Nano kẽm oxit (ZnO-NP) diệt nấm hồng Erythricium salmonicolor gây hại cà phê

Trong công trình này, một phương pháp tổng hợp đã được thiết kế để thu được các hạt nano kẽm oxit (ZnO NP) một cách có kiểm soát và có thể tái tạo. Các hạt nano thu được được xác định đặc điểm bằng cách sử dụng quang phổ hồng ngoại, nhiễu xạ tia X và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Ngoài ra, chúng tôi đã xác định khả năng chống nấm trong ống nghiệm của các hạt nano oxit kẽm được tổng hợp, kiểm tra tác động của chúng trên Erythricium salmonicolornhân quả bệnh hại hồng. Để xác định ảnh hưởng của lượng tiền chất kẽm được sử dụng trong quá trình tổng hợp nano kẽm oxit đến khả năng chống nấm, nồng độ kẽm axetat 0,1 và 0,15 M đã được kiểm tra. Để nghiên cứu sự bất hoạt của sự phát triển của sợi nấm, các nồng độ khác nhau của ZnO NP của hai loại mẫu tổng hợp đã được sử dụng. Tác dụng ức chế sự phát triển của nấm được xác định bằng cách đo diện tích sinh trưởng như một hàm số của thời gian. Sự thay đổi hình thái được quan sát bằng kính hiển vi quang học có độ phân giải cao (HROM), trong khi TEM được sử dụng để quan sát những thay đổi trong siêu cấu trúc của nó. Các kết quả cho thấy rằng nồng độ 9 mmol L ⁻¹ đối với mẫu thu được từ hệ thống 0,15 M và ở 12 mmol L ⁻¹ đối với hệ thống 0,1 M đã ức chế đáng kể sự phát triển của E. salmonicolor . Trong các hình ảnh HROM, một sự biến dạng đã được quan sát thấy trong mô hình tăng trưởng: sự mỏng đi đáng kể của các sợi của sợi nấm và xu hướng kết khối. Hình ảnh TEM cho thấy sự hóa lỏng của thành phần tế bào chất, làm cho nó trở nên ít mật độ điện tử hơn, với sự hiện diện của một số không bào và sự tách rời đáng kể của thành tế bào.

(Bản quyền thuộc NanoCMM Technology)

Giới thiệu

Kẽm oxit (ZnO) là một trong những hợp chất vô cơ có tầm quan trọng khoa học và công nghệ lớn nhất (Klingshirn 2007a , b ; Özgür et al. 2005 ; Pearton et al. 2005 ), một điều kiện liên tục được củng cố bằng cách mở ra các công nghệ mới, nơi chức năng của ZnO có thể đảm nhận những vai trò thú vị hơn bao giờ hết (Moezzi và cộng sự 2012 ) do tính chất quang học của nó (Djurišić và Leung 2006 ; Jagadish và Pearton 2011 ; Klingshirn và cộng sự 2010 ; Morkoç và Özgür 2008 ), bản chất bán dẫn của nó (Janotti và Van de Walle 2009 ; Klingshirn và cộng sự 2010; Morkoç và Özgür 2008 ), và các đặc tính bề mặt hóa lý (Wöll 2007 ). ZnO là chất bán dẫn có độ rộng vùng cấm trực tiếp (Vogel và cộng sự 1995 ) với giá trị năng lượng thực nghiệm là 3,37 eV. Do độ rộng vùng cấm rộng và năng lượng liên kết exciton lớn 60 meV ở nhiệt độ phòng, oxit này rất hấp dẫn đối với các ứng dụng như thiết bị quang điện tử và sử dụng làm vật liệu phân hủy quang học. Dựa trên các đặc điểm được đề cập và các đặc tính khác được chỉ ra và mô tả đầy đủ trong tài liệu (Jagadish và Pearton 2011 ; Klingshirn và cộng sự 2010 ; Moezzi và cộng sự 2012 ; Morkoç và Özgür 2008), các ứng dụng công nghệ của ZnO là vô cùng rộng rãi và đa dạng, nổi bật với khối lượng sử dụng như một thành phần quang dẫn (Blakeslee và cộng sự. 1962 ), như một chất hoạt hóa trong quá trình lưu hóa cao su trong công nghiệp (Nieuwenhuizen 2001 ), và trong các chất màu và chất phủ (Auer và cộng sự 1998 ), trong số những chất khác. Vì ZnO thường được xếp vào danh mục vật liệu không độc hại (Patnaik 2003 ), nó được sử dụng trong nhiều loại sản phẩm mỹ phẩm, bao gồm kem dưỡng ẩm, sản phẩm môi, cơ sở trang điểm khoáng, phấn phủ mặt, thuốc mỡ, kem dưỡng da và kem dưỡng da tay ( Nohynek và cộng sự 2007). Việc sản xuất các hạt nano và cấu trúc nano nói chung đã dẫn đến sự quan tâm ngày càng tăng đối với ZnO, có tính đến việc sử dụng tiềm năng trong các lĩnh vực như xử lý môi trường (Kisch 2015 ; Lead và Smith 2009 ; Lu và Pichat 2013 ).

Về việc sản xuất ZnO, oxit đã được tổng hợp bằng nhiều phương pháp (Kołodziejczak-Radzimska và Jesionowski 2014 ), bao gồm các phương pháp sau: kết tủa (Rodríguez-Páez và cộng sự 2001 ); Phức hợp polyme pechini ( Avila và cộng sự 2004 ), đốt cháy (Guo và Peng 2015 ), sol – gel (Alwan và cộng sự 2015 ); thủy nhiệt (Hardy et al. 2009 ), cơ khí hóa (Anand et al. 2014 ), hydro / solvo-nhiệt (Yan và Chuan-Shang 2009 ), và quá trình polyol (Dakhlaoui et al. 2009 ), trong số những quy trình khác.

Do kích thước nano của chúng, các hình thái khác nhau mà chúng có thể có và diện tích bề mặt riêng cao, các hạt nano cho thấy khả năng phản ứng hóa học cao, khả năng hấp phụ bề mặt cao và điện tích bề mặt cao. Đây là những yếu tố cho phép chúng tương tác rất hiệu quả với các hệ thống sinh học, gây ra độc tính đáng kể (Cassaignon và Colbeau 2013 ; Kahru và Dubourguier 2010 ; Ray và cộng sự 2009). Mặc dù đã đạt được nhiều tiến bộ trong việc tìm hiểu các tác động độc hại và môi trường — cả trực tiếp và gián tiếp — được tạo ra bởi sự tương tác với các hạt nano, chủ đề này vẫn chưa được khám phá đầy đủ. Các nguyên tắc chung yêu cầu được rút ra từ các nghiên cứu điển hình (từ các ví dụ có liên quan, môi trường) để xác định hành vi của các hạt nano cũng như các hiệu ứng sinh học của chúng (Cassaignon và Colbeau 2013 ; Houdy và cộng sự 2011 ; Rahman và cộng sự 2013 ).

