Nano đồng oxit (CuO-NP) được cho ăn giúp tăng đề kháng chống chọi vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi
Thuốc kháng sinh gần đây đã được thay thế bằng các hạt nano trong nhiều ứng dụng y tế. Mục tiêu chính của nghiên cứu này là đánh giá khả năng sử dụng hiệu quả các hạt nano đồng oxit đối với của cá rô phi sông Nin bằng cách xem xét hiệu suất tăng trưởng, những thay đổi cụ thể trong sinh hóa huyết thanh, biểu hiện gen gây viêm, phản ứng miễn dịch, phép đo hình thái ruột và khả năng chống lại thử thách của A. hydrophila. Một trăm ba mươi lăm con cá rô phi sông Nin đơn tính, nặng trung bình 19,1 ± 0,2g, đã được sử dụng trong thí nghiệm này. Cá được chia thành ba nhóm. Nhóm 2 và 3 được cho ăn chế độ ăn có chứa 2 và 4 mg CuO-NP / kg, trong khi nhóm đối chứng được cho ăn chế độ ăn tiêu chuẩn với 4 mg/kg đồng vô cơ. Đây là lần đầu tiên nano đồng oxit (CuO-NP) được sử dụng vào chế độ ăn của O. niloticus với sự thay thế một phần đồng dạng thông thường, điều quan trọng là kết quả của chúng tôi cho thấy hiệu suất tăng trưởng đã được cải thiện. So với nhóm đối chứng, nhóm cá được cho ăn chế độ ăn có chứa 2 hoặc 4 mg CuO-NP/kg cho thấy các thông số hiệu quả thức ăn, khả năng chống lại thử thách với A. hydrophila, phép đo hình thái ruột và các thông số đáp ứng miễn dịch (thực bào, lysozyme và hoạt động diệt khuẩn) tốt hơn. Các giá trị tốt nhất (p˂0,05) thu được bằng cách bổ sung CuO-NP thấp (chế độ ăn 2mg/kg). Ngoài ra, so với nhóm đối chứng, liều bổ sung CuONP thấp hơn đã điều chỉnh giảm đáng kể (p˂0,05) các gen CYP1A và IL-1β và làm giảm mức cholesterol trong huyết thanh. Tóm lại, đây là lần đầu tiên CuO-NP được sử dụng vào chế độ ăn của O. niloticus với sự thay thế một phần đồng dạng thông thường, điều quan trọng là kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc cho O. niloticus ăn 2 mg CuO-NP/kg cải thiện sự tăng trưởng, hệ thống miễn dịch và sức khỏe tổng thể của chúng. Tương tự như vậy, nano đồng oxit CuO-NP đã chứng minh được kết quả điều trị đầy hứa hẹn, khuyến khích việc cân nhắc thay thế việc sử dụng kháng sinh hoặc các loại thuốc khác trong chế độ ăn của cá bằng nuôi trồng thủy sản bền vững.
- Giới thiệu
Cá rô phi là loài cá được nuôi rộng rãi nhất trên toàn cầu cho mục đích thương mại [1] do chất lượng thịt đặc biệt, tăng trưởng nhanh và phù hợp rộng rãi cho sản xuất thâm canh. Ai Cập được công nhận trên toàn cầu là nhà sản xuất cá rô phi hàng đầu. Chế độ ăn uống cân bằng là yếu tố quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Cả cá và động vật có vú đều cần khoáng chất trong chế độ ăn để thúc đẩy tăng trưởng và tăng cường sức khỏe tổng thể. Những trở ngại chính đối với việc mở rộng nuôi trồng thủy sản bền vững là các bệnh ở cá gây ra tổn thất tài chính hàng năm đáng kể. Nhiễm trùng Aeromonas là nguyên nhân gây ra nhiều loại bệnh ở cả cá và người. Điều này là do các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở cá có cơ chế lây lan bệnh riêng biệt [2, 3]. Tỷ lệ mắc bệnh có liên quan đến các trường hợp căng thẳng, chẳng hạn như đối phó với tình trạng quá tải theo cách thù địch và gặp phải chất lượng nước kém, có thể dẫn đến các trường hợp nghiêm trọng và lan rộng [4, 5]. A. hydrophila, một loài Aeromonas spp., lây lan rộng rãi và thường bị cô lập [6]. Cá bị nhiễm bệnh có thể chết vì các mầm bệnh này. Ngoài ra, nó còn gây ra bệnh nhiễm trùng huyết xuất huyết và hội chứng loét dịch tễ [7], dẫn đến tổn thất tài chính đáng kể trong nuôi trồng thủy sản [8] và phá vỡ hệ vi khuẩn đường ruột của cá [9]
