Nano bạc điều trị bệnh thán thư trên hồ tiêu do nấm Colletotrichum gây ra

Bệnh thán thư trên hồ tiêu do loài Colletotrichum gây ra là một trong những yếu tố hạn chế quan trọng nhất đối với sản xuất hồ tiêu ở Hàn Quốc, việc quản lý hồ tiêu phụ thuộc nhiều vào hóa chất. Mục đích của công việc này là đánh giá khả năng sử dụng các hạt nano bạc thay cho các loại thuốc diệt nấm thương mại. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng của nano bạc đối với bệnh thán thư trên cây tiêu trong các điều kiện nuôi trồng khác nhau. Các hạt nano bạc (WA-PR-WB13R) được ứng dụng ở các nồng độ khác nhau để xác định các hoạt tính kháng nấm trong ống nghiệm và trên thực địa. Việc áp dụng các hạt nano bạc nồng độ 100 ppm tạo ra sự ức chế tối đa sự phát triển của sợi nấm cũng như sự nảy mầm của bào tử so với đối chứng in vitro. Trong các thử nghiệm đồng ruộng, khả năng ức chế nấm cao đáng kể khi các phân tử nano bạc được áp dụng trước khi dịch bệnh bùng phát trên cây trồng. Kết quả quét bằng kính hiển vi điện tử chỉ ra rằng các hạt nano bạc đã gây ra ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của sợi nấm của các loài Colletotrichum.

(Bản quyền thuộc NanoCMM Technology)

Giới thiệu

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra, là một loại bệnh gây hại nghiêm trọng xảy ra trên nhiều loại cây thương phẩm như đậu, dâu, tía tô và các cây trồng khác [ 1 ]. Để kiểm soát các loại nấm thực vật khác nhau, bao gồm các loài Colletotrichum , hóa chất nông nghiệp đã được sử dụng từ lâu. Việc sử dụng rộng rãi các hóa chất nông nghiệp chắc chắn đã làm giảm sự bùng phát của nấm bệnh, nhưng đồng thời cũng góp phần vào sự phát triển của các mầm bệnh kháng thuốc [ 2 , 3]. Hơn nữa, những hóa chất như vậy có thể gây chết các vi sinh vật có ích trong tầng sinh quyển và côn trùng có ích trong đất, và chúng cũng có thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn và tích tụ trong cơ thể con người dưới dạng dư lượng hóa chất không mong muốn [ 4 ]. Với sự xuất hiện và gia tăng của các vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh, và việc tiếp tục chú trọng đến chi phí chăm sóc sức khỏe, nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng phát triển các thuốc thử kháng khuẩn mới và hiệu quả, không kích thích sự đề kháng và ít tốn kém hơn.

Các vật liệu kích thước nano đã nổi lên như một chất chống vi khuẩn mới nhờ tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cao và các đặc tính vật lý và hóa học độc đáo, làm tăng khả năng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn và khả năng thấm qua tế bào [ 5 , 6 ]. Ngoài ra, công nghệ nano đã khuếch đại hiệu quả của các hạt bạc như chất kháng khuẩn.

Bạc được biết là tấn công một loạt các quá trình sinh học ở vi sinh vật bao gồm cả cấu trúc và chức năng màng tế bào [ 7 – 9 ]. Bạc cũng ức chế sự biểu hiện của các protein liên quan đến sản xuất ATP [ 10], mặc dù các cơ chế kháng khuẩn cụ thể của nó vẫn chưa được hiểu hoàn toàn. Việc sử dụng các hạt bạc có kích thước nano làm chất kháng khuẩn đã trở nên phổ biến hơn khi các tiến bộ công nghệ làm cho việc sản xuất chúng trở nên kinh tế hơn. Một trong những ứng dụng tiềm năng của bạc là quản lý bệnh hại cây trồng.

