Việc chiết xuất carotenoid từ các mẫu da được thực hiện theo phương pháp của Schiedt et al. (1995). Việc chiết xuất carotenoid từ các mẫu cơ được thực hiện theo phương pháp của Boonyarataplin et al. (2001). Các carotenoid huyết tương được chiết xuất bằng đầu dò âm thanh cầm tay theo phương pháp của Kiessling et al. (2003). Tổng lượng carotenoid hiện diện trên 100 g mô được tính từ phương trình sau (McBeth, 1972):

mg carotenoid/100 g mô

= (OD × vol × 10³)/(E× trọng lượng của mô(g))

trong đó E, hệ số hấp thụ, vì dịch chiết thô thường chứa nhiều loại carotenoid nên hệ số trung bình là 2500 thường được sử dụng trong tính toán; OD, mật độ quang ở λmax (476 nm); vol, tổng thể tích dung dịch (ml).

2.5.4. Tổng số lượng tế bào máu (THC) và thời gian đông máu

Tổng số lượng tế bào máu được tiến hành theo quy trình đã được thiết lập đối với tôm hùm đá (Fotedar et al., 2001). Phần chân ngực của mỗi con tôm từ mỗi bể nuôi được làm sạch bằng cồn 70%. Một lượng 0,2 mL dung dịch tan máu được rút vào ống tiêm vô trùng 1 mL chứa 0,2 mL chất chống đông máu (NaCl 450 mM, KCl 100 mM, EDTA-2Na 10 mM, HEPES 10 mM; pH7,45) và phân phối vào ống Eppendorf được giữ nguyên. trên mặt băng. Tổng số lượng tế bào máu của từng con tôm được ước tính bằng máy đo huyết cầu (Neubauer, Đức) dưới độ phóng đại 100 lần, từ hỗn hợp chất chống đông máu/tán huyết. Các tế bào được đếm trong cả hai lưới và giá trị trung bình được sử dụng làm số lượng tế bào máu. Tổng số lượng tế bào máu được tính bằng THC = (số tế bào được đếm × hệ số pha loãng × 1000)/thể tích của lưới (0,1 mm³).

Thời gian đông máu tan máu được xác định theo quy trình được mô tả bởi Fotedar et al. (2001) với một số sửa đổi. Máu tan được rút vào ống tiêm vô trùng được phân phối vào ống Eppendorf. Một lượng dịch 30 mL nhanh chóng được chuyển sang một ống khác và được hút vào ống mao dẫn. Ống được đảo ngược nhiều lần cho đến khi tan máu ngừng di chuyển và thời gian được ghi nhận là thời gian đông máu.

2.6. Tiếp xúc với không khí trong quá trình mô phỏng vận chuyển trực tiếp-thử nghiệm 2

Sau 60 ngày nuôi, tôm được vận chuyển sống mô phỏng. Từ mỗi nhóm ăn kiêng, 18 con tôm (6 con từ mỗi lần lặp lại) được đánh dấu bằng sơn móng tay và cho vào hộp polystyrene (60 × 40 × 30 cm) trong 36 giờ. Trong hộp có hai túi đá gel được phủ một lớp xốp. Tôm được đặt trên lớp bọt này rồi lại phủ một lớp bọt khác lên. Sau đó, hộp được đậy bằng nắp và niêm phong. Sau 36 giờ trong hộp, tôm được đặt trở lại môi trường nuôi cấy trong 6 giờ và sau đó được kiểm tra tổng số lượng tế bào máu và thời gian đông máu.

Sau thử nghiệm khả năng chịu đựng căng thẳng khi tiếp xúc với không khí, tôm sống sót được thu thập và các mẫu tuyến tiêu hóa cũng được lấy ra khỏi tôm lấy mẫu và đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng và sau đó được bảo quản ở -70°C. Việc xác định malondialdehyde và protein carbonyl cũng giống như đã đề cập ở trên. Việc xác định tổng số lượng tế bào máu (THC) và thời gian đông máu cũng tương tự như đã đề cập ở trên.

