Nano bạc điều trị bệnh xì mủ trên mít, sầu riêng, cây có múi… do nấm Phytophthora parasitica và P. capsici
Ứng dụng hạt nano để kiểm soát mầm bệnh thực vật là một lĩnh vực đang nổi lên nhanh chóng trong quản lý bệnh hại cây trồng, và các phương pháp tổng hợp hạt nano tiết kiệm và thân thiện với môi trường đang được nghiên cứu rộng rãi. Trong dự án này, chúng tôi đã nghiên cứu tiềm năng của các hạt nano bạc (AgNPs) được tổng hợp bằng chiết xuất nước của Artemisia absinthium chống lại một số loài Phytophthora spp., Gây ra nhiều bệnh hại cây trồng quan trọng về mặt kinh tế. Trong các thử nghiệm phản ứng với liều lượng in vitro được tiến hành trên các đĩa microtiter, 10 µg ml −1 AgNP đã ức chế sự phát triển của sợi nấm của P. parasitica , P. infestans , P. palmivora , P. cinnamomi , P. Tropicalis ,P. capsici và P. katsurae. Các phân tích phản ứng liều in vitro chi tiết được thực hiện với P. parasitica và P. capsici cho thấy rằng AgNP được tổng hợp bằng chiết xuất A. absinthium có hiệu lực cao (IC50: 2,1 đến 8,3 µg ml -1) và hiệu quả (100%) trong việc ức chế sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử động vật, sự dài ra của ống mầm và sự sản sinh động bào tử. Điều thú vị là, việc xử lý bằng AgNP đã làm tăng tốc độ đông tụ của các động vật có vú. Phù hợp với kết quả in vitro, trong các thí nghiệm trồng cây được tiến hành trong nhà kính cho thấy rằng các phương pháp xử lý bằng AgNP đã ngăn ngừa nhiễm Phytophthora và cải thiện tỷ lệ sống của cây. Hơn nữa, AgNP trong các thí nghiệm trên cây không tạo ra bất kỳ ảnh hưởng xấu nào đến sự phát triển của cây. Những nghiên cứu này cung cấp một phương pháp đơn giản và tiết kiệm để kiểm soát Phytophthora bằng AgNP mà không ảnh hưởng đến sinh lý thực vật bình thường.
(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)
GIỚI THIỆU
Các hạt nano bạc (AgNPs) thể hiện các hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm và chống khối u mạnh mẽ ( Kharissova et al. 2013 ). Do các hoạt động kháng khuẩn tuyệt vời và các đặc tính hóa lý mong muốn, AgNPs hiện đang được nghiên cứu rộng rãi để ứng dụng trong các ngành khác nhau bao gồm y học, chẩn đoán, mỹ phẩm và chế biến thực phẩm ( Thorley và Tetley 2013 , Dự án về Công nghệ nano mới nổi 2013 ). Trên thực tế, chúng đã được sử dụng trong băng vết thương, bao bì thực phẩm và trong các sản phẩm tiêu dùng như dệt may và giày dép để chống lại vi sinh vật gây mùi ( Schluesener và Schluesener 2013 ; Velmurugan và cộng sự 2014 ; Dự án về Công nghệ nano mới nổi 2013). AgNP chủ yếu bao gồm các cụm bạc hóa trị 0 (Ag 0 ), thường có kích thước đường kính từ 5 đến 100 nm. Tùy thuộc vào hóa học tổng hợp của chúng, các chế phẩm AgNP có thể bao gồm các cầu nano, ống nano, tinh thể hình tam giác hoặc sự kết hợp của các hình dạng này. Các cấu trúc nano ba chiều của AgNPs được ổn định bởi các chất đóng nắp khác nhau, chủ yếu là các chất tạo màng sinh học như cellulose, pectin, guar gum và polyethylene glycol ( George và cộng sự 2014 ; Lavorgna và cộng sự 2014 ; Mandal và cộng sự 2012 ; Raghavendra và cộng sự. 2013). Nhiều cơ chế đã được đề xuất cho các đặc tính kháng khuẩn của AgNPs. Chúng thể hiện ái lực cao với lưu huỳnh và phốt pho. Tương tác của chúng với lưu huỳnh có chứa axit amin bên trong hoặc bên ngoài tế bào ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào ( Prathna et al. 2011 ). Một cơ chế khác có thể xảy ra bao gồm việc giải phóng các ion bạc từ AgNP và tương tác sau đó của chúng với phốt pho trong DNA, do đó làm bất hoạt quá trình sao chép DNA. Các ion bạc được giải phóng cũng có thể phản ứng với các protein chứa lưu huỳnh, dẫn đến ức chế các chức năng của enzym và protein ( Gupta 1998 ). Ngoài ra, các ion bạc đã được báo cáo là có khả năng ức chế các protein chuỗi hô hấp và cản trở tính thấm của màng ( Holt và Bard 2005 ; Shrivastava và cộng sự 2007). Vì AgNPs hiển thị nhiều chế độ hoạt động ức chế chống lại vi sinh vật ( Clement và Jarrett 1994 ), nguy cơ mầm bệnh phát triển kháng lại AgNPs được giảm thiểu. Do khả năng kháng thuốc giảm sút, AgNPs có thể được sử dụng để kiểm soát các mầm bệnh cây trồng kháng thuốc trừ nấm hiệu quả hơn.