Vì bạc hiển thị nhiều phương thức tác động ức chế vi sinh vật [ 11 ], nó có thể được sử dụng để kiểm soát các mầm bệnh thực vật khác nhau theo cách tương đối an toàn hơn so với thuốc diệt nấm tổng hợp [ 12 ]. Cho đến nay, các nghiên cứu còn hạn chế đã cung cấp một số bằng chứng về khả năng ứng dụng của bạc để kiểm soát bệnh hại cây trồng [ 11]. Giảm kích thước hạt của vật liệu là một công cụ hiệu quả và đáng tin cậy để cải thiện tính tương thích sinh học của chúng. Trên thực tế, công nghệ nano giúp khắc phục những hạn chế về kích thước và có thể thay đổi cách nhìn của thế giới về khoa học [ 13 ]. Hơn nữa, vật liệu nano có thể được sửa đổi để có hiệu quả tốt hơn nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau như khoa học sinh học và y học.

Sự so sánh kích thước đơn giản này đưa ra ý tưởng về việc sử dụng các hạt nano làm đầu dò rất nhỏ cho phép làm sáng tỏ bộ máy tế bào mà không gây ra quá nhiều can thiệp [ 14 ]. Hiểu biết về các quá trình sinh học ở cấp độ nano là động lực mạnh mẽ thúc đẩy sự phát triển của công nghệ nano [ 15 ].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh tác dụng ức chế của các hạt nano bạc đối với các loài Colletotrichum và bệnh thán thư trên cây tiêu lần lượt trong ống nghiệm và trong điều kiện khảo nghiệm trên đồng ruộng. Các nghiên cứu in vitro đề cập đến ảnh hưởng của các hạt nano bạc đối với các loài Colletotrichum ở các nồng độ và môi trường sinh trưởng khác nhau cũng như cơ chế kiểm soát của các hạt nano bạc chống lại Colletotrichum trong các thử nghiệm thực địa.

Nguyên liệu và phương pháp

Hạt nano bạc và thuốc diệt nấm

Hạt nano bạc (WA-PR-WB13R [PR]) được cung cấp bởi Bio-Plus Co. Ltd. (Pohang, Hàn Quốc) ở nồng độ ban đầu 1000 ppm. Dung dịch hạt nano bạc dạng keo được pha loãng thành các nồng độ khác nhau 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm và 100 ppm bằng cách sử dụng nước cất ở nhiệt độ phòng (25 ℃). Các hạt nano này có hình dạng keo với kích thước trung bình từ 4 ~ 8 nm. Tất cả các dung dịch này được lưu trữ ở 40 ℃ để sử dụng tiếp. Nước cất được sử dụng để kiểm soát và hai loại thuốc diệt nấm khác nhau được sử dụng để kiểm soát tích cực: NSS-F bao gồm nano bạc và titan (Dongbangagro Co., Seoul, Korea) và Fenari (Dongbu HiTek, Seoul, Korea).

Nấm và phương tiện tăng trưởng

Sáu loài Colletotrichum được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Nông nghiệp Hàn Quốc (KACC), Suwon, Hàn Quốc (Bảng 1). Những loại nấm này được trồng trên thạch dextrose khoai tây (PDA) và được ủ ở 28 ± 2 ℃. Để phân biệt các hoạt động kháng nấm của các hạt nano bạc trong môi trường nuôi cấy, ba môi trường thạch khác nhau đã được sử dụng: PDA, thạch chiết xuất mạch nha (MEA) và thạch bột ngô (CMA).

Bảng 1

Thử nghiệm trong ống nghiệm

Thử nghiệm in vitro được thực hiện trên PDA, MEA và CMA được xử lý bằng các hạt nano bạc WA-PR-WB13R 10, 30, 50 và 100 ppm. 5 mL WA-PR-WB13R được đổ vào môi trường trước khi mạ vào mỗi đĩa Petri 90 × 15 mm. Môi trường có chứa các hạt nano bạc được ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ ủ, một nút thạch có đường kính 8 mm chứa nấm được cấy đồng thời vào tâm của mỗi đĩa Petri và ủ ở 28 ± 2 ℃. Sau 2 tuần ủ, các vùng ức chế được đo. Thử nghiệm được lặp lại hai lần và mỗi lần điều trị lặp lại ba lần. Tỷ lệ ức chế (%) được tính theo công thức sau:

