Nano đồng oxit được sử dụng trên cây lúa giống ( Oryza Sativa L.) và các phản ứng sinh lý
Gạo ( Oryza sativa L.), một loại lương thực chính của hàng tỷ người, đã được đánh giá về độc tính thực vật của hạt nano oxit đồng (CuO NP, kích thước <50 nm). Trong điều kiện thủy canh, bảy ngày tiếp xúc với 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP đã ức chế đáng kể tốc độ tăng trưởng của cây lúa con so với cả nhóm đối chứng và nhóm xử lý dịch nổi từ hỗn dịch CuO NP 250 mg/L. Ngoài ra, các chỉ số sinh lý liên quan đến chất chống oxy hóa, bao gồm tổn thương màng và hoạt động của enzyme chống oxy hóa, cũng được phát hiện. Xử lý bằng 250 mg/L CuO NP làm tăng đáng kể hàm lượng malondialdehyde (MDA) và độ dẫn điện của chồi lúa lần lượt là 83,4% và 67,0%. Hoạt động của cả catalase và superoxide dismutase đều giảm ở lá lúa được xử lý bằng CuO NP ở nồng độ 250 mg/L, trong khi hoạt động của superoxide dismutase tăng đáng kể 1,66 lần ở rễ lúa tiếp xúc với CuO NP 125 mg/L. Diệp lục, bao gồm diệp lục a và diệp lục b , và hàm lượng carotenoid trong lá lúa giảm khi tiếp xúc với CuO NP. Cuối cùng, để giải thích các cơ chế phân tử tiềm ẩn của các biến thể diệp lục, biểu hiện của bốn gen liên quan, cụ thể là, tiểu đơn vị chelatase D của Magnesium, Chlorophyll synthase , Magnesium-protoporphyrin IX methyltransferase và Chlorophyllide a oxygenase, đã được định lượng bằng qRT-PCR. Nhìn chung, CuO NP, đặc biệt là ở nồng độ 250 mg/L, có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa con, có thể là thông qua tổn thương oxy hóa và rối loạn tổng hợp diệp lục và carotenoid.
1. Giới thiệu
Các hạt nano được thiết kế (ENP) là các hạt có kích thước từ 1 đến 100 nm [ 1 ]. Do các đặc tính đặc biệt của chúng, chúng đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, chẳng hạn như trong y sinh học, nông nghiệp và công nghiệp [ 2 , 3 ]. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi ENP đã dẫn đến việc chúng không thể tránh khỏi và không thể đảo ngược được phát tán vào môi trường [ 4 ]. Với việc ENP dự kiến sẽ được sử dụng rộng rãi hơn, tác động của chúng đối với môi trường và các sinh vật đã trở thành mối quan tâm ngày càng tăng [ 5 , 6 , 7 , 8 ]. Khi thực vật tương tác với khí quyển, đất và nước, chúng có thể bị ô nhiễm trực tiếp bởi ENP. Do đó, việc đánh giá thường xuyên về độc tính thực vật của ENP được coi là có ý nghĩa then chốt trong việc bảo vệ môi trường [ 9 , 10 , 11 , 12 ].
Trong số các loại ENP khác nhau, các hạt nano oxit đồng (CuO NP) được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, chẳng hạn như siêu dẫn nhiệt độ cao [ 13 ], pin [ 14 ], cảm biến khí [ 15 ], phụ gia dầu bôi trơn [ 16 ], chất loại bỏ ô nhiễm [ 17 ] và xúc tác [ 18 ]. Người ta ước tính thận trọng rằng, từ năm 2020 đến năm 2025, thế giới sẽ tiêu thụ ít nhất 200.000–830.000 kg CuO NP mỗi năm [ 19 ]. Nhu cầu và ứng dụng cao của CuO NP sẽ làm tăng đáng kể khả năng chúng phát tán vào môi trường và tích tụ sinh học vào chuỗi thức ăn thông qua thực vật, gây hại tiềm tàng cho sức khỏe con người [ 20 , 21 ]. Do đó, việc đánh giá độc tính thực vật của CuO NP là đặc biệt quan trọng.
