Nano magie oxit – Tiêu diệt vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây thuốc lá

Magie (Mg) là một nguyên tố khoáng cần thiết cho cây trồng và không độc hại đối với sinh vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tận dụng lợi thế của công nghệ nano để nghiên cứu một cách có hệ thống các cơ chế kháng khuẩn của các hạt nano magie oxit (MgONPs) chống lại vi sinh vật thực vật Ralstonia solanacearum ( R. solanacearum ) in vitro và in vivo lần đầu tiên. R. solanacearum đã góp phần gây ra bệnh héo xanh, dẫn đến việc giảm sản lượng thuốc lá trên toàn thế giới. Kết quả chứng minh rằng MgONPs có hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ có ý nghĩa thống kê và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được đo lần lượt là 200 và 250 μg / mL. Các nghiên cứu bổ sung, nhằm mục đích tìm hiểu cơ chế độc tính của MgONPs, chỉ ra rằng tổn thương thực thể xảy ra đối với màng tế bào, cùng với sự giảm nhu động và khả năng hình thành màng sinh học của R. solanacearum, do sự gắn trực tiếp của MgONPs vào bề mặt của tế bào vi khuẩn, được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Sự tích tụ các loại oxy phản ứng (ROS) cũng có thể là một lý do quan trọng cho hoạt động kháng khuẩn, gây ra tổn thương DNA. Thử nghiệm đánh giá độc tính trong điều kiện nhà kính đã chứng minh rằng MgONPs đã có tác động lớn đến bệnh héo rũ do vi khuẩn trên thuốc lá, làm giảm chỉ số héo của vi khuẩn. Nhìn chung, các kết quả cho thấy sự phát triển của MgONPs như các chất kháng khuẩn thay thế sẽ trở thành một đối tượng nghiên cứu mới.

(Bản quyền NanoCMM Technology)

GIỚI THIỆU

Công nghệ nano, với tư cách là một lĩnh vực nghiên cứu liên ngành đang phát triển trong nhiều lĩnh vực khác nhau, có tiềm năng cho phép các ứng dụng đột phá trong nông nghiệp liên quan đến bảo vệ thực vật và dinh dưỡng, liên quan đến phân phối thuốc trừ sâu, cảm biến nano, phân hủy thuốc trừ sâu, vi chất dinh dưỡng để sử dụng hiệu quả, v.v. ( Ghormade et al., 2011 ). Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, do các đặc tính hóa lý vượt trội khác thường của chúng, tỷ lệ bề mặt trên thể tích cao và các đặc điểm cấu trúc kích thước nano độc đáo, một số vật liệu nano oxit kim loại vô cơ và hữu cơ, và một số vật liệu nano lai, chẳng hạn như TiO ₂ , ZnO, CuO ( Kalhapure và cộng sự, 2015 ), graphene oxit ( Chen và cộng sự, 2014 ), và Fe₃O₄-Các hạt nano từ tính có vỏ lõi ( Hemeg, 2017 ), đang ngày càng được ứng dụng nhiều hơn như các tác nhân kháng khuẩn thay thế trong các ứng dụng y sinh. Các cuộc điều tra gần đây đã chứng minh rằng chúng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gây bệnh Streptococcus mutans ( Liu và cộng sự, 2014 ) và Xanthomonas perforans ( Paret và cộng sự, 2013 ), nấm Fusarium graminearum ( F. graminearum ) ( Liu và cộng sự, 2017 ) và một số loại virus ( Mishra và cộng sự, 2011). Với tính thích hợp cao đối với các ứng dụng kháng khuẩn, việc sử dụng các hạt nano để phòng ngừa và kiểm soát bệnh thực vật là một chủ đề đầy hứa hẹn và có giá trị vì tăng hiệu quả, độ bền và đặc biệt là diện tích bề mặt riêng cao, có thể kích thích tương tác với các tế bào sống ( Kang và cộng sự, 2008 ). Hơn nữa, các tài liệu trước đây cũng lưu ý rằng các hạt nano kim loại vô cơ (chẳng hạn như ZnO, Ag, TiO ₂ , Cu) ngày càng được ứng dụng như một chất chống vi khuẩn, do sự tích tụ của các loại oxy phản ứng (ROS), có thể làm hỏng các thành phần tế bào, chẳng hạn như như protein, lipid, thậm chí cả axit nucleic ( Hemeg, 2017 ).