Tỉ lệ ức chế (%) = (R-r) * 100/R

trong đó R là sự phát triển xuyên tâm của nấm trong đĩa đối chứng và r là sự phát triển xuyên tâm của nấm trong đĩa được xử lý bằng hạt nano bạc. Dữ liệu từ các thí nghiệm được phân tích bằng cách phân tích phương sai (ANOVA) sử dụng SAS ver. 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) và các giá trị trung bình được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm đa dải của Duncan (DMRT) ở p = 0,05.

Thử nghiệm thực địa và phân tích dữ liệu

Để xác định hiệu quả của các hạt nano bạc đối với bệnh thán thư trên cây tiêu, một thí nghiệm đã được thực hiện ở Chuncheon, Kangwon-do, Hàn Quốc trước và sau khi cây tiêu bị nhiễm bệnh tự nhiên. Các hạt nano bạc được sử dụng đồng thời ở 10, 30, 50 và 100 ppm. Các hạt nano bạc được sử dụng trên lá của cây từ 3 ~ 4 tuần trước khi bệnh bùng phát và sau khi bệnh bùng phát. Các hạt nano bạc được sử dụng mỗi tuần trong bốn tuần. Kết quả thu được 4 tuần sau lần điều trị cuối cùng cho đợt điều trị trước khi dịch bệnh bùng phát và một tuần sau lần điều trị cuối cùng cho đợt điều trị sau khi bệnh bùng phát. Thuốc diệt nấm thương mại ‘NSS-F’, có chứa nano bạc và bạch kim, và thuốc diệt nấm hóa học ‘Fenari’ đã được sử dụng để kiểm soát tích cực. Nước cất được sử dụng như một đối chứng tiêu cực. Tỷ lệ bệnh (%) được tính bằng cách đếm số lá bị nhiễm bệnh trong số 150 lá của các cây được xử lý trong các thử nghiệm đồng ruộng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần.

Phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Khoảng 5 mL dung dịch có bốn nồng độ khác nhau, 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm và 100 ppm, của các hạt nano bạc WA-PR-WB13R đã được áp dụng trên sợi nấm C. gloeosporioides đã phát triển đầy đủ được trồng trên PDA bằng máy phun. Ứng dụng được thực hiện trong khoảng thời gian 1, 3, 5, 10 và 15 ngày và các sợi nấm chưa được xử lý được nuôi cấy làm đối chứng. Mỗi nghiệm thức được ủ ở nhiệt độ phòng. Toàn bộ mẫu được cố định trong glutaraldehyde 4% trong 3 giờ và được xử lý bằng dung dịch đệm cacodylate 0,1M trong 1 giờ. Sau khi rửa bằng nước cất, mẫu thử được khử nước trong loạt etanol đã phân loại đến 100%, được làm khô ở điểm tới hạn, và được phủ vàng bằng cách sử dụng bộ tăng cường nhiễu xạ ion. Mẫu vật được quan sát trên SEM (S-3500N; Công ty Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở điện áp gia tốc 10 kV.

Kết quả

Ức chế các loài Colletotrichum trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

Sáu loài Colletotrichum đã được chọn để phân tích tác dụng ức chế của các hạt nano bạc WA-PR-WB13B trên PDA, MEA và CMA. Các phân lập nấm được xử lý bằng nước cất được sử dụng làm đối chứng. Các hạt nano bạc cho thấy các mức độ ức chế khác nhau đối với sự phát triển của sợi nấm của các loài Colletotrichum (Bảng 2). Rõ ràng là ức chế đáng kể sự phát triển của sợi nấm Colletotrichum được cung cấp với các hạt nano bạc 100 ppm trên PDA. Sự ức chế hoàn toàn đã được quan sát thấy trên PDA được xử lý bằng các hạt nano bạc 100 ppm chống lại các chủng phân lập C-3 và C-5. Các chủng C-7 và C-8 cũng cho thấy sự ức chế hơn 90% đối với PDA được xử lý bằng các hạt nano bạc 100 ppm. Sự ức chế thấp nhất được quan sát thấy đối với phân lập C-6 trên PDA. Ở tất cả các nghiệm thức sử dụng hạt nano bạc 10 ppm, tỷ lệ ức chế thấp hơn so với các nghiệm thức khác.