Các hạt nano CuO đã được báo cáo là có độc tính đối với thực vật bằng cách gây ra một loạt các tác động sinh lý và chúng có thể có các tác động độc hại khác nhau đối với các loại cây khác nhau ở các nồng độ mục tiêu khác nhau [ 9 , 22 ]. Ví dụ, các hạt nano oxit đồng có thể ức chế sự phát triển của rễ và thân cây Brassica juncea L. theo cách phụ thuộc vào liều lượng [ 23 ]. Trong hai nghiên cứu, các hạt nano oxit đồng 500 mg/L đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của ngô [ 24 ], trong khi các hạt nano oxit đồng ˃10 mg/L ức chế đáng kể sự tích tụ sinh khối bông [ 25 ]. Người ta cũng đã báo cáo rằng các hạt nano CuO có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến Pisum sativum [ 26 ], Schoenoplectus tabernaemontani [ 27 ], Hordeum vulgare [ 28 ] , Landoltia punctate [ 29 ] và Oryza sativa (lúa) [ 30 , 31 ]. Người ta cũng phát hiện ra rằng CuO NP có khả năng ức chế sự kéo dài rễ của cây ngô và cây lúa mới nảy mầm, ngay cả ở nồng độ thấp là 25 mg/L [ 32 ]. Độc tính thực vật của CuO NP thường được đánh giá bằng cách đo các chỉ số kiểu hình về sự tăng trưởng và phát triển của cây, ví dụ như tỷ lệ nảy mầm, sự kéo dài rễ và sự tích tụ sinh khối [ 9 , 33 , 34 ]. Tuy nhiên, so với các hạt nano khác, các bài báo đã công bố tập trung vào những thay đổi về mặt sinh lý và phân tử do CuO NP gây ra vẫn còn hạn chế.
Là một loại lương thực thiết yếu trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta, việc sản xuất lúa gạo an toàn có tầm quan trọng sống còn. Độc tính thực vật của CuO NP trong gạo đã được báo cáo và hai yếu tố sinh lý chính chịu trách nhiệm cho độc tính thực vật của CuO NP: tổn thương oxy hóa và suy giảm quang hợp. Ví dụ, Shaw và Hossain [ 30 ] đã báo cáo rằng CuO (<50 nm) ở 0,5, 1,0 và 1,5 mM có thể làm giảm sự nảy mầm của hạt lúa và khả năng sống của tế bào rễ nhưng làm tăng mức H 2 O 2 và malondialdehyde (MDA) cũng như hoạt động của ascorbate peroxidase (APX) và glutathione reductase (GR). Hơn nữa, CuO NP ở mức 1000 mg/L có thể làm giảm tốc độ quang hợp, tốc độ thoát hơi nước và hàm lượng sắc tố quang hợp và làm tăng hàm lượng MDA và proline trong gạo [ 31 ]. Tuy nhiên, cơ chế phân tử mà CuO NP gây ra độc tính thực vật vẫn chưa rõ ràng. Cần có nhiều nghiên cứu hơn để hiểu rõ hơn về cơ chế này.
Mục đích của nghiên cứu này là (i) điều tra những thay đổi về kiểu hình do tiếp xúc ngắn hạn với CuO NP với cây lúa ở giai đoạn đầu trong quá trình nuôi trồng thủy canh; (ii) kiểm tra những thay đổi của các yếu tố sinh lý, ví dụ như tổn thương oxy hóa và suy giảm quang hợp, do CuO NP gây ra ở cây lúa; và (iii) đánh giá các cơ chế tiềm ẩn của tình trạng giảm diệp lục ở lá lúa tiếp xúc với CuO NP ở cấp độ phân tử.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Đặc tính của CuO NP
CuO NP (<50 nm, Sản phẩm số 544868) được mua từ Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Hình thái của CuO NP là hình elip hoặc hình cầu với kích thước từ 40 đến 80 nm khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Độ tinh khiết của CuO NP lớn hơn 97% và độ pH của huyền phù CuO NP (2000 mg/L) là 6,36 ± 0,02. Chi tiết về hình ảnh TEM và điện thế zeta của huyền phù CuO NP đã được công bố trước đây [ 21 ].
