Nano bạc điều trị bệnh khô vằn trên lúa do chủng nấm Rhizoctonia solani gây ra
Bệnh khô vằn trên lúa đã gây ra các vụ mất mùa lớn trên toàn thế giới. Việc quản lý tác nhân gây bệnh Rhizoctonia solani là khó khăn vì có phạm vi ký chủ rộng và sự hình thành hạch nấm có thể tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt; do đó phát triển các phương pháp quản lý dịch bệnh cải tiến mà không sử dụng các hóa chất độc hại đã được coi là mối quan tâm chính để duy trì nền nông nghiệp bền vững. Nghiên cứu được trình bày này đã tiết lộ tác động tiêu cực của các hạt nano bạc (SNP) đối với R. solani và sự tiến triển của bệnh cả in vitro và in vivo. Tác dụng phụ của SNP đối với R. solaniphụ thuộc đáng kể vào số lượng SNPs, được phun ở các nồng độ khác nhau trong ống nghiệm . Mức độ ức chế cao nhất đối với sự hình thành hạch nấm và sự phát triển của sợi nấm lần lượt là 92 và 85% ở nồng độ SNPs là 50 ppm. Thí nghiệm trong nhà kính in vivo cũng cho thấy SNP ở cùng nồng độ ảnh hưởng có lợi đến cả khối lượng tươi và khô của cây lúa với tác dụng ngăn chặn đáng kể sự phát triển vết bệnh trên lá.
(Bản quyền NanoCMM Technology)
- Giới thiệu
Ứng dụng của vật liệu nano đã ảnh hưởng rộng rãi đến việc phân phối thuốc, điều trị ung thư [1], năng lượng [2], y sinh [3], nông nghiệp [4] và nhiều ngành công nghệ cao khác trong những năm gần đây [5].
Công nghệ nano đã dẫn đến những phương pháp mới để kiểm soát dịch bệnh bằng cách sử dụng các vật liệu quy mô nguyên tử [6, 7]. Các hạt có quy mô cực nhỏ đã nổi lên như những tác nhân hiện đại do tỷ lệ bề mặt trên thể tích lớn của chúng, tạo ra bề mặt tiếp xúc lớn với các nguồn mầm bệnh [8]. Công nghệ nano có thể có tác động lớn đến các quá trình tự nhiên và nông nghiệp bằng cách giới thiệu các công cụ quy mô nhỏ [9]; thuốc bảo vệ thực vật [10]; phân bón [11]; lọc nước và xử lý ô nhiễm [12]; cảm biến nano, thiết bị chẩn đoán [13]; và biến đổi gen thực vật [14]. Trong số các hạt nano (NP), NP bạc (SNP) có thể tấn công vi sinh vật, bao gồm cả cấu trúc màng tế bào trong các quá trình sinh học quy mô lớn [15, 16]. Hoạt tính kháng khuẩn của các ion bạc đã được thiết lập tốt và do khả năng của các SNP được ion hóa xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn và điều chỉnh tín hiệu tế bào [17]. SNPs với các đặc tính chống nấm, kìm khuẩn và plasmonic là một trong những chất ức chế thân thiện với môi trường chống lại các mầm bệnh thực vật so với các chất diệt nấm tổng hợp [18]; tuy nhiên, khả năng chống nấm của nano bạc ít được chú ý hơn so với khoa học y tế và dược phẩm với chỉ một số nghiên cứu được thực hiện chống lại các loại nấm phytopathogenic như Alternaria Alternata, Botrytis cinerea [19] và Colletotrichum gloeosporioides [20].
Lúa (Oryza sativa L.) là lương thực chính cho một tỷ lệ lớn dân số thế giới, và là cây trồng chính quan trọng ở những vùng đất nông nghiệp lầy lội [21]. Bệnh khô vằn do Rhizoctonia solani Kühn AG1 (Teleomorph: Thanatephorus cucumeris; anastomosis group 1 IA, AG1 IA) gây ra, là bệnh hại lúa phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới. Sự nảy mầm của hạch nấm là yếu tố chính trong sự phát tán của bệnh khô vằn trên lúa, do đó bất kỳ chất ức chế tiềm năng nào đối với sự nảy mầm của hạch nấm, tức là SNPs, sẽ là yếu tố cần thiết để làm giảm mầm bệnh. Điều này buộc nông dân trồng lúa phải sử dụng một lượng lớn hóa chất chống thiên nhiên và hóa chất có hại hàng năm để phòng trừ bệnh khô vằn, điều này không chỉ gây thêm chi phí trong ngắn hạn mà còn làm tăng thiệt hại về lâu dài đối với sức khỏe con người và môi trường. Trong nghiên cứu này, để kiểm soát bệnh khô vằn trên lúa với trọng tâm là sản xuất sạch hơn với chi phí thấp hơn, các nồng độ nano bạc khác nhau đã được kiểm tra như một chất kháng nấm mới để ngăn chặn hoạt động gây bệnh của R. solani trong ống nghiệm (để đánh giá tác dụng ức chế của SNP đối với sự hình thành hạch nấm và sự phát triển của sợi nấm) và in vivo (để khảo sát ảnh hưởng của hoạt tính kháng nấm của nano bạc trên cây lúa trong điều kiện thử nghiệm trong nhà kính).