Tính gây bệnh của A. hydrophila rất đa dạng, bắt nguồn từ việc tiếp nhận nhiều thành phần khác nhau giúp tăng cường khả năng gây bệnh của nó. Các thành phần này bao gồm độc tố tế bào, chất kết dính, lipase, protease, hylA, khả năng hình thành màng sinh học và biểu hiện các yếu tố độc lực cụ thể [4,10]. Gen mã hóa aerolysin, được cho là một trong những chủng A. hydrophila mạnh nhất, được cho là tạo ra một loại protein hòa tan, ưa nước và ngoại bào có cả khả năng phân hủy tế bào và tan máu. Ngoài ra, nó gây tan máu thông qua liên kết có thẩm quyền với protein và có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của bệnh A. hydrophila ở cá [11]. Chỉ một số lượng hạn chế các loại kháng sinh có hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, các loại thuốc này dần dần phát triển khả năng kháng thuốc, đòi hỏi phải khám phá các hợp chất mới để chống lại các bệnh do vi khuẩn. Cả cá và các loại gia súc khác đều cần nhiều đồng (Cu) hơn trong chế độ ăn của chúng. Theo nghiên cứu do [12, 13] thực hiện, đồng được coi là một kim loại vi lượng thiết yếu đóng vai trò như một coenzym hỗ trợ quá trình hình thành máu, sản xuất collagen và quá trình trao đổi chất. Cá có thể đồng hóa đồng từ nước qua mang hoặc từ chế độ ăn qua ruột. Thông thường, các chế phẩm đồng có nguồn gốc từ nước không đáp ứng đầy đủ nhu cầu của cá rô phi sông Nin; do đó, cần bổ sung đồng. Các chất phụ gia thức ăn thông thường như bột cá và nguồn protein thực vật không có đủ hàm lượng đồng và không đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của cá [14]. Do đó, điều cần thiết là phải bổ sung đồng vào thức ăn cho cá để điều chỉnh mức đồng theo nhu cầu cụ thể của cá. Nhu cầu khoáng chất trong nuôi trồng thủy sản chịu ảnh hưởng của một số yếu tố, chẳng hạn như loại cá, độ tuổi và phương pháp cho ăn [15, 16, 17] nêu rằng cá rô phi cần 5 mg/kg đồng trong thức ăn của chúng trên cơ sở vật chất khô. Lượng này cao hơn mức bổ sung đồng trong chế độ ăn uống được khuyến nghị là 4 mg/kg thức ăn theo [17].
Khi lựa chọn nguồn đồng để bổ sung thức ăn, khả dụng sinh học của đồng từ nhiều nguồn đồng khác nhau được coi là yếu tố quan trọng cần tính đến [18]. Do khả dụng sinh học cao, đồng ít có trong các chất bổ sung chế độ ăn cho cá và được bài tiết qua chất thải, tích tụ, làm ô nhiễm nguồn nước đang dâng cao và ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của cá. Nguồn bổ sung đồng phổ biến nhất được sử dụng cho những thay đổi về phát triển và phản ứng kháng thuốc là các muối đồng vô cơ như đồng sunfat, oxit và clorua. Nhìn chung, vật liệu nano có những đặc tính đặc biệt như kích thước nhỏ, diện tích bề mặt lớn và đường kính lỗ rỗng đồng nhất giúp tăng cường cơ chế hấp thụ và bỏ qua tế bào [19]. Hiện nay, các hạt nano kim loại được sử dụng trong một số lĩnh vực như ứng dụng nông nghiệp, công nghiệp, y tế, thức ăn chăn nuôi và thủy sản [20]. Các hạt nano đồng oxit (CuO-NP) là các kim loại nano có ý nghĩa rất quan trọng vì đặc tính kháng khuẩn và ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y sinh học [21]. Việc sử dụng nano đồng oxit làm chất bổ sung chế độ ăn cho cá và gà thịt có thể tăng cường tăng trưởng, hoạt động như một chất chống oxy hóa và kích thích phản ứng miễn dịch.
Tuy nhiên, có rất ít bằng chứng có sẵn về chủ đề này. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nano đồng oxit làm tăng trưởng và phản ứng miễn dịch ở cá, đặc biệt là cá tráp biển đỏ và cá rô phi sông Nin, so với muối Cu vô cơ [13, 22]. Mục đích của thử nghiệm trình diễn là làm sáng tỏ tác động của việc thay thế đồng vô cơ bằng các mức CuO-NP khác nhau đối với hiệu suất, phản ứng miễn dịch, cấu trúc ruột, biểu hiện của gen gây viêm, các thông số sinh hóa huyết thanh và khả năng chống lại nhiễm trùng A. hydrophilia ở O. niloticus.
- Vật liệu và phương pháp
2.1. Mẫu cá
Tổng cộng khoảng năm mươi con O.niloticus, cả bị nhiễm bệnh và có vẻ khỏe mạnh, được lấy từ các trang trại nuôi cá ở tỉnh Kafr El-Sheikh. Cá được cẩn thận đặt trong túi polyethylene sạch, sau đó được niêm phong và nhanh chóng vận chuyển đến Phòng thí nghiệm Kafr El-Sheikh trong điều kiện vô trùng.
2.2. Kiểm tra cá
Kiểm tra lâm sàng và sau khi chết được thực hiện theo [23].
2.3. Nhận dạng vi khuẩn và sinh hóa
Tăm bông thu thập từ vết loét da và mẫu lấy từ thận, gan và lá lách được nuôi cấy trong môi trường cơ bản Aeromonas (Oxoid, Ltd) bổ sung ampicillin, môi trường Rimler-Shotts (R.S) và thạch đậu nành Tryptic. Các nền nuôi cấy này được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh hóa theo [24].