2.7. Phân tích biểu hiện của Hsp70 mRNA và HIF-1α mRNA

Protein sốc nhiệt 70 (Hsp 70) là một chất đi kèm phân tử được bảo tồn cao về mặt tiến hóa, là một phần quan trọng trong bộ máy gấp protein của tế bào và giúp bảo vệ tế bào khỏi căng thẳng (Joly et al., 2010). Để hiểu cơ chế phân tử chống oxy hóa của astaxanthin và β-carotene, trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của Hsp70 mRNA và yếu tố cảm ứng thiếu oxy-1α (HIF-1α) được đo bằng PCR định lượng thời gian thực ở tôm được cho ăn 5 chế độ ăn thử nghiệm khác nhau, và được xử lý bằng cách tiếp xúc với không khí trong quá trình vận chuyển trực tiếp mô phỏng. Tổng số RNA được chiết xuất bằng RNeasy Mini Kit (QIAGEN Cat: no. 74104) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và xử lý bằng DNase I (QIAGEN Cat: no. 79254) để loại bỏ DNA bị ô nhiễm. Sau đó, cDNA chuỗi đầu tiên được tổng hợp dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất về Bộ thuốc thử PrimeScript™ RT (Thời gian thực hoàn hảo) (TaKaRa DRR037S) sử dụng tổng số RNA làm mẫu. Hỗn hợp cDNA đã được pha loãng thành tỷ lệ 1:5 và được bảo quản ở −80 ° C cho RT-PCR định lượng thời gian thực tiếp theo. Các đoạn mồi của mỗi gen được thiết kế dựa trên cDNA của P. monodon đã được công bố bằng phần mềm Primer 3 (//primer3.wi.mit.edu/) (Bảng 3). Tất cả các mồi đều được sản xuất bởi Công ty TNHH Công nghệ sinh học Takara (Dalian) (Takara Dalian) và các điều kiện phản ứng cũng được tối ưu hóa. RT-PCR định lượng thời gian thực được thực hiện với tổng thể tích 20 μL chứa 10 μL 2 × SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TaKaRa DRR041A), 1 μL cDNA, 0,16 μM mỗi mồi và 8,2 μL đôi -nước cất. Chương trình RT-PCR định lượng thời gian thực bao gồm bước biến tính ở 95°C trong 2 phút, sau đó là 40 chu kỳ khuếch đại với 15 giây biến tính ở 95°C, ủ 15 giây ở 58°C, kéo dài 30 giây ở 72°C. Việc đọc huỳnh quang được thực hiện vào cuối mỗi chu kỳ. Để phân tích mức độ biểu hiện Hsp70 mRNA, phương pháp CT so sánh (phương pháp 2 – ΔΔCT) đã được sử dụng. CT cho Hsp70 được khuếch đại mục tiêu và CT cho β-actin kiểm soát nội bộ được xác định cho từng mẫu. Sự khác biệt về CT đối với mục tiêu và kiểm soát nội bộ, được gọi là ΔCT, được tính toán để bình thường hóa sự khác biệt về tổng lượng cDNA được thêm vào mỗi phản ứng và hiệu quả của RT-PCR. Nhóm đối chứng được sử dụng làm mẫu đối chiếu, được gọi là bộ hiệu chuẩn. ΔCT của mỗi mẫu được trừ khỏi ΔCT của bộ hiệu chuẩn, chênh lệch được gọi là ΔΔCT. Mức biểu hiện mRNA PoGal có thể được tính bằng 2 − ΔΔCT và giá trị đại diện cho chênh lệch n lần so với bộ hiệu chuẩn.

2.8. Tính toán và phân tích thống kê

Các thông số sinh học dùng để đánh giá chất lượng thức ăn được tính bằng các phương trình như sau:

Tăng cân (WG) % = 100 × (cân nặng trung bình cuối cùng−cân nặng trung bình ban đầu)/ cân nặng trung bình ban đầu;

Tăng sinh khối (BG)  (g) = sinh khối cuối cùng−sinh khối ban đầu;

Tỷ lệ sống (%) = 100 ×  số lượng tôm cuối cùng /số lượng tôm ban đầu;

Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) = lượng thức ăn khô / tăng trọng ướt;

Hiệu suất lưu giữ carotenoid trong mô (%) =  100 × (hàm lượng carotenoid của mô cuối cùng-hàm lượng carotenoid của mô ban đầu) / lượng carotenoid hấp thụ;

mg carotenoids=100 g mô =(OD× thể tích ×10³) / E × trọng lượng của mô (g)

trong đó E, hệ số hấp thụ, vì dịch chiết thô thường chứa nhiều loại carotenoid, hệ số trung bình là 2500

thường được sử dụng trong tính toán;

OD, mật độ quang tại λmax (476nm);

vol, tổng thể tích dung dịch (ml);

ADC = [1-(y_i / y_f) × (n_f / n_i)]

Bảng 3 Mồi dùng cho nghiên cứu định lượng PCR thời gian thực

Trong đó yi là hàm lượng trioxide yttrium trong thức ăn, yf là hàm lượng trioxide yttrium trong phân, ni là hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn và nf là hàm lượng chất dinh dưỡng trong phân. Tất cả dữ liệu từ các bể ba lần của mỗi chế độ ăn được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều và thử nghiệm đa phạm vi của Duncan. Quy trình Mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) đã được sử dụng để so sánh điều trị bằng chế độ ăn kiêng đơn lẻ về thành phần mô, các thông số stress oxy hóa, tổng số lượng tế bào máu (THC) và thời gian đông máu, nồng độ Hsp 70 mRNA và HIF-1α mRNA giữa hai thử nghiệm. Phần mềm là SPSS (Phiên bản 16.0). Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa ở mức P < 0,05.