Trong số nhiều oxit kim loại vô cơ khác nhau, các hạt nano magie oxit (MgONP) là một chất kháng khuẩn với ưu điểm là không độc hại và tương đối dễ kiếm. MgONPs đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ công nhận là vật liệu an toàn (21CFR184.1431). Những tiến bộ gần đây đã dẫn đến những phát triển dễ thấy với tiềm năng to lớn về vật liệu và thuốc ( Krishnamoorthy et al., 2012b ). Ví dụ, MgONPs có thể làm giảm chứng ợ nóng, bắt đầu sau kích hoạt khung xương sửa chữa xương và hoạt động như tác nhân tăng thân nhiệt trong liệu pháp điều trị ung thư ( Martinez-Boubeta và cộng sự, 2010 ). Gần đây hơn, Bindhu et al. (2016) đặc biệt phát hiện ra rằng nano magie oxit MgONPs có các hoạt động kháng khuẩn cực kỳ rõ rệt chống lại Staphylococcus aureus( S. aureus ) trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các liên kết peptit trong màng tế bào Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli đã bị phá hủy do tạo ra các ion superoxide trên bề mặt của MgONPs ( Huang và cộng sự, 2005 ). MgONPs có thể làm biến dạng và làm hỏng màng tế bào của E. coli , dẫn đến rò rỉ thành phần nội bào của chúng và cuối cùng là chết ( Jin và He, 2011). Tuy nhiên, người ta biết rất ít về các đặc tính kháng khuẩn của MgONPs đối với vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng. Hơn nữa, cơ chế chi tiết của MgONPs như tác nhân diệt khuẩn và khả năng kiểm soát bệnh hại cây trồng của chúng vẫn chưa rõ ràng. Với triển vọng sử dụng vật liệu nano trong nông nghiệp, điều quan trọng cần đề cập ở đây là không thể bỏ qua mối quan tâm ngày càng tăng về tính độc hại của MgONPs đối với các hệ thống môi trường. Trong mọi trường hợp, hiệu quả của các hạt nano này liên quan trực tiếp đến hoạt động kháng khuẩn của chúng và khả năng ảnh hưởng đến càng ít tế bào thực vật càng tốt.

Bệnh héo rũ do vi khuẩn, lần đầu tiên xảy ra ở các khu vực ôn đới, chẳng hạn như Châu Âu và Bắc Mỹ, là một loại bệnh thực vật có sức tàn phá lớn trên toàn thế giới gây ra bởi loài vi khuẩn hung hãn Ralstonia solanacearum . R. solanacearum là một loại vi khuẩn sống trong đất và không gây hại, có thể lây nhiễm cho hàng trăm loài thực vật ký chủ trên khắp thế giới, bao gồm khoai tây, cà chua, cà tím, lạc, ô liu, chuối và gừng ( Schell, 2000 ). Các mầm bệnh cảm nhận được các kích thích cụ thể, di chuyển về phía rễ cây bằng cách bơi và bám vào rễ, sau đó, tập hợp trên các mạch xylem và chặn hệ thống mạch xylem bằng cách tiết ra quá mức các enzym phân giải thành tế bào và polysaccharid ngoại bào (EPS) trong mô cây, cuối cùng gây chết vật chủ (Danhorn và Fuqua, 2007 ; Bogino và cộng sự, 2013 ). Có một số phương pháp điều trị để kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn, bao gồm tạo giống kháng bệnh, kiểm soát hóa chất và kiểm soát sinh học ( Yuliar et al., 2015 ). Lai tạo các giống kháng bệnh là biện pháp hữu hiệu nhất để quản lý dịch bệnh, nhưng phương pháp này tốn nhiều công sức; do đó, hầu hết các giống thuốc lá chất lượng cao đang sản xuất không có khả năng chống lại bệnh héo xanh do vi khuẩn của thuốc lá. Thật không may, một số mối đe dọa lớn và rủi ro môi trường do việc áp dụng các biện pháp kiểm soát không phù hợp và không hợp lý đã xuất hiện. Do đó, việc phát triển các đổi mới công nghệ hiệu quả để đáp ứng những thách thức toàn cầu lớn này là cần thiết.