2.4 Nhận dạng phân tử và đặc điểm của A. hydrophila bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Bằng cách phát hiện 16 sRNA và gen độc lực nổi tiếng nhất của A. hydrophila bằng PCR thông thường như thể hiện trong bảng (1)
2.4.1. Chiết xuất DNA: Bằng cách sử dụng bộ dụng cụ QIAamp DNA Mini (Qiagen, Đức, GmbH) để chiết xuất DNA từ các mẫu.
2.4.2. Mồi oligonucleotide: Như được liệt kê trong bảng (1), các mồi được sử dụng được cung cấp từ Metabion (Đức).
2.4.3. Khuếch đại PCR: Bằng cách sử dụng các mồi như thể hiện trong Bảng (1) EmeraldAmp Max PCR Master Mix (Takara, Nhật Bản). Phản ứng được thực hiện trong máy chu trình nhiệt Applied biosystem 2720.
2.4.4. Phân tích các sản phẩm PCR: Các mục của PCR được phân lập bằng điện di trên gel agarose 1,5% (Applichem, Đức, GmbH) và thông tin được phân tích thông qua phần mềm máy tính.
Bảng 1: Trình tự mồi, gen mục tiêu, kích thước amplicon và điều kiện chu kỳ
2.5. Cá thí nghiệm
Tổng cộng 135 con cá O. niloticus khỏe mạnh (trọng lượng trung bình: 19,1 ± 0,2 g) được lấy từ một trang trại cá tư nhân nằm ở Tỉnh Kafrelsheikh, Ai Cập. Những con cá này được chuyển đến cơ sở của Viện nghiên cứu sức khỏe động vật ở Tỉnh Kafrelsheikh. Chúng được đặt trong một bể thông gió tốt và được nuôi trong bể kính có kích thước 50 × 40 × 40 cm. Các bể được cung cấp nước máy đã được xử lý để loại bỏ clo. Nhiệt độ nước được duy trì ở mức không đổi là 25 ± 2 °C và sử dụng máy bơm điện để đảm bảo sục khí liên tục. Các mảnh vụn được loại bỏ và một nửa lượng nước được thay thế hàng ngày và thay thế hoàn toàn hai lần một tuần. Cá trải qua thời gian thích nghi kéo dài 14 ngày. Trong suốt giai đoạn thích nghi, cá được cung cấp chế độ ăn cơ bản không giới hạn.
2.6. Thí nghiệm
Thiết kế và Quy trình Chế độ ăn cơ bản (Bảng 2) được chuẩn bị để cung cấp 30% protein và 3265 Kcal DE/kg. Cá được chia thành ba nhóm khác nhau. Nhóm đầu tiên được cho ăn chế độ ăn có chứa 4mg đồng vô cơ trên một kilôgam thức ăn. Đồng này được lấy từ đồng sunfat do Công ty El-Gomhoria, Ai Cập sản xuất. Lượng đồng được điều chỉnh để đáp ứng nhu cầu đồng của cá rô phi sông Nin, theo [17]. Nhóm thứ 2 và thứ 3 được cho ăn chế độ ăn bổ sung lần lượt 2 và 4 mg/kg nano đồng oxit CuO-NP. Các hạt nano này do Công ty Mknano (M K Impex Corp., Canada) sản xuất và có kích thước 30nm. Thức ăn được sản xuất bằng viên có kích thước 2mm. Cá được cho ăn thủ công hai lần một ngày, từ 9:00 đến 14:00, cho đến khi chúng có vẻ hài lòng về mặt thị giác. Cá trong mỗi nhóm ban đầu được cân (W0) và sau đó được cân hai tuần một lần trong 8 tuần liên tiếp.
Bảng 2: Thành phần vật lý và hóa học của chế độ ăn cơ bản
*Hỗn hợp vitamin – mỗi kg chứa: vitamin A 12000000 IU, vitamin D3 2200000 IU, vitamin E 10 g, vitamin K3 2 g, vitamin B1 1 g, vitamin B2 5 g, vitamin B6 1,5 g, vitamin B12 0,01 g, vitamin C 250 g, Niacin 30 g, Biotin 0,050 g, Axit folic 1 g và Axit pantothenic 10 g và chất mang đến 1000 g. **Hỗn hợp khoáng chất – mỗi kg chứa: Mn 60 g, Cu 4 g (sử dụng đồng sunfat làm nguồn vô cơ cho nhóm đầu tiên và thay thế bằng CuO-NPs cho nhóm 2 và 3), Zn 50 g, Sắt 5 g, I 1 g, Co 0,1 g, Se 0,1 g, chất mang CaCO3 đến 1000 g. ***Năng lượng tiêu hóa: Protein (4,49 Kca/g), Chiết xuất ete (8,5 kcal/g), Carbohydrate (3,48 Kcal/g) [29]. ****Tỷ lệ P/E = mg protein/Kcal của DE [17] .
2.7. Hiệu suất tăng trưởng
Azab và cộng sự (2018) đã xác định các thông số tăng trưởng bằng các phương trình sau:
2.8. Xác định các thông số sinh hóa huyết thanh
Vào cuối thử nghiệm tăng trưởng, sáu mẫu máu được thu thập từ mỗi nhóm mà không sử dụng chất chống đông để tách huyết thanh. Huyết thanh thu thập được sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -18 ◦C để đánh giá mức cholesterol huyết thanh, hoạt động của các enzym gan và các dấu hiệu miễn dịch. Mức cholesterol huyết thanh và hoạt động AST, ALT huyết thanh được định lượng bằng các bộ dụng cụ có sẵn trên thị trường do Bio Diagnostic (Thuốc thử chẩn đoán và nghiên cứu) sản xuất.