3.Kết quả

3.1. Thử nghiệm 1

3.1.1. Hiệu suất sinh học

Hiệu suất sinh học của tôm được thể hiện trong Bảng 4. Hiệu suất tăng trưởng (FBW; WG; BG) và tỷ lệ sống của tôm được cho ăn D3 và D1 lần lượt cho thấy giá trị cao nhất và thấp nhất và có sự khác biệt đáng kể giữa chúng (P < 0,05). Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) của tôm được cho ăn D2, D3 và D5 thấp hơn đáng kể (P < 0,05) so với tôm được cho ăn D1 nhưng không có sự khác biệt đáng kể (P>0,05) với tôm được cho ăn D4.

Bảng 4 Ảnh hưởng của bảy khẩu phần thí nghiệm đến hiệu suất sinh học của tôm sú non

3.1.2. Thành phần toàn bộ cơ thể và cơ bắp

Thành phần toàn bộ cơ thể và cơ của tôm được thể hiện trong Bảng 5. Trong thử nghiệm 1, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy về độ ẩm toàn bộ cơ thể và cơ bắp cũng như hàm lượng tro giữa tất cả các chế độ ăn (P N 0,05). Hàm lượng protein toàn cơ thể của tôm được cho ăn D3 cao hơn đáng kể (P < 0,05) so với tôm được cho ăn D1 và D4 nhưng không có sự khác biệt đáng kể so với tôm được cho ăn D2 và D5 (P > 0,05). Hàm lượng lipid toàn cơ thể của tôm được cho ăn D4 và D5 cao hơn đáng kể so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác (P b 0,05). Hàm lượng protein cơ của tôm được cho ăn D3 và D5 cao hơn đáng kể (P < 0,05) so với tôm được cho ăn D1 và D4 nhưng không có sự khác biệt đáng kể so với tôm được cho ăn D2 (P > 0,05). Hàm lượng lipid cơ của tôm có cùng xu hướng với hàm lượng lipid toàn cơ thể của tôm.

Bảng 5 Thành phần toàn bộ cơ thể và cơ (% chất khô) của tôm sú non trước và sau khi được vận chuyển sống mô phỏng

3.1.3. Hàm lượng carotenoid mô và điểm màu cơ thể

Hàm lượng carotenoid toàn thân, cơ, da và huyết tương của tôm

được trình bày trong Bảng 6. Tôm được cho ăn khẩu phần bổ sung astaxanthin (D2–D3) cho thấy nồng độ carotenoid toàn cơ thể, cơ, da và huyết tương cao hơn (P b 0,05) so với tôm được cho ăn khẩu phần cơ bản và bổ sung β-carotene (D1 và D4–D5). ). Hơn nữa, việc bổ sung cholesterol làm tăng đáng kể nồng độ carotenoid (Pb 0,05) trong toàn bộ cơ thể, cơ, vỏ và huyết tương của tôm trong chế độ ăn có bổ sung astaxanthin (D3 so với D2). Tuy nhiên, việc bổ sung cholesterol chỉ làm tăng đáng kể nồng độ carotenoid (P b 0,05) trong huyết tương chứ không làm tăng đáng kể trong toàn bộ cơ thể, cơ và vỏ tôm trong các chế độ ăn có bổ sung β-carotene (D5 so với D4). Khi kết thúc thử nghiệm cho ăn, màu đỏ của tôm luộc ở nghiệm thức D3 cao hơn các nghiệm thức khác và màu vàng nhạt được quan sát thấy ở nghiệm thức khẩu phần cơ bản (D1) (Bảng 7).

Bảng 6 Hàm lượng tổng carotenoid của toàn bộ cơ thể (mg/g), cơ (mg/g), vỏ (mg/g) và huyết tương (μg/ mL) từ tôm được cho ăn 5 chế độ ăn thử nghiệm.

Bảng 7 Màu sắc quan sát được và điểm màu (SalmoFan™)a đối với P. monodon non được cho ăn năm khẩu phần thử nghiệm.

3.1.4. Hệ số tiêu hóa rõ ràng của các thành phần và năng lượng trong khẩu phần

ADC của chất khô, protein, lipid, carotenoid và năng lượng của khẩu phần thử nghiệm cho P. monodon non được trình bày trong Bảng 8. Không tìm thấy sự khác biệt về ADC của chất khô, protein, năng lượng và carotenoid giữa các khẩu phần thử nghiệm cho P. monodon con (PN 0,05). ADC của carotenoid trong chế độ ăn bổ sung carotenoid (D2–D5) ở mức cao (N90%) và việc bổ sung cholesterol không cải thiện đáng kể ADC carotenoid nữa. ADC của lipid trong chế độ ăn cơ bản thấp hơn đáng kể (P b 0,05) so với lipid trong các chế độ ăn khác, việc bổ sung cholesterol đã cải thiện ADC của lipid trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung β carotene (D4 so với D5) nhưng không cải thiện trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D3 so với Đ2).