2.2. Nuôi trồng cây lúa
Hạt giống lúa ( Oryza sativa spp. japonica ) được thu hoạch vào năm 2018 và được lưu trữ trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Tỷ lệ nảy mầm của chúng đã được chứng minh là cao hơn 90% trước khi thí nghiệm. Đầu tiên, hạt giống được khử trùng bằng natri hypoclorit (10%) trong 10 phút, sau đó rửa sạch bằng nước khử ion (DI) đã khử trùng năm lần để loại bỏ chất khử trùng còn lại và nảy mầm trong đĩa Petri 100 mm × 15 mm chứa 5 mL nước DI đã khử trùng trong buồng tăng trưởng trong bóng tối ở 25 ° C. Sau bốn ngày, 12 hạt giống đã nảy mầm được cấy vào cốc thủy tinh 200 mL có chứa 200 mL dung dịch dinh dưỡng Yoshida (pH 5,5) [ 35 ]. Tất cả các cây lúa giống đều được trồng trong buồng trong các điều kiện sau: độ ẩm tương đối 60%–70%, nhiệt độ ngày/đêm 25/20 ° C, quang kỳ 14 giờ và cường độ ánh sáng 16.500 lx. Trong 10 ngày tiếp theo, dung dịch dinh dưỡng Yoshida trong cốc thủy tinh 200 mL được thay mới sau mỗi 2 ngày.
Trước khi xử lý, huyền phù CuO NP được pha loãng trong các hàm lượng khác nhau của dung dịch dinh dưỡng Yoshida (pH 5,5) ở nồng độ 0, 62,5, 125 và 250 mg/L và siêu âm bằng cách sử dụng rung siêu âm (100 W, 40 KHz) trong 45 phút. Phần nổi từ huyền phù CuO NP 250 mg/L (S250) thu được bằng cách siêu âm (45 phút) trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida (pH 5,5), ly tâm trong 30 phút ở tốc độ 15.000 vòng/phút, sau đó lọc qua bộ lọc 0,22 μm. Cây lúa giống 14 ngày tuổi được xử lý bằng dung dịch CuO NP 0, 62,5, 125 và 250 mg/L và phần nổi từ huyền phù CuO NP 250 mg/L và được thay mới sau mỗi 2 ngày. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành với ba bản sao sinh học. Sau 7 ngày phơi sáng nữa, cây giống 21 ngày tuổi từ mỗi cốc được thu hoạch và rửa sạch bằng nước DI. Rễ và lá của cây giống lúa được tách ra và ghi lại trọng lượng tươi (FW) của chúng.
2.3. Tính toàn vẹn của hệ thống màng tế bào lúa
Để đánh giá tính toàn vẹn của màng tế bào, mức độ peroxy hóa lipid và rò rỉ ion trong rễ và lá lúa đã được định lượng. Peroxy hóa lipid đã được kiểm tra bằng phương pháp MDA do Heath và Packer mô tả [ 36 ] với một số sửa đổi nhỏ. Tóm lại, 0,5 g mô tươi của rễ và lá lúa đã được nghiền trong axit trichloroacetic (TCA) 0,1% ( w / v ). Sau khi ly tâm trong 20 phút ở 10.000 g, 20% TCA (1 mL) với axit thiobarbituric (TBA) 0,5% đã được thêm vào 1 mL dịch nổi. Sau khi thêm 100 μL hydroxyltoluene butyl hóa 4% (BHT, trong ethanol), hỗn hợp này được đun nóng ngay lập tức trong bồn nước ở 95 °C trong 30 phút, sau đó làm nguội nhanh và ly tâm trong 15 phút ở 10.000 g. Phần dịch trong được lấy ra để đo độ hấp thụ ở 532 và 600 nm bằng máy quang phổ Beckman Du-640 (Beckman Coulter, Brea, CA). Sau đó, 0,25% TBA trong 10% TCA được sử dụng làm mẫu trắng; hệ số tiêu hủy là 155 mM −1 cm −1 . Sự rò rỉ ion từ rễ và lá được đo theo phương pháp của Zhao et al. [ 37 ] với một số sửa đổi nhỏ. Năm đoạn rễ (dài khoảng 1 cm) và 10 đoạn lá (đường kính khoảng 0,5 cm) được cắt và rửa ba lần bằng nước khử ion để loại bỏ ion rò rỉ do tổn thương tức thời gây ra cho mô trong quá trình cắt. Sau đó, các đoạn được ủ trong lọ 10 mL chứa 8 mL nước khử ion trong 3 giờ trong máy lắc quay ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ trong 3 giờ, độ dẫn điện của dung dịch được đo và sau đó đun sôi ở 100 °C trong 30 phút. Sau khi dung dịch được làm nguội đến nhiệt độ phòng, độ dẫn điện được đo lại và kết quả được biểu thị dưới dạng độ dẫn điện tương đối [(độ dẫn điện sau khi ủ/độ dẫn điện trước khi đun sôi) × 100].