2.9. Xác định các thông số miễn dịch
Hoạt động diệt khuẩn và lysozyme huyết thanh được xác định theo [29, 30], tương ứng. Sáu mẫu máu được lấy từ mỗi nhóm bằng cách sử dụng natri citrat làm chất chống đông. Các mẫu này sau đó được sử dụng để xác định chỉ số và hoạt động thực bào, sử dụng phương pháp được mô tả bởi [31].
2.10. Phân tích biểu hiện gen bằng PCR thời gian thực
Tổng cộng sáu mẫu máu được lấy từ mỗi nhóm, với hai mẫu thu được từ mỗi lần sao chép. Để ngăn ngừa nhiễm bẩn DNA bộ gen, tổng RNA được phân lập bằng bộ dụng cụ tinh chế RNA toàn diện (Jena Bioscience) và sau đó được xử lý bằng DNAse I. Chuỗi cDNA ban đầu được tổng hợp bằng cách sử dụng phiên mã ngược M-MuLV từ SibEnzyme Ltd. và một đoạn mồi oligo-dT12–18 từ Bio Basic Inc. Các sản phẩm cDNA được pha loãng đến nồng độ 200 ng/μl để chuẩn bị cho quá trình khuếch đại PCR thời gian thực tiếp theo bằng cách sử dụng các đoạn mồi gen; IL-1β (FGATGACGACAAGCCAACCCT và RGCTGATGTACCAGTTGGGGT), CYP1A (FGCAAATGGCTGCTGCTTGTCA và RGTGTATCAAGGGTTCATGCCCT), và β-actin (FAGGGTGTGATGGTGGGTATG và RCTCAGCTCGTTGTAGAAGGTGT) làm đối chứng nội bộ. Mức mRNA tương đối của gen được tính bằng phương pháp 2 −ΔΔCT được chuẩn hóa theo β-actin [32] .
2.11. Kiểm tra mô bệnh học
Ba con cá từ mỗi nhóm được chọn và phần ruột trước, giữa và sau của chúng được loại bỏ. Các phần này được bảo quản ngay lập tức trong dung dịch formalin 10%, khử nước bằng 100% ethanol, nhúng trong parafin và sau đó cắt thành các lát dày 3μm. Cuối cùng, các lát được nhuộm bằng thuốc nhuộm hematoxylin và eosin. Các phần gan lách và ruột được phân tích để tìm các biến đổi mô học, như được chỉ ra bởi [33].
2.12. Thu thập mẫu thức ăn và phân tích hóa học
Vào đầu, giữa và cuối thời gian thử nghiệm, các mẫu thức ăn từ mỗi chế độ ăn được thu thập và giữ ở nhiệt độ -4oC để nghiên cứu thêm về thành phần của chúng. Mức độ vật chất khô, tro, protein thô và chiết xuất ete được đo bằng các kỹ thuật chuẩn hóa do Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức thiết lập [34]. Phân tích canxi được tiến hành theo phương pháp được mô tả bởi [35], trong khi phân tích phốt pho được thực hiện bằng phương pháp được đề xuất bởi [36] .
2.13. Nhiễm trùng thử thách
Một phân lập A. hydrophila được nuôi cấy qua đêm trong môi trường tryptone soya ở 28 °C. Sau đó, nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 3000 ×g trong 10 phút ở 4 °C. Viên tế bào thu được được rửa hai lần và huyền phù trong dung dịch muối sinh lý vô trùng. Huyền phù được điều chỉnh đến nồng độ 1×107 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên một mililít (CFU/ml). Trong tuần thứ 8 của thí nghiệm, cá ở cả nhóm điều trị và nhóm đối chứng đều được tiêm phúc mạc (IP) với 0,2 ml huyền phù A. hydrophila. Tử vong được quan sát trong thời gian 14 ngày. Các triệu chứng lâm sàng và phát hiện sau khi chết ở cá đã chết và cá bệnh nặng được ghi lại theo hướng dẫn của [23] Noga.
2.14. Phân tích thống kê
Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn). Ý nghĩa của dữ liệu được đánh giá bằng ANOVA một chiều, tiếp theo là kiểm định đa phạm vi của Duncan, để so sánh các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa p < 0,05. Chương trình phần mềm thống kê SPSS phiên bản 22 đã được sử dụng cho phân tích này.
- Kết quả:
3.1. Tỷ lệ nhiễm Aeromonas từ mẫu: Mười mẫu phân lập từ 50 con cá có kết quả xét nghiệm dương tính với A.hydrophilla với 20%.
3.2. Các triệu chứng và tổn thương sau khi chết của O. niloticus được khảo sát được thể hiện trong Hình 1.
Hình 1: Cho thấy vết loét da, bụng chướng và thối vây (bên trái) và tổn thương P/M cho thấy sự tích tụ chất lỏng màu vàng trong khoang bụng, gan nhợt nhạt với kết cấu dễ vỡ, túi mật sưng và tắc nghẽn lách và thận (bên phải)
3.3. Nhận dạng hình thái và sinh hóa
Các phân lập thu được là Gram âm, hình que thẳng có đầu tròn, không có nang và bào tử. Các khuẩn lạc có màu trắng trên thạch Tryptone soya, hình dạng lồi màu vàng trên môi trường Rimler-Shotts (R.S) và các khuẩn lạc màu xanh lá cây có tâm sẫm trên thạch Aeromonas. Kết quả thu được cho thấy oxidase, thử nghiệm indole, Voges-Proskauer và thử nghiệm sử dụng citrate là dương tính trong khi thử nghiệm methyl red là âm tính.
3.4. Nhận dạng và đặc tính phân tử.
3.4.a. Xác nhận kiểu gen của một số chủng A. hydrophila phân lập bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Như thể hiện trong Hình (2)
Hình 2: Làn L: Dấu hiệu kích thước phân tử (100-1000 bp) Làn Kiểm soát dương tính và âm tính. Làn 1 đến 7: các chủng A. hydrophila dương tính
3.4. b. Phát hiện một số gen độc lực của A. hydrophilla (hly và aero) bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Như thể hiện trong Hình (3).
Hình 3: Làn L bên phải: Dấu hiệu kích thước phân tử (100-1000 bp) Làn Kiểm soát dương tính và âm tính. Làn 3, 4 và 7: các chủng A. hydrophila dương tính với gen hly ở 592bp. Làn L “bên trái”: Dấu hiệu kích thước phân tử (100-1000 bp) Làn Kiểm soát dương tính và âm tính. Làn 1 đến 7: Các chủng A. hydrophila dương tính với gen Aero ở 326 bp
3.5. Các thông số về hiệu suất tăng trưởng và hiệu quả thức ăn
Các thông số về tăng trưởng của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn chế độ ăn đã nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3. Các thông số về tăng trưởng của cá rô phi sông Nile giống thường được cải thiện khi chúng được cho ăn chế độ ăn có chứa nano đồng oxit CuO-NP, so với nhóm cá được cho ăn chế độ ăn bổ sung đồng vô cơ. Việc bổ sung chế độ ăn 2 mg CuONP/kg thức ăn (50% nhu cầu khuyến nghị của NRC) có tác động tích cực đáng kể (p˂0,05) đến nhiều thông số khác nhau. So với nhóm cá được cho ăn chế độ ăn bổ sung đồng vô cơ, nhóm bổ sung CuO-NP cho thấy trọng lượng cơ thể cuối cùng tăng 6,2%, tăng tổng trọng lượng tăng 25,4%, tăng 28,7% về % tăng trọng, tăng 13,8% về SGR, cải thiện 21,4% về FCR, cải thiện 25,5% về PER và cải thiện 21,3% về EEU. Ngược lại, bổ sung nano đồng oxit nhiều hơn (100% yêu cầu đề xuất của NRC) dẫn đến cải thiện đáng kể (p˂0,05) về trọng lượng cơ thể cuối cùng, tổng trọng lượng tăng và % tăng trọng, trong khi các số liệu khác cho thấy sự cải thiện không đáng kể so với nhóm cá được cho ăn chế độ ăn bổ sung đồng vô cơ.
Bảng 3: Các thông số tăng trưởng của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức độ khác nhau của hạt nano đồng thay vì nguồn vô cơ
Giá trị trung bình trong cùng một hàng của các lứa khác nhau có sự khác biệt đáng kể ở mức p˂ 0,05.
3.6. Một số chất chuyển hóa huyết thanh
Tác động của việc thay thế nguồn đồng vô cơ bằng việc bổ sung nano đồng oxit trong chế độ ăn uống đối với nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết thanh (T-CHO) và hoạt động của các enzym gan trong huyết thanh (ALT và AST) được trình bày trong Hình 4. Người ta nhận thấy rằng việc thay thế đồng vô cơ bằng 2 hoặc 4 mg CuO-NP trên một kg chế độ ăn uống dẫn đến giảm đáng kể (p˂0,05) nồng độ TCHO trong huyết thanh và hoạt động ALT trong huyết thanh. Tuy nhiên, không có tác động đáng kể nào đến hoạt động AST trong huyết thanh.
Hình 4: Cholesterol huyết thanh (T-CHO) và hoạt động của enzyme chức năng gan huyết thanh của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức độ hạt nano đồng khác nhau thay vì nguồn vô cơ
3.7. Phản ứng miễn dịch
Hình 5 và 6 hiển thị các thông số của phản ứng miễn dịch. Chỉ số thực bào, hoạt động thực bào và hoạt động diệt khuẩn tăng đáng kể (p˂0,05) ở cá được cho ăn chế độ ăn có chứa 2mg CuO-NPs/kg, so với nhóm cá được cho ăn 4 mg đồng vô cơ hoặc 4 mg/kg thức ăn nano đồng oxit CuO-NPs. Hơn nữa, cả hai mức độ bổ sung CuO-NP đều làm tăng đáng kể (p˂0,05) hoạt động của lysosome huyết thanh so với nhóm cá được cho ăn chế độ ăn bổ sung đồng vô cơ.