Bảng 8 Hệ số tiêu hóa biểu kiến (ADC, %) của năm khẩu phần thí nghiệm về chất khô, protein thô, lipid, carotenoid tổng số và năng lượng.

3.1.5. Hiệu quả duy trì carotenoid mô

Hiệu quả lưu giữ carotenoid trong các mô (toàn bộ cơ thể, cơ và vỏ) được thể hiện trong Bảng 9. Hiệu quả lưu giữ carotenoid tối đa trong các mô đều được quan sát thấy ở tôm được cho ăn D3, khác với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác (P < 0,05), tiếp theo là tôm được cho ăn D2. Việc bổ sung cholesterol đã cải thiện hiệu quả duy trì carotenoid ở mô trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D3 so với D2) nhưng không cải thiện trong các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung β-carotene (D4 so với D5).

Bảng 9 Hiệu suất lưu giữ Carotenoid (%) trên toàn bộ cơ thể, cơ và vỏ tôm được cho ăn 7 chế độ ăn thử nghiệm.

3.1.6. Thông số miễn dịch

Khả năng chống oxy hóa (tổng số lượng tế bào máu và thời gian đông máu của bạch huyết), các thông số stress oxy hóa (hàm lượng malondialdehyd và protein carbonyl của tuyến tiêu hóa) và biểu hiện gen (mức Hsp 70 mRNA và HIF-1α mRNA của tuyến tiêu hóa) của tôm được thể hiện trong Bảng 10. Trong thử nghiệm 1, tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản thấp hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác. Ngược lại, thời gian đông máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác. Trong thử nghiệm 1, hàm lượng malondialdehyd trong tuyến tiêu hóa của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác, hơn nữa, không có sự khác biệt đáng kể (PN 0,05) về hàm lượng malondialdehyd trong tuyến tiêu hóa. tôm trong các nghiệm thức D2–D5. Không có sự khác biệt đáng kể (PN 0,05) về hàm lượng protein carbonyl trong tuyến tiêu hóa của tôm trong số tất cả các chế độ ăn. Trong thử nghiệm 1, không tìm thấy sự khác biệt đáng kể (P N 0,05) trong biểu hiện của Hsp 70 mRNA và HIF-1α mRNA trong tuyến tiêu hóa của tôm trong số tất cả các chế độ ăn.

Bảng 10 Các thông số miễn dịch của tôm bị cảm nhiễm trước và sau khi được vận chuyển sống mô phỏng.

3.2. Thử nghiệm 2

3.2.1. Tỷ lệ sống của tôm trong thử nghiệm khả năng chịu stress tiếp xúc với không khí

Sau 36 giờ mô phỏng vận chuyển sống, không quan sát thấy tôm chết ở bất kỳ nhóm chế độ ăn nào.

3.2.2. Thành phần toàn bộ cơ thể và cơ bắp

Thành phần toàn bộ cơ thể và cơ của tôm được thể hiện trong Bảng 5. Trong thử nghiệm 2, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy về độ ẩm toàn bộ cơ thể và cơ bắp cũng như hàm lượng tro giữa tất cả các chế độ ăn (P N 0,05). Hàm lượng protein toàn cơ thể của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1) thấp hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn D3 nhưng không có sự khác biệt đáng kể so với tôm được cho ăn D2, D4 và D5 (P N 0,05). Hàm lượng lipid toàn cơ thể của tôm được cho ăn D4 và D5 cao hơn đáng kể so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác (P b 0,05). Hàm lượng protein cơ của tôm được cho ăn D2 và D3 cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác (P N 0,05). Hàm lượng lipid cơ của tôm có cùng xu hướng với hàm lượng lipid toàn cơ thể của tôm.

3.2.3. Thông số miễn dịch

Khả năng chống oxy hóa (tổng số lượng tế bào máu và đông máu tan máu), thời gian tan máu, các thông số stress oxy hóa (hàm lượng malondialdehyd và protein carbonyl của tuyến tiêu hóa) và biểu hiện gen (mức Hsp 70 mRNA và HIF-1α mRNA của tuyến tiêu hóa) của tôm được trình bày trong Bảng 10. Trong thử nghiệm 2, tổng số lượng tế bào máu tôm được cho ăn

chế độ ăn cơ bản thấp hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác, hơn nữa, tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D2 và D3) cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản. Chế độ ăn bổ sung β-carotene (D4 và D5). Ngược lại, thời gian đông máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác.

Trong thử nghiệm 2, hàm lượng malondialdehyde và protein carbonyl trong tuyến tiêu hóa của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác, hơn nữa, không có sự khác biệt đáng kể (P N 0,05) được tìm thấy trong malondialdehyd và carbonyl. hàm lượng protein trong tuyến tiêu hóa của tôm ở nghiệm thức D2–D5.