2.4. Hoạt động của Enzym chống oxy hóa của Cây lúa giống
Để phân tích hoạt động của enzyme chống oxy hóa trong gạo tiếp xúc với CuO NP, 1 g rễ và lá tươi được nghiền trong 10 mL đệm kali phosphat đã làm lạnh trước (PBS, 100 mM, pH 6,8) và sau đó ly tâm trong 20 phút ở 10.000 g. Phần dịch nổi được sử dụng để kiểm tra hoạt động của enzyme chống oxy hóa. Catalase (CAT, EC 1.11.1.6) được đo bằng cách theo dõi sự phân hủy H 2 O 2 ở 240 nm, có hệ số tiêu hủy là 39,4 mM −1 cm −1 [ 38 ], trong khi hoạt động của superoxide dismutase (SOD, EC 1.11.1.7) được định lượng bằng cách theo dõi sự ức chế nitroblue tetrazolium ở 560 nm theo Beyer et al. [ 39 ]. Hoạt động của guaiacol peroxidase (POD, EC 1.15.1.1) được phát hiện bằng cách theo dõi sự hình thành của quá trình khử hydro guaiacol (hệ số tiêu diệt 6,39 mM −1 cm −1 ) ở 420 nm [ 40 ]. Hoạt động của CAT, SOD và POD được thực hiện bằng máy quang phổ Beckman Du-640 (Beckman Coulter, Brea, CA, Hoa Kỳ) ở 25 °C.
2.5. Hàm lượng diệp lục và carotenoid
Hàm lượng diệp lục và carotenoid trong lá lúa được phát hiện theo Nair và Chung [ 41 ]. Lá lúa có khối lượng 0,05 g được ủ trong etanol 95% ( v / v ) (10 mL) trong 3 ngày trong bóng tối ở 4 °C. Sau khi ly tâm, độ hấp thụ của phần chất lỏng trong được đo bằng máy quang phổ Beckman Du-640 (Beckman Coulter, Brea, CA, Hoa Kỳ) ở 470, 665 và 649 nm. Sau đó, hàm lượng diệp lục và carotenoid được tính theo Lichtenthaler và Wellburn [ 42 ].
2.6. PCR định lượng thời gian thực (qRT-PCR) của các gen tổng hợp diệp lục
RNA được chiết xuất bằng thuốc thử TRIzol (Bioteke, Bắc Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một microgam RNA tổng số được phiên mã ngược thành cDNA bằng bộ thuốc thử PrimeScript™ RT (TaKaRa, Tokyo, Nhật Bản) theo giao thức của nhà sản xuất. Cuối cùng, qRT-PCR của bốn gen tổng hợp diệp lục, cụ thể là Magnesium chelatase D subunit ( CHLD ), Chlorophyll synthase ( CHLG ), Magnesium-protoporphyrin IX methyltransferase ( CHLM ) và Chlorophyllide a oxygenase ( CAO ), đã được thực hiện. ACT2 (actin-2, LOC4349087) [ 3 ] của cây lúa được sử dụng làm tài liệu tham khảo nội bộ. Các cặp mồi được sử dụng trong phân tích qRT-PCR của CHLD , CHLG , CHLM và CAO đã được trình bày chi tiết trong một nghiên cứu trước đây [ 33 ]. Thí nghiệm qRT-PCR được thực hiện bằng Hệ thống PCR thời gian thực Applied Biosystems 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Tóm lại, tổng thể tích phản ứng là 10 μL được chuẩn bị với 0,2 μM mồi xuôi và ngược, 5 μL SYBR Premix Ex Taq™ II (TaKaRa, Tokyo, Nhật Bản) và 1 μL cDNA khuôn. Chương trình khuếch đại như sau: biến tính ban đầu ở 95 °C trong 5 phút, 40 chu kỳ 10 giây ở 95 °C, 10 giây ở 60 °C và 20 giây ở 72 °C. Dữ liệu huỳnh quang đã được thu thập và mức độ biểu hiện tương đối của các gen này được tính bằng công thức 2 − △△Ct [ 43 ]. Trong phân tích qRT-PCR, các bản sao sinh học đã được đo ba lần.