Hình 5: Chỉ số thực bào huyết thanh và hoạt động của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức nano đồng oxit CuO-NP khác nhau thay vì nguồn vô cơ
Hình 6: Lysozyme huyết thanh và hoạt động diệt khuẩn của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức độ CuO-NP khác nhau thay vì nguồn vô cơ
3.8. Biểu hiện gen tiền viêm
Hình 7 hiển thị biểu hiện mRNA của các gen cytokine tiền viêm (CYP1A và IL-1β) trong máu cá. Việc bổ sung 2 mg/kg nano đồng vào thức ăn dẫn đến sự giảm đáng kể (p˂0,05) trong biểu hiện mRNA của gen CYP1A và IL-1β, so với nhóm đối chứng hoặc nhóm cá được cho ăn chế độ ăn có chứa 4 mg/kg CuONP. Ngoài ra, những con cá được cho ăn chế độ ăn có chứa thêm 4 mg CuO-NP trên một kg cho thấy sự gia tăng nhỏ trong biểu hiện mRNA của gen CYP1A và IL-1β, nhưng sự gia tăng này không có ý nghĩa thống kê (p≥0,05) khi so sánh với nhóm đối chứng.
Hình 7: Biểu hiện gen CYP1A và IL-1β của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức CuO-NP khác nhau thay vì nguồn vô cơ
3.9. Mô học đường ruột
Bảng 4 và Hình 8 cho thấy tác động của việc thay thế nguồn đồng vô cơ bằng các hạt nano đồng trong chế độ ăn đối với bệnh lý học đường ruột của cá rô phi sông Nin. Nghiên cứu cho thấy việc thay thế nguồn cung cấp đồng vô cơ bằng 2 mg CuO-NPs/kg thức ăn dẫn đến sự gia tăng đáng kể (p˂0,05) về chiều dài nhung mao, tỷ lệ C/D và diện tích bề mặt nhung mao ở tất cả các vùng ruột. Tuy nhiên, không có thay đổi đáng kể nào về độ sâu hốc ở tất cả các phần ruột. Tuy nhiên, khi cá được cho ăn thức ăn có chứa 4 mg CuO-NPs/kg để thay thế nguồn đồng vô cơ, không có tác động đáng kể nào đến chiều dài nhung mao, độ sâu hốc và diện tích bề mặt nhung mao ở tất cả các phần ruột, ngoại trừ chiều dài nhung mao ở phần trước.
Bảng 4: Đo hình thái ruột của cá rô phi sông Nin giống được cho ăn các mức hạt nano đồng khác nhau thay vì nguồn vô cơ
Các giá trị có chữ số mũ khác nhau trong cùng một hàng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05).
Hình 8: Bệnh lý mô học đường ruột của cá rô phi sông Nile giống được cho ăn các mức độ hạt nano đồng khác nhau thay vì nguồn vô cơ
3.10. Thách thức chống lại nhiễm trùng A. hydrophila
Bảng 5 trình bày tác động của việc thêm hạt nano đồng vào thức ăn đối với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của cá rô phi sông Nile khi tiếp xúc với thử thách. Nghiên cứu cho thấy việc thay thế đồng vô cơ bằng 2 hoặc 4 mg CuONP trên một kilôgam thức ăn đã làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở cá rô phi sông Nile khi tiếp xúc với thử thách.
Bảng 5: Tỷ lệ tử vong % và tỷ lệ mắc bệnh % của cá rô phi sông Nin giống được cho ăn các mức hạt nano đồng khác nhau thay vì nguồn vô cơ
- Thảo luận:
Dựa trên những phát hiện của chúng tôi, tỷ lệ xuất hiện của A. hydrophila là khoảng 20%, tương tự như tỷ lệ lưu hành được báo cáo bởi [37]. Tuy nhiên, tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ lưu hành được báo cáo bởi [38] và cao hơn tỷ lệ lưu hành được ghi nhận bởi [39]. Tính gây bệnh của Aeromonas hydrophila được quyết định bởi sự biểu hiện của nhiều loại ngoại độc tố, bao gồm aerolysin, hemolysin, lipase, độc tố ruột cytotonic và protease [40]. Hơn nữa, [26] đã ghi nhận sự hiện diện của aerA trong tất cả các chủng A. hydrophila được phân lập từ cá bị nhiễm trùng huyết xuất huyết. Tính gây bệnh của A. hydrophila có liên quan tích cực đến sự hiện diện của gen aerA và hyl. Nghiên cứu của chúng tôi bao gồm việc thử nghiệm các phân lập A. hydrophila để tìm sự hiện diện của gen aer A và hyl, được coi là những gen gây bệnh quan trọng nhất và thường gặp nhất ở loài này. Trong số bảy phân lập được chọn, ba trong số chúng (42,85%) được phát hiện chứa gen hly, trong khi tất cả chúng đều được phát hiện chứa gen aer A (100%). Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu do [38, 41, 42] thực hiện. Tuy nhiên, [3] đã báo cáo tỷ lệ lưu hành 100% của hyl và tỷ lệ lưu hành 82,5% của Aerolysin (aerA).