Trong thử nghiệm 2, biểu hiện Hsp 70 mRNA của tuyến tiêu hóa của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác, hơn nữa, không tìm thấy sự khác biệt đáng kể (P N 0,05) trong biểu hiện Hsp 70 mRNA của tuyến tiêu hóa của tôm trong số các nghiệm thức D2–D5. Hồ sơ biểu hiện của HIF-1α mRNA của tuyến tiêu hóa của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản thấp hơn đáng kể (P b 0,05) so với tôm được cho ăn các chế độ ăn khác, hơn nữa, việc bổ sung cholesterol đã cải thiện đáng kể nồng độ HIF-1α mRNA của tuyến tiêu hóa trong astaxanthin và Phương pháp điều trị bằng chế độ ăn bổ sung β-carotene (D3 so với D2; D5 so với D4)

4.Thảo luận

4.1. Hiệu suất tăng trưởng của tôm

Trong nghiên cứu này, hiệu suất tăng trưởng của P. monodon bị ảnh hưởng bởi các chế độ ăn thử nghiệm khác nhau (Bảng 4). Segner và cộng sự. (1989) cho rằng carotenoid có vai trò tích cực trong quá trình trao đổi chất trung gian và có tác dụng có lợi đối với sự phát triển của động vật thủy sản. Tương tự, Amar et al. (2001) và Niu và cộng sự. (2009) báo cáo rằng carotenoid trong chế độ ăn uống, đóng vai trò là nguồn sắc tố, cũng có thể tăng cường sử dụng chất dinh dưỡng và cuối cùng có thể giúp cải thiện sự phát triển của tôm. Các nguồn carotenoid trong chế độ ăn khác nhau có kết quả khác nhau đối với sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm. Trong công việc của Yamada et al. (1990), astaxanthin được báo cáo là có hiệu quả hơn đối với sắc tố ở Penaeus japonicus so với β-carotene hoặc canthaxanthin. Cũng với P japonicus, Chien và Jeng (1992) đã báo cáo tỷ lệ sống cao hơn ở tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung astaxanthin so với tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung β carotene hoặc tảo. Điều này phù hợp với kết quả hiện tại.

4.2. Thành phần mô của tôm

Trong thí nghiệm hiện tại, các phân tích hóa học cho thấy mức tăng nhỏ hơn của protein toàn cơ thể và cơ bắp nhờ astaxanthin hoặc β-carotene trong chế độ ăn, đồng thời hàm lượng lipid toàn cơ thể và cơ bắp của tôm từ thử nghiệm 2 (thử nghiệm khả năng chịu đựng căng thẳng khi tiếp xúc với không khí) cho thấy thấp hơn (P b 0,05). ) so với tôm ở thử nghiệm 1 (thời gian nuôi bình thường) (Bảng 5). Hơn nữa, hàm lượng chất béo cao hơn đáng kể ở tôm được cho ăn chế độ ăn có chứa β-carotene (D4 và D5) so với chế độ ăn cơ bản và chứa astaxanthin (D1, D2 và D3). Vitamin A tham gia rộng rãi vào các quá trình sinh hóa khác nhau trong cơ thể và β-carotene có thể được chuyển hóa thành vitamin A như một nguồn vitamin A chính (Ong và Chytil, 1975). Trong nghiên cứu của Yang et al. (2007) cũng chỉ ra rằng hàm lượng lipid và protein toàn cơ thể của tôm thẻ Litopenaeus vannamei bị ảnh hưởng tích cực bởi việc bổ sung vitamin A trong khẩu phần ăn. Singh và cộng sự. (1969) đã tìm thấy axit béo tự do trong huyết tương tăng cao và lipid gan tăng ở chuột được cho ăn vitamin A và cho rằng những thay đổi này là do sự huy động axit béo từ mô mỡ. Trong nghiên cứu của Shiau và Chen (2000), hàm lượng chất béo trong cơ thể cao và nồng độ chất béo trung tính trong máu giảm cũng được tìm thấy ở tôm được cho ăn chế độ ăn nhiều vitamin A. Tuy nhiên, một hiện tượng ngược lại đã được báo cáo ở cá và tỷ lệ mỡ trong cơ thể giảm ở cá hồi được cho ăn chế độ ăn dư thừa vitamin A (Poston, 1970). Cơ chế của carotenoid trong chế độ ăn đối với dinh dưỡng lipid ở động vật giáp xác cần được nghiên cứu thêm.