2.7. Phân tích thống kê
Kết quả được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Sau khi kiểm tra tính chuẩn và tính đồng nhất, dữ liệu được đưa vào kiểm tra ANOVA một chiều trong phần mềm SPSS (Phiên bản 17.0) (SPSS, Chicago, IL, Hoa Kỳ). So sánh bội số Tukey’s honest significant difference (HSD) được sử dụng để tiến hành so sánh bội số. Mức ý nghĩa là p < 0,05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Tích lũy sinh khối của cây lúa giống
Sau bảy ngày, cây con tiếp xúc với CuO NP cho thấy những thay đổi về kiểu hình so với cây đối chứng ( Hình 1 A). Cụ thể, rễ và chồi ngắn hơn so với đối chứng, cho thấy CuO NP có độc đối với cây lúa, ngay cả ở nồng độ thấp 62,5 mg/L. Kết quả thống kê cho thấy CuO NP 62,5, 125 và 250 mg/L làm giảm trọng lượng rễ lúa lần lượt là 31,1%, 67,2% và 73,5% so với đối chứng ( p < 0,05) ( Hình 1 B). Ngoài ra, trọng lượng lá lúa được xử lý bằng CuO NP 62,5, 125 và 250 mg/L thấp hơn lần lượt là 38,4%, 62,7% và 72,8% so với đối chứng ( p < 0,05), cho thấy độc tính thực vật của CuO NP ở cây lúa phụ thuộc vào liều lượng. Thực tế, cách thức gây độc thực vật phụ thuộc vào liều lượng như vậy cũng đã được báo cáo ở nhiều loại thực vật khác nhau, ví dụ, Schoenoplectus tabernaemontani [ 27 ], Hordeum vulgare L. [ 28 ], lúa mì [ 44 ] và gạo [ 30 ].
Hình 1: Tác động của CuO NP lên sự phát triển của cây lúa giống. ( A ) Kiểu hình của cây lúa giống; ( B ) Trọng lượng tươi của rễ và lá lúa tiếp xúc với 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP, dịch nổi từ huyền phù CuO NP 250 mg/L và không có CuO NP, trong 7 ngày. Các thanh biểu thị giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu ba lần. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình của các phương pháp xử lý ( p < 0,05, Tukey-HSD).
Độc tính của Cu2 + ở mức cao trong thực vật đã được báo cáo trước đây [ 45 , 46 ]. Người ta đã phát hiện ra rằng CuO NP có thể giải phóng ion Cu trong dung dịch nước [ 47 , 48 ], đây có thể là một yếu tố gây ra độc tính của CuO NP trong thực vật. Trong nghiên cứu này, những cây được xử lý bằng chất lỏng trong suốt từ hỗn dịch CuO NP 250 mg/L không cho thấy bất kỳ thay đổi kiểu hình và thay đổi nào đáng kể về trọng lượng tươi của cây lúa so với đối chứng. Shi et al. [ 29 ] đã báo cáo rằng hỗn dịch CuO NP có thể giải phóng 0,16 mg/L Cu2 + , không đủ để dẫn đến độc tính thực vật của CuO NP ở Landoltia punctata . Zhang et al. [ 27 ] cũng chỉ ra rằng nồng độ 0,06 mg/L, mức được giải phóng từ hỗn dịch CuO NP, không ảnh hưởng đến sự phát triển của Schoenoplectus tabernaemontani . Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy Cu 2+ được giải phóng (0,11 ± 0,04 mg·L −1 ) của 2000 mg/L CuO NP không cho thấy tác dụng ức chế đáng kể nào đối với sự phát triển rễ của cả ngô và lúa [ 32 ]. Do đó, những kết quả này cho thấy rằng việc giải phóng Cu 2+ có thể không phải là lý do chính gây ra độc tính thực vật do CuO NP gây ra.