- Vật liệu và phương pháp
2.1 Thuốc thử, hạt gạo và nguồn nấm bệnh
Huyền dịch SNPs được lấy từ Nanocide Co., Tehran, với nồng độ 4000 ppm và kích thước hạt trung bình 5–10 nm, ở dạng vật chất keo màu nâu sẫm. Hạt giống lúa O. sativa L. var Hashemi và nuôi cấy thuần chủng R. solani AG-1 IA được lấy từ Viện Nghiên cứu Lúa Iran (IRRI), Rasht [22]. O. sativa L. var Hashemi có khả năng cho năng suất cao nhưng dễ nhiễm bệnh khô vằn. Nấm được duy trì trên thạch dextrose khoai tây (PDA, Merck Co.) ở nhiệt độ phòng.
2.2 Kiểm tra in vitro về tác dụng ức chế SNPs đối với sợi nấm và hạch nấm của R. solani
Để đánh giá tác dụng chống nấm in vitro của nano bạc đối với R. solani AG1, bốn nồng độ khác nhau của huyền phù SNPs (5, 10, 25 và 50 ppm) đã được thêm vào đĩa Petri trước khi đổ đĩa với PDA. Các nút thạch đồng nhất có đường kính 6 mm chứa sợi nấm được cấy đồng thời vào tâm của mỗi đĩa Petri có chứa SNP, sau đó ủ ở 28 ± 1 ° C trong ba ngày. Tỷ lệ ức chế sự phát triển của sợi nấm được tính toán bằng cách sử dụng (1) [4].
Tỉ lệ ức chế (RH %) = (R-r)/R*100%
Tham số RH là tốc độ ức chế, R đối với sự phát triển ức chế sợi nấm là sự mở rộng đường kính của sợi nấm trong đĩa đối chứng (cm) và đối với sự phát triển hình thành hạch nấm trong quá trình ức chế, R là trọng lượng của hạch nấm trong món ăn kiểm soát (mg). Tham số r cho sự phát triển ức chế sợi nấm là sự mở rộng đường kính của sợi nấm khi được xử lý bằng SNP (cm), và đối với sự phát triển hình thành hạch nấm trong quá trình ức chế, r là trọng lượng của hạch nấm khi được xử lý bằng SNPs (mg). Hiệu quả chống nấm của SNPs chống lại sự hình thành hạch nấm R. solani được đo sau khi thêm bốn nồng độ nano bạc vào nội dung môi trường PDA. Các đĩa R. solani đã cấy được duy trì ở nhiệt độ phòng trong hai tuần để biểu hiện sự hình thành hạch nấm, và tỷ lệ ức chế sự hình thành hạch nấm được tính toán bằng cách sử dụng (1). Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần. Ảnh hưởng của SNP đối với sự nảy mầm của hạch nấm đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng quy trình sau [23]. Hạch nấm của R. solani được hình thành trên PDA ở 15 ° C thông qua việc ủ các đĩa đã cấy trong một tuần. Các hạch nấm đồng đều được thu thập từ các đĩa PDA, và bề mặt được khử trùng trong dung dịch natri hypoclorit 1,5% trong 3 phút. Sau đó, ba hạch nấm đã khử trùng bề mặt được xử lý bằng SNP ở các nồng độ khác nhau và đặt trong đĩa petri, sau đó chúng được ủ trong một tuần ở 25 ° C trong bóng tối. Tỷ lệ nảy mầm của hạch nấm được đo và so sánh với đối chứng
Hình 1 Tác động ức chế in vitro của các nồng độ SNP khác nhau (được chỉ ra ở trên cùng bên phải của cột bên trái) trên R. solani AG1 Giai đoạn phát triển của sợi nấm [cột bên trái (a) – (e)], sự hình thành hạch nấm [cột giữa (f) – (j)], Nảy mầm hạch nấm [cột bên phải (k) – (o)]
2.3 Kiểm tra nano bạc trên bệnh khô vằn trong điều kiện nhà kính