4.3. Sinh khả dụng của astaxanthin và β-carotene

Trong thí nghiệm hiện tại, ADC cao và hiệu quả lưu giữ carotenoids ở mức độ thấp có nghĩa là astaxanthin trong chế độ ăn uống có thể được tiêu hóa hiệu quả trong đường tiêu hóa của P. monodon, nhưng không thể tích tụ trong các mô dưới dạng sắc tố. Điều này có thể một phần là do sự kết hợp thấp của carotenoids vào chylomicron, sự bài tiết thấp carotenoids và các chất chuyển hóa của chúng liên quan đến chylomicron vào bạch huyết, hoặc sự chuyển hóa trao đổi chất thành các hợp chất không màu mà cuối cùng có thể được bài tiết (Van Het Hof và cộng sự, 2000). Về cơ chế mà việc bổ sung cholesterol trong chế độ ăn có thể có tác dụng làm tăng khả dụng sinh học của astaxanthin ở tôm, có thể kết luận rằng, trước hết, sự hiện diện của cholesterol trong chế độ ăn trong ruột sẽ kích thích giải phóng axit mật (Horton và cộng sự, 1995). Việc đưa axit mật vào chế độ ăn của chồn sương (Lakshman và cộng sự, 1996) và chuột (Schweigert và cộng sự, 2002) làm tăng đáng kể sự hấp thụ và tích lũy mô của carotenoids. Đặc tính lưỡng tính của axit mật rất quan trọng trong lòng ruột để hình thành các mixen và liposome hỗn hợp trong quá trình nhũ hóa và tiêu hóa lipid và các hợp chất hòa tan trong lipid như astaxanthin (Ódoherty et al., 1973). Hơn nữa, một nghiên cứu được báo cáo gần đây của Tyssandier et al. (2001) chỉ ra rằng lipid mật được cho là lipid duy nhất hòa tan carotenoid trong pha nước của ruột, có thể ảnh hưởng đến việc vận chuyển carotenoid. Thứ hai, cholesterol trong chế độ ăn uống có thể thúc đẩy việc vận chuyển carotenoid bằng cách tăng sự hình thành lipoprotein. Trong tế bào ruột, carotenoids được kết hợp thành chylomicron, chylomicron cuối cùng được đưa vào máu và carotenoids chủ yếu được vận chuyển bởi lipoprotein, đặc biệt là lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) trong máu (Deming và Erdman, 1999; Herbeth et al., 2007) . Hơn nữa, apolipoprotein B là protein cấu trúc chính của VLDL và chylomicron, và cholesterol là yếu tố quyết định quan trọng của quá trình tổng hợp apolipoprotein B (Kumar và cộng sự, 1992). Hơn nữa, sự gia tăng cholesterol trong chế độ ăn uống cũng có thể ảnh hưởng đến việc tái chế lipoprotein ở gan thông qua việc điều chỉnh giảm hoạt động của thụ thể LDL ở gan (Karnaukhov, 1979)

Tuy nhiên, nghiên cứu này không tìm thấy tác dụng tích cực nào của cholesterol trong chế độ ăn đối với β-carotene. Về tình trạng khác nhau giữa astaxanthin và β-carotene, trước hết có thể là do các phân lớp khác nhau của astaxanthin và β-carotene. Astaxanthin là hợp chất phân cực hơn và β-carotene thuộc nhóm caroten hydrocarbon không phân cực (Yeum và Russell, 2002). Có thể là các carotenoid ít phân cực hơn, chủ yếu nằm ở bề mặt lipoprotein của các giọt lipid, dễ dàng được vận chuyển hơn so với các carotenoid ít phân cực hơn, chủ yếu nằm ở lõi lipoprotein của các giọt (Tyssandier và cộng sự, 2001). Van Het Hof và cộng sự. (2000) tuyên bố rằng sự phá vỡ cấu trúc thực phẩm và giải phóng carotenoid là bước đầu tiên trong quá trình hấp thụ carotenoid; và bước thứ hai trong quá trình hấp thụ carotenoid có thể ảnh hưởng đến khả dụng sinh học của chúng liên quan đến việc kết hợp các carotenoid được giải phóng vào các mixen hỗn hợp. Là các hợp chất hòa tan trong lipid, việc tiêu thụ chất béo cùng với carotenoid được cho là rất quan trọng. Một lượng lớn chất béo giàu carotenoid được bổ sung vào bữa ăn (3 g chất béo/bữa ăn) có hiệu quả tương đương với một lượng chất béo giàu carotenoid (35 g chất béo/bữa) trong việc tăng cường nồng độ α-carotene và β-carotene trong huyết tương; tuy nhiên, đối với hợp chất phân cực của lutein, được thêm vào dưới dạng este lutein, phản ứng trong huyết tương cao hơn 100% sau khi tiêu thụ toàn bộ chất béo (Van Het Hof và cộng sự, 2000). Do đó, lượng cholesterol trong chế độ ăn cần thiết để đảm bảo sự hấp thụ carotenoid dường như phụ thuộc vào đặc tính hóa lý của carotenoid được ăn vào, đặc biệt là đối với β-carotene hiện tại không mang lại khả dụng sinh học tương tự như quan sát được đối với astaxanthin hiện tại. Hơn nữa, sự hấp thu của các phân lớp carotenoid khác nhau được kích hoạt bằng các con đường khác nhau chẳng hạn như các chất vận chuyển khác nhau, chẳng hạn như ở người, sự hấp thụ β-carotene bị hạn chế bởi lyso-phosphatidylcholine chứ không phải bởi cholesterol (During và cộng sự, 2005). Thứ hai, như chúng ta biết rằng β-carotene là tiền chất dinh dưỡng của vitamin A, β-carotene có thể được phân cắt để tạo ra hai phân tử vitamin A (retinol) trong ruột (Wolf, 1984). Một tỷ lệ lớn β-carotene tiêu thụ được hấp thu nguyên vẹn, chuyển hóa thành vitamin A hoặc bài tiết (Parker, 1996).