Hiện đang có mối quan tâm lớn về mặt khoa học và công nghệ đối với các hạt nano và oxit kim loại, bao gồm cả ZnO (Bréchignac et al. 2007 ; Klabunde và Richards 2009 ). Kiến thức về các tác dụng sinh học của chúng đã tạo ra rất nhiều sự quan tâm, dẫn đến cái tên đặc biệt là “nanotoxicology”, một thuật ngữ được đặt ra vào năm 2005 bởi Oberdörster et al. ( 2005 ). Nhiều bài báo đã được xuất bản và các tổng hợp rất toàn diện về chủ đề này (Bréchignac et al. 2007 ; Zucolotto et al. 2013 ). Xem xét độc tính của chúng, việc sử dụng tiềm năng của các hạt nano để kiểm soát nấm phytopathogenic đã tạo ra sự quan tâm lớn (Ram và cộng sự 2011 ; Zucolotto và cộng sự. 2013), được thúc đẩy bởi các nghiên cứu trước đây cho thấy hoạt động chống nấm hiệu quả của các vật liệu hạt nano khác nhau bao gồm bạc (Kumar và cộng sự 2008 ), đồng (Cioffi và cộng sự 2005 ; León và cộng sự 2011 ), titanium dioxide (Maneerat và Hayata 2006 ), và oxit kẽm (Lipovsky et al. 2011 ). Cụ thể, khi làm việc trong các hệ thống nước hoặc những hệ thống mà trong đó có thể hòa tan các NP ZnO và do đó tạo ra Zn ²⁺ trong môi trường, hai hiệu ứng được xem xét khi phân tích độc tính của ZnO: hiệu ứng thứ nhất phụ thuộc vào hạt và hiệu ứng thứ hai được thúc đẩy bởi Zn ²⁺ hòa tan , các cơ chế sẽ có các phương thức hoạt động khác nhau, như được chứng minh bởi Poynton và cộng sự. (2010 ) làm việc với D. magna . Các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các NP ZnO và do đó, sự đóng góp của các ion Zn ²⁺ vào độc tính oxit là sự hiện diện của một số anion Cl ^– và SO ₄ ²⁻ chẳng hạn (Ma và cộng sự 2013 ), nhiệt độ ( Reed và cộng sự 2012 ), sự hiện diện của vật liệu hữu cơ (Miao và cộng sự 2010 ) – rất quan trọng đối với nghiên cứu hiện tại – và sự hiện diện của photphat trong môi trường, như Mingua và cộng sự đã chỉ ra. ( 2010 ) và Reed et al. ( 2012 ) trong các nghiên cứu của họ.

Mặc dù không có sự nhất trí về cơ chế chính xác tạo ra độc tính do các NP ZnO gây ra, nhưng quan điểm được chấp nhận nhiều nhất là loại độc tính này thường do ROS trung gian sẽ được tạo ra trên bề mặt của hạt. Các loài này có thể xuất hiện do các đặc tính điện tử của vật liệu bán dẫn và / hoặc khả năng của các NP ZnO để phá vỡ các quá trình truyền điện tử trong các hệ thống sinh học, có thể xảy ra ở màng trong của ty thể (Xia và cộng sự 2008 ), chẳng hạn như như phản ứng của bề mặt các NP ZnO với nước, tạo ra các gốc hydroxyl (OH.) (Sapkota và cộng sự 2011 ) hoặc H ₂ O ₂ (Sawai và cộng sự 1998 ).

Hơn nữa, các cơ chế khác nhau nên được đưa ra đối với các loại nấm khác nhau, như được minh họa trong nghiên cứu về Botrytis cinerea và Penicillium expansum bằng phương pháp quang phổ Raman. Trong nghiên cứu này (He et al. 2011 ), các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong phổ Raman tương ứng với nấm B. cinerea , cường độ của các dải liên kết với axit nucleic và carbohydrate tăng lên đáng kể khi được xử lý bằng ZnO NPs, trong khi điều này không xảy ra với các dải của protein và lipid. Sharma và cộng sự. ( 2010 ) đã nghiên cứu các đặc tính chống nấm của các hạt nano ZnO, được tổng hợp có và không sử dụng chất hoạt động bề mặt, trong các điều kiện phản ứng khác nhau, trên các chủng Fusariumsp. Hoạt tính chống nấm của các VQG này được so sánh với nấm được xử lý chống nấm truyền thống bằng cách sử dụng sunphat đồng. Các kết quả chỉ ra rằng hoạt tính chống nấm của các NP ZnO phụ thuộc vào nồng độ và kích thước của NP. Đặc tính thứ hai được xác định bởi các điều kiện phản ứng khác nhau được sử dụng trong quá trình tổng hợp chúng. Ông và cộng sự. ( 2011 ) sau đó đã thử nghiệm tác dụng chống nấm của các NP ZnO và phương thức hoạt động của chúng trên hai loại nấm gây bệnh sau thu hoạch: Botrytis cinerea và Penicillium expansum . Kết quả thu được cho thấy ở nồng độ trên 3 mmol L ⁻¹, sự phát triển của các mầm bệnh này đã bị ức chế đáng kể. Hơn nữa, các phát hiện chỉ ra rằng hoạt tính kháng nấm của các NP ZnO là khác nhau đối với B. cinerea và P. expansum , vì trong trường hợp đầu tiên, sự phát triển bị ức chế vì các hạt nano ảnh hưởng trực tiếp đến các chức năng tế bào, gây ra sự biến dạng trong sợi nấm, trong khi ở P. expansum không có sự phát triển của tế bào đồng bào và tế bào bào tử, điều này cuối cùng dẫn đến cái chết của sợi nấm.

Dựa trên tất cả những gì đã nêu ở trên và khả năng chống nấm của các hạt ZnO, công trình này nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano này đối với một loại nấm ảnh hưởng đến cây cà phê: E. salmonicolor . Về mặt hoạt động thương mại, cà phê là một sản phẩm có tầm quan trọng kinh tế lớn đối với Brazil, Việt Nam, Colombia, Indonesia, Ethiopia, Peru, Ấn Độ, Honduras, Mexico và Costa Rica, cùng những nước khác. Các quốc gia này là những nước sản xuất chính, với sản lượng toàn cầu hàng năm khoảng 6,3 triệu tấn mỗi năm (Parras et al. 2007 ). Tại Colombia, nhà sản xuất lớn thứ ba trên thế giới, cà phê ( Coffea arabica L.) là nguồn tài nguyên quan trọng thứ hai sau dầu mỏ, với sản lượng đạt 10,9 triệu bao (FNC 2014), làm cho nó trở thành một nguồn lực quan trọng cho tăng trưởng kinh tế và phát triển công nghiệp (Naranjo et al. 2011 ). Trong khi đó, nấm, bao gồm cả E. salmonicolor , là nguyên nhân chính gây ra một số bệnh do thực vật gây ra (Galvis-García 2002 ) có thể tồn tại trong các đồn điền cà phê, làm giảm nghiêm trọng năng suất cây trồng và đôi khi có thể phá hủy toàn bộ vụ thu hoạch (Rodríguez 2001 ) . E. salmonicolor là nguyên nhân gây ra căn bệnh được gọi là “bệnh hồng” làm vàng và héo lá, thân và quả, dẫn đến chết cây (Galvis-García 2002). Để giải quyết vấn đề này, cần có nghiên cứu về các giải pháp thay thế kháng nấm mới, ví dụ có tính đến việc sử dụng công nghệ nano, cụ thể là các hạt nano, cho phép kiểm soát hóa lý của nấm mà không làm thay đổi thu hoạch cuối cùng.

Trong bài báo này, các hạt nano kẽm oxit được tổng hợp bằng một con đường hóa học và hiển thị các đặc điểm nhất định được xác định bởi các điều kiện tổng hợp. Các nano kẽm oxit đã được sử dụng để thực hiện một nghiên cứu in vitro có hệ thống, xem xét một số nồng độ khác nhau để xác định tác dụng kháng nấm đối với vi khuẩn E. salmonicolor . Nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của các thông số tổng hợp khác nhau, bao gồm cả nồng độ ban đầu của tiền chất, đến khả năng diệt nấm của ZnO hạt nano.

quy trình thí nghiệm

Tổng hợp các hạt nano kẽm oxit

Để tổng hợp các hạt nano ZnO, phương pháp sol-gel đã được sử dụng. Đối với điều này, 13,1694 g kẽm axetat di-hydrat ((CH ₃ COO) ₂ · Zn · 2H ₂ O — Merck) được sử dụng làm tiền chất, và 0,07289 g chất hoạt động bề mặt, cetyltrimetyl amoni bromua (((C ₁₆ H ₃₃ ) N (CH3) ₃) Br — Merck), được sử dụng để kiểm soát sự phát triển của các hạt. Để tạo thuận lợi cho quá trình tạo mầm của pha rắn, bằng phản ứng thủy phân và phản ứng ngưng tụ, một dung dịch etanol phân tích (400 mL) đã được chuẩn bị ở nồng độ tiền chất [0,15 M] để phân tán lượng kẽm axetat đã chỉ ra trước đó, cùng với chất hoạt động bề mặt, và thiết lập độ pH làm việc của hệ thống (pH 8,5) bằng cách thêm từng giọt nước cất và amoni hydroxit (NH ₄ OH-Baker Analyzed) vào dung dịch. Hệ thống được làm nóng đến ~ 70 ° C và được duy trì trong điều kiện khuấy liên tục trong 6 giờ. Việc đình chỉ sau đó được phép kéo dài trong 3 ngày. Vào cuối giai đoạn này, huyền phù được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 30 phút, và sau khi làm khô mẫu được nung ở 450 ° C trong lò nung trong 2 giờ. Hình  1cho thấy sơ đồ tổng hợp được sử dụng trong công việc này để thu được ZnO-NP.

Hình 1. Quy trình tổng hợp được sử dụng để thu được ZnO-NP

Quy trình tương tự được thực hiện để thu được dung dịch [0,1 M], trong đó lượng kẽm thích hợp được hòa tan với chất hoạt động bề mặt trong 600 mL etanol phân tích. Tóm lại, các yếu tố sau được lấy làm biến số của quá trình tổng hợp: nồng độ của tiền chất và thể tích dung môi. Điều này tạo ra hai hệ thống được gọi là ZnO NP 0,15 / 400 (13,1694 g kẽm axetat di-hydrat trong 400 mL để tạo ra nồng độ [0,15 M]) và ZnO NP 0,1 / 600 (13,1694 g kẽm axetat di-hydrat trong 600 mL, cho nồng độ [0,1 M]).

Đặc điểm của các nano kẽm oxit được tổng hợp

Khi các mẫu được thu thập thông qua con đường tổng hợp được mô tả ở trên (Hình  1 ), chúng được đặc trưng bằng cách sử dụng, ví dụ: phổ IR, kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và nhiễu xạ tia X (XRD).

Quang phổ IR

Để xác định các nhóm chức khác nhau, mẫu cần phân tích được lấy bằng cách trộn KBr khô với chất rắn tổng hợp, ở nồng độ khoảng 10%. Quá trình quét được thực hiện trong khoảng từ 4000 đến 400 cm ^-1 bằng máy quang phổ Thermo Nicolet IR 200.

Kính hiển vi điện tử

Để xác định kích thước và hình thái của các hạt nano kẽm oxit được tổng hợp, chúng được lơ lửng trong 1 mL etanol và được đặt trong bể siêu âm trong 1 giờ. Sau đó, bằng pipet pasteur, một lượng nhỏ được lấy và lắng trên lưới niken trước đó đã phủ màng formvar để quan sát trong kính hiển vi điện tử truyền qua Jeol model JEM 1200 EX.

Nhiễu xạ tia X

Để xác định các pha tinh thể có trong các mẫu rắn, người ta thu được các mẫu nhiễu xạ tia X của các mẫu quan tâm ở dạng bột. Chúng được ghi lại bằng máy đo nhiễu xạ D8 ADVANCE kiểu Bruker sử dụng bức xạ Kα từ Cu (λ = 1,542 Å) trong khoảng 10–70 trong 2 θ .

Sự nhân lên của chủng vi nấm E. salmonicolor trong phòng thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn E. salmonicolor được tặng bởi Trung tâm Nghiên cứu Cà phê Quốc gia (Cenicafe) ở Chinchina, Caldas, Colombia. Các chủng này được nhân rộng và phát triển trong môi trường nuôi cấy, cơ sở thạch dextrose khoai tây (PDA) + oxytetracycline. Môi trường được hấp tiệt trùng ở 121 ° C và sau đó, trong tủ hút dòng chảy tầng, chúng được đổ vào đĩa petri vô trùng, sử dụng 20 mL cho mỗi đĩa. Cuối cùng, chúng được ủ trong 3 ngày ở 25 ° C, để đảm bảo vô trùng, theo khuyến nghị của quy trình cho loại thử nghiệm này (Lane et al. 2012 ). Khi kết thúc quá trình ủ 3 ngày, tiến hành gieo hạt, cấy một đĩa sợi nấm có đường kính 1,5 cm vào chính giữa mỗi đĩa petri và các chủng này sau đó được ủ để đảm bảo sinh trưởng (khoảng 16 ngày) trong điều kiện phòng thí nghiệm (25 ° C).

Các loại nấm được duy trì bằng cách sử dụng kỹ thuật trồng lại định kỳ cho phép các nền văn hóa tồn tại trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này dựa trên việc chuyển sự phát triển từ môi trường khô hoặc cũ sang môi trường tươi, tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm. Bằng cách này, tránh được nguy cơ ô nhiễm cao và sự biến đổi các đặc tính của các chủng, vốn thể hiện những nhược điểm chính, sẽ tránh được (Aleman và cộng sự 2005 ).

Đánh giá tác dụng chống nấm của các nano kẽm oxit đối với sự phát triển in vitro của vi khuẩn E. salmonicolor

Chuẩn bị chế phẩm vi nấm và xét nghiệm sinh học trong môi trường nuôi cấy với nano kẽm oxit

Để xác định sự ức chế sự phát triển của sợi nấm đang nghiên cứu, có tính đến ảnh hưởng của các NP ZnO, môi trường nuôi cấy rắn đã được chuẩn bị cho chủng bằng phương pháp được đề cập trong “ Nhân rộng chủng nấm E. salmonicolor trong phòng thí nghiệm ” . Các nghiệm thức được đánh giá là (1) môi trường nuôi cấy không có xử lý (đối chứng); (2) môi trường nuôi cấy + oxyclorua đồng (23,41 mmol L ⁻¹ ) (thuốc diệt nấm); (3) môi trường nuôi cấy + ZnO NP (12 mmol L ⁻¹ ); (4) môi trường nuôi cấy + ZnO NP (9 mmol L ⁻¹ ); (5) môi trường nuôi cấy + ZnO NP (6 mmol L ⁻¹ ), và (6) môi trường nuôi cấy + ZnO NP (3 mmol L ⁻¹). Trong khi đó, điều quan trọng là phải làm rõ rằng thuốc diệt nấm, đồng oxyclorua (Cu ₂ (OH) ₃ Cl), đã được sử dụng làm “chất chuẩn” trong nghiên cứu, vì nó thường được sử dụng như một phương tiện phòng ngừa bệnh hồng (Galvis -García 2002 ).

Các nồng độ khác nhau của ZnO NP được thêm vào môi trường nuôi cấy và được xử lý siêu âm để đảm bảo sự phân tán của chúng trong môi trường; Sau đó, chúng được đổ vào đĩa petri, môi trường được để cho đông đặc, và cuối cùng, các hệ thống này được ủ trong 3 ngày (xem “ Kết quả và thảo luận ”).

Để đảm bảo tính đồng nhất và khả năng tái tạo trong quá trình gieo hạt, một loại nấm có tuổi đời 16 ngày đã được sử dụng, từ đó các mẫu được lấy bằng cách sử dụng một lỗ có đường kính 1,5 cm, để đảm bảo sự tồn tại của các cấu trúc sinh trưởng. Sau đó, các sợi nấm được cấy vào trung tâm của mỗi đĩa petri có xử lý. Để thu được kết quả đáng tin cậy, thí nghiệm đã được thực hiện ba lần.

Bảy ngày được phép trôi qua sau khi gieo hạt, để đảm bảo nấm phát triển đầy đủ và sau đó chụp ảnh các mẫu cấy 3 ngày một lần. Những hồ sơ này sau đó được đưa đến một hệ thống phân tích hình ảnh, “Image Analyzer pro” để đo diện tích phát triển của nấm trong đĩa Petri, tiếp tục cho đến ngày thứ 25, để quan sát hoạt động của các phương pháp xử lý theo thời gian.

Phần trăm (%) ức chế

Sự ức chế sự phát triển của sợi nấm được xác định dựa trên diện tích phát triển của nấm, được đo bằng cm ² và được biểu thị bằng phần trăm ức chế, một thông số được tính bằng công thức sau do Pandey et al đề xuất. ( 1982 ):

% Inhibition=(Growth of control−Growth of treatment)×100/ Growth of control

Xác định tổn thương hình thái và siêu cấu trúc của nấm bằng kính hiển vi quang học độ phân giải cao (HROM) và kính hiển vi điện tử (TEM)

Xử lý và chuẩn bị mẫu

Các mẫu E. salmonicolor, được sử dụng để phân tích siêu cấu trúc của sợi nấm, được xử lý theo các kỹ thuật tiêu chuẩn của quy trình TEM (Bozzola và Russell 1999 ). Các mẫu nấm nhỏ được cho vào lọ 1 mL, cố định qua đêm trong hỗn hợp 2,5% glutaraldehyde ở 4 ° C. Ngày hôm sau, bộ cố định được tháo ra và các mẫu được rửa ba lần bằng đệm photphat (PBS) trong 5 phút mỗi lần. Sau đó, chúng được cố định bằng 1% osmium tetroxide (OsO ₄ ) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và rửa lại bằng dung dịch đệm, ba lần trong cùng 5 phút mỗi lần.

Các mẫu sau cố định được khử nước bằng etanol theo các nồng độ tăng dần 30, 50, 70, 80, 90, 95 và 100%, được để trong mỗi nồng độ cồn trong 10 phút. Quá trình ngâm trước được thực hiện với hỗn hợp rượu và nhựa trắng LR theo tỷ lệ 3: 1, 1: 1 và 1: 3, hai tỷ lệ đầu tiên trong 45 phút mỗi tỷ lệ, và tỷ lệ cuối cùng trong 1 giờ.

Cuối cùng, các mẫu được đặt trong viên nang gelatin, dán nhãn, nhúng trong nhựa trắng LR, và được polyme hóa trong buồng UV ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Khi các mẫu đã được polyme hóa, các viên nang được lấy và khắc bằng dao để loại bỏ nhựa thừa và do đó thu được các phần bán mịn có kích thước 200–300 nm và các phần siêu mịn 40–60 nm. Các mặt cắt bán mịn và siêu mịn được lấy bằng dao thủy tinh với sự hỗ trợ của máy siêu nhỏ Leica, kiểu Ultracut R.

Kính hiển vi quang học độ phân giải cao

Dấu ấn.

Sử dụng băng keo trong, các mẫu được lấy trực tiếp từ môi trường nuôi cấy, chú ý đến tất cả các nghiệm thức và đối chứng tương ứng của chúng. Dấu ấn sau đó được đặt trên một lam kính, cùng với một giọt màu xanh lam Lactophenol. Sau đó chúng được quan sát bằng HROM (Nikon Microphot). Các hình ảnh quan tâm được ghi lại bằng Nikon Digital Sight DS-2Mv được kết nối với kính hiển vi, sử dụng chương trình “Nis Elements” để chụp ảnh.

Phân tích các mặt cắt mỏng.

Các phần bán mỏng có độ dày 200–300 nm được cố định, sử dụng nhiệt, trên các phiến kính bằng cách nhuộm màu xanh lam toluidine, đốt cháy đĩa và rửa bằng nước cất. Sau đó, chúng được quan sát trong kính hiển vi ánh sáng Microphot của Nikon sử dụng vật kính 40 × và 100 × để chọn vùng quan tâm nơi số lượng cấu trúc sợi nấm nhiều nhất được tìm thấy sắp xếp theo chiều ngang và dọc. Khu vực này đã được đánh dấu và chạm khắc lại để có được các phần siêu mỏng.

Kính hiển vi điện tử

Phân tích siêu cấu trúc và mô tả ảnh hưởng của các nano kẽm oxit lên mầm bệnh E. salmonicolor được thực hiện bằng cách quan sát các ảnh hiển vi được chụp ở các độ phóng đại khác nhau, sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua Jeol model JEM 1200 EX, hoạt động ở 80 kV (Bozzola và Russell 1999 ) .

Tương phản với uranyl axetat – xitrat chì.

Các phần siêu mỏng, dày 40-60 nm và có màu từ xám đến bạc, được đặt cùng nhau trên các lưới đồng có phủ màng formvar. Chúng được đối chiếu với 4% uranyl axetat trong 20 phút, sử dụng phương pháp tuyển nổi trong một buồng tối và ẩm. Các phần được rửa bằng giọt nước cất và sau đó được đặt tiếp xúc với một giọt chì citrat trong 10 phút trong một buồng ẩm có chứa các viên natri hydroxit (NaOH). Cuối cùng, các phần được rửa bằng nước cất, làm khô bằng giấy lọc, và được đặt vào ngăn chứa mẫu của TEM để quan sát (Bozzola và Russell 1999 ).

Phân tích thống kê

Một nghiên cứu thống kê được thực hiện trên dữ liệu liên quan đến khu vực phát triển của nấm (đo bằng cm ²), một tham số được ghi lại theo định kỳ. Để xác định xem liệu sự khác biệt quan sát được trong thông số này có ý nghĩa thống kê hay không, một thử nghiệm giả thuyết đã được tiến hành bằng cách sử dụng thiết kế các khối hoàn toàn ngẫu nhiên để so sánh bốn nồng độ của ZnO NP, một nồng độ của đồng oxychloride (thuốc diệt nấm đối chứng) và đối chứng, cấu thành các nghiệm thức được xem xét trong nghiên cứu (tổng cộng là 6), và trong bảy khối (ngày), hoạt động của các phương pháp điều trị theo thời gian đã được kiểm tra ở 7, 10, 13, 16, 19, 22 và 25 ngày. Tất cả dữ liệu đều được phân tích về sự phù hợp trong phân phối và tính đồng nhất của phương sai, và vì hai tiêu chí này đã được đáp ứng, thử nghiệm hai chiều ANOVA đã được sử dụng, được thực hiện trong BioEstat 5.3 (Zar 2014) chương trình; đồ họa được xây dựng bằng chương trình Graph Pad prism 5 (Lieber et al. 2006 ).

kết quả và thảo luận

Đặc điểm của các nano kẽm oxit được tổng hợp

Kính hiển vi điện tử

Đối với quá trình tổng hợp nano kẽm oxit, lượng tính bằng gam của tiền chất kẽm (Zn (CH ₃ COOH) ₂ ) và thể tích của dung môi (etanol) được lấy làm biến số, tức là nồng độ ban đầu của tiền chất được coi là một biến số. . Theo phương pháp được chỉ ra, các hạt nano được chỉ ra trong Hình  2 a đã được thu được, sử dụng nồng độ 0,15-M của tiền chất trong một thể tích 400 mL etanol; bột gốm này được gọi là ZnO NP 0,15 / 400.

Hình 2 Ảnh hiển vi của một ZnO NP 0,15 / 400 và b ZnO NP 0,1 / 600 được quan sát bằng TEM

Các hình ảnh trong Hình  2 a1 cho thấy các hạt nano được tổng hợp có hai dạng hình thái: (a) hình cầu và (b) dạng thấu kính, mặc dù nhìn kỹ hơn, trong Hình  2 a2, các kim được hình thành bởi sự tập hợp có trật tự. của các hạt nano kẽm oxit, một cơ chế tăng trưởng được tham khảo và nghiên cứu, bởi Bogush và Zukoski ( 1991 ). Kích thước của các hạt nano này nằm trong khoảng từ 20 đến 35 nm.

Trong khi đó, để tìm kiếm sự phân tán tốt hơn của các hạt nano, nồng độ của tiền chất đã được điều chỉnh, thành 0,1 M, tăng thể tích dung môi trong quá trình tổng hợp lên 600 mL và duy trì không đổi lượng chất hoạt động bề mặt được sử dụng; mẫu này được gọi là ZnO NP 0,1 / 600 và hình thái và kích thước hạt của nó được quan sát trong Hình  2 b. Ở đây, kích thước của các hạt nano nằm trong khoảng từ 30 đến 45 nm.

Cần lưu ý rằng trong quá trình quan sát bột nano kẽm oxit 0,1 / 600, sử dụng TEM, các điện tử trong chùm đã thúc đẩy các phản ứng khiến các hạt nano tự nhóm lại theo một cách cụ thể, như được minh họa trong Hình  2 b2, tạo ra “cụm” chứa một số lượng hữu hạn các hạt nano.

Bằng cách thay đổi các điều kiện tổng hợp, bột gốm thu được cho thấy một số khác biệt rõ rệt, bao gồm cả trạng thái kết tụ của chúng, như được minh họa trong Hình  2 : trong khi mẫu ZnO NP 0,15 / 400 tạo ra kết tụ mềm, các đám cứng hoặc kết tụ được nhìn thấy. với ZnO NP 0,1 / 600. Hơn nữa, màu sắc của các mẫu được tổng hợp cũng thay đổi tùy thuộc vào điều kiện tổng hợp (Hình  3 ), ZnO NP 0,15 / 400 có màu trắng với màu đậm hơn một chút (Hình  3 a), màu xám đối với ZnO NP / 0,1 600 (Hình  3b), một đặc điểm cho thấy cấu trúc khuyết tật trong chất rắn là khác nhau. Vì ZnO là chất rắn không phân cực, nó có thể được tìm thấy với nhiều màu sắc khác nhau bao gồm trắng, xanh lục nhạt, vàng nhạt, nâu, xám và thậm chí hồng, tùy thuộc vào nồng độ khuyết tật trong chất rắn, một điều kiện xác định lớn một phần bởi lượng oxy có trong cấu trúc tinh thể của nó (Greenwood và Earnshaw 1997 ).

Hình 3 Màu của bột ZnO NP thu được sau khi xử lý nhiệt; a ZnO NP 0,15 / 400 và b ZnO NP 0,1 / 600

Quang học hồng ngoại

Hình  4 cho thấy phổ IR thu được đối với các mẫu đang xét. Trong quang phổ, hiển nhiên là sự hiện diện của các nhóm hydroxyl trong dải ở ~ 3450 cm ⁻¹ và của các phân tử nước trong dải uốn ở ~ 1630 cm ⁻¹ , cũng như sự vắng mặt của các dải có thể liên kết với pha hữu cơ của chất rắn, mặc dù đã sử dụng các hợp chất hữu cơ trong quá trình tổng hợp các hạt nano kẽm oxit. Điều này chỉ ra rằng xử lý nhiệt ở 450 ° C có hiệu quả trong việc loại bỏ pha hữu cơ.

Hình 4 Phổ hồng ngoại đối với mẫu nano kẽm oxit 0,15 / 400 và b nano kẽm oxit 0,1 / 600

Vì mối quan tâm đặc biệt của nghiên cứu này nằm ở sự có mặt của các liên kết Zn – O và Zn – OH liên quan đến cation Zn ²⁺ và các dải của chúng chủ yếu được tìm thấy trong khoảng từ 1000 đến 400 cm ⁻¹ , vùng cụ thể này của phổ IR đã được sử dụng để phân tích sự khác biệt gây ra bởi những thay đổi trong các thông số tổng hợp (Hình  5 ).

Hình 5 Phổ IR từ 1200 đến 400 cm ⁻¹ đối với mẫu ZnO NP 0,15 / 400 và b ZnO NP 0,1 / 600

Phổ từ 1200 đến 400 cm ⁻¹ trong Hình  5 , tương ứng với hai chất rắn nano kẽm oxit quan tâm, cho thấy sự khác biệt rõ ràng về số lượng các dải và vị trí của chúng: trong khi đối với mẫu ZnO NP 0,15 / 400 có hai dải (Hình  5 a), một ở 450 cm ⁻¹ và một ở 500 cm ⁻¹ , cũng như vai ở 560 cm ⁻¹ , ZnO NP 0,1 / 600 cho thấy một dải đơn ở 450 cm ⁻¹ và một vai ở 500 cm ⁻¹ (Hình  5b). Sự khác biệt này trong phổ cho thấy rằng đã có những thay đổi trong môi trường của các nhóm chức Zn-O và Zn-OH, chủ yếu về số lượng và / hoặc sự sắp xếp của chúng, ở cấp độ bên trong và bề mặt của chất rắn, những thay đổi được thúc đẩy bởi các sửa đổi trong các tham số của tổng hợp (Socrates 2004 ). Điều này dường như cho thấy, với mối quan hệ cấu trúc-tính chất được thể hiện bởi vật liệu, rằng các mẫu có thể trải qua những thay đổi về đặc tính vật lý và hóa học của chúng.

Nhiễu xạ tia X

Hình  6 , cho thấy các đồ thị nhiễu xạ tương ứng với hai mẫu đang xét. Các pic xuất hiện ở đó tương ứng với ZnO (PDF 79-206), là pha tinh thể duy nhất có mặt và độ mảnh của pic cho thấy sự kết tinh tốt của các mẫu. Ngược lại với phổ IR trong Hình. 4 và 5 , trong các biểu đồ nhiễu xạ trong Hình  6 không có sự khác biệt rõ ràng giữa các phổ, cho thấy rằng không có sự thay đổi trong phạm vi dài trong cấu trúc của các mẫu. Điều này dẫn đến kết luận rằng những thay đổi quan sát được trong các mẫu, do sự biến đổi trong các thông số tổng hợp mang lại, thuộc loại cục bộ hơn, như được chỉ ra bởi quang phổ IR (Hình  4 , 5 ).

Hình 6 Đồ thị nhiễu xạ của tia X tương ứng với mẫu ZnO NP 0,15 / 400 và b ZnO NP 0,1 / 600

Sự nhân lên của vi nấm gây bệnh thực vật E. salmonicolor trong phòng thí nghiệm

Khi nấm phytopathogenic được cấy và cho phép phát triển trong môi trường nuôi cấy tương ứng của nó, người ta thấy rằng ở 16 ngày sự phát triển của nó là tối ưu. Kết quả này chứng tỏ rằng môi trường nuôi cấy, được chỉ ra trước đây, là thích hợp nhất cho sự phát triển của nó (Lane et al. 2012 ). Hơn nữa, cần lưu ý rằng đối với E. salmonicolor , việc sử dụng kháng sinh oxytetracycline, được sử dụng với số lượng 0,03 g / L, đã làm giảm nguy cơ nhiễm bẩn và độ tinh khiết nuôi cấy cho phép (Kuang-Ren và Tzeng 2009 ).

Phương pháp duy trì nấm được sử dụng trong nghiên cứu này là trồng lại định kỳ, một kỹ thuật đảm bảo sự sống sót tốt của các mẫu cấy trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, để các kết quả có độ tin cậy cao hơn, nên tìm các phương pháp khác để duy trì các chủng vi sinh vật, chẳng hạn như phương pháp được khuyến nghị bởi Aleman và cộng sự. ( 2005 ) và Huertas et al. ( 2006 ), nơi đảm bảo khả năng tồn tại, độ tinh khiết và tính ổn định di truyền của các nền văn hóa.

Đánh giá tác dụng kháng nấm của các NP ZnO đối với việc nuôi cấy vi khuẩn E. salmonicolor trong ống nghiệm

Sự phát triển của vi khuẩn E. salmonicolor trong hệ thống ZnO NP 0,15 / 400

Hình  7 so sánh đối chứng, xử lý bằng thuốc diệt nấm và xử lý nồng độ 9 mmol L ⁻¹ với ZnO NP 0,15 / 400. Hình ảnh cho thấy đặc điểm sinh trưởng vĩ mô của E. salmonicolor ở 16 ngày tuổi trên môi trường nuôi cấy dựa trên thạch dextrose khoai tây với oxytetracycline. Nhìn vào các bức ảnh, hiệu quả của việc xử lý nồng độ ZnO NPs này đối với việc ức chế sự phát triển của nấm là rõ ràng. Theo các kết quả này, ở 16 ngày, việc xử lý bằng thuốc diệt nấm không ức chế hoặc làm chậm sự phát triển của nấm, trong khi xử lý bằng ZnO NPs thì có. Kết quả của quan sát ban đầu này, những thay đổi về hình thái đã thể hiện rõ ở dạng, rìa, kết cấu và khu vực nấm phát triển.

Hình 7 Sự phát triển vĩ mô của nấm E. salmonicolor ở 16 ngày tuổi: đối chứng , b xử lý bằng thuốc diệt nấm và xử lý c với nồng độ 9 mmol L ^-1 của các hạt nano của hệ thống ZnO NP 0,15 / 400

Để xác định phần trăm ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. salmonicolor do xử lý với nano kẽm oxit ZnO NP 0,15 / 400, lấy thuốc kiểm soát và thuốc diệt nấm làm tài liệu tham khảo, người ta đã sử dụng phương pháp luận và phương trình được chỉ ra trong ” Phần trăm (%) ức chế ” ; kết quả thu được được thể hiện trong Bảng  1 . Các phép đo diện tích của nấm được thực hiện vào những ngày theo dõi được chỉ định và chúng được sử dụng để tính toán phần trăm ức chế, cho thấy rằng ZnO NP 0,15 / 400 gây ra tác động ức chế đáng kể đến sự phát triển của nấm khi so sánh với đối chứng (Bảng  1 ).

Bảng 1 Phần trăm (%) ức chế sự phát triển của sợi nấm của vi khuẩn E. salmonicolor khi sử dụng các hạt nano ZnO NP 0,15 / 400

Quan sát kết quả trong Bảng  1 , rõ ràng là phần trăm ức chế cao nhất được tìm thấy vào ngày thứ 10, với mức ức chế 84,9%, giảm dần theo thời gian cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Vào ngày 25, mức ức chế 64,3% đã đạt được. Điều này cho thấy rằng các NP ban đầu cho thấy khả năng chống nấm cao, giảm dần theo thời gian mà không bao giờ mất hoàn toàn tác dụng ức chế của chúng: tỷ lệ phần trăm thấp nhất là 23,5% đối với nồng độ 3 mmol L ^-1 vào ngày 22, so với 21,9% thu được khi xử lý thuốc diệt nấm vào cùng ngày. Xem xét các giá trị phần trăm ức chế được ghi trong Bảng  1 , có thể kết luận rằng sự hiện diện của nano kẽm oxit 0,15 / 400 trong các mẫu cấy đã ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của E. salmonicolor .

Dựa trên những điều trên và theo phân tích hai chiều ANOVA được sử dụng trong nghiên cứu này đối với vi khuẩn E. salmonicolor , khi nó được xử lý, đã tìm thấy sự khác biệt đáng kể trong sự phát triển của nấm: ANOVA là F  = 25,6447 và một giá trị của p  <0,0001. Sự khác biệt lớn nhất về sự phát triển của nấm được tìm thấy ở các nghiệm thức có NP ở nồng độ 12, 9 và 6 mmol L ⁻¹ , với nghiệm thức 9 mmol L ⁻¹ nổi bật vì nó kiểm soát tốt hơn sự phát triển của sợi nấm nấm, trong khi ở nồng độ 3 mmol L ^-1 không có sự khác biệt đáng kể giữa tác dụng của các NP ZnO và thuốc diệt nấm.

Sự khác biệt đáng kể cũng được quan sát thấy giữa các khối (ngày), gặp ANOVA là F  = 30,7202 và giá trị p  <0,0001. Trong Hình  8 , tất cả các kết quả của các thử nghiệm được tiến hành có thể được nhìn thấy, cho thấy rằng vào các ngày 10, 19 và 25, nồng độ 9 mmol L ^-1 của hệ thống ZnO NP 0,15 / 400 tiếp tục cho thấy sự ức chế đáng kể sự phát triển của sợi nấm. .

Hình 8 Hoạt tính kháng nấm của các nồng độ khác nhau của ZnO NP 0,15 / 400 trên vi khuẩn E. salmonicolor

Sự phát triển của vi khuẩn E. salmonicolor trên hệ thống với nano kẽm oxit 0,1 / 600

Để xác định ảnh hưởng của các tham số tổng hợp đến khả năng chống nấm của các NP ZnO, một thử nghiệm tương tự đã được thực hiện với các mẫu ZnO NP 0,15 / 400 được mô tả ở trên, nhưng sử dụng các hạt nano từ hệ thống ZnO NP 0,1 / 600. Để làm được điều này, sự phát triển của vi khuẩn E. salmonicolor đã được ghi lại và tỷ lệ phần trăm ức chế được tính toán bằng cách sử dụng các dữ liệu này. Hình  9 cho thấy kết quả thu được khi xử lý với nồng độ 12 mmol L ⁻¹ của ZnO NP 0,1 / 600, trong đó tác dụng ức chế khi sử dụng các hạt nano mới này là rõ ràng nhất. Kết quả trong Hình  9 cho thấy sự ức chế sự phát triển của E. salmonicolorcho đến ngày thứ 10, tại thời điểm đó rõ ràng là NP được sử dụng ở đây kém hiệu quả hơn trong việc kiểm soát sự phát triển của sợi nấm so với các hạt nano của hệ thống ZnO NP 0,15 / 400 (Hình  7 ). Điều quan trọng cần lưu ý là trong thử nghiệm này, không thể ghi lại dữ liệu cho tất cả các ngày được đề xuất, vì vào ngày 16, nấm đã bao phủ toàn bộ đĩa petri. Do đó, một nghiên cứu thống kê đã không được thực hiện vì không có đủ dữ liệu để có được một kết quả đáng tin cậy.

Hình 9 Sự phát triển vi mô của vi khuẩn E. salmonicolor ở 10 ngày tuổi: đối chứng , b xử lý bằng thuốc diệt nấm và xử lý c với 12 mmol L ⁻¹ của ZnO NP 0,1 / 600

Bảng  2 cho thấy các giá trị thu được đối với phần trăm ức chế sự phát triển của nấm ở E. salmonicolor trong các mẫu cấy được xử lý bằng các hạt nano từ hệ thống ZnO NP 0,1 / 600, lấy làm tham chiếu cho việc kiểm soát và xử lý bằng thuốc diệt nấm. Kết quả chỉ ra rằng phần trăm ức chế cao nhất là 71,3% vào ngày thứ 7, so với 51,1% vào ngày thứ 10, so với điều trị bằng thuốc diệt nấm, là 66,8% vào ngày thứ 7 và 46,7% vào ngày thứ 10. Những dữ liệu này cho thấy tác dụng thuận lợi của NP về kiểm soát sự phát triển của sợi nấm E salmonicolor . Tuy nhiên, nếu dữ liệu trong Bảng  2 (ZnO NP 0,1 / 600) được so sánh với dữ liệu trong Bảng  1(ZnO NP 0,15 / 400), một sự khác biệt đáng kể được quan sát thấy, sự ức chế hiệu quả hơn đối với hệ thống thứ hai.

Bảng 2 Phần trăm (%) ức chế sự phát triển của sợi nấm E. salmonicolor khi các hạt nano từ hệ thống ZnO NP 0,1 / 600 được sử dụng trong xử lý

Có thể giải thích kết quả kém thuận lợi hơn thu được với mẫu ZnO NP 0,1 / 600 (Hình  9 ; Bảng  2 ) so với mẫu ZnO NP 0,15 / 400 (Hình  7 ; Bảng  1 ) khi xem xét sự hình thành các đám hoặc kết tụ cứng , như trong Hình  2 . Những điều này sẽ làm giảm diện tích bề mặt của ZnO, dẫn đến giảm hoạt động chống lại nấm của nó, như có thể thấy trong Hình  9 , nơi nấm gần như lấp đầy hoàn toàn đĩa petri ở 10 ngày tuổi. Hơn nữa, có bằng chứng cho thấy bản chất của mỗi hệ thống trong số hai hệ thống NPN tổng hợp ZnO là khác nhau, được xác định bởi những thay đổi trong điều kiện tổng hợp. Đầu tiên, các mẫu có màu sắc khác nhau (Hình  3). Điều này có thể được gây ra bởi sự thay đổi về nồng độ và bản chất của các khuyết tật, một điều kiện có thể ảnh hưởng đến chức năng của bột gốm (Greenwood và Earnshaw 1997 ). Thứ hai, phổ IR tương ứng với hai mẫu này (Hình  4 , 5 ) cho thấy sự khác biệt về vị trí của các dải, điều này ngụ ý những thay đổi trong cấu trúc của chất rắn, mặc dù giống nhau về mặt hóa học và cấu trúc (Hình  6 ).

Trong khi đó, việc điều trị bằng thuốc diệt nấm không có ý nghĩa và không tạo ra sự ức chế đáng kể sự phát triển của các loại nấm được nghiên cứu. Điều này có thể được giải thích khi xem xét các điều kiện sử dụng trong phòng thí nghiệm khác với điều kiện sử dụng ngoài thực địa, điều này có thể dẫn đến thay đổi phương thức hoạt động ức chế đối với loại nấm được nghiên cứu. Dựa trên các kết quả thu được, có thể kết luận rằng trong điều kiện in vitro, trong đó thử nghiệm được tiến hành, các NP ZnO có tác dụng ức chế sự phát triển sợi nấm của E. salmonicolor nhiều hơn so với thuốc diệt nấm đối chứng được sử dụng, đồng oxychloride. Tuy nhiên, để có thêm dữ liệu kết luận về tác dụng kháng nấm này, cần tiến hành thêm thử nghiệm với các loại thuốc diệt nấm khác được sử dụng để kiểm soát bệnh hồng.

Xác định tổn thương hình thái và siêu cấu trúc đối với nấm được xác định bằng cách sử dụng HROM và TEM

Cho rằng các hạt nano kẽm oxit 0,15 / 400 là hạt cho thấy khả năng kháng nấm cao nhất với vi khuẩn E. salmonicolor , các thay đổi về hình thái và siêu cấu trúc của các loại nấm tương tác với chúng đã được phân tích.

Những thay đổi về hình thái của E. salmonicolor được quan sát bằng HROM

Hình  10 cho thấy các hình ảnh của sợi nấm thu được thông qua quá trình in chìm, quy trình được mô tả trong “ Kính hiển vi quang học độ phân giải cao ”. Các sợi nấm được xem là có thành nhẵn, cấu trúc “mạng lưới” và vách ngăn rõ ràng (Hình  10 a) nhuộm màu tốt hơn phần bên trong của sợi nấm.

Hình 10 Hình ảnh cấu trúc sợi nấm của E. salmonicolor . a Đối chứng, b xử lý bằng thuốc diệt nấm, c xử lý với 12 mmol L ⁻¹ , d 9 mmol L ⁻¹ và e 6 mmol L ⁻¹ ZnO NP 0,15 / 400

Trong hình  10 b, có thể thấy rằng các sợi của sợi nấm có xu hướng tụ lại và màu nhuộm được sử dụng có ái lực mạnh hơn với phần bên trong, nghĩa là không nhìn thấy vách ngăn. Trong các nghiệm thức 12, 9 và 6 mmol L ⁻¹ với ZnO NP 0,15 / 400, kết quả là có sự biến dạng trong các kiểu tăng trưởng, vì các sợi của sợi nấm mỏng hơn đáng kể và có xu hướng kết thành khối (Hình  10 c – e). Từ các quan sát, rõ ràng là nano kẽm oxit 0,15 / 400 đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. salmonicolor .

Những thay đổi siêu cấu trúc của vi khuẩn E. salmonicolor được quan sát bằng TEM

Ở các phần E. salmonicolor ở 16 ngày tăng trưởng, người ta đã quan sát thấy sự hiện diện của các bào quan như không bào (V) và ty thể (Mit) trong tế bào chất được bảo tồn (Cyt), với thành tế bào xác định (Cw), khiến nó dày đặc điện tử hơn (Romero de Pérez 2003 ) khi quan sát nó trong TEM, Hình  11 a, trong khi xử lý bằng thuốc diệt nấm, người ta đã quan sát thấy sự phân đoạn của thành tế bào, một sự thay đổi không thể coi là có liên quan vì cấu trúc của nó tương tự như cấu trúc của đối chứng, Hình  11 b. Cuối cùng, ở các phần nấm được xử lý bằng ZnO NP 0,15 / 400 (9 mmol L ⁻¹), một sự dày lên đồng đều của thành tế bào, với sự hóa lỏng đáng chú ý của các chất bên trong tế bào chất, làm cho nó ít đậm đặc điện tử hơn, Hình  11 c. Một hiệu ứng tương tự cũng được tạo ra với 12 mmol L ⁻¹ ZnO NP 0,15 / 400, nơi một số lượng không bào (V) và sự tách rời của thành tế bào (Cw) cũng được nhìn thấy, Hình  11 d.