Hạt lúa được gieo xuống dưới bề mặt đất 3–4 cm của bầu (1 L) và chúng được tách thành sáu nhóm với bốn bầu trong mỗi nhóm như sau: (a) mầm bệnh đơn lẻ, (b) mầm bệnh + SNPs (5 ppm), (c) mầm bệnh + SNPs (10 ppm), (d) mầm bệnh + SNPs (25 ppm), (e) mầm bệnh + SNPs (50 ppm) và (f) kiểm soát (không SNPs). Cây lúa được trồng trong chậu trong điều kiện nhà kính ở 30 ° C và độ ẩm tương đối 85–95%. Khi cây đến giai đoạn đẻ nhánh muộn (cây ba tuần tuổi), chúng được xử lý bằng quy trình cấy nấm R. solani. Để đạt được điều này, huyền phù sợi nấm R. solani (5 × 108 CFU / ml) được phun đều bằng bình phun tay trên cây lúa [24]. Để duy trì độ che phủ hợp lý của nano bạc trên tán lá trong suốt thời gian đánh giá, hai lần phun được áp dụng bao gồm 24 giờ sau khi cấy và 7 ngày sau đó. Sau quá trình phun chế phẩm chống mầm bệnh và phun nano bạc, cây con được đậy bằng túi ni lông trong ba ngày để duy trì độ ẩm cao. Sau 15 ngày, mức độ nghiêm trọng của bệnh được ghi nhận thông qua việc đo trọng lượng tươi, trọng lượng khô và chiều cao tổn thương tương đối (RLH), theo tiêu chuẩn IRRI 1996. RLH của mỗi máy xới được tính bằng cách sử dụng (2) [25]
RLH% = [Chiều cao tổn thương (cm)/Chiều cao cây (cm)] *100%
2.4 Phân tích thống kê
Dữ liệu ghi lại được phân tích phương sai bằng phần mềm SAS (Viện SAS, phiên bản 9). Thử nghiệm Nhiều phạm vi của Duncan đã được sử dụng để so sánh các phương tiện.
- Kết quả
3.1 Kiểm tra in vitro về tác dụng ức chế của SNP trên sợi nấm và hạch nấm của R. solani
Ảnh hưởng của nồng độ SNPS được thử nghiệm đối với sự phát triển của sợi nấm, sự hình thành hạch nấm và sự nảy mầm được trình bày trong Hình 1. Các đĩa được xử lý bằng SNPs 50 ppm cho thấy số lượng hạch nấm tối thiểu. RHs 12, 23, 68 và 92% được tìm thấy tương ứng với nồng độ SNPs 5, 10, 25 và 50. Liên quan đến sự phát triển của sợi nấm, RHs là 8, 35, 67 và 85 đã được ghi lại cho SNP của các nồng độ tương ứng là 5, 10, 25 và 50 ppm. RHs là 15, 26, 57 và 98% được tìm thấy đối với nồng độ SNPs lần lượt là 5, 10, 25 và 50 ppm liên quan đến sự nảy mầm của hạch nấm. Những kết quả này chỉ ra rằng SNPs đã ức chế mạnh mẽ R. solani trong điều kiện in vitro (Hình 2).
Hình 2 RH in vitro của nano bạc ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của hạch nấm và sự hình thành hạch nấm của R. solani AG1-IA
3.2 Kiểm tra in vivo đối với bệnh khô vằn ở điều kiện nhà kính
Hình 3 cho thấy cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh muộn 90 ngày trong điều kiện nhà kính (30 ° C, độ ẩm 85–95%). Kết quả in vivo của SNP chống lại R. solani, tác nhân gây bệnh khô vằn, được trình bày trong Hình 4. Hình 4a chỉ ra các triệu chứng trên lá do nhiễm chỉ R. solani và Hình. 4b – e chỉ ra mầm bệnh cộng với 5, 10, 25 và 50 ppm SNPs được áp dụng và các mức độ ức chế khác nhau của chúng đối với sự phát triển của vết bệnh. Việc xử lý cây trồng với mầm bệnh mà không có SNPs dẫn đến các triệu chứng khô vằn điển hình, nhưng các cây được xử lý với mầm bệnh + SNPs cho thấy các mức độ tác dụng ức chế khác nhau. Theo kết quả phân tích phương sai của các tính trạng khác nhau, tất cả các tính trạng đều khác nhau ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05. Giảm đáng kể các triệu chứng của mầm bệnh trong các chậu được xử lý bằng nano bạc. Nồng độ SNPs 5 ppm có ảnh hưởng nhỏ đến khối lượng khô của cây lúa (Bảng 1); bằng cách tăng nồng độ SNPs lên 50 ppm, khối lượng tươi và khối lượng khô tăng lên đáng kể. Ở nồng độ SNPs 50 ppm, RLH của mỗi máy xới giảm, bằng chứng cho thấy việc áp dụng nano bạc có ảnh hưởng kháng nấm mạnh và giảm thiểu sự tổn thương trên lúa đẻ nhánh. Các kết quả so sánh về hoạt động ức chế của nano bạc chống lại bệnh khô vằn cho thấy sự giảm đáng kể các vết bệnh trên khô vằn (Hình 5).