3.2. Tính toàn vẹn của hệ thống màng tế bào lúa
Trong điều kiện bất lợi, thực vật có thể sản xuất ra các loài oxy phản ứng (ROS) có thể gây tổn hại đến các đại phân tử sinh học và hệ thống màng tế bào [ 26 ]. Như thể hiện trong Hình 2A , 125 và 250 mg/L CuO NP làm tăng đáng kể hàm lượng MDA của thân lúa lần lượt là 69,7% và 83,4% so với cây không tiếp xúc (đối chứng) ( p < 0,05). Tương ứng, mức độ dẫn điện trong lá lúa được xử lý bằng 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP cũng tăng lần lượt là 14,6%, 42,7% và 67,0% so với đối chứng ( p < 0,05) ( Hình 2B ).
Hình 2 Tác động của CuO NP lên tính toàn vẹn của hệ thống màng tế bào cây lúa giống. ( A ) Hàm lượng MDA; ( B ) độ dẫn điện của cây lúa giống tiếp xúc với 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP, dịch nổi từ huyền phù CuO NP 250 mg/L và không có CuO NP trong 7 ngày. Các thanh biểu thị giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu ba lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình của các phương pháp xử lý ( p < 0,05, Tukey-HSD).
Mặt khác, hàm lượng MDA tương đối cao hơn ở rễ lúa tiếp xúc với 125 và 250 mg/L CuO NP. Các nghiên cứu trước đây cũng phát hiện ra sự suy giảm tính toàn vẹn của màng tế bào chất do CuO NP gây ra ở các loài thực vật khác, ví dụ như Arabidopsis Thaliana [ 49 ] và Hordeum vulgare L. [ 28 ]. Shaw và Hossain cũng báo cáo rằng hàm lượng MDA tăng đáng kể trong lá lúa tiếp xúc với CuO NP trong cả 7 và 14 ngày [ 30 ]. Chỉ có 125 mg/L CuO NP làm giảm đáng kể độ dẫn điện của rễ lúa 6,5% (0,70 ± 0,01) so với nhóm đối chứng (0,75 ± 0,02), trong khi độ dẫn điện cho thấy những thay đổi không đáng kể ở rễ lúa tiếp xúc với 62,5 (0,72 ± 0,02) và 250 mg/L (0,72 ± 0,01) CuO NP. Do đó, người ta cho rằng rễ lúa có thể đã tạo ra một hệ thống phòng thủ để duy trì sự cân bằng ion bên trong và bên ngoài tế bào.
3.3. Hoạt động của Enzym chống oxy hóa của Cây lúa giống
Sự phá hủy tính toàn vẹn của hệ thống màng tế bào lúa có thể là do sự gia tăng các loài oxy phản ứng trong quá trình xử lý CuO NP. Như thể hiện trong Hình 3A , 125 và 250 mg/L CuO NP làm giảm đáng kể hoạt động CAT của lá lúa lần lượt là 73,9% (94,84 ± 53,17) và 75,0% (90,71 ± 34,39), so với cây không tiếp xúc (363,18 ± 39,44) ( p < 0,05). Chỉ có nồng độ cao 250 mg/L CuO NP mới làm giảm đáng kể hoạt động POD của lá lúa 32,3% (27,57 ± 0,69), trong khi 62,5 (33,45 ± 0,85) và 125 mg/L (29,72 ± 4,13) CuO NP không cho thấy thay đổi đáng kể nào so với đối chứng ( Hình 3 C), cho thấy rằng lá lúa có thể có các hệ thống phòng thủ tích cực khác để bảo vệ chúng khỏi stress oxy hóa do ROS trung gian. Ngoài ra, những thay đổi không đáng kể đã được tìm thấy trong các hoạt động CAT và POD giữa rễ tiếp xúc với CuO NP và rễ đối chứng ( Hình 3 A, C). Hoạt động SOD cho thấy xu hướng khác nhau so với hoạt động CAT và POD ở cây lúa con. Như thể hiện trong Hình 3 B, hoạt động SOD tăng đáng kể 166% ( p < 0,05) ở rễ lúa được xử lý bằng 125 mg/L CuO NP, nhưng không thấy thay đổi nào ở lá lúa. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, nhiều yếu tố đã được đề xuất là cơ chế tiềm ẩn của CuO NP gây độc tính thực vật, ví dụ, tổn thương DNA, các ion kim loại giải phóng từ NP, tạo ra ROS và stress oxy hóa [ 21 ]. Trong số đó, stress oxy hóa đã thu hút được sự chú ý đáng kể [ 28 , 30 ]. Để bảo vệ bản thân khỏi tác hại của H 2 O 2 dư thừa , thực vật thường kích hoạt hệ thống phòng thủ của chúng, bao gồm các cách bằng enzym (CAT, POD, v.v.) và không bằng enzym (cytochrome f , proline, carotenoid, v.v.) [ 50 ]. Là các enzym chống oxy hóa quan trọng, SOD có thể xúc tác O 2− thành H 2 O 2 , trong khi CAT và POD có thể xúc tác H 2 O 2 thành H 2 O [ 51 ]. Hoạt động SOD ngày càng tăng ở rễ lúa tiếp xúc với CuO NP cho thấy rằng cây lúa có thể tạo ra một lượng đáng kể ROS. Tuy nhiên, không có thay đổi nào trong hoạt động của CAT và POD ở rễ lúa tiếp xúc với CuO NP. Kết quả này có thể được giải thích là do lượng H 2 O 2 dư thừa trong rễ lúa vượt quá khả năng xúc tác tối đa của CAT và POD.
Hình 3 Tác động của CuO NP tiếp xúc với hoạt động của enzyme chống oxy hóa. ( A ) CAT; ( B ) SOD và ( C ) POD là các hoạt động trong rễ và chồi của cây lúa giống tiếp xúc với 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP, dịch nổi từ hỗn dịch CuO NP 250 mg/L và không xử lý trong 7 ngày. Các thanh biểu thị giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu ba lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình của các phương pháp xử lý ( p < 0,05, Tukey-HSD).
3.4. Hàm lượng diệp lục và carotenoid trong lá lúa
Lá lúa tiếp xúc với nồng độ hạt nano CuO tăng dần dần chuyển sang màu vàng ( Hình 1 A). Chiết xuất diệp lục và carotenoid từ lá lúa tiếp xúc cũng biểu hiện màu sắc khác nhau so với nhóm đối chứng và cây được xử lý bằng dịch nổi từ hỗn dịch hạt nano CuO 62,5 đến 250 mg/L ( Hình 4 A). Hàm lượng diệp lục a (Chl- a ) trong lá lúa được xử lý bằng hạt nano CuO 125 và 250 mg/L giảm đáng kể lần lượt là 53,5% và 70,4%, trong khi hàm lượng diệp lục b (Chl- b ) thấp hơn lần lượt là 54,8% và 64,7% so với nhóm đối chứng ( p < 0,05) ( Hình 4 B, C). Hàm lượng diệp lục tổng thể hiện cùng một kiểu như cả Chl- a và Chl- b ( Hình 4 D). Hàm lượng carotenoid giảm đáng kể lần lượt là 24,1%, 52,5% và 59,7% ở lá lúa tiếp xúc với hạt nano CuO 62,5, 125 và 250 mg/L ( p < 0,05) ( Hình 4 E). Năng suất quang hợp và hàm lượng Chl- a và Chl- b được coi là những chỉ số quan trọng trong việc đánh giá độc tính thực vật của hạt nano, ví dụ như hạt nano Ag [ 52 ] và hạt nano ZnO [ 1 , 33 ]. Shaw và cộng sự cũng báo cáo rằng Hordeum vulgare L. khi tiếp xúc với hạt nano CuO 0,5, 1,0 và 1,5 mM trong 20 ngày đã làm giảm đáng kể hàm lượng diệp lục [ 28 ]. Phù hợp với các báo cáo này, hàm lượng diệp lục cũng giảm ở lá lúa tiếp xúc với hạt nano CuO trong nghiên cứu của chúng tôi. Hơn nữa, quá trình quang hợp ở cây lúa con bị hạn chế và sự phát triển của cây bị ức chế.