Các hạt nano bạc được tổng hợp bằng cách sử dụng chất chiết xuất từ thực vật đã được chứng minh là có khả năng ức chế vi khuẩn và nấm gây bệnh cho cây trồng ( Kaur và cộng sự 2012 ; Kim và cộng sự 2012 ; Panacek và cộng sự 2009 ; Pimprikar và cộng sự 2009 ). Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, không có nghiên cứu nào báo cáo khả năng của AgNP chống lại tế bào trứng, vốn khác biệt về mặt sinh học so với nấm thật. Chi oomycete Phytophthora bao gồm hơn một trăm loài, chúng lây nhiễm nhiều loại thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và cây cảnh trong nông nghiệp được quản lý và cây rừng trong các hệ sinh thái tự nhiên ( Kroon và cộng sự 2012 ). Thiệt hại mùa màng trên toàn thế giới do bệnh Phytophthora ước tính lên đến hàng tỷ đô la (Wawra và cộng sự. 2012 ). Các ví dụ nổi bật bao gồm thiệt hại 6,7 tỷ đô la đối với khoai tây do bệnh mốc sương ( Haverkort et al. 2008 ) và 1 đến 2 tỷ đô la ở đậu tương do bệnh thối rễ Phytophthora ( Tyler 2007 ). Một số loài Phytophthora phá hoại nhiều nhất và được biết đến nhiều nhất là P. infestan s (bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua), P. parasitica (bệnh cháy lá, thối rễ và thân ở cây cảnh và cây hàng năm bao gồm cả cây có múi), P. capsici (bệnh cháy lá ở nhiều loại rau), P. sojae (thối rễ và thân đậu tương), và P. ramorum (sồi chết đột ngột) ( Cacciola và Lio 2008 ; Cline và cộng sự 2008 ;Erwin và Ribeiro 1996 ; Gevens và cộng sự. Năm 2007 ; Grunwald và cộng sự. Năm 2012 ; Kroon và cộng sự. 2012 ). Hiện nay, nhiều loại hóa chất tổng hợp khác nhau được sử dụng để kiểm soát những mầm bệnh này. Tuy nhiên, Phytophthora spp. được biết là phát triển khả năng kháng hóa chất rất nhanh ( Childers và cộng sự 2015 ; Dobrowolski và cộng sự 2008 ; Gisi và Cohen 1996 ; Hu và cộng sự 2012 ; Hu và cộng sự 2005 ; Hu và cộng sự 2008 , 2010 ; Hwang và Benson 2005 ; Meng và cộng sự 2011 ; Perez-Sierra và cộng sự 2011 ;Randall và cộng sự. 2014 ; Timmer và cộng sự. 1998 ). Kháng thuốc diệt nấm là một trong những vấn đề lớn trong việc quản lý bệnh do Phytophthora spp. Giải quyết vấn đề kháng thuốc diệt nấm sẽ đòi hỏi phải khám phá ra các sản phẩm thay thế với phương thức hành động mới. AgNPs, do nguy cơ phát triển khả năng kháng thuốc thấp hơn, có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc quản lý tính kháng thuốc trừ nấm của Phytophthora spp.
AgNPs có thể được tổng hợp bằng nhiều phương pháp vật lý khác nhau như xúc tác huyết tương và cắt bỏ bằng laser ( Amendola và cộng sự 2007 ) và các phương pháp hóa học yêu cầu chất khử như natri borohydrat ( Borase và cộng sự 2014 ; Zhu và cộng sự 2000 ). Phương pháp vật lý liên quan đến nhiệt độ cao và tia laser, đắt tiền và yêu cầu thiết bị chuyên dụng và nhân viên có tay nghề cao. Các phương pháp tổng hợp hóa học thường liên quan đến nhiệt độ và áp suất cao, và việc tạo ra các sản phẩm phụ nguy hiểm tiềm ẩn gây ra những lo ngại về môi trường ( Borase et al. 2014 ; Zhu et al. 2000). Tổng hợp xanh, sử dụng vật liệu sinh học làm nguồn chất khử và chất đóng nắp, mang lại cách tiếp cận tương đối an toàn hơn và thân thiện với môi trường để tổng hợp hạt nano ( Borase et al. 2014 ). Nhiều nguồn sinh học bao gồm chiết xuất từ mô thực vật và vi khuẩn đã được sử dụng để tổng hợp AgNPs (được đánh giá trong Borase và cộng sự 2014 ; Kharissova và cộng sự 2013 ). Mặc dù cơ chế chính xác về cách vật liệu sinh học làm trung gian tổng hợp AgNP chưa được hiểu rõ, nhưng các chất chuyển hóa và enzym khác nhau được đề xuất để cung cấp khả năng khử để khử Ag + thành Ag 0. Ngoài các chất khử, chiết xuất sinh học cũng được đề xuất để cung cấp các chất đóng nắp, giúp ổn định AgNPs (được xem xét trong Borase và cộng sự 2014 ; Kharissova và cộng sự 2013 ). Artemisia absinthium L. được tìm thấy tự nhiên ở chân núi Himalaya ở tiểu lục địa Ấn Độ. Trước đây, nhóm của chúng tôi cũng như những người khác đã chỉ ra rằng loài thực vật này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, có khả năng cung cấp nguồn tuyệt vời để khử Ag + thành AgNP ( Ali và Abbasi 2014a , b ; Ali và cộng sự 2013 ; Lee và cộng sự. 2013 ; Singh và cộng sự 2012 ). Sử dụng chiết xuất nước của A. absinthium, chúng tôi đã tổng hợp thành công và đặc trưng cho AgNP (Ali và cộng sự, dữ liệu chưa được công bố ). Trong báo cáo này, chúng tôi đã điều tra tiềm năng của các AgNP này trong việc ức chế Phytophthora spp. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên cho thấy việc kiểm soát hiệu quả bệnh Phytophthora spp. sử dụng các hạt nano bạc. Các mục tiêu chính của nghiên cứu này là (i) đánh giá hiệu quả và hiệu lực của Artemisia -mediated AgNP chống lại các loài Phytophthora spp khác nhau . in vitro và in planta, và (ii) để xác định ảnh hưởng của AgNP đến các giai đoạn phát triển và sinh sản khác nhau của Phytophthoraspp. Kết quả điều tra của chúng tôi sẽ mở rộng danh mục các sản phẩm có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc luân phiên với các hóa chất khác để kiểm soát bệnh Phytophthora .