Hình 3 Lúa mạ sau 90 ngày trong điều kiện nhà kính, với nhiệt độ 30 ° C và độ ẩm không đổi 85–95%
Hình 4 Ảnh hưởng của việc xử lý SNPs đối với sự phát triển vết bệnh của R. solani trên lá lúa
(a) Một mình mầm bệnh, (b) Mầm bệnh + SNPs (5 ppm), (c) Mầm bệnh + SNPs (10 ppm), (d) Mầm bệnh + SNPs (25 ppm), (e) Mầm bệnh + SNPs (50 ppm), (f) Kiểm soát chưa được xử lý
Hình 5 Ảnh hưởng của SNP đến sự phát triển vết bệnh của R. solani trên bệnh khô vằn
(a) Một mình mầm bệnh, (b) Mầm bệnh + SNPs (5 ppm), (c) Mầm bệnh + SNPs (10 ppm), (d) Mầm bệnh + SNPs (25 ppm), (e) Mầm bệnh + SNPs (50 ppm), (f) Kiểm soát chưa được xử lý
3.3 Thảo luận
Nano bạc có thể làm biến tính tế bào bằng cách tấn công màng và cấu trúc của chúng. Một nghiên cứu trước đây cho thấy SNP làm gián đoạn các hệ thống vận chuyển, bao gồm cả dòng chảy ion [26]. Sự rối loạn chức năng của dòng chảy ion gây ra sự tích tụ nhanh chóng của các ion bạc, làm gián đoạn các quá trình tế bào như hô hấp và trao đổi chất do phản ứng với các phân tử. Ji Seon và cộng sự. (2009) cho thấy rằng khi xử lý bằng cách phun SNPs, các thành sợi nấm bị hư hại nghiêm trọng và dẫn đến sự phân hủy sợi nấm. Xem xét các tác động tế bào của các ion bạc, SNP làm trung gian cho sự sụp đổ ở các sợi nấm Sclerotinia sclerotiorum làm hỏng các thành sợi [27].
Các ion bạc được biết là vô hiệu hóa các enzym và DNA của tế bào bằng cách phối hợp với các nhóm hiến tặng điện tử như thiols, cacboxylat, indol, amit, hydroxyl, v.v. [28, 29] Theo các nghiên cứu trước đây về nano bạc, SNPs càng nhỏ, chúng càng giải phóng nhiều ion Ag +, ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật [30, 31]. Như được phát hiện trong cuộc điều tra của chúng tôi, SNP trong dung dịch nước với kích thước nhỏ có thể xâm nhập vào tế bào của vi sinh vật và phá hủy tính toàn vẹn của màng của chúng [32–34]. NP có tỷ lệ bề mặt trên thể tích rất lớn giúp tăng cường đáng kể đặc tính thấm màng tế bào của chúng so với các dạng không phải NP của cùng một vật liệu [35–37]. NP có thể xâm nhập vào màng của vi sinh vật, dẫn đến biến dạng tế bào [38]. NPs, với tỷ lệ bề mặt trên thể tích lớn, thể hiện đặc tính kháng khuẩn tích cực do khả năng tương tác với màng tế bào cao hơn thông qua phá vỡ cấu trúc thành tế bào, ảnh hưởng đến chuỗi hô hấp và sự phân chia tế bào trong DNA và protein như một vi sinh vật [39]. Có khả năng là kích thước của SNPs tương tự đóng một vai trò quan trọng trong tính thấm và hoạt động kháng nấm của chúng. Tóm lại, SNPs có hoạt tính kháng nấm tích cực với đặc tính diệt khuẩn tuyệt vời, do đó, chúng có tiềm năng được coi là một loại thuốc trừ sâu kinh tế và thân thiện với môi trường. Việc áp dụng các chất diệt nấm hóa học làm tăng thêm chi phí gián tiếp lâu dài và tiềm ẩn vì nó gây ra các phản ứng phụ nguy hiểm cho cả sức khỏe con người và môi trường [40]. Các nhà biên tập của Nature ước tính rằng bất kỳ công nghệ nào cũng mất khoảng 20 năm để xuất hiện từ phòng thí nghiệm và được thương mại hóa [41]. Việc ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp có thể mất vài thập kỷ để chuyển từ phòng thí nghiệm sang đất liền, tuy nhiên những kỳ vọng hợp lý sẽ rất quan trọng để lĩnh vực non trẻ này nở rộ [42].