4.4. Khả năng chống oxy hóa của astaxanthin và β-carotene

Tăng cường sức đề kháng của tôm he trước tình trạng căng thẳng do thiếu oxy (Chien và cộng sự, 1999; Niu và cộng sự, 2009), stress do độ mặn (Chien và cộng sự, 2003), stress do amoniac (Pan và cộng sự, 2003a) và một lần nữa, tiếp xúc với không khí trong quá trình vận chuyển sống mô phỏng trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi được phát hiện có liên quan đến carotenoid trong chế độ ăn uống. Cho dù trong thử nghiệm 1 hay thử nghiệm 2, MDA được coi là chỉ số về quá trình peroxid hóa lipid ở tôm được cho ăn chế độ ăn có chứa carotenoid (D2–D5) đều thấp hơn đáng kể so với tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1); hơn nữa, hàm lượng MDA và protein carbonyl trong tuyến tiêu hóa của tôm từ thử nghiệm 2 là mức cao hơn (P b 0,05) (Bảng 10). Carotenoid có đặc tính dập tắt oxy nhóm đơn tốt và có thể đóng vai trò là chất chống oxy hóa trong các hệ thống chứa axit béo không bão hòa bằng cách dập tắt các gốc tự do (Martin và cộng sự, 1993). Điều này cho thấy rằng carotenoid có thể dùng để bảo vệ các axit béo không bão hòa đa của các mô khỏi tác động bất lợi của quá trình oxy hóa, đặc biệt đối với tôm khi bị thiếu oxy. Việc coi protein carbonyl là dấu ấn sinh học về tổn hại oxy hóa đối với protein là khá gần đây đối với cá (Parvez và Raisuddin, 2005) và không được sử dụng phổ biến cho tôm. Tuy nhiên, sự biến đổi oxy hóa của protein là một trong nhiều hậu quả của stress oxy hóa (Stadtman, 1986), và việc xét nghiệm các nhóm carbonyl trong protein cung cấp một kỹ thuật thuận tiện để phát hiện và định lượng stress oxy hóa (Levine và cộng sự, 1994). Nhìn chung, tất cả những điều này đều hỗ trợ mức độ căng thẳng oxy hóa thấp hơn ở tôm được cho ăn chế độ ăn có chứa carotenoid (D2-D5) so với chế độ ăn cơ bản (D1). Tổng số lượng tế bào máu và thời gian đông máu cũng được sử dụng làm chỉ số đánh giá sức khỏe của giáp xác (Fotedar et al., 2001). Thời gian đông máu và số lượng tế bào máu tuần hoàn đã được báo cáo là thay đổi ở giáp xác do thời gian lưu giữ trong bể bảo quản và vận chuyển sống (Fotedar et al., 2006; Le Moullac và Haffner, 2000). Tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn các chế độ ăn cơ bản và bổ sung β-carotene (D1, D4 và D5) giảm đáng kể (P b 0,05) sau 36 giờ vận chuyển sống mô phỏng trong khi nó không thay đổi ở tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung astaxanthin (D2 và Đ3). Thời gian đông máu của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản (D1) tăng đáng kể (P b 0,05) sau khi vận chuyển sống mô phỏng và không thay đổi ở tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung carotenoid (D2-D5) (Bảng 10). Sự suy giảm tổng số lượng tế bào máu sau khi tiếp xúc với không khí trong quá trình vận chuyển sống mô phỏng có thể liên quan đến sự ly giải tế bào máu do các hoạt động phòng vệ (van de Braak và cộng sự, 2002). Đối với tổng số lượng tế bào máu của tôm được cho ăn khẩu phần chứa astaxanthin (D2 và D3) không giảm sau khi vận chuyển sống mô phỏng. Sequeira và cộng sự. (1996) chỉ ra rằng tế bào máu P. japonicus có khả năng sinh sôi nảy nở và tốc độ sinh sôi nảy nở có thể tăng gấp ba lần khi tôm được cho ăn chất kích thích miễn dịch. Trong nghiên cứu hiện tại, việc kết hợp astaxanthin trong chế độ ăn có thể kích thích và tăng tốc độ tăng sinh của tế bào máu của tôm để bù đắp cho sự mất tế bào máu do tiếp xúc với không khí trong quá trình vận chuyển sống mô phỏng, dẫn đến tổng tỷ lệ số lượng tế bào máu không đổi. Việc tiếp xúc với không khí đã được chứng minh là làm giảm tình trạng sức khỏe của tôm hùm đá (Panucilus lygnus) (Fotedar et al., 2001). Thử nghiệm 2 cho thấy tôm được cho ăn chế độ ăn có chứa astaxanthin (D2 và D3) khỏe mạnh hơn tôm được cho ăn các chế độ ăn khác được biểu thị bằng tổng số lượng tế bào máu cao hơn và thời gian đông máu bạch huyết thấp hơn sau 36 giờ vận chuyển sống mô phỏng.