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tổng hợp các hạt nano bạc.
Các cây A. absinthium được nuôi trong nhà kính đã được làm khô ở nhiệt độ phòng và được sử dụng để tổng hợp AgNPs. Chiết xuất thực vật được chuẩn bị bằng cách đun sôi 1 g lá bột khô của A. absinthium trong 10 ml nước khử ion trong 5 phút. Dịch chiết dạng nước được làm nguội đến nhiệt độ phòng (25 ° C), lọc qua màng lọc 0,45 μm (Millex) và bảo quản ở 4 ° C cho đến khi sử dụng. Để tổng hợp các hạt nano bạc, AgNO3 (2 mM) và các chất chiết xuất từ thực vật trong nước được chuẩn bị như mô tả ở trên được trộn với các thể tích bằng nhau, và các phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. AgNO 3 không phản ứng và các chất chiết xuất từ thực vật được loại bỏ bằng cách tạo viên và rửa AgNP như sau. Hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở 14.000 × g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Phần nổi phía trên được loại bỏ và các viên AgNP được ngâm lại trong nước khử ion, sau đó được ly tâm ở 14,000 × g trong 10 phút. Quá trình này được lặp lại năm lần. AgNP thu được được ngâm lại trong nước khử ion và được sử dụng trong các thử nghiệm kháng khuẩn.
Quá trình tổng hợp AgNP được theo dõi bằng cách ghi lại phổ UV-vis (λ 250 đến 700 nm) sử dụng máy quang phổ NanoDrop 2000C (Thermo Fischer Scientific) hoặc đầu đọc vi tấm đa chế độ Synergy H1 Hybrid (BioTek).
Các xét nghiệm và phân tích dữ liệu ức chế Phytophthora in vitro .
Hiệu lực và hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc đã được thử nghiệm đối với các loài Phytophthora spp khác nhau . trong ống nghiệm. Nguồn Phytophthora spp. được sử dụng làm mục tiêu trong báo cáo này được cung cấp trong Bảng 1 . Tuy nhiên, hầu hết các thử nghiệm ức chế đều tập trung vào P. parasitica và P. capsici . Ban đầu, tác dụng của các dung dịch pha loãng 10 lần của AgNPs (100, 10 và 1 µg ml -1 ) được thử nghiệm đối với các Phytophthora spp khác nhau . Các thử nghiệm in vitro được thực hiện trong một thử nghiệm tấm microtiter thông lượng cao như đã mô tả trước đây ( Ali và Reddy 2000). Tóm lại, hỗn hợp xét nghiệm được lắp ráp trong một đĩa microtiter đáy phẳng 96 giếng với mỗi giếng chứa 10% nước ép V8, 3.000 bào tử động vật và một loạt các dung dịch pha loãng AgNP gấp đôi (100 đến 0,10 µg ml −1 , wt / vol) trong 200 µl tổng thể tích phản ứng. Kiểm soát không có AgNP. Mỗi nghiệm thức được lặp lại bốn lần, và các thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần. Các tấm microtiter được bọc bằng parafilm và ủ ở 25 ° C trong một buồng ẩm để duy trì độ ẩm cao. Mật độ quang học (OD 600 nm) của các tấm microtiter được đọc ngay lập tức và 24 giờ sau khi bắt đầu thử nghiệm bằng đầu đọc tấm microtiter đa chế độ lai Synergy H1 (BioTek). Tăng trưởng ròng được xác định bằng cách trừ đi OD 600dữ liệu nm khi bắt đầu thử nghiệm từ dữ liệu ở khoảng thời gian 24 giờ. Dữ liệu tăng trưởng ròng được chuẩn hóa thành kiểm soát chưa được xử lý và được phân tích bằng cách sử dụng mô hình logistic sigmoidal bốn tham số bằng phần mềm Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.). Các phân tích thống kê về độ phù hợp của các đường cong cũng được thực hiện bằng cách sử dụng Prism 6.0. Các giá trị IC50, nồng độ AgNP cần thiết để ức chế sinh trưởng 50%, được tính toán từ các đường cong logistic được trang bị. Các tấm được kiểm tra dưới kính hiển vi và ảnh được ghi lại bằng máy ảnh kỹ thuật số gắn với kính hiển vi ngược (IX8, Olympus).
Bảng 1. Ức chế sinh trưởng của Phytophthora spp. bởi các hạt nano bạc (AgNP)
Để đánh giá ảnh hưởng của nano bạc đến sự nảy mầm của bào tử động vật, chiều dài ống mầm và túi chứa bào tử động vật, bào tử động vật được xử lý bằng hai lần pha loãng AgNP (100 đến 0,10 µg ml -1, wt / vol) trong các tấm microtiter như đã mô tả ở trên. Ngoài ra, sản lượng bào tử và sự phát tán bào tử động vật sau đó được theo dõi thường xuyên trong vài ngày. Mỗi lần điều trị được lặp lại ba lần. Mười lăm phút sau khi được xử lý bằng AgNP, các bào tử động vật bơi lội và bọc túi được đếm trong ba trường nhìn dưới kính hiển vi đảo ngược (IX8, Olympus). Mười giờ sau, ba bức ảnh ngẫu nhiên được chụp trong mỗi giếng của đĩa microtiter, và đếm các bào tử động vật nảy mầm và không nảy mầm. Chiều dài ống mầm được đo bằng phần mềm NIH Image J. Dữ liệu về liều lượng đáp ứng về sự nảy mầm của bào tử động vật, chiều dài ống mầm và túi chứa bào tử động vật được đưa vào một đường cong sigmoidal bốn tham số bằng phần mềm Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.). Giá trị IC50 cho các thông số trên được tính toán từ các đường cong biểu thị vừa vặn.
Trong thực vật ức chế Phytophthora bằng nano bạc
Đối với các thử nghiệm ức chế P. parasitica ở planta , cây Nicotiana benthamiana (PI 555478) được trồng từ hạt trong nhà kính được duy trì ở 25 ± 5 ° C với chu kỳ quang kỳ 16 giờ sáng / 8 giờ tối. Sau 15 đến 21 ngày, các cây N. benthamiana được chuyển sang buồng sinh trưởng đi bộ được duy trì ở 25 ± 5 ° C với ánh sáng 16 giờ (90 μmol / s / m 2 ) và chu kỳ tối 8 giờ. Cây được phun cho đến khi chảy nước bằng các biện pháp xử lý sau: AgNP ở 100 µg ml −1 , AgNP ở 10 µg ml −1 , mefenoxam (Subdue MAXX, 33,2 µg hoạt chất ml −1), như một đối chứng tích cực và nước như một đối chứng tiêu cực. Mỗi nghiệm thức bao gồm ba lần lặp lại với mỗi lần lặp lại bao gồm chín cây được sắp xếp trong một ma trận 3 × 3 trong các chậu vuông bằng nhựa dùng một lần (103 cm 2 ). Một ngày sau, các cây đã được xử lý được phun kỹ lưỡng với 25 ml hỗn dịch bào tử động vật P. parasitica (10 5 bào tử động vật ml -1 ). Để chuẩn bị huyền phù động vật, P. parasitica được nuôi trong 2 tuần trên thạch nước trái cây V8 20% đã đông đặc chứa 0,2% CaCO 3 dưới bóng tối ở 25 ° C trong buồng sinh trưởng được kiểm soát khí hậu. Bào tử sau đó được cạo ra khỏi đĩa trong 5 ml nước vô trùng và ủ ở nhiệt độ phòng (25 ° C) trong 30 phút để giải phóng các bào tử động vật. Kiêm nhiệm,Các bào tử động vật P. parasitica được xử lý bằng các phương pháp điều trị tương tự trong một đĩa microtiter để quan sát bằng kính hiển vi. Sau 10 ngày tính toán, số lượng cây khỏe mạnh sống sót và không biểu hiện bất kỳ triệu chứng bệnh Phytophthora nào được tính. Dữ liệu về phần trăm cây khỏe mạnh được tính toán cho mỗi nghiệm thức, và được phân tích thống kê về ý nghĩa của sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phép thử t của Student . Thí nghiệm được lặp lại hai lần.
KẾT QUẢ
Tổng hợp và xác định đặc tính của nano bạc bằng quang phổ UV-vis.
Sự thay đổi màu của hỗn hợp phản ứng thành màu nâu vàng hoặc nâu sẫm sau khi trộn dịch chiết thực vật và nitrat bạc là đặc điểm chung của quá trình sinh tổng hợp hạt nano bạc. Hai mươi bốn giờ sau khi trộn dịch chiết nước A. absinthium với AgNO 3 , dung dịch AgNP dạng keo màu nâu xuất hiện ( Hình. 1A ). Không quan sát thấy sự thay đổi màu sắc với dịch chiết thực vật hoặc chỉ với AgNO 3 trong cùng điều kiện. Các phân tích quang phổ nhìn thấy UV cũng cho thấy sự gia tăng phổ UV-vis trên 350 nm với sự gia tăng rõ rệt nhất trong phạm vi 400 đến 500 nm ( Hình 1B). AgNP được đặc trưng vật lý bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua, tia X phân tán năng lượng, tán xạ ánh sáng động và điện thế zeta (Ali và cộng sự, dữ liệu chưa được công bố ).
Hình 1.Tổng hợp các hạt nano bạc bằng cách sử dụng chiết xuất Artemisia absinthium . A, Lọ thủy tinh có ghi bạc nitrat (AgNO 3 ), dung dịch nước A. absinthium và dung dịch keo của các hạt nano bạc (AgNPs) được tổng hợp bằng cách trộn AgNO 3 và A. absinthium dịch chiết nước theo tỷ lệ 1: 1. B, độ hấp thụ UV-vis (250 đến 700 nm) của các hỗn hợp phản ứng trên sau 24 giờ ủ.
Nano bạc ức chế Phytophthora spp. trong ống nghiệm.
Khả năng ức chế các loài Phytophthora spp khác nhau của nano bạc . được đánh giá trong ống nghiệm ở các giai đoạn phát triển sinh dưỡng và sinh sản khác nhau. Chúng bao gồm sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử động vật và chiều dài ống mầm (sự phát triển sinh dưỡng), và sự phóng thích bào tử và động vật có vú (sinh sản), tất cả đều quyết định khả năng gây bệnh và phát triển dịch bệnh. Ảnh hưởng của ba nồng độ AgNP (100, 10 và 1 µg ml -1 ) đến sự phát triển của sợi nấm của các loài Phytophthora spp quan trọng về kinh tế khác nhau . được đánh giá trong ống nghiệm trong các đĩa microtiter. Kiểm tra bằng kính hiển vi về sự phát triển của sợi nấm cho thấy rằng AgNP được áp dụng ở tỷ lệ 100 và 10 µg ml -1 đã ức chế mạnh sự phát triển của tất cả các loài Phytophthoraspp. được thử nghiệm sau 12 giờ ủ ( Bảng 1 ). Tăng trưởng với nghiệm thức AgNP 1 µg ml -1 tương tự như đối chứng.
Để xác định hiệu lực và hiệu quả của AgNPs, các dung dịch pha loãng nối tiếp gấp đôi của AgNP khác nhau, từ 100 đến 0,1 µg ml -1 đã được thử nghiệm chống lại P. parasitica và P. capsici . Dữ liệu về phản ứng với liều lượng được trang bị với một đường cong logistic, chỉ ra rằng AgNP ức chế sự phát triển của sợi nấm Phytophthora theo cách phụ thuộc vào liều lượng ( Hình 2A và B ). Các phân tích về độ phù hợp cho thấy R 2 rất cao và tổng sai số tiêu chuẩn thấp (Sy. ×, được chỉ ra trên Hình 2A và B ), cho thấy rằng sự phù hợp thông số của đường cong sigmoid với dữ liệu đáp ứng liều của AgNP là có ý nghĩa. Các giá trị IC50 và IC90, được tính toán từ các đường cong logistic đáp ứng liều, rất giống nhau đối vớiP. parasitica và P. capsici , cho thấy rằng AgNP ức chế cả hai loài tốt như nhau ( Bảng 2 ). Những quan sát này đã được xác minh thông qua kiểm tra bằng kính hiển vi về sự phát triển của sợi nấm, phù hợp với dữ liệu định lượng ( Hình 2C và D ). Tương tự, nồng độ ức chế tối thiểu cần thiết để ức chế 100% đối với cả hai loài Phytophthora là 25 µg ml -1 . Nhiều hợp chất kháng vi khuẩn tạo ra hình thái tế bào bất thường như sợi nấm có hình dạng bất thường, phân nhánh quá mức và sợi nấm xơ xác. Không có đặc điểm hình thái bất thường nào như vậy được quan sát thấy ở bất kỳ loài Phytophthora spp nào. xử lý bằng AgNPs.
Hình 2. Ức chế sự phát triển của sợi nấm đối với Phytophthora parasitica và P. capsici bằng các hạt nano bạc (AgNPs). Đường cong liều lượng đáp ứng hiển thị sự ức chế tăng trưởng của A, P. parasitica và B, P. capsici để đáp ứng với các nồng độ khác nhau của nano bạc. Ảnh hiển vi ánh sáng cho thấy sự phát triển của sợi nấm của C, P. parasitica và D, P. capsici sau 24 giờ xử lý với nồng độ AgNP được chỉ định. Sự ức chế hoàn toàn của cả hai loài được quan sát thấy khi phản ứng với 25 µg ml -1 AgNP. Thanh = 100 µm.
BẢNG 2. Giá trị IC50 và IC90 của các hạt nano bạc (AgNPs) chống lại Phytophthora spp.
AgNPs làm giảm khả năng nảy mầm của bào tử động vật, chiều dài ống mầm và sản xuất bào tử ở P. parasitica và P. capsici.
Sự lây nhiễm thành công của Phytophthora cho cây phụ thuộc vào sự nảy mầm của bào tử động vật và sự kéo dài của ống mầm. Do đó, ảnh hưởng của nano bạc đến hai thông số gây bệnh này đã được nghiên cứu trong ống nghiệm. Sự nảy mầm của động bào tử và chiều dài ống mầm đều bị ức chế đáng kể bởi nano bạc theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tương tự như sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử động vật và dữ liệu đáp ứng liều lượng chiều dài ống mầm cũng phù hợp với các đường cong biểu thị điển hình với các giá trị phù hợp cao ( Hình 3A và B ). Giá trị IC50 và IC90 đối với sự nảy mầm của bào tử động vật và chiều dài ống mầm có thể so sánh được đối với cả Phytophthora spp. ( Bảng 2 ). Tương tự Imax(mức độ ức chế tối đa đạt được) đối với sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử động vật và chiều dài ống mầm đạt 100% với liều 10 đến 25 µg ml -1 cho thấy rằng AgNP được tổng hợp trong nghiên cứu hiện tại có hiệu quả cao đối với cả Phytophthora spp. ( Bảng 2 ).
Hình 3.Ảnh hưởng của hạt nano bạc (AgNPs) đến các giai đoạn phát triển khác nhau của Phytophthora spp. Đường cong liều lượng-phản ứng cho thấy tác dụng ức chế của các nồng độ khác nhau của AgNP đối với sự nảy mầm của bào tử động vật và chiều dài ống mầm của A, P. parasitica và B, P. capsici , và C, túi bào tử động vật của P. parasitica .
Sự phát triển của dịch bệnh Phytophthora phụ thuộc vào sản xuất bào tử và phóng thích bào tử động vật. Trong các thử nghiệm in vitro, không có sản sinh bào tử nào được quan sát thấy trong tối đa 15 ngày sau khi xử lý nano bạc ở tốc độ phát triển cho phép của sợi nấm (≥6,25 µg ml -1 ). Ở nồng độ nano bạc thấp hơn (≤3,12 µg ml −1 ), không ức chế sự phát triển của sợi nấm, sản xuất bào tử và sản xuất bào tử động vật không khác biệt đáng kể so với đối chứng không được xử lý (dữ liệu không được hiển thị). Nhìn chung, những kết quả này chỉ ra rằng AgNP được tổng hợp với chiết xuất từ A. absinthium có hoạt tính mạnh chống lại P. parasitica và P. capsici .
Xử lý bằng AgNP giúp tăng cường mô bào tử ở P. capsici và P. parasitica.
Sau khi giải phóng khỏi túi bào tử, bào tử động vật Phytophthora bơi xung quanh trong môi trường nước, thường trong vài giờ, để tìm các vị trí lây nhiễm thích hợp. Sau khi làm như vậy, bào tử động vật đóng túi, nảy mầm và xâm nhập vào các mô của vật chủ. Trong quá trình kiểm tra thông thường bằng kính hiển vi đối với các động bào tử ngay sau khi thiết lập các thí nghiệm xử lý AgNP, chúng tôi nhận thấy ít bào tử động vật bơi hơn sau khi xử lý với nồng độ nano bạc cao hơn. Quan sát này đã thúc đẩy chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng nano bạc có thể đang đẩy nhanh quá trình đóng gói động vật có vú. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã phân tích túi bào tử động vật ở một số thời điểm sau khi xử lý với các nồng độ AgNP khác nhau. So với đối chứng, tất cả các động vật có vú ngừng bơi trong vòng 10 phút sau khi xử lý với AgNP ở nồng độ ≥10 µg ml −1. Các bào tử động vật được xử lý bằng AgNP có hình dạng tròn đặc trưng và nhanh chóng chìm xuống đáy của các đĩa vi sinh. Ngược lại, các động vật có vú bơi lội được quan sát thấy trong các đối chứng không được xử lý trong ít nhất 4 giờ sau khi bắt đầu thử nghiệm. Những kết quả này đã được xác minh thêm bằng cách phân tích thống kê dữ liệu về bơi lội và động vật có túi sau 15 phút xử lý với các dung dịch pha loãng AgNP nối tiếp (100 đến 0,10 µg ml -1 ). Xử lý với AgNP ≥1,56 µg ml -1 cho thấy lượng bào tử động vật có nang cao hơn đáng kể so với đối chứng ( Bảng 3 ). Các kết quả có thể so sánh đáng kể trên túi bào tử động vật được ghi nhận đối với P. parasitica và P. capsici. Dữ liệu về phản ứng liều lượng của các động vật có túi và đang bơi được gắn với các đường cong sigmoidal ( Hình 3C ). Các phân tích này cho thấy sự tăng cường hình thành bào tử động vật phụ thuộc vào liều lượng với IC50 là 1,22 (độ tin cậy 95%: 1,12 đến 1,32) và IC90 là 2,79 (khoảng tin cậy 95%: 2,4 đến 3,2). Dự kiến, phần trăm bào tử động vật bơi lội giảm đáng kể khi nồng độ AgNP tăng lên.
BẢNG 3. Ảnh hưởng của các hạt nano bạc (AgNP) trên vi bào tử trùng Phytophthora parasitica
AgNP ức chế P. parasitica ở planta.
Để nghiên cứu tiềm năng của nano bạc trong việc kiểm soát bệnh do P. parasitica gây ra ở planta, cây thuốc lá được phun 100 hoặc 10 µg ml -1 AgNP, sau đó cấy P. parasitica . Ứng dụng với mefenoxam ( SubdueMaxx , Syngenta), một loại thuốc diệt nấm thường được sử dụng chống lại Phytophthora , và nước được sử dụng như các biện pháp kiểm soát tích cực và tiêu cực, tương ứng. Các phương pháp điều trị tương tự cũng được thực hiện trong một đĩa vi mô để so sánh giữa việc kiểm soát bệnh trên cây trồng với sự ức chế tăng trưởng trong ống nghiệm. Dữ liệu hiển vi của đĩa microtiter và quan sát bằng mắt của cây 5 ngày sau khi nhiễm P. parasitica được trình bày trong Hình 4A. Phần trăm cây sống sót, không biểu hiện bất kỳ triệu chứng nào của nhiễm nấm Phytophthora , đã được phân tích thống kê. Các phân tích này cho thấy rằng so với đối chứng âm tính, hiển thị 7,7% tỷ lệ sống trung bình của cây, các nghiệm thức AgNP áp dụng ở 100 và 10 µg ml -1 cho thấy tỷ lệ sống sót của cây thuốc lá tương ứng là 96,3% và 77,8% ( Hình 4B ). Trong kiểm soát bệnh hại cây trồng với 100 µg ml -1 AgNP có thể so sánh với SubdueMaxx ( P = 0,42), trong khi AgNP ở liều 10 µg ml -1 ít hiệu quả hơn khoảng 23% so với SubdueMaxx ( P = 0,008), nhưng về cơ bản vẫn (70%) tốt hơn so với đối chứng không được điều trị.
Hình 4.Trong thực vật, ức chế Phytophthora ký sinh trên cây thuốc lá bằng các hạt nano bạc (AgNPs). A, Cây thuốc lá được xử lý với các nồng độ chỉ định của AgNP và mefenoxam (SubdueMaxx), sau đó là cấy vi khuẩn P. parasitica . Hình ảnh hiển vi ánh sáng tương ứng của sợi nấm được xử lý bằng AgNP trong ống nghiệm được hiển thị ở hàng trên. Hình ảnh được chụp 5 ngày sau khi cấy. B, Biểu đồ thanh thể hiện phần trăm tỷ lệ sống sót của cây sau khi cấy P. parasitica để đáp ứng với xử lý bằng AgNP, mefenoxam (SubdueMaxx) và nước (đối chứng). So với kiểm soát nước, tỷ lệ sống của cây tăng lên đáng kể ở nghiệm thức AgNP (*, P = 0,008, n = 27; **,P = 0,001, n = 27).
THẢO LUẬN
P. absinthium là một cây thuốc quan trọng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh ( Ali và Abbasi 2014a, b ; Ali et al. 2013 ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằng nano bạc được tổng hợp bằng chiết xuất nước của cây này ức chế hiệu quả một số loài Phytophthora spp quan trọng trong nông nghiệp . Nhiều loài trong chi này gây ra các bệnh phá hoại trên thực vật và chúng nổi tiếng với việc phát triển khả năng kháng thuốc diệt nấm và phá vỡ các gen kháng thuốc bằng cách nhanh chóng trải qua các đột biến gen. Sự sẵn có của các nano bạc có thể bảo vệ phổ rộng sẽ cung cấp các công cụ thay thế để kiểm soát các bệnh do Phytophthora spp gây ra .
Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học chống lại các bệnh do vi sinh vật thực vật gây ra nhiều thách thức như ô nhiễm môi trường và phát triển tính kháng thuốc trừ sâu ở vi sinh vật. Do đó, việc điều tra nhằm phát hiện ra các giải pháp thay thế thuốc trừ sâu hóa học chống lại các bệnh do vi sinh vật gây ra là rất mong muốn. Các hạt nano có thể được sử dụng thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học và các nghiên cứu báo cáo việc sử dụng các hạt nano để kiểm soát nấm trong điều kiện đồng ruộng đang xuất hiện trong tài liệu ( Kaur và cộng sự 2012 ; Panacek và cộng sự 2009 ; Pimprikar và cộng sự 2009 ). Hầu hết các nghiên cứu này đều tập trung vào khả năng kháng khuẩn và ở một mức độ thấp hơn là các hoạt động kháng nấm. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, không có nghiên cứu nào được báo cáo để khám phá việc sử dụng AgNP để kiểm soátPhytophthora hoặc bất kỳ loài oomycetes nào khác, về mặt phát sinh loài rất khác với nấm thật. Trong nghiên cứu này, dữ liệu cho thấy hiệu quả ở nồng độ thấp hơn nhiều so với 100 μg / ml đối với một số loài Phytophthora spp. AgNPs rất mạnh mẽ và hiệu quả ở các giai đoạn sống khác nhau, bao gồm cả sự phát triển của sợi nấm, sản xuất bào tử và sự nảy mầm của bào tử động vật làm cho chúng trở thành một lựa chọn tuyệt vời để kiểm soát bệnh Phytophthora . MIC trong ống nghiệm đối với AgNP được tổng hợp trong nghiên cứu này là khoảng 25 µg ml -1 . Sử dụng cùng một nồng độ, sự ức chế khác nhau (24,7 đến 83,5%) đã được báo cáo đối với AgNP tổng hợp chống lại một số loại nấm khác nhau ( Kim và cộng sự 2012), cho thấy rằng AgNP được báo cáo trong các nghiên cứu của chúng tôi có thể hiệu quả hơn. Tuy nhiên, sự khác biệt này có thể là do nguồn AgNP (sinh học so với hóa học) hoặc sự khác biệt về các sinh vật mục tiêu ( Phytophthora so với nấm).
Điều thú vị là, việc xử lý bằng AgNPs đã đẩy nhanh quá trình tạo túi bào tử động vật ở P. parasitica ( Hình 3C ). Tuy nhiên, trái ngược với sự phát triển bình thường của bào tử động vật, bao gồm sự hình thành túi, nảy mầm và kéo dài ống mầm, sự phát triển và nảy mầm của bào tử động vật có túi do AgNP gây ra đã hoàn toàn bị bắt giữ, cho thấy rằng AgNPs có thể ảnh hưởng đến sinh lý phát triển bình thường của động vật có vú. Cần có các cuộc điều tra sâu hơn bằng cách sử dụng các nghiên cứu về bộ gen, phân tử và siêu cấu trúc để có được cái nhìn sâu sắc về cách các AgNP ảnh hưởng đến sự phát triển của động bào tử.
Phần lớn các nghiên cứu về kháng sinh sử dụng các hạt nano đã tập trung vào các nghiên cứu trong ống nghiệm trong một môi trường được kiểm soát rất cô lập, không đại diện cho các kịch bản thế giới thực ( Chernousova và Epple 2013 ; Prabhu và Poulose 2012 ; Prasad và cộng sự 2011 ; Rai và cộng sự 2009 ; Rai và cộng sự 2012). Để hữu ích cho ứng dụng thực tế trên đồng ruộng, là một hệ thống phức tạp cao bao gồm nhiều yếu tố vật lý như nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng, và các thực thể sinh học như cộng đồng vi sinh vật gắn liền với thực vật, bắt buộc phải đánh giá hoạt tính sinh học của AgNPs trong thực vật . AgNP hoặc bất kỳ hạt nano nào khác hoạt động ở quy mô nano và hoạt động của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các chất khử và oxy hóa khác nhau trong môi trường vi mô ở giao diện mầm bệnh của cây trồng. Trong nghiên cứu này, AgNPs rất hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh trên cây thuốc lá được cấy P. ký sinh trùng trong điều kiện nhà kính. Hiệu quả trong thực vật của AgNPs (100 µg ml -1 ) chống lại Phytophthorađược báo cáo trong nghiên cứu này rất giống với hiệu quả của AgNP đối với các bệnh do nấm thực gây ra như bệnh thán thư trên cây tiêu và bệnh phấn trắng trên dưa chuột và bí ngô trên đồng ruộng ( Lamsal et al. 2011a , b ). Sự phù hợp này về hiệu quả chống lại nấm thật và Phytophthora spp., Được đặt trong các vương quốc riêng biệt ( Judelson 2007 ), cho thấy rằng nano bạc có các hoạt động kháng khuẩn phổ rộng và chúng có thể đồng thời kiểm soát nhiều loại bệnh.
Chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ tác động bất lợi nào đến sự phát triển và giải phẫu của cây thuốc lá ngay cả ở nồng độ cao hơn nhiều lần so với mức tối thiểu cần thiết để ức chế sinh trưởng hoàn toàn, cho thấy rằng AgNP được tổng hợp trong nghiên cứu này là an toàn cho ứng dụng trên cây trồng. Những kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu không báo cáo bất kỳ tác động bất lợi nào của AgNPs khi được sử dụng ở nồng độ để kiểm soát bệnh thực vật ( Lamsal và cộng sự 2011a , b ). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi khác với các báo cáo khác, trong đó độc tính thực vật của AgNP được tổng hợp hóa học đã được báo cáo ( Gubbins và cộng sự 2011 ; Kumari và cộng sự 2009 ; Navarro và cộng sự 2008 ; Stampoulis và cộng sự 2009 ; Yin và cộng sự 2012). Sự khác biệt và giống nhau về kết quả giữa nghiên cứu của chúng tôi và các báo cáo này có thể là do các đặc tính vật lý khác nhau như giới hạn của AgNP được hình thành bằng cách sử dụng chiết xuất thực vật hoặc sự khác biệt trong các phương pháp khảo nghiệm độc tính thực vật ( Stampoulis và cộng sự 2009 ). Mặc dù, AgNP được sử dụng trong nhiều sản phẩm tiêu dùng khác nhau, một số báo cáo chỉ ra tác động bất lợi của AgNP đối với tế bào động vật có vú ( Ma và cộng sự 2011 ), cá ( Asharani và cộng sự 2008 ), và động vật giáp xác ( Blinova và cộng sự 2013 ). Dựa trên các báo cáo chưa kết luận ở trên, các nghiên cứu trong tương lai nhằm điều tra một cách có hệ thống về độc tính sinh thái của các loại AgNPs khác nhau nên được tiến hành trước khi chúng có thể được thương mại hóa để bảo vệ thực vật chống lại bệnh tật.
KẾT LUẬN
Ứng dụng của các hạt nano chống lại mầm bệnh thực vật là một lĩnh vực mới đang phát triển. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằng các AgNP qua trung gian A. absinthium cho thấy hiệu lực cao chống lại các mầm bệnh quan trọng trong nông nghiệp trong chi Phytophthora . Phương pháp điều trị in vitro dẫn đến ức chế hoàn toàn P. parasitica và P. capsici ở một số giai đoạn phát triển bao gồm nảy mầm bào tử, kéo dài chiều dài ống mầm và hình thành bào tử. Quan trọng hơn, trong việc áp dụng AgNPs trên cây thuốc lá, phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora gây ra mà không có bất kỳ độc tính thực vật nào. Sinh tổng hợp và sử dụng AgNPs chống lại Phytophthora có thể làm giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đắt tiền.
Nguồn tham khảo: Inhibition of Phytophthora parasitica and P. capsici by Silver Nanoparticles Synthesized Using Aqueous Extract of Artemisia absinthium