Đồng có vai trò thiết yếu trong quá trình tăng trưởng và phản ứng miễn dịch của cá [43]. Mục tiêu của thử nghiệm hiện tại là so sánh giữa việc bổ sung CuSO4 (đồng sunfat) và CuO-NP (hạt nano đồng oxit) trong chế độ ăn đối với hiệu quả tăng trưởng và phản ứng miễn dịch của cá rô phi. Việc thay thế CuSO4 bằng cả hai mức CuO-NP dẫn đến cải thiện trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW), tổng mức tăng, tăng%, SGR, FCR, PER và EEU. Bằng chứng trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mối tương quan giữa các hạt có kích thước nano và khả năng tiếp cận và sử dụng cao của chúng trong cơ thể cá. Các hạt nano được phát hiện có hiệu quả hơn các hạt vô cơ lớn hơn khi được dùng ở liều thấp hơn [44, 45]. Tác dụng tốt của CuO-NP trong chế độ ăn, trái ngược với các nguồn vô cơ, đối với hiệu quả tăng trưởng có thể là do khả năng cải thiện độ ổn định oxy hóa của thức ăn, tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch và chống oxy hóa, và tăng khả năng hấp thụ của ruột [46].
Dữ liệu thu được được xác nhận bởi [47] đối với cá trắm cỏ. [22] cũng khuyến nghị bổ sung 2 mg CuO-NP vào thức ăn để tăng cường sự phát triển của cá tráp biển đỏ. Việc giảm đường kính của CuO-NP được công nhận rộng rãi là có tác dụng tăng cường khả năng hấp thụ dưới dạng hạt nano toàn bộ [48]. Kết quả thu được chỉ ra rằng tính khả dụng của CuO-NP cao gấp khoảng hai lần so với tỷ lệ tiêu thụ các nguồn vô cơ trong cá rô phi sông Nin. Những phát hiện của [13] đã chứng minh rằng hiệu suất tăng trưởng của cá rô phi sông Nin được cải thiện khi bổ sung CuO-NP. Ngoài ra, sự giảm nhẹ về tốc độ tăng trưởng được quan sát thấy ở nhóm cá rô phi sông Nin được cho ăn thức ăn bổ sung 4 mg CuO-NP/kg có thể là do lượng đồng quá nhiều. Theo [49], người ta thấy rằng hàm lượng đồng cao trong chế độ ăn của cá có thể làm giảm sự phát triển của cá. Nghiên cứu này đặc biệt chỉ ra rằng mức tối đa 4 mg hạt nano đồng trên một kilôgam thức ăn dẫn đến giảm FBW, tăng trọng (WG) và SGR ở cá chép thông thường so với phạm vi lý tưởng là 2,51 đến 2,56 mg/kg. Lipid là chất chuyển hóa quan trọng đối với hoạt động của vật nuôi.
Ở cá, lipid thường được lưu trữ dưới dạng triglyceride và cholesterol, đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng [50]. Dữ liệu mới nhất cho thấy việc bổ sung nano đồng oxit CuO-NP dẫn đến giảm đáng kể (P˂0,05) mức T-CHO của cá rô phi sông Nin. Sự mất mát trong dự trữ trao đổi chất của T-CHO là do sự gia tăng tiết hormone làm tăng tốc quá trình trao đổi chất, như đã nêu trong {51]. Các quan sát mà chúng tôi trình bày được xác nhận bởi [52], người đã chứng minh rằng việc bổ sung CuO-NP dẫn đến giảm hàm lượng lipid tổng thể trong tôm càng xanh P. clarkii. Hơn nữa, có thể suy ra rằng sự hiện diện của đồng trong cơ thể cá lớn hơn khi chúng được cho ăn các bữa ăn có chứa CuO-NP so với chế độ ăn có chứa nguồn vô cơ. Điều này thể hiện rõ ở sự giảm quan sát thấy ở mức T-CHO. Các phát hiện từ cả hai [13, 53] đã chứng minh rằng việc bổ sung chế độ ăn bằng 3 hoặc 6 mg đồng dạng khối hoặc Nano trên một kg dẫn đến giảm mức cholesterol toàn phần trong huyết tương so với nhóm không được bổ sung đồng. Hàm lượng ALT huyết thanh ở cá rô phi sông Nin giảm đáng kể (p˂0,05) khi bổ sung 2 hoặc 4 mg CuO-NP/kg chế độ ăn, so với những con được cho ăn chế độ ăn có chứa 4 mg đồng vô cơ trên một kg. Dữ liệu thu thập được cho thấy rằng CuO-NP có thể có hiệu quả cao hơn về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương oxy hóa so với các nguồn đồng vô cơ.
Việc bổ sung CuO-NP vào chế độ ăn của cá rô phi sông Nin đã cải thiện hoạt động thực bào, lysozyme và diệt khuẩn trong huyết thanh. Sự gia tăng này được quan sát thấy khi so sánh với việc sử dụng đồng vô cơ làm nguồn thức ăn. Trong số các mức bổ sung CuO-NP khác nhau, các giá trị tốt nhất được ghi nhận ở cá được cho ăn chế độ ăn có chứa 2mg CuO-NP/kg, trái ngược với cá được cho ăn đồng vô cơ hoặc mức Nano-Cu cao hơn (4mg/kg). Dữ liệu được trình bày chứng minh rằng Nano-Cu có vai trò quan trọng trong việc cải thiện tình trạng miễn dịch. Nhóm được bổ sung CuO-NP thấp (chế độ ăn 2mg/kg) cho thấy mức độ thực bào, lysozyme và hoạt động diệt khuẩn cao nhất. Phát hiện này phù hợp với các quan sát của [46,13], người đã phát hiện ra rằng việc bổ sung Nano-Cu vào chế độ ăn đã cải thiện hoạt động của lysozyme so với nguồn đồng vô cơ.