Hiệu quả của nano bạc được tăng lên bằng cách kết hợp miconazole thuốc chống nấm với nano bạc thể hiện hoạt tính diệt nấm đáng kể [43]. SNP với kitin ức chế sự nảy mầm của bào tử của các mầm bệnh được khảo sát [44, 45]. Hơn nữa, SNP giới hạn hoạt tính sinh học được phát hiện có thể kiểm soát nấm nội sinh của C. gloeosporioides, trong ống nghiệm [46]. Hoạt động chống nấm của SNP có thể so sánh với hoạt động của SNP dạng ion; tuy nhiên, ion bạc vẫn gây độc tế bào ở nồng độ ức chế sự phát triển của các loại nấm men được kiểm tra [47]. Theo nghiên cứu trước đây, cả hai tác động tích cực và tiêu cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật đã được đề xuất [48]. Ở một số loài thực vật (ví dụ: Brassica juncea), SNPs đã được chỉ ra ảnh hưởng đến tổng số các yếu tố tăng trưởng thực vật bao gồm chiều dài chồi và rễ và các thuộc tính sinh hóa như chất diệp lục, hàm lượng carbohydrate và protein và tỷ lệ các enzym chống oxy hóa [49].
- Kết luận
Nghiên cứu in vitro và in vivo về hoạt tính kháng nấm của nano bạc ở nồng độ 5, 10, 25 và 50 ppm được tiến hành đối với nấm bệnh R. solani để giảm và ngăn ngừa bệnh khô vằn trên cây lúa. Kết quả in vitro cho thấy RHs đối với sự phát triển của sợi nấm, sự hình thành hạch nấm và sự nảy mầm của hạch nấm lần lượt là (8, 35, 67, 85), (12, 23, 68, 92) và (15, 26, 57, 98) cho nồng độ SNPs tương ứng của chúng (5, 10, 25 và 50 ppm). Kết quả cho thấy rõ ràng rằng RHs phụ thuộc mạnh mẽ vào nồng độ SNPs, và về cơ bản tăng lên khi nồng độ SNPs tăng lên. Như đã chỉ ra trong thử nghiệm in vitro, chúng ta có thể kết luận xu hướng ngày càng tăng trong tỷ lệ ức chế sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của hạch nấm và sự hình thành hạch nấm với số lượng SPN ngày càng tăng. Bằng cách phun SNPs trên cây lúa, các triệu chứng bệnh khô vằn trên lá giảm và ở nồng độ SNPs 50 ppm, các triệu chứng bệnh hoàn toàn biến mất. Kết quả in vivo cho thấy giải pháp SNPs đã tạo ra một lớp kháng khuẩn xung quanh cây lúa để bảo vệ cây khỏi các mầm bệnh. Nó cũng được chứng minh rằng SNP ảnh hưởng lớn đến sự hình thành và nảy mầm của hạch nấm. SNPs có thể thâm nhập vào màng tế bào nấm và thành tế bào, giết chết các tế bào vi sinh vật. Điều tra này cho thấy SNPs có thể thay thế thuốc trừ sâu hóa học trong việc kiểm soát và ức chế bệnh khô vằn, một bệnh phổ biến trên lúa.
Meysam Soltani Nejad 1, Gholam Hosein Shahidi Bonjar 1, Mehrdad Khatami 2, Abbas Amini 3, Sonia Aghighi 4,5
1 Department of Plant Pathology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Bam University of Medical Sciences, Bam, Iran
3 Institute for Infrastructure Engineering, University of Western Sydney, Kingswood, NSW 2751, Australia
4 Horticultural Research Institute, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
5 School of Veterinary and Life Sciences, Murdoch University, Perth, WA 6150, Australia
E-mail: meysamsoltaninejad@gmail.com