Tương tự như vậy, sự ức chế gây ra bởi các hạt nano bạc chống lại sự phát triển của sợi nấm của các loài Colletotrichum cũng được quan sát thấy trên môi trường MEA; tuy nhiên tỷ lệ ức chế không đáng kể so với môi trường PDA. Tỷ lệ ức chế cao nhất được quan sát đối với C-6 được xử lý với 50 ppm hạt nano bạc (84,56%) và xử lý chống lại C-6 trên hạt nano bạc 30 ppm cũng cho thấy sự ức chế đáng kể đối với MEA (84,50%). Tỷ lệ ức chế thấp nhất được quan sát đối với C-7 được xử lý với 10 ppm hạt nano bạc trên MEA (11,33%).

Tuy nhiên, trên môi trường CMA, tất cả các nồng độ cho thấy ức chế hơn 45% nhưng kết quả không có ý nghĩa như trên môi trường PDA. Sự ức chế cao nhất quan sát được trên CMA là chống lại C-7 trên nồng độ 100 ppm của các hạt nano bạc (93,50%) và sự ức chế thấp nhất được quan sát đối với C-8 được xử lý bằng các hạt nano bạc 100 ppm. Do đó, kết quả cho thấy tỷ lệ ức chế thay đổi tùy theo việc lựa chọn môi trường sinh trưởng và nồng độ của hạt nano bạc. Trong thí nghiệm này, PDA là môi trường thuận lợi nhất để ngăn chặn mầm bệnh trong ống nghiệm . Kết quả cũng cho thấy tỷ lệ ức chế khác nhau ở các loài Colletotrichum khi được sử dụng trong các môi trường sinh trưởng khác nhau với các nồng độ hạt nano bạc khác nhau.

Bảng 2. Tỷ lệ ức chế (%) của các hạt nano bạc WA-PR-WB13R chống lại các loài Colletotrichum trên các môi trường và nồng độ sinh trưởng khác nhau (ppm)

Dữ liệu theo sau bởi (các) chữ cái giống nhau trong cùng một cột không khác biệt nhau đáng kể theo thử nghiệm đa phạm vi Duncan (DMRT) ở p = 0,05.

PDA, thạch dextrose khoai tây; MEA, thạch chiết xuất mạch nha; CMA, thạch bột ngô.

^a tỷ lệ ức chế (%) được xác định dựa trên các phương pháp lặp lại 3 lần.

Tác dụng của nano bạc đối với bệnh thán thư trong khảo nghiệm đồng ruộng

Tác dụng ức chế của các hạt nano bạc WA-PR-WB13B được phân tích đối với bệnh thán thư trên cây tiêu gần Chuncheon, Hàn Quốc (Hình 1). Tỷ lệ bệnh trung bình là tối đa (84,1%) ở cây đối chứng. Kết quả cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức, tỷ lệ bệnh cao hơn được quan sát thấy ở các cây được xử lý sau khi bệnh bùng phát. Thuốc trừ bệnh thương mại, NSS-F và Fenari, cho thấy tỷ lệ bệnh lần lượt là 35,2% và 25,3% trên cây được xử lý trước khi bệnh bùng phát.