Hình 4 Tác động của CuO NP lên hàm lượng diệp lục và carotenoid trong lá lúa. ( A ) Ảnh dung dịch chiết xuất diệp lục của lá lúa 21 ngày tuổi được xử lý bằng 0, 62,5, 125, 250 mg/L CuO NP và dịch chiết từ 250 mg/L CuO NP (từ trái sang phải); ( B ) Hàm lượng Chl-a; ( C ) Hàm lượng Chl-b; ( D ) Hàm lượng diệp lục tổng số; ( E ) Hàm lượng carotenoid. Các thanh biểu thị giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu ba lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình của các phương pháp xử lý ( p < 0,05, Tukey-HSD).
3.5. Tổng hợp diệp lục và caroten trong lá lúa
Bốn gen sinh tổng hợp diệp lục, cụ thể là CHLD , CHLG , CHLM và CAO , được phát hiện là tăng đáng kể theo các độ lớn khác nhau của CuO NP ở mức 62,5, 125 và 250 mg/L. Cụ thể, CuO NP 125 mg/L biểu hiện sự thay đổi tối đa, với mức độ gen CHLD , CHLG , CHLM và CAO tăng lần lượt là 5,18, 2,39, 4,02 và 2,25 lần so với đối chứng ( p < 0,05) ( Hình 5 ). Mặc dù hàm lượng diệp lục trong lá lúa được xử lý bằng CuO NP 250 mg/L ít hơn đáng kể so với lá được xử lý bằng CuO NP 125 mg/L, nhưng mức độ của bốn gen này ở cây được xử lý bằng CuO NP 250 mg/L khá giống với mức độ được xử lý bằng CuO NP 125 mg/L. Ngoài ra, mức độ gen CHLD , CHLG , CHLM và CAO ở cây được xử lý bằng dịch chiết 250 mg/L CuO NP cũng tăng 2,72, 1,74, 3,62 và 1,73 lần so với đối chứng. Mẫu hình khác biệt như vậy về hàm lượng diệp lục và mức độ biểu hiện cho thấy những cây lúa giống tiếp xúc với CuO NP có thể điều chỉnh biểu hiện của một số gen để thích nghi với môi trường bị căng thẳng.
Hình 5 Tác động của CuO NP lên gen tổng hợp Diệp lục trong lá lúa được xử lý bằng 0, 62,5, 125, 250 mg/L CuO NP hoặc dịch nổi của 250 mg/L CuO NP. Các thanh biểu thị giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu ba lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trung bình của các phương pháp xử lý ( p < 0,05, Tukey-HSD).
4. Kết luận
Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của CuO NP lên cây lúa bằng cách ước tính những thay đổi về kiểu hình và các phản ứng sinh lý có liên quan. Kết quả chỉ ra rằng 62,5, 125 và 250 mg/L CuO NP lơ lửng trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có thể ức chế đáng kể sự phát triển của cây lúa và hàm lượng diệp lục. Tổn thương oxy hóa cũng được thấy ở các chồi lúa tiếp xúc với CuO NP, và hàm lượng MDA và độ dẫn điện được điều chỉnh tăng đáng kể so với đối chứng. Hoạt động của SOD cũng lớn hơn ở rễ lúa tiếp xúc với 125 mg/L CuO NP. Hàm lượng diệp lục, bao gồm Chl- a và Chl- b , và carotenoid giảm, trong khi bốn gen tổng hợp diệp lục, cụ thể là CHLD , CHLG , CHLM và CAO , tăng đáng kể. Nhìn chung, những phát hiện trong nghiên cứu này có thể cung cấp bằng chứng cho việc đánh giá rủi ro và hướng dẫn các ứng dụng của CuO NP trong nông nghiệp. Tuy nhiên, độc tính ở cây lúa giống thu được do tiếp xúc ngắn hạn với nồng độ CuO NP cao, có thể không tồn tại trong môi trường tự nhiên. Tác động tiềm tàng của việc tiếp xúc lâu dài với CuO NP ở nồng độ thấp đối với cây ăn được và sự tích tụ sinh học của chúng trong các phần ăn được cần được nghiên cứu thêm.
Nguồn: