Nano bạc được tiêm vào thân, bón lá, tưới rễ cây có múi để tăng hiệu quả trị bệnh

Kiểm soát dịch bệnh cây trồng là rất quan trọng đối với sự phát triển bền vững của nông nghiệp, với những tiến bộ gần đây trong công nghệ nano đưa ra một giải pháp đầy hứa hẹn cho vấn đề cấp bách này. Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp phân phối hạt nano bạc (AgNP) vẫn chưa được khám phá đầy đủ và kiến ​​thức về vòng đời và khả năng di chuyển của các NP trong cây vẫn chưa được biết đến nhiều. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá hiệu quả của các phương pháp phân phối NP và điều tra tính di động và phân bố của NP với các lớp phủ bề mặt khác nhau (citrate (Ct), polyvinylpyrrolidone (PVP), và gum Arabic (GA)) trong các cây cam chanh Mexico. Trái ngược với hiệu quả phân phối hạn chế được báo cáo đối với các phương pháp phân phối qua lá và rễ, việc tiêm vào cuống lá và tiêm vào thân có thể cung cấp một lượng lớn NPs vào cây, mặc dù thời gian tiêm vào cuống lá lâu hơn nhiều so với tiêm vào thân (7 ngày so với 2 giờ ở cây có múi). Khi NP xâm nhập vào cây trồng, các tương tác lực đẩy giữa các NP và bề mặt ống dẫn được dự đoán sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển NP trong cây. So với PVP và Ct, GA có hiệu quả cao trong việc ức chế sự tập hợp các NP trong nhựa cây tổng hợp và tăng cường khả năng di chuyển của NP trong cây. Trong thời gian thử nghiệm 7 ngày, phần lớn nano bạc thu hồi từ cây (10 mL, 10 ppm GA-AgNP huyền phù) vẫn còn trong thân cây (trung bình 81,0%), với một lượng đáng kể trong rễ (trung bình 11,7%) , một số ở cành (trung bình 4,4%), và một số ít ở lá (trung bình 2,9%). Hơn nữa, nồng độ NP trong quá trình tiêm và thời gian ủ cây sau khi tiêm được phát hiện có ảnh hưởng đến sự phân bố của nano bạc trong cây

(Bản quyền thuộc NanoCMM Technology)

GIỚI THIỆU

Nhu cầu thế giới về trái cây và rau quả đang tăng đều đặn, nhưng tăng trưởng sản xuất

đã giảm tốc so với cùng kỳ. Theo Siegel và cộng sự.  nguồn cung cấp trái cây toàn cầu và

rau đã giảm 22% so với nhu cầu trong năm 2009 và sự thiếu hụt này có thể sẽ trầm trọng hơn. Trong số lý do sản xuất chậm lại, bệnh cây trồng, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra bởi côn trùng, là một mối quan tâm ngày càng tăng. Ví dụ, Huanglongbing (HLB), một căn bệnh gây chết cây có múi, chịu trách nhiệm cho 4,5 tỷ đô la trong tổng thiệt hại kinh tế ở Florida trong khoảng thời gian giữa 2006 đến 2011. HLB do vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus ( C.Las) gây ra do rầy chổng cánh lây lan và hiện không thể chữa khỏi.

Tác nhân gây bệnh chủ yếu cư trú trong hệ thống mao mạch thực vật ( ví dụ , xylem / hoặc phloem), nơi khó loại bỏ nhưng có thể dễ dàng di chuyển trong toàn bộ thực vật. Vẫn còn nhiều thách thức để xác định đặc điểm và nuôi cấy những mầm bệnh này và thao túng chúng về mặt di truyền. Cho đến nay, tiến độ đã được báo cáo về việc kiểm soát mầm bệnh thông qua gen kháng thực vật, loại kháng sinh, hoặc sử dụng các chất kích thích tăng trưởng thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu về các phương pháp hiệu quả để kiểm soát các bệnh này vẫn còn cấp tính. Gần đây những phát triển công nghệ nano mang lại một con đường đầy hứa hẹn hướng tới một giải pháp chữa bệnh cho cây trồng. Một số hạt nano (NP) có đặc tính kháng khuẩn tuyệt vời: nano đồng và nano kẽm đang được đánh giá về hiệu quả chống lại C.Las hoặc các mầm bệnh vi khuẩn khác trên cây có múi và nano bạc (AgNPs) cũng đã được đánh giá về khả năng ức chế trực tiếp mầm bệnh thực vật. Ngoài ra, các NP có thể di chuyển hiệu quả trong thực vật (chẳng hạn như cà chua, dưa chuột, lúa mì), sử dụng hệ thống mao mạch của thực vật, nơi chúng có thể tương tác với các mầm bệnh xâm nhập. Tuy nhiên, một số vấn đề quan trọng phải được giải quyết trước khi các ứng dụng nông nghiệp thực tế có thể được khả thi thực hiện.

Một trong những câu hỏi quan trọng là làm thế nào để đưa NP vào cây một cách hiệu quả (hiệu quả phân phối: lượng NP đi vào cây chia cho tổng khối lượng NP được định lượng). Lá (bao gồm phun / thẩm thấu huyền phù NP, tiếp xúc với sol khí nano, xâm nhập chân không, và truyền bồn có áp suất ) và Tưới rễ bằng NP ( tức là làm ướt đất) 22,23 là các phương pháp được báo cáo rộng rãi nhất. Trong khi phun qua lá có thể cung cấp NP cho lục lạp của cây có múi hoặc trong trung bì của lá thuốc lá, có thể dễ dàng rửa sạch NP được phân phối bằng kỹ thuật này tránh xa nước (trên 70% tổng số NP được sử dụng trên lá). Ngoài ra, lớp biểu bì của lá ngăn cản sự xâm nhập của hầu hết các NP, với khoảng 80% NP xâm nhập vào lá còn lại trong

200 nm đầu tiên bên dưới lớp biểu bì lá sau 7 ngày phơi nhiễm. Về ứng dụng gốc, trong khi hầu hết các NP vẫn còn trong môi trường nuôi cấy, biểu bì và dải Casparian (ở dạng hoàn chỉnh root) ngăn chặn sự xâm nhập của NPs. 28 Do đó, rất có thể hiệu quả phân phối lượng bón thấp của lá và rễ, mặc dù hiệu quả của việc bón lá có vẻ cao hơn so với bón gốc. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, rất ít nỗ lực đã được thực hiện một cách có hệ thống để điều tra và so sánh hiệu quả của các phương pháp này đối với việc phân phối NP.

Một phương pháp phân phối khác

Phương pháp tiêm trực tiếp vào cành / cuống lá và chích thân chưa được quan tâm nhiều. Trong một báo cáo gần đây, một phương pháp tiêm trực tiếp đã được sử dụng để cung cấp một cách hiệu quả các chất kích hoạt bảo vệ thực vật, kháng sinh và DNA plasmid.

Ngoài phương pháp phân phối đã chọn, tính di động của NP bị ảnh hưởng bởi nội bộ của môi trường thực vật và cách thức mà nước và chất hòa tan, bao gồm cả nồng độ cao của vô cơ / hữu cơ và NP / chất kháng khuẩn, di chuyển trong các mô mạch của nó, xylem (vận chuyển đi lên) và phloem (vận chuyển đi xuống). Cả xylem và phloem đều bao gồm các ống dẫn hình (mạch gỗ trong xylem và mạch rây trong phloem) để vận chuyển dọc trục. Hình dạng ống được thực hiện bởi các ô được sắp xếp từ đầu đến cuối mà các bức tường cuối của chúng được đục lỗ để tạo điều kiện vận chuyển. Trên thành bên của chúng, các mạch liền kề được nối với nhau bằng các hố nhỏ hơn nhiều so với mảng lỗ thủng. Các lỗ nằm giữa các thành tế bào của cả hai mạch và giữ lại một màng trung tâm, được gọi là màng hố intervessel. 35 Các mạch riêng lẻ có chiều dài hữu hạn và tính liên tục của nước. Việc di chuyển bên ngoài mạch đầu tiên được đảm bảo bằng cách chồng lên mạch kế cận. Do đó, những mạch này rơ le dựa vào các kết nối hố, bao gồm cả màng hố intervessel của chúng, qua đó các chất hòa tan phải vượt qua để vào một mạch mới. 36 Một khi NP vào một thực vật, phần lớn vẫn chưa biết làm thế nào môi trường phức tạp nội bộ của nhà máy ( ví dụ như nhựa tổng hợp, 34,37 tốc độ dòng chảy nhựa, 38,39 và lỗ chân lông, kích thước của khoang màng, khoang màng mạch gỗ và mạch rây 37–39 ) ảnh hưởng đến vòng đời và vận chuyển NP. Dựa trên các báo cáo trước đây, cường độ ion cao của nhựa cây có thể dẫn đến NP sự kết tụ, trong khi sự tồn tại của nhiều phân tử hữu cơ có thể làm giảm sự kết tụ thông qua ổn định steric; 40–42 loại ion cụ thể ( ví dụ , clorua, 43 photphat 44 ), hoặc các đại phân tử hữu cơ( ví dụ , axit humic 45 và các chất cao phân tử ngoại bào 46,47 ) có thể tác động đến tỷ lệ giải thể của các NP; và, tốc độ dòng chảy nhựa cây và kích thước lỗ của màng hố xylem của thực vật hoặc Các lỗ rỗng của mạch rây pholem có thể tác động đến sự lắng đọng và tách rời của các NP. 48 Như vậy, hành vi NP trong nhựa cây cần được đánh giá để hiểu rõ hơn về sự vận chuyển NP và sự phân bố của chúng trong các mô thực vật. Điều quan trọng là, phần lớn các nghiên cứu khám phá việc sử dụng VQG trong nông nghiệp tập trung vào trên cây hàng năm nhỏ, dễ (và nhanh) phát triển, chẳng hạn như cà chua, dưa chuột, lúa mì, và dưa hấu. 18,19,49,50 Một số ít, nếu có, các nghiên cứu đã xem xét số phận và sự vận chuyển của các NP nói chung, cây thân gỗ lâu năm, chẳng hạn như cây cối.

Xét về giá trị cao của cây lâu năm và cây nho, có động cơ kinh tế mạnh mẽ để phát triển các phương pháp chữa bệnh phù hợp với cây cối, điều này có thể biện minh cho chi phí NPs.

Các đặc tính của NP, chẳng hạn như kích thước và lớp phủ bề mặt của chúng, cũng ảnh hưởng đến hành vi của NP trong cây. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, kích thước nhỏ thích hợp hơn để thâm nhập vào biểu bì. 52,53 Cho ví dụ, chỉ những NP nhỏ hơn 5,4 nm (PVP) được áp dụng cho một lá cam quýt mới xâm nhập vào phloem; 54

Các hạt vàng có kích thước nhỏ hơn 10 nm vượt qua lớp biểu bì của lá lúa mì sau 2 tuần. 49 Ngoài kích thước, có vẻ như lớp phủ bề mặt có thể ảnh hưởng đến việc vận chuyển NP trong cây.

Các lớp phủ bề mặt thay đổi tính kỵ nước và điện tích bề mặt, cũng như cung cấp cho steric sự ổn định. 49,55–59 Nó đã được báo cáo rằng trong ứng dụng lá, trong khi lớp phủ PVP tăng cường hấp thụ ở lá lúa mì so với lớp phủ citrate (cùng kích thước kim loại cho cả hai NP được phủ), lớp phủ citrate cho phép vận chuyển NP hiệu quả hơn đến hệ mạch của cây (sau khi thâm nhập biểu bì) do đặc tính ưa nước. 49 Tuy nhiên, trong các ứng dụng gốc, lớp phủ PVP tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển các chấm lượng tử CdS (QD) từ gốc đến chồi so với QD trần trong đậu tương. 55 Về điện tích bề mặt, các điện tích âm sinh ra từ lớp phủ tạo điều kiện thuận lợi cho vận chuyển NP trong củ cải, cỏ lúa mạch đen, cây lúa và cây bí ngô, 60 và cho phép vận chuyển QDs nhanh hơn trong hệ thống dẫn của Arabidopsis thaliana so với lớp phủ tích điện dương. 61 Ngoài ra, các polyme hữu cơ có thể cung cấp sự ổn định steric cho các NP, 62 có khả năng đóng một vai trò quan trọng, có vai trò ổn định các VQG trong điều kiện độ mặn cao. 63 Do đó, các thay đổi về kích thước và bề mặt có thể được sử dụng để kiểm soát việc vận chuyển NP trong thực vật.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá hiệu quả của các phương pháp phân phối NP (bón qua lá, gốc, bón phân, tiêm cành và chích thân) cho cây có múi (Chanh Mexico và quýt clementine. Nour ghép vào gốc ghép Carrizo), và kiểm tra vòng đời và chuyển động của NPs trong cây. Chúng tôi sử dụng Nano bạc trong nghiên cứu này vì ba lý do chính: i) Nano bạc có một plasmonic cụ thể và giúp theo dõi chúng dễ dàng hơn trong chất nền thực vật phức tạp; ii) lý lịch

Nồng độ Nano bạc tương đối thấp, giảm thiểu khả năng gây nhiễu; và iii) Nano bạc đã biết tới như thuốc diệt khuẩn, làm cho chúng trở thành ứng cử viên hấp dẫn để điều trị các bệnh trên cây có múi, chẳng hạn như HLB.

Ngoài ra, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của kích thước và lớp phủ bề mặt (polyvinylpyrrolidone (PVP), gum arabic (GA), và natri xitrate (Ct)) trong quá trình vận chuyển NP. Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng tiêm thân cây có thể đưa NP vào cây một cách hiệu quả và NP có thể di chuyển một cách có hệ thống cả về mặt động vật và cơ bản thông qua hệ thống mạch của cây, với phần lớn các NP còn lại trong thân cây.

Tuy nhiên, chúng ta không thể phân biệt một cách định lượng dạng bạc ( tức là NP nguyên sinh, sự hình thành vầng hào quang protein, ion bạc, ion chelat, bạc tái kết tủa. Điều quan trọng, chúng tôi theo dõi luồng NPs từ xylem đến phloem (qua lá), cũng như khả năng bài tiết NPs từ rễ cây. Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về hiệu quả của phương pháp phân phối NP và tính di động của NP ở những cây lớn, phức tạp, chẳng hạn như cây thân gỗ.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đặc điểm của NP trong nhựa cây tổng hợp

Bởi vì việc vận chuyển NP trong toàn bộ cấu trúc cây có thể sẽ liên quan đến việc di chuyển qua xylem và phloem, điều quan trọng là phải hiểu cách các NP sẽ hoạt động như thế nào trong nhựa cây lấp đầy những mạch. Chúng tôi đo nồng độ các chất hòa tan vô cơ trong nhựa cây thu được từ các tĩnh mạch của chanh Mexico (quá trình chiết xuất không phân biệt giữa xylem nhựa cây và phloem nhựa cây, và chúng tôi không xác định được các hợp chất hữu cơ trong nhựa cây), và kết quả được thể hiện trong Bảng 1. Độ pH của nhựa cây nằm trong khoảng từ 5,5 đến 5,9, với các cation phong phú nhất là K + và Ca 2+ . Về mặt anion,Cl – , SO₄^2- , PO₄^3- và NO₃^–  là các ion chiếm ưu thế, phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Một kiểm tra nồng độ trong Bảng 1 cho thấy i) một số Mg²⁺ và Ca²⁺ có thể hình thành kết tủa và ii) sự mất cân bằng giữa tổng điện tích dương và điện tích âm trong nhựa cây, với sự dư thừa của các điện tích dương là hiển nhiên. Từ lâu, người ta đã công nhận rằng một phần nhất định của khoáng chất tồn tại ở dạng không hòa tan trong nhựa cây tổng hợp, 66 và phần này có thể thay đổi tùy theo rễ và lá và từ ngày đến đêm. 67 Ngoài ra, có nhiều loài hữu cơ trong nhựa cây họ cam quýt, chủ yếu bao gồm đường, axit cacboxylic mạch ngắn và axit amin (Bảng S1). 37 Chúng tôi suy đoán rằng khoáng chất kết tủa và các anion hữu cơ bị thiếu ( ví dụ: nhóm axit cacboxylic) chịu trách nhiệm về sự mất cân bằng điện tích. Tổng cường độ ion (liên kết với các ion vô cơ của nhựa cây được xác định là trên 500 mM. Độ mặn cao và các chất hữu cơ phong phú được tìm thấy trong nhựa cây có thể ảnh hưởng đến sự tập hợp, vận chuyển và phân giải các NP.

Lưu ý: Khối lượng phân tử của Ct, PVP và GA (g / mol): 294, 40000 và 250000. a , các phép đo bằng nước nanopure (pH 5,5, AgNP, 10 ppm); b , các phép đo trong nhựa cây tổng hợp (pH 5,5; AgNP, 10 ppm); c , ước tính từ phân tích nhiệt trọng lượng trong SI, Hình S4 ; d , mô tả chi tiết về Ước tính độ dày lớp polyme (trong nhựa cây tổng hợp) được cung cấp trong SI, Hình S5 . (p> 0,05, sự khác biệt không đáng kể giữa các dữ liệu từ cùng một nhóm).

Đường kính hạt của lõi kim loại PVP-, GA- và Ct-AgNPs, được đo bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), là 17,9 ± 7,5, 9,2 ± 4,2 và 28,7 ± 11,0 nm, tương ứng (Bảng 2, Hình S1), trong khi đường kính thủy động lực học (HD) của các VQG này (Bảng 2) lần lượt là 85,1 ± 3,6, 40,5 ± 1,3 và 94,3 ± 5,4 nm trong nước nano. Mỗi loại AgNP có phân bố kích thước, khác biệt về mặt thống kê (Hình S2 ac). Hơn nữa, tầm quan trọng của việc xác định đặc điểm của các NP trong điều kiện nước liên quan đến nhựa cây. Trên cơ sở Bảng 1 và tài liệu, 66 chúng tôi đã tạo ra một loại nhựa tổng hợp chủ yếu bao gồm các loài hòa tan (độ dẫn điện: 29,33 mS / cm; cường độ ion: 467 mM; tổng cacbon hữu cơ: 1,60 ± 0,05 × 10⁴ ppm. Chi tiết thành phần có thể được tìm thấy trong Bảng S1). Khi AgNP tiếp xúc với nhựa cây tổng hợp, đường kính HD của PVP-, GA- và Ct-AgNP là 134,6 ± 2,5, 52,1 ± 8,9 và 428,2 ± 12 nm, và mỗi AgNP vẫn duy trì phạm vi kích thước khác biệt về mặt thống kê (Hình S2 df) (Các biểu đồ tương ứng cho ba phép đo DLS được cung cấp trong Hình S3). Trong vòng 10 phút, kích thước của GA-AgNP không cho thấy sự thay đổi đáng kể (89,8 ± 0,4 nm), trong khi của PVP-AgNP và Ct-AgNP tăng lên Lần lượt là 208,7 ± 2,9 nm và 682 ± 12,4 nm (Hình 1a). Điều này ngụ ý rằng GA thành công ổn định nano bạc trong khi citrate không hiệu quả trong việc ổn định AgNP so với nhựa cây tổng hợp; PVP ổn định AgNP ở mức độ vừa phải. Tiềm năng zeta tương tự của ba loại AgNP, được hiển thị trong Bảng 2 (PVP-, GA- và Ct-AgNP: -6,99 ± 0,28 mV, -10,13 ± 0,63 mV và -4,24 ± 1,71 mV), chỉ ra rằng cường độ ion cao của nhựa cây nén lớp điện kép, lớp này có thể hạn chế sự đóng góp của lực đẩy tĩnh điện đối với sự ổn định của các NP trong nhựa cây tổng hợp.

Do đó, lực đẩy steric có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định NP. Ct (trọng lượng phân tử (M w ), 294 g / mol) lớp phủ cung cấp nano bạc với các nhóm chức cacboxylat, truyền bổ sung các điện tích âm lên bề mặt NP. GA (M w là 250000 g / mol), một chất bài tiết tự nhiên từ

cây keo, là một hỗn hợp hữu cơ bao gồm 80% trọng lượng polysaccharid (d-galactose, l-arabinose, l-rhamnose, d-glucuronic acid) và 20% trọng lượng protein. 68 Nồng độ cao của GA đã được chứng minh là có thể ổn định nhũ tương trong các điều kiện nước đầy thử thách, với 25 mM CaCl₂  PVP (M w là 40000 g / mol) là một polyme không ion với nhóm chức C = O, C – N và CH 2, chứa một gốc pyrrolidon ưa nước và một nhóm alkyl kỵ nước.

Các lớp phủ PVP đã được chứng minh là có thể ngăn chặn sự kết tụ NP thông qua các hiệu ứng cản trở steric. Sử dụng phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) và mô hình độ dày lớp polyme, 62,71,72 chúng tôi ước tính rằng nồng độ bề mặt của Ct, PVP và GA trên AgNP là 9,6 ± 0,2 × 10^-4, 1,1 ± 0,1 × 10^-3 và 5,3 ± 0,7 × 10^-2 g / m 2 , với PVP và GA tạo thành một lớp polyme có độ dày 4,4 và 20,1 nm, tương ứng (mô tả chi tiết về nồng độ bề mặt polyme và độ dày được tính toán được cung cấp trong SI, Hình S4 và S5). Cho rằng, màng hố xylem có đường kính lỗ trong khoảng 10-340 nm,  có thể màng hố có thể chặn sự vận chuyển của PVP- và Ct-AgNP tổng hợp giữa các phần tử tàu xylem. Xét về trục vận chuyển, vì các lỗ rỗng trung bình của các tấm sàng phloem và các tấm thủng xylem nằm trong khoảng giữa 200 nm đến 1,5 μm, 36,73,74,78 các cấu trúc giống như màng này không áp đặt loại trừ kích thước đáng kể gây áp lực lên quá trình vận chuyển GA-AgNP, nhưng có thể ngừng vận chuyển hầu hết các PVP- và Ct-AgNP tổng hợp.

Tuy nhiên, các hạt đơn lẻ (không kết hợp) và đặc biệt là GA-AgNP có kích thước nhỏ hơn, có khả năng để có thể đi qua màng hố, làm tăng diện tích dẫn tổng thể có sẵn cho các hạt này. Ngoài ra, đáng chú ý là các protein ở cả xylem và phloem nhựa cây, đặc biệt là nhựa cây từ thực vật bị nhiễm mầm bệnh hoặc côn trùng, 79,80 có thể thay thế các lớp phủ trên nano bạc và tác động đến số phận và khả năng di chuyển của nano bạc trong thực vật. 81 Không rõ liệu điều này có xảy ra trong hệ thống của chúng tôi và cần được điều tra trong các nghiên cứu trong tương lai.

Để khám phá một cách định lượng tác động của kích thước và tiềm năng zeta đối với quá trình vận chuyển nano bạc trong mạch, chúng tôi sử dụng mô hình Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) để tính toán năng lượng tương tác giữa NP và các bề mặt của hệ thống mạch thực vật (xylem và phloem); có thể tìm thấy mô tả chi tiết về các phép tính DLVO trong SI . Mô hình DLVO của chúng tôi cho thấy rằng các điện tích âm trên bề mặt PVP-, GA- và Ct-AgNP dẫn đến năng lượng tương tác đẩy tương ứng là 2,41, 2,29 và 3,58 kT. Tuy nhiên, tổng Lifshitz-van der Waals và năng lượng tương tác tĩnh điện của ba loại AgNP này (cả trong xylem và phloem) luôn âm, với kích thước hạt dẫn đến lực hấp dẫn cao giữa NP và bề mặt xylem / phloem (Hình S6). Điều này cho thấy rằng ổn định tĩnh điện không phải là lý do chính cho sự ổn định NP, và ở đó các lực lượng khác chịu trách nhiệm cho sự ổn định này giúp cho NP di động trong các mạch.