Mức độ biểu hiện mRNA của hai gen cytokine tiền viêm (CYP1A và IL-1β) đã được đo trong máu cá. Theo [54], bổ sung chế độ ăn cho cá với một lượng nhỏ (2mg/kg) nano đồng oxit CuO-NP thay vì nguồn đồng vô cơ có thể làm giảm hiệu quả tình trạng viêm ở các mô cá khác nhau bằng cách điều chỉnh giảm IL-1ß. Điều này cũng chỉ ra sự cải thiện trong hoạt động thực bào. Biểu hiện của gen IL-1ß và CYP1A ở cá giảm đáng kể khi chúng được cho ăn chế độ ăn có chứa mức vừa phải (chế độ ăn 2mg/kg) CuO-NP. Sự giảm biểu hiện gen này đã thúc đẩy phản ứng miễn dịch của cá rô phi sông Nin, như đã quan sát thấy trong một nghiên cứu của [55, 56].
Dữ liệu chúng tôi thu được, phù hợp với các phát hiện của [57], đã chứng minh rằng việc bổ sung nano đồng oxit CuO-NP vào chế độ ăn của cá hồi cầu vồng dẫn đến sự giảm đáng kể (p˂0,05) trong biểu hiện của các gen TNF-α, IL-1ß, IL-10, SOD, CAT và GPX so với nhóm đối chứng. Việc bổ sung CuO-NP ở nồng độ 2 hoặc 4 mg/kg vào chế độ ăn của cá rô phi sông Nin dẫn đến tăng chiều dài nhung mao, diện tích bề mặt nhung mao và tỷ lệ V/D so với nhóm cá được cho ăn chế độ ăn bổ sung đồng vô cơ. Những phát hiện này cho thấy việc bổ sung CuO-NP đã thúc đẩy khả năng hấp thụ của ruột cá.
Sự tăng cường khả năng hấp thụ của ruột có thể là do tác dụng chống oxy hóa vượt trội và tăng tính khả dụng của nguồn nano đồng oxit CuO-NP so với nguồn đồng vô cơ [19]. Nghiên cứu được trình bày trong [13] cho thấy việc bổ sung nano đồng oxit vào chế độ ăn của cá rô phi sông Nin ở mức 3 hoặc 6 mg/kg đã cải thiện cấu trúc ruột của chúng. Sự cải thiện này đã được quan sát thấy khi so sánh nhóm bổ sung Nano Cu với nhóm được bổ sung Cu vô cơ. Hơn nữa, những cải thiện đáng kể nhất đã được quan sát thấy ở liều bổ sung CuO-NP thấp hơn. Người ta đã công nhận rộng rãi rằng đồng vô cơ tạo thành một hợp chất với axit phytic trong thức ăn thực vật, làm suy yếu khả năng hấp thụ của nó.
Tăng cường khả năng kháng bệnh và tỷ lệ sống sót chống lại A. hydrophila Thách thức mà cá rô phi sông Nin phải đối mặt khi được cho ăn chế độ ăn bổ sung 2 hoặc 4 mg/kg nano đồng oxit CuO-NP thay vì nguồn vô cơ có thể liên quan đến tác dụng chống oxy hóa và cải thiện miễn dịch của CuO-NP. Phụ gia thức ăn thường tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng chống lại một số bệnh do vi-rút ở cá [58, 59]. Theo kết quả của chúng tôi, được xác nhận bởi [55], cá hồi cầu vồng được cho ăn chế độ ăn có chứa Cu-NP và vitamin C cho thấy sự cải thiện đáng kể (p < 0,05) về tỷ lệ sống sót khi so sánh với nhóm đối chứng, đặc biệt là chống lại Y. ruckeri.
- Kết luận
Tóm lại, thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh hiệu suất tăng trưởng, tình trạng miễn dịch, mô học đường ruột và khả năng kháng bệnh được cải thiện ở O. niloticus được cho ăn chế độ ăn bổ sung CuO-NP, trái ngược với chế độ ăn có chứa nguồn đồng vô cơ. Theo dữ liệu thu thập được, chế độ ăn có 2mg/kg nano đồng oxit CuO-NP có tác động tích cực đáng kể đến hiệu suất tăng trưởng. Nó cũng làm giảm mức cholesterol trong huyết thanh và tăng cường phản ứng miễn dịch bằng cách cải thiện thực bào, hoạt động của lysozyme và hoạt động diệt khuẩn. Ngoài ra, nó còn điều chỉnh giảm biểu hiện của các gen cytokine gây viêm và cải thiện các phép đo đường ruột. Nhìn chung, chế độ ăn này cải thiện khả năng kháng bệnh của cá rô phi sông Nile.
Nguồn tham khảo:
Abeer M El-Shenawy, Gehan IE Ali, Heba M Mousa, Mustafa Shukry and Foad Farrag