4.5. Biểu hiện gen của Hsp 70 và HIF-1α

Hsp 70 là một người đi kèm phân tử được bảo tồn cao về mặt tiến hóa, là một phần quan trọng trong bộ máy gấp protein của tế bào, có thể hỗ trợ sửa chữa và bảo vệ protein của tế bào khỏi tổn thương do căng thẳng gây ra và giảm thiểu sự tổng hợp protein (Franzellitti và Fabbri, 2005). Woo và cộng sự. (2011) và Xu và cộng sự. (2011) chỉ ra rằng tình trạng thiếu oxy thể hiện mức độ căng thẳng cao có thể dẫn đến việc tạo ra các gen liên quan đến phản ứng của tế bào như protein sốc nhiệt. Mức độ biểu hiện của Hsp 70 mRNA được điều chỉnh tăng đáng kể trong tình trạng thiếu oxy so với Normoxia ở tôm được cho ăn tất cả các chế độ ăn thử nghiệm; tuy nhiên, mức độ biểu hiện Hsp 70 mRNA của tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản cao hơn đáng kể so với tôm được cho ăn chế độ ăn có chứa carotenoid (D2–D5) trong điều kiện thiếu oxy, điều này chứng tỏ rằng astaxanthin hoặc β-carotene trong chế độ ăn có thể làm giảm một phần tình trạng thiếu oxy phản ứng căng thẳng. Người ta biết rất ít về sự hiện diện và vai trò của HIF-1 trong điều kiện thiếu oxy ở động vật giáp xác. Heidbreder và cộng sự. (2003) đề xuất rằng HIF-1α có thể góp phần bảo vệ trong khoảng thời gian sớm và/hoặc tình trạng thiếu oxy vừa phải hoặc chống lại tình trạng thiếu oxy nghiêm trọng và/hoặc kéo dài. Treinin và cộng sự. (2003) đã chứng minh rằng HIF-1α là yếu tố phiên mã quy định hàng chục gen liên quan đến phản ứng với tình trạng thiếu oxy, những phản ứng phân tử này sau đó sẽ tạo thành một loạt các điều chỉnh sinh hóa và sinh lý, giúp động vật sống sót tốt hơn trong điều kiện thiếu oxy. Trong thí nghiệm hiện tại, mức độ biểu hiện của HIF-1α mRNA của tôm đã giảm đáng kể trong tình trạng thiếu oxy so với Normoxia ở tôm được cho ăn tất cả các chế độ ăn thử nghiệm, tuy nhiên, mức độ biểu hiện của HIF-1α mRNA của tôm được cho ăn có chứa astaxanthin hoặc β-carotene chế độ ăn cao hơn so với tôm được cho ăn chế độ ăn cơ bản trong điều kiện thiếu oxy, điều này cũng chỉ ra rằng astaxanthin hoặc β-carotene trong chế độ ăn có thể làm giảm một phần phản ứng căng thẳng do thiếu oxy ở P. monodon bằng cách tăng cường hiệu quả hoặc tiện ích của việc vận chuyển oxy.

5.Kết luận

Tóm lại, dữ liệu về thử nghiệm tăng trưởng và phản ứng miễn dịch cho thấy astaxanthin tốt hơn β-carotene trong việc cải thiện hiệu suất tăng trưởng, tình trạng sức khỏe và khả năng phòng vệ trước tình trạng căng thẳng khi tiếp xúc với không khí. Việc thay thế phương pháp điều trị bằng astaxanthin bằng kháng sinh có thể cung cấp các kỹ thuật nuôi mới, an toàn và hiệu quả có giá trị cho nuôi trồng thủy sản trong trang trại trong tương lai gần. Hơn nữa, việc bổ sung cholesterol có thể nâng cao hiệu quả của astaxanthin một cách tích cực chứ không phải β-carotene.

Nguồn: Comparison effect of dietary astaxanthin and β-carotene in the presence and absence of cholesterol supplementation on growth performance, antioxidant capacity and gene expression of Penaeus monodon under normoxia and hypoxia condition
Jin Niu a,⁎, Hua Wen c, Chun-Hou Li a, Yong-Jian Liu b, Li-Xia Tian b, Xu Chen a, Zhong Huang a, Hei-Zhao Lin