Với một lớp PVP hoặc GA ngoài nano bạc, điều quan trọng là phải đưa tương tác steric vào xem xét để giải thích khả năng di chuyển của NP ở thực vật. Giả định rằng bề mặt bên trong của

Các mạch xylem / phloem không được tráng và phẳng, và tương tác steric (U ste ) bao gồm thẩm thấu, tương tác đẩy (U osm ) và đàn hồi (U ela ) (trong khoảng 0 < h < d , trong đó h là khoảng cách giữa NP và bề mặt mạch, và d là chiều dày lớp). 62 Tương tác thẩm thấu và đàn hồi

có thể được ước tính thông qua các phương trình 1-3:

trong đó r là bán kính của NP trong nhựa cây tổng hợp có nguồn gốc từ kích thước cường độ DLS (nm), M W và ρ là phần thể tích, trọng lượng phân tử (g / mol) và mật độ (1,29 và 1,35 g / cm 3 ) của PVP hoặc GA, tương ứng, N a là số Avogadro, Г max là nồng độ bề mặt tối đa của PVP

và GA, χ là tham số khả năng thanh toán của Flory-Huggins đối với GA (0,47) và PVP (0,45), T là nhiệt độ (K), và k_B là hằng số Boltzmann. Người ta xác định rằng một khi h < d , U ste chiếm ưu thế trong các tương tác

giữa các NP và bề mặt xylem / phloem. Điều này đặc biệt rõ ràng đối với U ste có nguồn gốc từ

Sửa đổi GA, cao hơn hai bậc độ lớn so với tổng của Lifshitz-van der Waals và năng lượng tương tác tĩnh điện (Hình S7). Do đó, rất có thể xảy ra phản tương tác steric là lý do chính cho tính di động của NP trong thực vật.

Trong khi tác động của kích thước hạt, pH, nhiệt độ, chất hữu cơ tự nhiên và các ion thông thường lên sự hòa tan AgNPs đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, sự hòa tan các NP trong nhựa cây vẫn còn không xác định. Chúng tôi đã nghiên cứu sự hòa tan của nano bạc trong ba loại môi trường sau: (1) thành phần hữu cơ của nhựa cây tổng hợp, (2) thành phần vô cơ của nhựa cây tổng hợp, và (3) tổng hợp nhựa cây (Vui lòng tham khảo Bảng S1 để biết thành phần chi tiết). Người ta thấy rằng sau 7 ngày trên tất cả các phương tiện ion Ag chiếm ít hơn 1% tổng số Ag, với tỷ lệ thấp nhất (0,22%) được tìm thấy trong chất hữu cơ nhựa cây (Hình 1c). Giá trị này thấp hơn nhiều so với độ hòa tan được báo cáo trong nước khử ion (>> 5% 82,85,87 ), chúng tôi sử dụng quang phổ UV-Vis để điều tra thành phần của phản ứng AgNPs. 88,89 Kết quả cho thấy trên thực tế, phần lớn vẫn còn nano bạc và AgCl đã xuất hiện ở dạng chất rắn lơ lửng sau phản ứng có nguồn gốc từ hệ phản ứng với nhựa cây tổng hợp 90 (chi tiết mô tả về phổ UV-Vis có thể được tìm thấy trong Hình S8). Vì tỉ khối của Ag hoà tan là tổng lượng Ag trong dung dịch nhựa cây vô cơ và nhựa cây tổng hợp là rất gần nhau (cả hai đều xấp xỉ 0,7%), có khả năng là các chất hòa tan vô cơ có trong nhựa cây đã thúc đẩy quá trình hòa tan của AgNPs, mặc dù sự hòa tan tương đối ít diễn ra. Dựa trên một nghiên cứu trước đây, 43 tốc độ hòa tan của AgNPs (đường kính trung bình 32,9 nm) ở tỷ lệ mol Cl / Ag là 535, là 0,107 ± 0,020% / giờ, và sự gia tăng tỷ lệ Cl / Ag càng làm tăng tốc độ hòa tan. Tuy vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, trong khi tỷ lệ mol Cl / Ag là 610 và kích thước của AgNPs nhỏ hơn (cả hai làm tăng tốc độ hòa tan), tốc độ hòa tan giảm. Do đó, chúng tôi kết luận rằng sự hiện diện của các chất hữu cơ trong nhựa cây tổng hợp đã ức chế sự phân giải AgNPs, 91 phù hợp với phát hiện trước đó rằng CeO 2 có thể vận chuyển từ rễ đến chồi với sự hòa tan rất hạn chế.

Các đặc tính chống vi khuẩn của nano bạc một phần có liên quan đến sự hòa tan của chúng (như các ion bạc chịu trách nhiệm cho hoạt động chống vi sinh vật 93 ), sự hòa tan chậm của nano bạc trong nhựa cây có thể làm giảm hiệu suất chống vi khuẩn của chúng, mặc dù vẫn chưa biết nồng độ của các ion bạc là bao nhiêu thực sự cần thiết để tạo ra một phản ứng chống vi khuẩn thỏa đáng. Tuy nhiên, hạn chế này có thể có khả năng được giải quyết bằng cách tăng lượng AgNP vào cây. Bất kể, cụ thể Các thí nghiệm liên quan đến hiệu quả của AgNPs như chất chống vi sinh vật trên cây vẫn cần thiết.

Hình 1. (a) Sự phát triển kích thước của AgNPs (10 ppm) trong nhựa cây tổng hợp (pH = 5,5) trong vòng 10 phút ban đầu, (b) lắng AgNPs (100 ppm) trong nhựa cây tổng hợp (pH = 5.5), và (c) hòa tan AgNPs (100 ppm) trong các thành phần vô cơ của nhựa cây tổng hợp (Vô cơ), các thành phần hữu cơ của nhựa cây tổng hợp (Hữu cơ) và nhựa cây tổng hợp (Hỗn hợp) (pH = 5,5)

Tính di động của NP được phân phối theo các phương pháp khác nhau

Làm ướt đất, bón lá (tưới nhỏ giọt) và tưới cành đã được đánh giá về khả năng đưa nano bạc vào chanh Mexico. Như thể hiện trong Hình 2, Hàm lượng Ag trung bình (được định nghĩa là khối lượng Ag / khối lượng của mô lá) là cao nhất trong lá của cây tiếp xúc qua xử lý phun cành sau 7 ngày (149,97 ± 82,70 μg / kg mô khô), tiếp theo bởi thực vật tiếp xúc qua bón lá (55,183 ± 17,10 μg / kg mô khô), và làm ướt đất (13,95 ± 8,13 μg / kg mô khô) (sự khác biệt giữa hàm lượng Ag sau 7 ngày trong nhóm bón cành và nhóm bón lá / làm ướt đất là đáng kể, trong khi sự khác biệt về hàm lượng Ag giữa nhóm bón lá và nhóm tiêm cho cành là không đáng kể). Phép thử Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) cộng với Kiểm định Ít nhất của Fisher Kiểm tra sự khác biệt (LSD) chỉ ra rằng sự khác biệt giữa hàm lượng nano bạc trung bình tổng thể từ Nhóm làm ướt đất (9,97 ± 7,87 μg / kg) và nhóm đối chứng (8,26 ± 6,45 μg / kg) không có ý nghĩa, trong khi hàm lượng Ag từ việc tiêm nhánh khác đáng kể so với hàm lượng trong đối chứng và các nhóm làm khô đất. Tuy nhiên, hàm lượng nano bạc trung bình trong nhóm tiêm nhánh (50,44 ± 67,39 μg / kg) trong khi cao hơn so với nhóm bón lá (31,78 ± 26,64 μg / kg), không có ý nghĩa thống kê. Do đó, kết quả của chúng tôi ngụ ý rằng làm ướt đất là phương pháp kém hiệu quả nhất để phân phối NP vào lá, điều này đồng ý với các nghiên cứu trước đây báo cáo rằng phần lớn NPs được áp dụng cho rễ sẽ hấp thụ trên bề mặt của chúng. 60,94–97 Trong trường hợp nuôi cành, hàm lượng Ag trung bình trong lá của cây được cho ăn PVP-, GA-, và Ct-AgNP là 58,71 ± 69,15, 71,48 ± 108,81, và 34,48 ± 27,05 μg / kg, tương ứng; các kết quả này không khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Tuy nhiên, dựa trên các giá trị trung bình, có khả năng PVP và GA hiệu quả hơn trong tăng cường vận chuyển NP, so với Ct. Bên cạnh kích thước nhỏ hơn của GA-AgNP và PVP-AgNP (hơn Ct-AgNP), lực đẩy steric được coi là yếu tố quan trọng khác để tăng cường khả năng di chuyển của NP trong thực vật dựa trên công việc mô hình hóa của chúng tôi. Ngoài ra, trong khi nồng độ bề mặt của GA cao hơn nhiều so với PVP, tính di động của các NP trong cây không bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhận dạng của lớp phủ. Trong thí nghiệm hòa tan 7 ngày trong nhựa cây tổng hợp, chúng tôi nhận thấy rằng PVP-AgNP hấp thụ một lượng đáng kể chất hữu cơ từ dung dịch (có thể thông qua liên kết hydro do sự hiện diện của nhiều nhóm C = O 70 ), nhưng GA-AgNP và Ct-AgNP thì không. Nó có thể là các chất hữu cơ được hấp thụ từ nhựa cây cung cấp thêm lực đẩy steric cho PVP-AgNP. Về mặt Ct-AgNP, quá trình giải hấp xitrat có thể dễ dàng xảy ra trong điều kiện độ mặn cao, 98 và các chất hữu cơ trong nhựa cây, đặc biệt là protein, có thể có thể bám vào ( thông qua tương tác kỵ nước) và do đó ổn định một số AgNP, 99 góp phần vào việc vận chuyển Ct-AgNP trong cây. Nói chung, ngày càng tăng thời gian vận chuyển (khoảng thời gian giữa bón NP và thu hoạch mô) hoặc liều lượng NP (từ 20 ppm đến 100 ppm) làm tăng hàm lượng Ag trong lá một cách rõ ràng, cho thấy rằng AgNP là

liên tục vận chuyển đến lá, và lượng nano bạc cao hơn dẫn đến lá có hàm lượng Ag cao hơn. Tuy nhiên, dựa trên nghiên cứu khác, có thể đạt đến ngưỡng tải 100 , vượt quá ngưỡng đó

tăng nồng độ NP không nhất thiết làm tăng hàm lượng NP trong lá; cái này có thể do sự tắc nghẽn của cấu trúc màng xốp ngăn cản sự vận chuyển NP giữa tế bào gây ra bởi sự tập hợp NP.