Tuy nhiên, ở nghiệm thức sau khi bùng phát bệnh, tỷ lệ mắc bệnh cao hơn đáng kể so với nghiệm thức trước khi bùng phát bệnh với NSS-F và Fenari (lần lượt là 72,1% và 63,4%). Trong tất cả các nghiệm thức, tỷ lệ bệnh thấp nhất được quan sát thấy trên cây được xử lý bằng hạt nano bạc 50 ppm trước khi bệnh bùng phát (9,7%), và tỷ lệ bệnh cao nhất được quan sát thấy trên cây được xử lý bằng NSS-F sau khi bệnh bùng phát (72,1%). Kết quả cho thấy phương pháp xử lý bằng hạt nano bạc đã ngăn chặn sự tấn công của mầm bệnh khi áp dụng trước khi bệnh bùng phát trên cây trồng. Ngoài ra, kết quả cũng chỉ ra rằng các nghiệm thức WA-PR-WB13B bằng hạt nano bạc có hiệu quả hơn các loại thuốc diệt nấm thương mại NSS-F và Fenari trong các thử nghiệm trên đồng ruộng.

SEM quan sát sợi nấm C. gloeosporioides

Nồng độ khác nhau của các hạt nano bạc và sự ức chế sự nảy mầm của sợi nấm C. gloeosporioides được phân tích thông qua SEM. Để làm sáng tỏ ảnh hưởng của các hạt nano bạc đối với sự phát triển của nấm, các sợi nấm khỏe mạnh phát triển trên đĩa PDA được phun dung dịch hạt nano bạc 30, 50 hoặc 100 ppm và được quan sát bằng SEM. Quan sát bằng kính hiển vi này cho thấy rằng các hạt nano bạc đã làm hỏng các sợi nấm một cách rõ ràng (Hình 2B ~ 2D), trong khi sợi nấm được xử lý bằng nước (đối chứng) dường như vẫn còn nguyên vẹn (Hình 2A). Tổn thương trên sợi nấm tăng lên theo sự gia tăng của nồng độ và thời gian. Sợi nấm bị trũng và bị tổn thương do tác dụng của các hạt nano bạc (Hình 2B ~ 2D). Các sợi nấm được quan sát 3 ngày sau khi xử lý các hạt nano bạc 100 ppm cho thấy các dị tật về sự phát triển của sợi nấm và hình dạng của các thành sợi nấm. Các lớp của vách sợi nấm cũng bị xé ra trên các sợi nấm bị hư hỏng sau 3 ngày (Hình 2D) và nhiều sợi nấm bị gãy sau 5 ngày. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy trên bào tử của C. gloeosporioides (không được hiển thị). Do đó, kết quả cho thấy nồng độ và thời gian điều trị đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế mầm bệnh.

Thảo luận

Các kết quả thu được về hoạt tính kháng nấm cho thấy rõ ràng rằng sự phát triển của các loài Colletotrichum bao gồm C. gloeosporioides bị ức chế ở các nồng độ khác nhau của các hạt nano bạc. Dựa trên sự so sánh các kết quả thu được từ trước và sau khi xử lý dịch bệnh, kết quả chỉ ra rằng việc ức chế nấm có thể đạt được khi áp dụng trước khi các triệu chứng bệnh xảy ra trên cây trồng. Các đặc tính kháng nấm cao nhất đã được quan sát thấy trong trường hợp xử lý với các hạt nano bạc 50 ppm trong các thử nghiệm thực địa và các hạt nano bạc 100 ppm trong ống nghiệm . Do đó, các kết quả đã chứng minh rõ ràng rằng các hạt nano bạc có khả năng ức chế các loài nấm gây bệnh Colletotrichum trong điều kiện hiện trường cũng như trong môi trường được kiểm soát.

Các loại bạc có kích thước nanomet có các đặc tính khác nhau, có thể đến từ những thay đổi về hình thái, cấu trúc và sinh lý [ 16 ]. Thật vậy, một số bằng chứng ủng hộ hiệu quả nâng cao của các hạt nano bạc đối với hoạt động kháng khuẩn. Các hạt nano bạc có tính phản ứng cao vì chúng tạo ra các ion Ag ⁺ trong khi bạc kim loại tương đối không hoạt động [ 5 ]. Nó cũng chỉ ra rằng các hạt nano thâm nhập hiệu quả vào các tế bào vi sinh vật, điều này có nghĩa là nồng độ bạc kích thước nano thấp hơn sẽ đủ để kiểm soát vi sinh vật. Điều này sẽ hiệu quả, đặc biệt là đối với một số sinh vật ít nhạy cảm hơn với kháng sinh do sự xâm nhập kém của một số kháng sinh vào tế bào [ 17].