Hình 11 TEM các phần của vi khuẩn E. salmonicolor : a Đối chứng, và được xử lý với b chất diệt nấm đồng oxychloride, c ZnO NP 0,15 / 400 ở 9 mmol L ⁻¹ , và d ZnO NP 0,15 / 400 ở 12 mmol L ⁻¹ [không bào (V), ti thể (Mit), thành tế bào (Cw) và tế bào chất (Cyt)]

Tóm lại, các hiệu ứng quan sát được đối với sự tương tác của các hạt nano của hệ thống nano kẽm oxit 0,15 / 400 trên vi khuẩn E. salmonicolor tương ứng với những thay đổi hình thái chính đến đáng kể trong sợi nấm (Hình  10 , 11 ). Nói chung, các kết quả thu được trong nghiên cứu này cung cấp các yếu tố thú vị để đưa ra một cơ chế giải thích và giải thích cho độc tính của các NP ZnO (Buerki-Thurnherr et al. 2012 ; Sharma 2011), đặc biệt là hoạt động chống nấm của chúng. Tính đến các tiêu chí thông thường được sử dụng để phân loại các hợp chất chống nấm, một khía cạnh quan trọng cần xem xét là “vị trí hoạt động” của các hạt nano (trên màng tế bào, thành tế bào, DNA hoặc RNA), cũng như các đặc điểm bề mặt của nó. Do đó, khi đưa ra một cơ chế khả thi để tính đến khả năng chống nấm của các NP ZnO, thành của nấm có thể được xem như một mục tiêu, cũng tính đến các đặc điểm hóa lý bề mặt của ZnO (Altunbek và cộng sự 2014 ; Wöll 2007 ) , cũng như các đặc điểm hóa lý khác của nó – ví dụ như kích thước và hình dạng – cũng có thể ảnh hưởng đến độc tính của oxit này (Mu et al. 2014). Vách nấm, trong việc kiểm soát tính thấm của tế bào, là một phần của tế bào tương tác với môi trường bên ngoài, và do đó với các NP ZnO có trong môi trường nuôi cấy nấm được quan tâm trong công việc này. Phần này của tế bào nấm được cấu tạo chủ yếu từ polysaccharid và protein. Cụ thể, có β-1,3- D -glucan và β-1,6- D -glucan macroprotein, chitin, protein và lipid, và trong số các polysaccharid, chitin, glucan và mannan hoặc galactomannan (Pontón 2008 ) chiếm ưu thế .

Một cơ chế có thể có của hoạt động chống nấm của các ZnO-NP có thể tính đến tác dụng của ROS và / hoặc Zn ²⁺ trên N -acetylglucosamine ( N -acetyl- D -glucose-2-amine) hoặc trên β-1 3- D -glucan cú pháp (FKs1p). ROS được tạo ra bởi các hạt nano (Lipovsky và cộng sự 2009 , 2011 ), trong khi Zn ²⁺ là sản phẩm của sự hòa tan các hạt nano trong môi trường nuôi cấy (Lv và cộng sự 2012 ; Mudunkotuwa và cộng sự 2012 ; Reed và cộng sự 2012 ; Xia và cộng sự 2008 ) . N-acetylglucosamine tham gia vào quá trình tổng hợp kitin (một polysaccharide có tầm quan trọng lớn trong cấu trúc của thành tế bào), trong khi tổng hợp β-1 3- D -glucan tham gia vào quá trình tổng hợp β-1,3- D -glucan (một thành phần quan trọng khác của thành tế bào ở nấm). Điều này sẽ lặp lại tác động của penicillin trên thành tế bào vi khuẩn (Park và Stromistger 1957 ).

Mặc dù tác động của các hạt nano đối với các hệ thống sinh học đã là chủ đề nghiên cứu (Colvin và Kulinowski 2007 ; Klein 2007 ; Rahman và cộng sự 2013 ), cần có nhiều nghiên cứu hơn để xem xét tác động của oxit kẽm nano đối với chitin và glucan, do đối với những tác động quan sát được trong quá trình làm việc này của ZnO-NP đối với vi khuẩn E. salmonicolor , sự dày lên đáng kể của thành tế bào và sự hóa lỏng của các chất bên trong tế bào chất (Hình  10 , 11). Các nghiên cứu như vậy phải xem xét thành phần hóa học của vách và xác định cách các NP ZnO có thể kiểm soát hoặc ức chế sự tổng hợp các enzym của chitin và glucan, lấy tham chiếu kiến ​​thức về các chất ức chế glucan chống nấm cổ điển (Douglas 2001 ; Romero et al. 2005 ) và tổng hợp chitin (Gongora 2002 ; Merzendorfer 2006 ), đặc biệt chú ý đến các đặc thù của độc tính của các hạt nano (Zucolotto et al. 2013 ).

Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các hạt nano gây ra ứng suất oxy hóa (Xia et al. 2008 ). Các tác dụng có hại dường như được gây ra hoặc trực tiếp trên mô đích, do độc tính của các dẫn xuất ROS, hoặc gián tiếp do tác động của các dẫn xuất này lên việc sản xuất các chất trung gian của hệ thống miễn dịch và viêm, chủ yếu là đồng tiền viêm. -độc tố. Sự căng thẳng oxy hóa này có thể vô hiệu hóa các antiprotease đồng thời kích hoạt các metalloprotease, do đó khuyến khích quá trình phân giải protein và phá hủy tế bào không kiểm soát. Một số tác giả (L’Azou và Marano 2011) gợi ý rằng viêm là một phản ứng chính và stress oxy hóa là hậu quả của điều này. Do đó, các hạt nano sẽ được cơ thể công nhận là vật chất lạ cần được loại bỏ bằng phản ứng viêm, ví dụ như sự gia tăng kích thước của không bào và / hoặc của thành tế bào, như được chỉ ra trong Hình  11 . Sự tương tác giữa các hạt nano và protein của hệ thống sinh học đóng một vai trò quyết định trong khả năng chúng được nhận biết bởi các tế bào của hệ thống miễn dịch chịu trách nhiệm loại bỏ chúng, cũng như mô của thành tế bào, mục tiêu của các hạt nano , có thể phát ra tín hiệu chống viêm. Viêm có thể đẩy nhanh quá trình sản xuất ROS và giảm khả năng phòng thủ chống oxy hóa, thúc đẩy stress oxy hóa và tổn thương mô liên quan.

Kết luận

Một phương pháp đã được xây dựng cho phép tổng hợp các hạt nano kẽm oxit một cách có kiểm soát và có thể tái tạo. Các hạt nano này đã chứng minh tác dụng chống nấm đối với vi khuẩn Erythricium salmonicolor , một mầm bệnh gây ra bệnh hại cây cà phê được gọi là bệnh hồng. Dựa trên kết quả, để đảm bảo chức năng chống nấm đầy đủ của các nano kẽm oxit, các thông số tổng hợp cần được kiểm soát chặt chẽ: bất kỳ thay đổi nào trong số này đều có thể ảnh hưởng đến hành vi của hạt nano. Các nano kẽm oxit có kích thước trong khoảng từ 20 đến 45 nm cho thấy khả năng kháng nấm đáng kể trên sự phát triển của sợi nấm của vi khuẩn E. salmonicolor in vitro và sử dụng các kích thước này ở nồng độ 6 mmol L ^-1đã gây ra một sự ức chế đáng kể. Các hạt nano ZnO NP hệ 0,15 / 400 gây ra sự hóa lỏng các chất bên trong tế bào chất, làm cho tế bào chất ít mật độ điện tử hơn và tạo ra sự tách rời đáng kể của thành tế bào nấm. Những tác động này cần được nghiên cứu kỹ hơn vì chúng có thể được chứng minh là đại diện khi xem xét cơ chế hoạt động của các NP ZnO đối với nấm bệnh, phá hoại.