Hình 2. Hàm lượng Ag trung bình trong sáu lá chanh Mexico (từ lá gần nhất đến lá xa nhất từ ​​(> 50 cm) khu vực định lượng) như một chức năng của lớp phủ NP, nồng độ huyền phù, và thời gian. (a) đất bị xói mòn; (b) ứng dụng lá; (c) cho ăn cành. (Kiểm soát: không tiếp xúc với AgNPs; 20 và 100: 20 và 100 ppm AgNP huyền phù; 1 ngày và 7 ngày sau phơi nhiễm 1 ngày và 7 ngày; PVP, GA và Ct: PVP-, GA- và Ct-AgNP). *, năm mẫu được sử dụng cho biểu đồ vì một mẫu được công nhận là dữ liệu bất thường trong phân tích biểu đồ hộp. Kiểm tra ANOVA một chiều cộng với kiểm tra LSD của Fisher được sử dụng để phân tích thống kê (p <0,05)

Chúng tôi đã ước tính hiệu quả phân phối của việc bón lá thông qua việc chia khối lượng Ag thu được từ toàn bộ cây với tổng khối lượng Ag được đưa vào ( tức là đã được định lượng) vào cây, vì những cây này đã thấy hàm lượng Ag trong lá cao hơn đáng kể so với những cây phơi qua đất. Sáu tuần sau tiếp xúc với lá (không có tác động xấu đến sự phát triển của thực vật), ba cây (tiếp xúc với 0,5 ml 100 ppm PVP-, GA- hoặc huyền phù Ct-AgNP) được lấy mẫu phá hủy và tách thành lá (đã không bao gồm ba lá ban đầu đã có liều lượng AgNP), cành, thân và rễ. chúng tôi thu hồi từ 1,5-3,0 μg Ag trong tổng số 50 μg Ag (tổng khối lượng Ag thêm vào cây), chiếm 3-6% tổng số nano bạc được áp dụng (Hình S9). Điều này ngụ ý rằng nano bạc có thể vận chuyển đến cành, thân và rễ từ lá thông qua lớp phloem và lớp phủ bề mặt đó có thể tác động đến

khả năng di chuyển của NP trong cây như sự phân bố của các loại nano bạc khác nhau trong lá, thân cành và rễ đã khác (Hình S9). Ngoài ra, có thể hiệu quả phân phối có thể cao hơn bởi vì (i) lá ban đầu được bổ sung thêm Ag không được bao gồm trong mẫu lá và (ii) rễ cây có khả năng bài tiết NP vào đất theo cách tương tự như rễ lúa mì (chi tiết về điều này bên dưới). 98

Tuy nhiên, tỷ lệ này cao hơn nhiều so với tỷ lệ đất bị xói mòn, đã được báo cáo về đưa từ 0,03-0,11% NP vào cây trồng. 101.102 Trong các ứng dụng lá, một lượng NP có thể xâm nhập vào cây qua khí khổng mà không bị giữ lại trong biểu bì. Ngược lại, biểu bì trên rễ ngăn phần lớn NPs xâm nhập vào cây, và một dải Caspi nguyên vẹn ngăn cản con đường vận chuyển bất sản của NPs. 28 Nó đã được báo cáo rằng các ứng dụng trên lá có thể cung cấp một lượng NP lớn hơn vào thực vật so với đất các ứng dụng. 14,20 Tuy nhiên, trong bón lá, ngay cả đối với những NP xâm nhập vào cây qua khí khổng, chúng vẫn phải di chuyển qua cấu trúc trung bì trước khi đến các mạch dẫn. 32

Cấu trúc mesophyll có thể là nơi lưu trữ tạm thời cho các VQG, cản trở việc vận chuyển của NP đối với phloem. Tuy nhiên, trong cấp nhánh, hệ thống treo nano bạc có thể hoàn toàn được cây hấp thụ, cho phép dòng NP trực tiếp từ ống tiêm thức ăn đến hệ thống phloem / xylem. Phương pháp loại bỏ sự cản trở của các cấu trúc biểu bì / trung bì / trung mô đối với vận chuyển NP, và có thể đưa AgNP vào cây một cách hiệu quả. Tuy nhiên, trong quá trình bón nano bạc được lưu ý rằng tốc độ hấp thụ huyền phù AgNP rất khác nhau giữa các cây trồng (từ 24 giờ đến 168 giờ), làm cho hình thức ứng dụng này khó thực hiện. Do đó, chúng tôi quyết định khám phá phương pháp tiêm vào thân như một phương pháp để đưa 100% NP vào cây trồng trong thời gian ngắn hơn.

Ngoài ra, điều đáng nói là sự khác biệt trong các mạch dẫn ban đầu của các NP gặp phải ngay sau khi ứng dụng có thể ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển NP. Cụ thể, sau khi bón lá (áp dụng cho phần trên của cây) và nuôi cành (ở đầu cành) con đường chính của lối vào ban đầu sẽ thông qua phloem, trong khi sau khi bơm thân cây và đất nó có thể sẽ được thông qua xylem. Tuy nhiên, về lâu dài, cả xylem và phloem góp phần vận chuyển NP trong cây.

Tác động của lớp phủ bề mặt đến khả năng di chuyển của NP trong cây sau khi tiêm

Trong các cành và thân gỗ, chỉ tìm thấy sự gần gũi giữa xylem và phloem. bên trong vỏ cây (Hình 3a). Trong các mặt cắt ngang, xylem chiếm hầu hết hình trụ trung tâm của thân cây cho đến một vòng cambium có mạch ngay bên dưới vỏ cây. Cambium là một mô phân sinh mỏng hình thành các tế bào xylem mới hướng vào bên trong chi, và mô phân sinh mới hướng ra bên ngoài. Phloem chiếm một vùng rất hẹp ngay bên ngoài cambium, và nó dễ vỡ. Do đó, việc phân phối NP thông qua tiêm vào thân nhằm vào xylem. 10 ml của 1.000 ppm nano bạc huyền phù (Ct-AgNPs, PVP-AgNPs, GA-AgNPs) được tiêm vào cây quýt 2,5 tuổi có chất clementine thông qua tiêm vào thân ở 20-30 psi trong thời gian 2 giờ. Vào ngày 1, ngày 7 và ngày 42, ba lá cục bộ (tức là gần điểm tiêm) và ba lá từ một điểm xa nhất xa điểm tiêm (được gọi là lá “hệ thống”) được thu thập và đo lường Hàm lượng Ag. Vào Ngày thứ 42, cây cối được tách thành lá, cành, thân và rễ, và được lấy mẫu phá hủy với mục đích thực hiện cân bằng khối lượng trên Ag, và xác định sự phân bố Ag trên cây. Điều thú vị là sau khi thân cây được cắt thành 4-5 đoạn (tùy thuộc vào tổng số chiều dài thân cây), nhiều đốm nâu ở vùng xylem thứ cấp được quan sát liên tiếp các phân đoạn trong một số cây, bao gồm cả trong phân đoạn bên dưới điểm tiêm ngay trên rễ (Hình 3b). Màu nâu này chứng tỏ rằng tiêm thân cây có thể cung cấp NP khắp thân cây, bao gồm cả về phía rễ. Hơn nữa, ánh xạ nguyên tố của vùng hơi nâu trên mặt cắt ngang của thân cây bằng kính hiển vi điện tử quét năng lượng phép đo phổ tia X phân tán xác nhận sự xuất hiện của AgNP trong các mạch xylem, nhưng không phải tất cả các phần tử mạch xylem (một khu vực nhỏ dọc theo xylem thứ cấp của thân cây) được sử dụng cho vận chuyển các NP (Hình 3c)

Hình 3. (a) Hình ảnh kính hiển vi ánh sáng về mặt cắt ngang của thân cây quýt (phụ là ảnh của mặt cắt ngang của thân cây); (b) tiêm GA-AgNPs vào thân cây (NPs có thể nhìn thấy dưới dạng nhuộm màu nâu trong mô xylem thứ cấp gần phloem (được đánh dấu bằng đường viền màu đỏ), và nhuộm luôn là trên thân cây nơi tiêm thuốc); (c) ánh xạ nguyên tố của màu nâu

khoanh vùng trên mặt cắt ngang của thân cây bằng cách quét kính hiển vi điện tử với tia X phân tán năng lượng phép đo phổ (màu-nguyên tố: xanh-cacbon; đỏ-bạc); (d) Hàm lượng Ag trong lá cây được tiêm Ct-AgNPs, PVP-AgNPs và GA-AgNPs vào ngày 1, 7 và 42 sau khi tiêm (LOC

và SYS: lá cục bộ và lá toàn thân); (e) Hàm lượng Ag trong lá, cành, thân và rễ hồi phục vào ngày thứ 42 sau tiêm; (f) tổng khối lượng Ag trong lá, cành, thân và rễ Ag hồi phục vào ngày thứ 42 sau khi tiêm. (c và d :, thân cây ;, Gốc,, Cành ;, Lá) (10 ml 1000 ppm AgNP, cây quýt clementine 2,5 năm tuổi) (Thử nghiệm ANOVA một chiều cộng với Kiểm tra LSD của Fisher được sử dụng để phân tích thống kê, p <0,05 ).

Sau khi tiêm, cả ba loại nano bạc đều di chuyển từ điểm tiêm sang lá, nhưng bề mặt lớp phủ ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển ở các mức độ khác nhau. Hàm lượng Ag trong lá cây tiêm với GA-AgNPs được xếp hạng cao nhất, tiếp theo là những cây được tiêm PVP-AgNPs, và sau đó là Ct- AgNPs (GA-AgNP nhóm vs Ct-AgNP / nhóm PVP-AgNP, P <0,05; PVP-AgNP vs CT- AgNP, P> 0,05 ), chỉ ra rằng GA-AgNPs có tiềm năng vận chuyển lớn nhất từ từ thân đến lá (Hình 3d). Trong số những cây được tiêm GA-AgNP, hàm lượng Ag trong lá cục bộ luôn luôn cao hơn ở các lá hệ thống, cho thấy có thể hạn chế vận chuyển do sự tập hợp / lắng đọng của AgNPs trong các bình xylem, và có thể do nhà máy áp dụng sàng Hệ thống dẫn điện. Điều thú vị là ở những cây được tiêm GA-AgNPs, cả lá cục bộ và toàn thân thể hiện hàm lượng Ag cao nhất vào Ngày 1 (59,4 ± 52,5 μg / kg và 38,4 ± 28,9 μg / kg), giảm xuống 27,01 ± 30,2 μg / kg và 19,6 ± 31,11 μg / kg, tương ứng vào Ngày thứ 7 và đến 24,15 ± 20,4 μg / kg và 11,05 ± 8,2 μg / kg, tương ứng, vào Ngày 42 (Hình 3d) (Ngày 1 cục bộ so với ngày 7/42 cục bộ, Ngày 1 toàn thân so với ngày 42 toàn thân, P <0,05 ). Ngoài ra, khối lượng Ag thay đổi trong lá suốt

Thí nghiệm (Hình S10) đã chứng minh một xu hướng tương tự như trong Hình 3d. Ước tính, ước lượng sự đóng góp có thể có của việc pha loãng sinh học đối với sự thay đổi khối lượng / hàm lượng Ag, chúng tôi đã thực hiện Pearson các mối tương quan để định lượng khả năng trọng lượng lá cao có thể dẫn đến khối lượng Ag cao trong lá (Kiểm tra ý nghĩa 2 phía đã được sử dụng). Người ta thấy rằng không có mối tương quan đáng kể giữa chúng, cho thấy sự pha loãng sinh học có thể không phải là lý do chính làm giảm lượng Ag của lá. Do đó, khối lượng giảm dần theo thời gian ngụ ý rằng GA-AgNPs có thể vận chuyển trong cây thông qua cả xylem (vận chuyển lên) và phloem (vận chuyển xuống) và vận chuyển đi xuống có thể loại bỏ AgNPs khỏi cây và vào rễ. Sự suy giảm của hàm lượng Ag trong lá không rõ ràng ở những cây được tiêm Ct-AgNPs và PVP-AgNPs, có lẽ biểu thị rằng những NPs không di chuyển hiệu quả trong thực vật. Tuy nhiên, chúng ta không thể loại trừ khả năng sự thay đổi khối lượng / hàm lượng Ag trong lá cục bộ / hệ thống có thể bị ảnh hưởng bởi (i) lưu trữ Ag + bởi các protein như bảo vệ cây khỏi ô nhiễm kim loại, 103 và (ii) một phần nano bạc nhiều hơn di động hơn các loại khác do mật độ hoặc kích thước lớp phủ NP không đồng nhất gây ra bởi nano bạc

Sự phân bố của Ag trong cây tiêm vào ngày thứ 42 sau khi tiêm được thể hiện trong Hình 3e và 3f. Đối với cả ba công thức AgNP, hàm lượng Ag trong thân cây là lớn nhất, tiếp theo là rễ, cành và lá. Hàm lượng Ag trong thân cây được tiêm Ct-AgNPs, PVP-AgNPs và GA-AgNPs là 40.468,5 ± 224,1, 88.360,1 ± 25.429,7 và 33.394 ± 24.575,7 μg / kg (dữ liệu thu thập trong mỗi bộ P> 0,05 ), chiếm 99,9%, 69,0% và 66,5% tổng khối lượng Ag thu được từ toàn bộ cây, tương ứng. Những kết quả này chứng minh rằng Ct-AgNPs không thể vận chuyển trong cây (có thể do chúng kết tụ nhanh trong nhựa cây. Mặc dù citrat trên bề mặt VQG có thể dễ dàng được thay thế bằng các đại phân tử, đóng góp của sự thay đổi này đối với tính di động của Ct-AgNP không rõ ràng). Tuy nhiên, vì PVP-AgNPs và GA-AgNPs chống lại sự tổng hợp, vận chuyển liên tục được kích hoạt. Trong khi hàm lượng Ag trong rễ cây được tiêm PVP-AgNPs hoặc GA-AgNPs cũng tương tự (12.941,9 ± 9.125 μg / kg so với 12.994,3 ± 2.084,9 μg / kg, P> 0,05 ), Hàm lượng Ag trong cành từ cây được tiêm PVP-AgNPs (16.777,9 ± 11.254,4 μg / kg, P> 0,05 ) cao hơn nhiều so với cây được tiêm GA-AgNPs (735,2 ± 464,5 μg / kg, P> 0,05 ) (PVP-AgNP so với GA-AgNP, P <0,05 ). Ngược lại, hàm lượng Ag trong lá cây được tiêm PVP-AgNPs (11,2 ± 7,9 μg / kg, P> 0,05 ) thấp hơn một chút so với cây được tiêm với GA-AgNPs (19,4 ± 6,7 μg / kg, P> 0,05 ) (PVP-AgNP so với GA-AgNP, P> 0,05 ). Hàm lượng Ag với mức thấp được tìm thấy trong lá, sự khác biệt giữa hai lớp phủ này (trung bình cao hơn 74% Hàm lượng Ag trong lá của những cây được tiêm GA-AgNPs so với những cây được tiêm PVP-AgNP) ngụ ý rằng GA-AgNPs có thể vận chuyển đến lá dễ dàng hơn PVP-AgNPs. Hiệu quả phân phối ( tức là khối lượng bạc thu hồi từ cây sau 42 ngày so với khối lượng ban đầu được đưa vào) của Ct-AgNPs, PVP-AgNPs và GA-AgNPs thông qua tiêm thân là ước tính lần lượt là 19,4 ± 2,3%, 39,5 ± 4,5% và 22,8 ± 7,2%. Theo sau thân cây khi tiêm, chúng tôi quan sát thấy những giọt nhỏ chứa Ct-AgNPs tại vị trí vết thương trên cây (do tỉa cành) gần điểm chích; không có giọt nào như vậy được quan sát thấy sau PVP-AgNP hoặc tiêm GA-AgNP. Do đó, không phải tất cả Ct-AgNPs đều được đưa vào cây, góp phần vào tổng số Ag thu hồi thấp (chỉ chiếm ~ 20% Ag). Dựa trên sự vận chuyển tương đối cao của PVP-AgNPs và GA-AgNPs so với Ct-AgNPs ( tức là hàm lượng Ag trong thân cây tiêm Ct-AgNPs, PVP-AgNPs và GA-AgNPs chiếm 99,9%, 69,0% và 66,5% tổng khối lượng Ag đã thu hồi) và phần lớn Ag có trong rễ, có thể hai loại NP này đã được rễ bài tiết, cho thấy rằng các NP nhỏ có thể được vận chuyển và bài tiết bởi thực vật dễ dàng hơn. 49 Do đó, giả thuyết rằng sự bài tiết ở rễ góp phần đến khả năng thu hồi Ag thấp ở những cây được tiêm PVP- hoặc GA-AgNP.

Tác động của nồng độ đến vận chuyển NP sau khi tiêm vào thân cây

GA-AgNP thể hiện hành vi vận chuyển mạnh mẽ nhất, di chuyển từ vị trí tiêm thân cây

đến tất cả các bộ phận của cây. Đặc biệt, khối lượng Ag cao hơn tìm thấy trong rễ cho thấy có thể Vận chuyển AgNP giữa xylem và phloem, mặc dù có thể lực phun ép NP vào chính hệ thống gốc. Do đó, để điều tra thêm việc vận chuyển AgNP trong bảy ngày đầu tiên sau khi tiêm, những cây được tiêm hỗn dịch GA-AgNP được lấy mẫu tiêu hủy trong ngày 1, 3 và 7 và tách thành các mẫu lá, cành, thân, rễ.

Hình 4. Khối lượng Ag thu hồi (a & b) và hàm lượng Ag (c & d) trong các mô khác nhau của Cây quýt clementine 2,5 tuổi được tiêm 10 ml huyền phù 10 ppm (tổng số 100 μg Ag) (a & c)

và 10 ml 100 ppm (tổng cộng 1000 μg Ag) (b & d) GA-AgNPs. Các mô được lấy mẫu vào Ngày 1, 3 và 7 sau khi tiêm ( Thân cây; gốc, nhánh; Lá cây).

(*, Tiêm 100 ppm GA- Hỗn dịch AgNPs vào Ngày thứ 3 không thành công và chỉ có 7 ml hỗn dịch được tiêm trong vòng 2 giờ trong khi phần còn lại là 10 ml)

(Thử nghiệm ANOVA một chiều cộng với thử nghiệm LSD của Fisher được sử dụng để thống kê phân tích ( P <0,05). Sự khác biệt đáng kể giữa dữ liệu nhóm GA-AgNP và Ct-AgNP / PVP-AgNP ; không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm PVP-AgNP và nhóm Ct-AgNP )

Sự phân bố của Ag trong các đoạn cây khác nhau vào Ngày 1, 3 và 7 sau khi tiêm với 10 ppm hoặc 100 ppm GA-AgNPs được thể hiện trong Hình 4. Tổng khối lượng Ag được đo trong cây thay đổi đáng kể giữa các thời điểm và không có xu hướng rõ ràng về khối lượng Ag từ Ngày 1 đến Ngày 7 có thể được sáng suốt. Trong số những cây được tiêm hỗn dịch GA-AgNP 10 ppm, tổng Khối lượng Ag thu hồi dao động trong khoảng 14,2 – 67,7 μg trong tổng số 100 μg được tiêm vào (Hình 4a), trong khi đó từ những cây được tiêm hỗn dịch GA-AgNP 100 ppm dao động trong khoảng 150,0 – 722,3 μg trong tổng số 1.000 μg được tiêm (Hình 4b). Trong tất cả các trường hợp, đại đa số (84,6 ± 3,4% tổng số Ag thu hồi trong cây được tiêm huyền phù GA-AgNP 10 ppm và 91,3 ± 5,5% trong cây được tiêm huyền phù GA-AgNP 100 ppm) bạc vẫn còn trong thân cây qua 7-ngày thực nghiệm. Trong khi rễ và cành có một lượng Ag đáng kể sau

khi tiêm, tổng khối lượng Ag trong lá vẫn nhỏ (<1,5 μg trong cả hai lần tiêm) và sự gia tăng nồng độ của huyền phù GA-AgNP không dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ Khối lượng Ag trong lá (Hình 4 a & b). Tổng khối lượng Ag trong các nhánh tăng từ 0,2 ± 0,01 μg đến 7,5 ± 4,7 μg ở cây được tiêm huyền phù GA-AgNP 10 ppm ( P <0,05 ) và từ 20,1 ± 1,0 μg đến 54,5 ± 48,3 μg ở cây được tiêm huyền phù GA-AgNP 100 ppm ( P> 0,05 ), như thời gian thu hoạch được kéo dài từ 1 ngày đến 7 ngày. Ngược lại, khối lượng Ag trong rễ giảm nhẹ từ 33,8 ± 33,4 μg đến 13,5 ± 7,2 μg ở cây được tiêm huyền phù GA-AgNP 100 ppm ( P> 0,05 ), mặc dù sự suy giảm này không rõ ràng ở những cây được tiêm 10 ppm GA-Ag NP hỗn dịch (2,6 ± 2,1 μg so với 2,3 ± 2,0 μg tương ứng trong ngày 1 và ngày 7, không có sự khác biệt đáng kể )

Điều đó đang nói, 1) sự gia tăng khối lượng Ag trong nhánh từ ngày 1 đến ngày 7 có thể ngụ ý rằng GA-AgNP liên tục được vận chuyển đến các nhánh từ điểm tiêm, và 2) sự suy giảm của

Khối lượng Ag trong rễ từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 7 có thể ngụ ý rằng GA-AgNPs đã được bài tiết khỏi rễ. Ngoài ra, hàm lượng Ag tương đối không đổi trong lá của cả hai nhóm với sự tiêm chích nồng độ khác nhau có thể chỉ ra phản ứng sinh lý nhất định của cây có múi đối với AgNPs (chẳng hạn như Ag khử độc và lưu trữ NP), 103 cần được điều tra kỹ lưỡng hơn. Tuy nhiên, khối lượng bạc mà chúng tôi đo được rất khác nhau trong mỗi nhóm (hiển nhiên bởi độ tin cậy khoảng thời gian lớn), đưa ra bất kỳ kết luận nào mang tính suy đoán cao.

Để phân tích sâu hơn sự phân bố Ag trong các cây, chúng tôi đã chuẩn hóa tổng khối lượng Ag ở các các mô cây với khối lượng khô của chúng (Hình 4c, 4d) và tính% khối lượng Ag trong mỗi mô, so với tổng khối lượng Ag thu hồi được từ toàn bộ cây (Hình S11 a, b). Trong hình 4c, Ag

Hàm lượng Ag ở lá tăng từ 6,6 ± 1,1 μg / kg vào ngày 1 (% khối lượng Ag = 2,9%) lên 14,3 ± 13,4 μg / kg vào Ngày 3 (% khối lượng Ag = 6,3%) trước khi giảm nhẹ xuống 13,3 ± 4,0 μg / kg vào Ngày 7, trong khi hàm lượng Ag trong rễ giảm từ 35,8 ± 8,1 μg / kg (% khối lượng Ag = 19,0%) xuống 21,2 ± 7,6 μg / kg (% khối lượng Ag = 7,1%) từ Ngày 1 đến Ngày 3 trước khi tăng lên 50,4 ± 41,6 μg / kg (% khối lượng của Ag = 8,9%) vào ngày thứ 7 (Hình 4c); khoảng tin cậy lớn liên quan đến thành phần gốc giữa các cây phản ánh sự khác biệt lớn giữa các cây được lấy mẫu, điều này có thể được thúc đẩy bởi sự khác biệt sinh lý tự nhiên giữa các cây. Như sự vận chuyển lên và xuống của AgNP chịu trách nhiệm cho sự hiện diện của Ag trong lá và rễ, tương ứng, là sự biến đổi động lực học của thành phần của lá và rễ ngụ ý rằng cường độ vận chuyển lên xuống là liên tục thay đổi. Tương tự, trong Hình 4d (cây được tiêm hỗn dịch AgNP 100 ppm), tổng hàm lượng Ag trung bình trong lá của những cây được tiêm hỗn dịch AgNP 100 ppm là 13,5 ± 10,9 μg / kg (% khối lượng Ag = 0,1%), trong khi đó ở cây được tiêm huyền phù AgNP 10 ppm là 11,0 ± 7,5 μg / kg (% khối lượng của Ag = 3%) (Hình 4c) ( P> 0,05 ). Điều này cho thấy rằng ngày càng tăng nồng độ huyền phù AgNP về cơ bản không làm tăng đáng kể tổng lượng AgNP trong lá. Nhìn trong Hình 3c, vận chuyển AgNPs không chiếm toàn bộ hình trụ xylem, điều này có lẽ là kết quả của phương pháp tiêm một điểm của chúng tôi. Rất có thể nếu tiêm mở rộng đến nhiều điểm, khả năng vận chuyển của xylem đối với NP có thể tăng lên. Ngoài ra, vào ngày thứ 7, hàm lượng Ag trong cành cao hơn (1584,0 ± 1459,5 μg / kg, % khối lượng Ag = 8,5%)

so với ngày 1 (430,8 ± 94,9 μg / kg,% khối lượng Ag = 3,7%) ( P <0,05 ), nhưng Ag trung bình

Hàm lượng trong rễ (205,4 ± 187,0 μg / kg,% khối lượng Ag = 3,7%) thấp hơn so với ngày 1 (673,4 ± 639,1 μg / kg,% khối lượng của Ag = 5,2%) ( P> 0,05 ) (Hình 4d). Điều này cho thấy một lần nữa rằng AgNPs đã liên tục được vận chuyển đến các cành từ thân cây thông qua các mạch xylem, và có lẽ đã được bài tiết ra khỏi cây bằng rễ.

Để xác minh xem liệu AgNP có thực sự có thể được vận chuyển xuống dưới lớp pholem hay không (cuối cùng đến gốc) ở những cây có chích thân, chúng tôi đo hàm lượng Ag trong mô giàu phloem (vỏ cây) và mô giàu xylem (mô còn lại không có vỏ) trên thân cây 7 ngày sau khi tiêm

(từ cây được tiêm hỗn dịch AgNP 10 ppm). Mặc dù đây là một ước tính sơ bộ ( ví dụ: chúng tôi không thể loại trừ khả năng một số mạch xylem vẫn còn dính vào vỏ cây), nó giúp minh họa

vận chuyển NP thông qua các hệ thống dẫn điện khác nhau của nhà máy. Người ta thấy rằng Hàm lượng Ag trung bình trong mô thân giàu xylem và giàu phloem là 757,0 ± 512,0 μg / kg và 300,5 ± 170,8 μg / kg (tiêm được thực hiện trong mô giàu xylem) ( P <0,05 ), với hàm lượng Ag tăng lên từ 154,2 ± 38,7 μg / kg ở phần trên cùng của mô thân giàu phloem (10 cm trên cùng trong tổng số Thân cây dài 20 cm) đến 446,8 ± 19,3 μg / kg ở phần dưới cùng của mô thân giàu phloem (phần dưới 10 cm trên tổng số thân cây dài 20 cm) ( P <0,05 ). Điều này cho thấy rằng các AgNP liên tục vận chuyển từ thân cây đến rễ qua phloem, 51,52 mặc dù chúng ta không thể loại trừ sự vận chuyển xuyên tâm của các NP giữa xylem và phloem, do tổn thương các mạch duy trì trong quá trình tiêm.

Trong nỗ lực tìm hiểu sự phân bố của các nano bạc trong hệ thống gốc, chúng tôi đã tách rễ từ các lông rễ, và đo hàm lượng Ag của chúng. Đối với cây được tiêm AgNP 10 ppm huyền phù, hàm lượng Ag trung bình trong rễ chính và lông rễ là 34,4 ± 10,1 μg / kg và Lần lượt là 55,5 ± 3,0 μg / kg ( P <0,05 ); đối với những cây được tiêm hỗn dịch AgNP 100 ppm, hàm lượng Ag trung bình trong rễ chính và lông rễ là 219,2 ± 61,8 μg / kg và 49,5 ± 33,7 μg / kg, tương ứng ( P <0,05 ). Hàm lượng Ag cao trong lông rễ (thường cao hơn trong lá và một số cành) gợi ý rằng phloem truyền AgNPs từ rễ chính đến rễ lông, nơi AgNPs có thể được đào thải ra khỏi cây, trong một quá trình tương tự như đường thực vật, amino axit, axit hữu cơ, các nuclêôtit và tiết enzim. 106–108 Trong khi kết luận này là suy đoán, một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các NP vàng được đào thải bởi rễ lúa mì, khi các NP được ứng dụng qua phân bón lá.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, vì phân phối phloem trực tiếp là không thể thực hiện được, nên xylem là mục tiêu chính cho phân phối NP trong quá trình tiêm. Tuy nhiên, sự xuất hiện của nano bạc trong thân cây và rễ ngụ ý ứng dụng tiềm năng của công nghệ nano để kiểm soát tăng trưởng C Las. Bởi vì C Las vi khuẩn, phloem-cư trú, di chuyển xuống rễ và nhân lên mặc dù chúng xâm nhập vào cây bằng cách côn trùng ăn các mô trên không (lá, cành). 109

Ảnh hưởng của cấu trúc thực vật đến sự vận chuyểnnano bạc từ thân sang lá

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng Ag trong các lá khác nhau từ các cành khác nhau là đáng kể, và chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng hàm lượng nano bạc cao (μg Ag / kg mô khô) trong cành sẽ dẫn đến hàm lượng nano bạc cao trong lá trên cành này. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã xác định tương quan giữa khối lượng lá khô (g), khối lượng Ag trong lá (μg Ag thu hồi), hàm lượng Ag trong lá (μg Ag / kg lá khô), khối lượng Ag trong cành (μg Ag thu hồi), hàm lượng Ag trong cành (μg Ag / kg cành khô), trọng lượng cành khô (g), chiều dài cành (cm), và khoảng cách của cành từ điểm tiêm (cm) bằng cách sử dụng phân tích tương quan của Pearson. Chúng tôi không tìm thấy tương quan đáng kể giữa “khối lượng lá khô” và “khối lượng Ag trong lá” hoặc “Hàm lượng Ag trong lá”, cho biết rằng sự phát triển của lá không ảnh hưởng đáng kể đến việc vận chuyển AgNP vào lá (từ pha loãng sinh học không phải là nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm hàm lượng Ag trong lá quan sát được từ nghiên cứu cây). Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng Ag trong lá có tương quan thuận với khối lượng / hàm lượng Ag trong một nhánh ( r > 0,34, p = 0,01) (Bảng 3). Ngoài ra, hàm lượng Ag trong lá có tương quan nghịch với tổng chiều dài của nhánh ( r = -0,336, p = 0,01), trong khi Tương quan nghịch giữa khối lượng Ag trong lá và tổng chiều dài cành không có ý nghĩa (Bảng 4). Điều này ngụ ý rằng hàm lượng AgNP cao hơn trong một nhánh sẽ mang lại hàm lượng nano bạc cao hơn trong lá, cành càng dài càng làm giảm khối lượng Ag trong lá. Đó là để nói rằng có một vật lý quá trình ( tức là đi qua màng hố) làm giảm tính di động của NP khi vận chuyển lâu hơn khoảng cách. Hơn nữa, như đã thấy từ Bảng 4, khối lượng AgNP trong một nhánh có tương quan thuận với trọng lượng khô của cành ( r = 0,277, p = 0,05), và có thể tương quan nghịch với tổng chiều dài của nhánh (mặc dù mối tương quan không có ý nghĩa). Do đó, có khả năng là một nhánh có đường kính lớn tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển NP từ thân sang lá. Ngoài ra, như đã thấy từ Hình 3, vì không phải tất cả các bình xylem đều được sử dụng để vận chuyển AgNP, các nhánh xảy ra kết nối với các bình vận chuyển AgNP sẽ có thể có hàm lượng AgNP cao hơn.

Tổng lượng Ag thu hồi được trong 14 cây quýt clementine (nhận 10 hoặc 100 ppm Thuốc tiêm huyền phù GA-AgNP) được nghiên cứu trong các thí nghiệm cân bằng khối lượng dao động trong khoảng 14,22% đến 72,23% tổng khối lượng Ag được đưa vào (Hình S12). Điều thú vị là mức phục hồi thấp (<30%) là thường liên quan đến trọng lượng khô của rễ cao (> 60 g trọng lượng khô, đối với cây quýt clementine 2-3 năm tuổi) hoặc tỷ lệ trọng lượng rễ trên cả cây cao (> 0,25) thì khả năng tỷ lệ phục hồi cao (> 45%) liên quan đến trọng lượng khô của rễ thấp (<60 g trọng lượng khô đối với cây có múi 2-3 năm tuổi cây) hoặc tỷ lệ trọng lượng của rễ so với toàn cây thấp (<0,25). Điều này càng củng cố giả thuyết của chúng tôi AgNPs có thể được bài tiết bởi rễ cây có múi, với bộ rễ lớn hơn có khả năng bài tiết nhanh hơn.

Bảng 3. Hệ số tương quan Pearson ( r ) giữa khối lượng Ag trong lá / cành (ug), hàm lượng Ag trong khô lá / cành (μg / kg), trọng lượng khô của lá và cành (g), tổng chiều dài cành (cm) và cành khoảng cách từ chỗ tiêm (cm) (mẫu từ cây quýt có clementine nhận được 10 hoặc 100 ppm GA-AgNP tiêm)

Lưu ý: a , một nhánh hoặc trong một số ít trường hợp hai nhánh nằm gần nhau trên thân cây là được nhóm lại và các lá trong cùng một nhóm cành được xếp vào một mẫu; **, tương quan có ý nghĩa ở mức p = 0,01. *, mối tương quan có ý nghĩa ở mức p = 0,05

Theo dõi nano bạc trong mô lá

Để xác nhận sự xuất hiện của nano bạc trên lá, khu vực giữa xương sườn từ một lá hệ thống được thu thập từ cây quýt clementine 1 ngày sau khi tiêm 10 ml 100 ppm GA-AgNP huyền phù là được phân lập, nhúng và vi mô để quét kính hiển vi điện tử truyền qua (STEM. Người ta đã xác nhận rằng AgNPs hiện diện trong các bình xylem (Hình 5a), bằng chứng là cấu hình khoảng cách mạng tinh thể của chúng, được tính là 0,23 nm, phù hợp với khoảng cách của mặt phẳng tinh thể (1,1,1) của AgNPs (Hình 5b). 110 STEM / TEM bổ sung hiển thị AgNPs trong các mẫu lá (diện tích xylem, màng hoặc không gian ngoại bào) được cung cấp trong Hình S13

Hình 5. (a) NP (vùng tối hơn của ảnh TEM) được tìm thấy trong xylem của một lá hệ thống được thu thập 1 ngày sau 10 ml tiêm huyền phù GA-AgNP 100 ppm, và (b) cấu hình không gian mạng của hạt (không gian mạng tinh thể trung bình được tính từ các vùng 1, 2, 3 và 4, d = 0,23 nm).

Để khám phá thêm con đường vận chuyển của nano bạc trên lá, một nhánh 20 cm từ clementine cây quýt được đặt vào huyền phù GA-AgNP 100 ppm trong 24 giờ (theo cách đó chúng ta có thể tăng lượng AgNP trên lá một cách đáng kể, giúp chúng tôi xác định thêm AgNP có thể có con đường vận chuyển trên lá qua hình ảnh siêu kính hiển vi). Một chiếc lá trên ngọn là được thu thập và khu vực giữa xương sườn được cô lập, nhúng và microtomed. AgNPs đã được xác định

trong lá bằng cách sử dụng hình ảnh siêu kính, cho phép chúng tôi so sánh mức độ phong phú tương đối của nano bạc ở các vị trí khác nhau. Người ta thấy rằng có nhiều nano bạc hơn trong ngoại bào không gian hơn không gian nội bào của tế bào palisade và trung mô gần khu vực khí khổng (khu vực St, Hình 6 a & b). Tuy nhiên, hình ảnh siêu kính cận là một phương pháp phân tích bán định lượng (như hầu hết các phương pháp hiển vi là), và những kết quả này phải được xem xét trong bối cảnh này. Ngoài ra, chúng tôi AgNPs quan sát được trong cả không gian ngoại bào và nội bào của tế bào vỏ bó như trong không gian nội bào bên cạnh các phần tử phloem (khu vực Ph và Bs, Hình 6 c & d và Hình S14). Điều thú vị là, rất ít AgNP được tìm thấy trong xylem. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng AgNPs di chuyển bất sản từ xylem đến vùng khí khổng thông qua các tế bào trung mô do thoát hơi nước. Thật trùng hợp, đường được đồng hóa từ quá trình quang hợp trong tế bào trung bì liên tục khuếch tán vào phloem, và những đường tích lũy này hút nước (thẩm thấu) từ xylem liền kề vào phloem. 111,112 Do đó, các NP được trang bị trong phloem cùng với nước. 32 Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng con đường vận chuyển NP được xác định bằng cách sử dụng phân tích hình ảnh hyperspectral có thể không thể hiện đầy đủ sự di chuyển của NP trong lá từ cây có múi cây được tiêm AgNP, vì mật độ NP trong lá từ cành cắt cao hơn nhiều, và chúng tôi đã không xem xét phản ứng sinh lý của lá đối với việc cắt tỉa của nó.

Hình 6. Phân tích hình ảnh hyperspectral phân phối AgNPs trong một microtomed giữa xương sườn của một lá quýt clementine (AgNP được phát hiện được hiển thị trong các hình chữ nhật màu tím) thu được bằng cách nhúng một Nhánh 20 cm vào huyền phù GA-AgNP 100 ppm trong 24 giờ: (a) và (b), diện tích khí khổng; (NS) và (d) vùng vỏ bọc xylem / phloem / bó. Các thành phần khác nhau của lá, biểu bì, khoang khí khổng phụ, mô xốp, xylem, phloem và vỏ bọc được đánh dấu là Ep, Sc, St, Xy, Ph, và Bs, tương ứng. Thanh tỷ lệ trong (a) áp dụng cho tất cả các bảng

PHẦN KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh rằng tiêm vào thân cây, trong số bốn phương pháp được thử nghiệm cho phân phối nano bạc vào cây (các phương pháp phân phối khác đã được thử nghiệm là bón lá, tiêm cành và làm ướt đất), có thể dễ dàng cung cấp một lượng lớn nano bạc vào cây có múi. Sau phân phối, Ct-AgNPs có xu hướng ở lại trong thân cây vì sự kết hợp nhanh chóng gây ra bởi độ mặn cao của nhựa cây, trong khi PVP- và GA-AgNPs có thể được phân phối trên toàn bộ cây thông qua cả vận chuyển lên và xuống do lực đẩy thép mạnh do lớp phủ bề mặt. Chúng tôi chứng minh rằng hệ thống gốc có thể là một bể chứa NP như một lượng AgNP được tìm thấy ở đó, và ngoài ra, các lông rễ có khả năng bài tiết NP ra khỏi cây. Về vận chuyển AgNPs từ thân sang lá, cành ngắn gần chỗ chích có xu hướng có hàm lượng Ag cao, dẫn đến hàm lượng Ag trong lá trên các cành này cao.

Hơn nữa, trên lá, một con đường vận chuyển tiềm năng của nano bạc từ xylem đến phloem gần khí khổng các khu vực đã được xác định. Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của việc sử dụng NPs như các tác nhân hoặc gen chống vi khuẩn cây trồng lâu năm.

PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Natri xitrat, polyvinylpyrolidon (PVP, M = 40000), kẹo cao su Ả Rập (GA, M = 250000),

dung dịch bạc nitrat (0,1 M), natri borohydrid, MgSO4 , NH4 NO3 , KCl, CaCl2 , MgCl2 , NaCl,axit boric, Fe(NO3)₃ , ZnSO4 , CuCl2 , KH2PO4 , axit fumaric, axit malic, proline, sucrose, glucose, fructose, axit citric, axit quinic, asparagin, glutaraldehyde, axit nitric và axit clohydric được mua từ Sigma Aldrich và được sử dụng mà không cần sửa đổi thêm. Nhúng 812 là mua từ Fisher.

Tổng hợp nano bạc

Nano bạc đã được tổng hợp theo một nghiên cứu trước đây. 113 Tóm tắt, 10 ml dung dịch gốc AgNO₃  đã được thêm vào 270 ml nước nanopure. Sau đó, 10 ml GA (10% trọng lượng), PVP (10% trọng lượng), hoặc natri citrate (10% trọng lượng) được thêm vào, và dung dịch được khuấy ở tốc độ 1000 vòng / phút trong 15 phút trong bể nước đá.

Sau đó, thêm 10 ml dung dịch natri borohydrid (1% trọng lượng), và tiếp tục khuấy hỗn hợp thêm 1 giờ (trong bồn nước đá). Lọc chân không (màng PS 35, Solecta, Oceanside, CAI; ở 50 psi) được sử dụng để tách các NP ra khỏi môi trường nước, sau đó là rửa ba lần với nước nanopure. AgNPs lắng đọng trên màng sau đó được thu thập và sử dụng để tạo ra Hỗn dịch nước 1000 ppm, và để trong tủ lạnh (4 o C).

Nguyên liệu thực vật

Hai loài cam quýt khác nhau được sử dụng để nghiên cứu nano bạc trên cây trồng : (1) Vôi Mexico 2-3 năm tuổi (Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle) trồng trong nhà kính tại UC Riverside vào năm 2017, và (2) quýt clementine 2-3 năm tuổi ( C. clementina hort. Ex Tanaka) ghép vào gốc ghép Carrizo ( C. sinensis (L.) Osbeck × Poncirus trifoliata (L.) Raf.) Phát triển trong cùng UC Riverside nhà kính vào mùa xuân (26 tháng 2 đến 20 tháng 3) và mùa thu (11 tháng 9 đến 5 tháng 11) của 2018. Tất cả các cây có múi đều được tưới thủ công bằng nước máy hoặc nước phân bón (NPK 21: 5: 20 pha trộn). Kiểm soát nhiệt độ trong nhà kính bao gồm một hệ thống làm mát 3 giai đoạn, với một ống xả để bật quạt ở 85ºC, tiếp theo là quạt gió và bộ làm mát bay hơi khi đạt đến 89ºC.

Đặc điểm NP (phân tích tổng hợp và hòa tan)

Vôi Mexico 2-3 năm tuổi được sử dụng cho tất cả các nghiên cứu vận chuyển và phân phối nano bạc. Lá đã thu thập trên 05 Tháng năm thứ năm 2016 và 12 tháng năm thứ 2017 (lá mười từ mỗi cây thành hai bản), và là ngay lập tức được gửi đến Cal GAP Inc. (NovaCropControl, Hà Lan) để chiết xuất nhựa cây và phân tích chất tan vô cơ. 114 Dựa trên phân tích này và một nghiên cứu gần đây, 37 nhựa cây có múi tổng hợp được bao gồm 995 mM KCl, 90 mM CaCl2 , 20 mM MgCl2 , 5,0 mM NaNO3 , 6 mM KH2PO 4 , 65,9 mM sacaroza, 20,5 mM glucoza, 10,3 mM fructoza, 55,1 mM axit malic, 28,2 mM axit xitric, 68,0 mM proline và 16,6 mM asparagin vào nước khử ion, với độ pH được điều chỉnh thành 5,5 với 0,1 NaOH và HCl 0,01M. Dung dịch nhựa cây vô cơ chỉ chứa các chất tan vô cơ, trong khi dung dịch nhựa cây hữu cơ chỉ chứa các chất hòa tan hữu cơ trong nhựa cây tổng hợp. 10 ppm PVP-, GA-, Ct-AgNPs (được điều chế từ hỗn dịch gốc AgNP) được sử dụng cho kích thước HD và tiềm năng zeta các phép đo bằng thiết bị ZetaPlus (BrookHaven, US). Để đo lường tiềm năng zeta của AgNP trong nhựa cây tổng hợp một cách chính xác, chúng tôi điều hòa điện cực trước khi đo (chi tiết thông tin có thể được tìm thấy trong SI ). Tổng hợp các AgNP được theo dõi liên tục thông qua các thay đổi ở chế độ HD được đo 30 giây một lần trong khoảng thời gian 10 phút. Các xét nghiệm lắng cặn đã được thực hiện trên phép đo phổ UV-Vis (Thermo Scientific Evolution TM 350, US) bằng cách đo độ hấp thụ ở 395 nm mỗi 30 phút trong khoảng thời gian 8 giờ. Thử nghiệm độ hòa tan được thực hiện trong lọ thủy tinh 12 ml có nắp PTFE (Fisher Scientific, US). 10 ml nhựa cây vô cơ tổng hợp, nhựa cây hữu cơ, hoặc nhựa cây, chứa 100 ppm AgNPs đã được thêm vào các lọ. Sau 7 ngày, nồng độ ion Ag trong mỗi lọ được đo bằng ICP-MS (NexION 2000, PerkinElmer, với giới hạn phát hiện, 0,2 ppb) sau khi các lọ được ly tâm ở 25000 g trong 60 phút (Sorvall TM , Thermo Scientific), lọc qua bộ lọc polyvinylidene flo 0,22 μm và axit hóa trong axit nitric 5% (Các thí nghiệm đối chứng với Ct-, PVP-, GA-AgNP tươi trong các môi trường nước này đã xác nhận rằng ly tâm và lọc có thể tách thành công AgNP ra khỏi môi trường).

Sự hấp thụ và vận chuyển AgNP ở cây vôi Mexico sau khi bón lá, làm ướt đất, và tiêm cành

Các huyền phù 20 ppm (0,5 ml, 10 μg) và 100 ppm (0,5 ml, 50 μg) PVP-, GA- và Ct-AgNP được bón cho cây vôi Mexico thông qua bón lá, làm tơi đất và tiêm cành cành (Hình S15 a). Trong ứng dụng bón lá, ba lá phát triển tốt (trên cùng một cành, trên cùng của cây, cao hơn mặt đất khoảng 75 cm) được mài nhẹ bằng giấy nhám mịn, và dung dịch 0,17 ml đã được thêm vào mỗi lá trong số ba lá (tổng cộng 0,5 ml). Trong đất bị xói mòn, một nano bạc nhỏ lớp đất mặt (3 cm dưới gốc của thân cây) được cắt bỏ để lộ rễ, sau đó 0,5 ml AgNP huyền phù đã được nhỏ giọt vào rễ, sau đó được che phủ trở lại. Trong việc cho ăn nhánh, đầu của một nhánh (chiều dài: trên 35 cm; chiều cao:> 15 cm trên mặt đất) đã được cắt và một ống tiêm 5 ml được kết nối đến cành đã cắt bằng ống cao su và dùng băng keo silicon dán kín. 0,5 ml dung dịch đã được thêm vào ống tiêm, và thông qua trọng lực, đã được phép hấp thụ bởi cây. Vào 1 ngày và 7 ngày. Sau khi tiếp xúc với NP, 6 lá được thu thập để phân tích Ag. Các mẫu lá được sấy khô ở 80^o C trong 48 giờ. Sau khi đo trọng lượng khô, các mẫu lá được đốt cháy (ở 550 o C), và tro được thu gom và phân hủy bằng nước cường toan (ở 110 o C trong 1 giờ). Nồng độ Ag là đo bằng ICP-MS. Sau 6 tuần, sáu cây tiếp xúc qua bón lá (2 cây cho mỗi cây loại ứng dụng nano bạc) đã được hy sinh, tách thành các lá (những phần còn lại sau khi lấy mẫu vào Ngày 1 và Ngày 7), cành, thân và rễ. Hàm lượng Ag trong các mô này đã được phân tích, và tổng khối lượng Ag trong các cây thu được.

Vận chuyển nano bạc trong cây quýt có chất clementine sau khi tiêm vào thân

Huyền phù nano bạc được tiêm vào thân cây quýt có clementine (～ 5 cm trên mặt đất; đường kính toàn bộ ống tiêm, ～ 1 cm) bằng dụng cụ phun khí nén (Hình S15 b). Tiêm được thực hiện ở áp suất 20–80 psi. Trong khi phần lớn các mũi tiêm là hoàn thành trong vòng 2 giờ, hai lần tiêm với huyền phù GA-AgNP cần tối đa 24 giờ hoàn thành; không rõ tại sao một số mũi tiêm cần thời gian lâu hơn. Tuy nhiên, nó không chắc sự tắc nghẽn xylem đó là nguyên nhân dẫn đến thời gian tiêm dài hơn, vì Ct- AgNPs không bao giờ mất quá 2 giờ để tiêm. Hai vòng thí nghiệm đã được tiến hành. Ngày thứ nhất, để kiểm tra tác động của sự biến đổi bề mặt đối với quá trình vận chuyển nano bạc, 10 ml 1000 ppm (10 mg Ag in tổng cộng) Các huyền phù Ct-, PVP- và GA-AgNP được tiêm vào cây (ba cây cho mỗi cây loại sửa đổi của AgNPs) (bắt đầu từ 26/02/2018). Ba cục bộ (gần điểm tiêm) và 3 lá toàn thân (xa điểm tiêm nhất) được thu thập vào ngày 1, 7 và 42 sau khi tiêm mũi tiêm. Vào ngày thứ 42, cây cối đã tách lá, cành, thân, rễ cho khối lượng Ag là phân tích phân phối và cân bằng khối lượng. Thứ hai, để kiểm tra tác động của nồng độ AgNP đối với Vận chuyển NP trong cây (sau khi tiêm), 10 ml huyền phù GA-AgNP (10 ppm và 100 ppm, 0,1 và 1 mg Ag tổng cộng) đã được tiêm vào tổng số 18 cây (ba lần tiêm lặp lại của ba cây ở mỗi nồng độ AgNP) (bắt đầu từ ngày 17/09/2018). Vào ngày 1, ngày 3 và ngày 7 sau khi tiêm, cây cối bị tách lá, cành, thân, rễ. Nói chung, thân cây được cắt thành 3-5 các mảnh và 4-7 nhánh được lấy mẫu, lưu ý khoảng cách giữa điểm chèn nhánh trên thân cây và điểm tiêm. Các lá từ cùng một cành đã được thu thập cùng nhau. Đến xác minh sự xuất hiện của nano bạc trong mô giàu phloem, chúng tôi cẩn thận bóc lớp mô nằm bên ngoài lớp cambium (chủ yếu là vỏ cây và phloem được minh họa trong Hình 3a), và phần còn lại của thân cây bị bong tróc là mô giàu xylem. Ngoài ra, chúng tôi cũng tách các lông rễ ra khỏi rễ chính để định lượng khối lượng Ag trong lông hút của rễ. Tất cả các mô thực vật được cân sau khi sấy khô ở 80 o C để 48-72 giờ (cho đến khi trọng lượng ngừng thay đổi), và sau đó bị đốt cháy ở 550 o C. Tro là được thu hồi và tiêu hóa bằng nước cường toan (ở 110 o C trong 1 giờ). Nồng độ Ag trong tiêu hóa tro được đo bằng ICP-MS. Để kiểm tra độ tin cậy của phương pháp phân tích, nhỏ 10 μl. Hỗn dịch AgNP 100 ppm được đặt lên ba lá, ba đoạn thân và chính rễ (từ cây không được tiêm AgNPs). Sau khi đốt và phân hủy axit, chúng tôi thu hồi từ 95% đến 98% tổng lượng Ag được thêm vào, chứng tỏ độ bền của phân tích.

Hình dung GA-AgNPs trong cành và lá quýt clementine

Để xác nhận việc vận chuyển GA-AgNPs từ điểm tiêm đến nhánh, các đoạn nhánh ngắn được loại bỏ ở khoảng cách khoảng 2 cm trên điểm tiêm và cắt theo chiều dài 1 cm sử dụng Máy cưa vòng kim cương tốc độ thấp Model 650 (South Bay Technology, Inc., San Clemente, CA). Bề mặt được đánh bóng bằng dao thủy tinh được lắp trên microtome RMC MT-X (Boeckeler Instruments, Inc., Tucson, AZ). Kính hiển vi điện tử và phân tích vi EDX được thực hiện trên một Tescan Mira3 SEM (Tescan, Brno, Cộng hòa Séc) được trang bị hệ thống Bruker Quantax EDS (Bruker, Billerica, MA) tại Cơ sở Trung tâm về Soi và Phân tích Vi mô nâng cao

(CFAMM) tại Đại học California ở Riverside. Để khám phá sự vận chuyển của nano bạc từ điểm tiêm đến lá, hệ thống lá đã được thu thập 1 ngày sau khi tiêm hỗn dịch GA-AgNP 100 ppm. Một mẫu mô lá 2 × 3 cm (vùng giữa xương sườn gần với cuống lá) được cắt và cố định trong 5% glutaraldehyde trong 24 giờ ở 4^o C. mẫu sau đó được rửa ba lần với dung dịch đệm phosphat 0,1 mol / L pH = 7,2, và khử nước với một loạt axeton được phân loại (10%, 30%, 50%, 70%, 90% và 100%). Sau đó, mô đã nhúng trong nhựa epoxy (ETON 812). 115 Các mẫu được nhúng là microtomed (Leica, US) thành các lát 200 nm bằng dao kim cương trên một lam kính hiển vi tiêu chuẩn (Cố định, nhúng, và microtoming được thực hiện trong khoa Bệnh lý và Phòng thí nghiệm, Đại học California tại Los Angeles). Trang trình bày sau đó được gửi đến Đại học Duke và được chụp ảnh sử dụng kính hiển vi siêu viễn thị (CytoViva, Auburn, Al). Sau khi phân tích CytoViva, một khu vực mẫu được xác định có chứa AgNPs được chọn và được cắt thành 60-80 nm cho cả hai TEM (Kính hiển vi điện tử lạnh T12, FEI Tecnai) và phân tích STEM (Titan 80-300 kV, FEI).

Để khảo sát sự vận chuyển nano bạc giữa xylem và phloem gần và xung quanh khí khổng các lỗ hở trên lá, chúng tôi sử dụng hình ảnh siêu kính để xác định AgNP trên toàn bộ lá kết cấu. Một nhánh dài 20 cm (có 10 lá) được cắt và đặt trong chất nano GA-AgNP 100 ppm huyền phù nước. Sau 24 h, người ta thu được một chiếc lá ở ngọn cành, phiến lá. được nhúng và sử dụng microtomed đến các phần dày 200 nm, và được tạo hình bằng cách sử dụng hyperspectral

kính hiển vi. Một thư viện quang phổ tham chiếu bao gồm 38 quang phổ được xây dựng thủ công từ một mẫu đối chứng 5 mg / L GA-AgNP trong nước nano (Hình S16), được phép lắng lên bề mặt kính qua đêm. Việc lựa chọn phổ thủ công đã được thực hiện để đảm bảo chất lượng cao, quang phổ đại diện trong khi giảm thiểu xác suất dương tính giả. Phù hợp của thư viện tham khảo đối với các mẫu lá đã qua xử lý và đối chứng được thực hiện bằng cách sử dụng góc phổ

phương pháp ánh xạ với ngưỡng 0,25 rad, do đó tiết lộ các AgNP riêng lẻ và nhóm trong các mẫu. Điều này dẫn đến tỷ lệ dương tính giả ở các mẫu lá đối chứng là <0,005% theo số của pixel (~ 5 pixel / hình ảnh), đồng thời đối sánh tích cực> 75% các hạt trong hình ảnh AgNP kiểm soát.

Việc phát hiện trong mẫu được xử lý bằng nano bạc được coi là dương tính khi có ít nhất 0,5% pixel trong ảnh đã khớp với thư viện quang phổ với cùng một ngưỡng 0,25 rad. Bất kỳ quang phổ nào nhất quán dẫn đến kết quả dương tính giả đã bị xóa khỏi thư viện phổ trong quá trình tối ưu hóa. Hình ảnh bổ sung hiển thị các pixel được ánh xạ trong các mô được xử lý và kiểm soát tiêu cực được cung cấp trong SI , Hình S17.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Chúng tôi thực hiện một chiều

Kiểm tra ANOVA cộng với kiểm tra LSD của Fisher để phân tích thống kê. p <0,05 được coi là có ý nghĩa.

NỘI DUNG LIÊN KẾT

Thông tin hỗ trợ .

Thông tin Hỗ trợ được cung cấp miễn phí qua Internet tại http://pubs.acs.org/

Các tệp sau đây được cung cấp miễn phí. Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO)

Mô tả về mô hình; Ước tính độ dày lớp polyme; Điều hòa điện cực cho điện thế Zeta; Hình S1 Hình ảnh TEM của AgNPs với các biến đổi bề mặt khác nhau: (a) Ct, (b) PVP và (c) GA. (Thanh tỷ lệ ở a, b và c: 100 nm; thanh tỷ lệ ở hình được chèn, 50nm); Hình S2. Sự phân bố kích thước của AgNP với sự thay đổi bề mặt khác nhau trong nước DI (ac) và nhựa cây tổng hợp (df); Hình S3. Tương ứng cho ba phép đo DLS trong nhựa cây tổng hợp (10 ppm AgNP, pH = 5,5): (a) GA-AgNP, (b) PVP-AgNP và (c) Ct-AgNP. (các chấm trong hình bầu dục màu đỏ là tín hiệu của dữ liệu do cụ sưu tầm); Hình S4. Thay đổi trọng lượng trung bình so với nhiệt độ cho từng loại AgNP tráng và AgNP trần; Hình S5. Tính di động điện di của lớp phủ trần và bề mặt AgNPs; Hình S6. Hồ sơ năng lượng tương tác DLVO giữa AgNP (PVP-AgNP, GA-AgNP và Ct-AgNP) và bề mặt xylem / phloem; Hình S7. DLVO cổ điển và năng lượng tương tác steric giữa PVP-AgNP (a) / GA-AgNP (b) và bề mặt xylem / phloem; Hình S8. Phổ UV-Vis của AgNP nguyên sinh và phản ứng (7 ngày) với các biến đổi bề mặt khác nhau (20 ppm trên lý thuyết): (a) Ct, (b) PVP, và (c) GA. (Inorg: thành phần vô cơ của nhựa cây tổng hợp; Org: thành phần hữu cơ nhựa tổng hợp; Trộn: nhựa cây tổng hợp); Hình S9. Khối lượng Ag được phục hồi trong lá, thân và rễ từ các cây khác nhau trong việc bón lá với PVP-, GA-, Ct-AgNP sau sáu tuần (vôi Mexico, 0,5 ml tiếp xúc với AgNP 100 ppm); Hình S10. % khối lượng Ag trong lá khô, cành, thân, rễ tính đến tổng khối lượng Ag thu hồi được ở những cây được tiêm GA-AgNPs 10 ppm (a) và 100 ppm (b); Hình S11. Mối quan hệ giữa tỷ lệ khối lượng Ag thu hồi (Khối lượng Ag thu hồi từ cây đến giá trị lý thuyết của khối lượng Ag được tiêm vào) và khối lượng rễ khô (hoặc tỷ lệ khối lượng của khô rễ đến toàn cây) (cây quýt xanh 2,5 năm tuổi, tiêm 10 ml AgNPs, nhưng tiêm hỗn dịch GA-AgNPs 100 ppm vào Ngày thứ 3 không thành công và chỉ có 7 ml huyền phù đã được tiêm trong vòng 2 giờ); Hình S12. Mối quan hệ giữa tỷ lệ thu hồi khối lượng Ag (Khối lượng Ag thu hồi từ tất cả các cây quýt 2,5 năm tuổi đạt giá trị lý thuyết về khối lượng Ag tiêm) và trọng lượng rễ khô (hoặc tỷ lệ trọng lượng của rễ khô so với toàn cây); Hình S13. TEM hình ảnh mặt cắt ngang của xương sườn giữa (chủ yếu là diện tích xylem): (a, b) các NP nghi ngờ trong xylem (các thành dày không liên tục là sự dày lên theo hình xoắn ốc của một phần tử tàu non; (c, d) AgNPs nghi ngờ (hình bầu dục màu đỏ) trong màng hoặc khoảng gian bào; Hình S14. Phân tích CytoViva trên nAg sự phân bố ở phần giữa của lá có kích thước siêu nhỏ (AgNP được phát hiện được hiển thị trong các hình tròn / hình chữ nhật): (a) AgNPs trong vỏ bọc (1, ngoại bào) và phloem (2, nội bào), (b) AgNPs trong mô bọt biển (1, ngoại bào; 2, nội bào)); Hình S15. (a) Cho ăn cành và (b) chích thân cây cho đưa VQG vào cây có múi; Hình S16. (a) Phân tích CytoViva của huyền phù nAg (20 nm) và (b) thư viện quang phổ của nó; Hình S17. Ảnh siêu kính (a, c và e) và trường tối tương ứng hình ảnh (d, d và f) về sự phân bố AgNPs trong một phần giữa gân của lá quýt có chất clementine thu được bằng cách nhúng một nhánh dài 20 cm vào huyền phù GA-AgNP 100 ppm trong 24 giờ (g, hình ảnh đối chứng âm). Bảng S1 Thành phần nhựa tổng hợp của vôi Mêhicô.

Nguồn tham khảo:

Delivery, Fate, and Mobility of Silver Nanoparticles in Citrus Trees