Một nghiên cứu trước đây đã quan sát thấy rằng các hạt nano bạc làm gián đoạn các hệ thống vận chuyển bao gồm cả dòng chảy ion [ 5 ]. Sự rối loạn chức năng của dòng chảy ion có thể gây ra sự tích tụ nhanh chóng của các ion bạc, làm gián đoạn các quá trình tế bào ở nồng độ thấp hơn của chúng như trao đổi chất và hô hấp bằng cách phản ứng với các phân tử. Ngoài ra, các ion bạc được biết là tạo ra các loại oxy phản ứng thông qua phản ứng của chúng với oxy, gây bất lợi cho tế bào, gây ra thiệt hại cho protein, lipid và axit nucleic [ 18 , 19 ].

Trong khi đó, một nghiên cứu trước đây cho rằng các hạt nano bạc có thể làm chậm đáng kể sự phát triển của sợi nấm C. gloeosporioides theo cách phụ thuộc vào liều lượng trong ống nghiệm [ 20]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào tác dụng ức chế của các hạt nano bạc đối với sáu loài Colletotrichum trên ba môi trường sinh trưởng khác nhau trong ống nghiệm cũng như trong các thử nghiệm thực địa. Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cũng cho thấy rằng việc sử dụng các hạt nano bạc có hiệu quả chống lại nấm hình thành xơ cứng, bệnh phấn trắng và bệnh Raffaelea sp. [ 21 – 24 ].

Tương tự, nghiên cứu hiện tại cũng cho thấy rằng các hạt nano bạc có hiệu quả trong việc kiểm soát mầm bệnh thán thư hại tiêu trên các loài Colletotrichum bao gồm C. gloeosporioides. Vì vậy, các hạt nano bạc được điều chế bằng phương pháp hiệu quả về chi phí có triển vọng lớn như một chất kháng khuẩn, và hoạt tính kháng nấm của các hạt nano bạc có tiềm năng lớn để sử dụng trong việc kiểm soát nấm bệnh sinh bào tử thực vật. Nghiên cứu thực địa cũng cho thấy rằng, do hiệu quả của bạc bị ảnh hưởng rất nhiều bởi thời gian sử dụng, các ứng dụng phòng ngừa của các hạt nano bạc hoạt động tốt hơn trước khi các chủng nấm phân lập xâm nhập và cư trú trong mô thực vật.

Tóm lại, ứng dụng của các hạt nano bạc có thể dẫn đến những khám phá có giá trị trong các lĩnh vực khác nhau như hệ thống kiểm soát mầm bệnh và kháng khuẩn. Tuy nhiên, với sự ra đời của các hạt nano bạc và công dụng chính của nó như một chất kháng khuẩn, cần có nhiều thử nghiệm thực nghiệm để hiểu được độc tính. Vẫn còn một số câu hỏi cần giải quyết, chẳng hạn như cơ chế tương tác chính xác của các hạt nano bạc với tế bào nấm và diện tích bề mặt của các hạt nano ảnh hưởng đến hoạt động tiêu diệt như thế nào. Ngoài ra, các mô hình động vật và các nghiên cứu lâm sàng cũng sẽ cần được thực hiện để hiểu rõ hơn về hiệu quả kháng nấm của các hạt nano bạc.

Nguồn tham khảo:

Application of Silver Nanoparticles for the Control of Colletotrichum Species In Vitro and Pepper Anthracnose Disease in Field

Kabir Lamsal,¹ Sang Woo Kim,¹ Jin Hee Jung,¹ Yun Seok Kim,¹ Kyong Su Kim,² and Youn Su Lee¹