May mắn thay, các cuộc điều tra đã chỉ ra rằng nano magie oxit MgONPs gây ra sự đề kháng toàn thân chống lại R. solanacearum bằng cách kích hoạt các con đường truyền tín hiệu của axit salicylic (SA-), axit jasmonic (JA-) và ethylene (ET-) ở cây cà chua ( Imada và cộng sự, 2016 ) . Những thực tế này làm nổi bật khả năng sử dụng MgONPs như một giải pháp thay thế hiệu quả cho thuốc trừ sâu hóa học trong bảo vệ cây trồng. Để thực hiện các mục tiêu của việc áp dụng MgONPs, gần đây chúng tôi đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của MgONPs chống lại vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh thực vật, thủ phạm chính của căn bệnh héo rũ do vi khuẩn gây ra và lần đầu tiên, nó đã làm sáng tỏ cơ chế tương tác của nó với MgONPs. Trong tài liệu này, các thí nghiệm diệt khuẩn được tiến hành bằng một số công nghệ (bao gồm kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi laser đồng tiêu quét) để khảo sát quá trình độc tính chính giữa MgONPs và R. solanacearum. Tác động hiệp đồng giữa sự phá vỡ màng tế bào, stress oxy hóa và ức chế màng sinh học, cũng như hoạt động vận động, được đề xuất, có liên quan đến các đặc điểm sinh lý, siêu cấu trúc và liên quan đến độc lực của R. solanacearum. Khả năng kiểm soát hơn nữa hiệu quả của MgONPs để ngăn ngừa bệnh héo rũ vi khuẩn thuốc lá bằng cách tưới tiêu vùng rễ và tác dụng phụ của MgONPs đối với thuốc lá trong nhà kính đã được nghiên cứu.

Đi đến:

Nguyên liệu và phương pháp

Đặc tính của các hạt nano

MgONPs và MgO bulk được mua từ Sigma-Aldrich (Sigma) Chemical Co. tương ứng. Các nano magie oxit MgONP được lơ lửng trong một lượng dư etanol (100%), được gắn trên lưới đồng TEM và được quét ở 200 kV. Sự phân bố kích thước hạt và tiềm năng zeta của các phân tán MgONP được đánh giá bằng cách sử dụng Dòng Nano Malvern Zetasizer (Malvern, Vương quốc Anh).

Chủng và điều kiện tăng trưởng của vi khuẩn

Ralstonia solanacearum (biovar 3, phylotype I) được phân lập từ cây thuốc lá bị nhiễm bệnh tự nhiên ở Pengshui (Trùng Khánh, Trung Quốc), được xác định là một chủng gây bệnh cao. Các vi khuẩn đã tách được xếp thành từng vệt trên môi trường triphenyl tetrazolium clorua (TTC) ở 30 ° C, và một khuẩn lạc đơn lẻ được chọn để nuôi cấy trong môi trường B trên 1 L môi trường có chứa Difco Bacto-Peptone (10 g), chiết xuất nấm men Difco (1 g ), và Difco casamino axit (1 g) ở 30 ° C qua đêm ở 200 g. Sau đó, các mẫu cấy này được thu hoạch trong giai đoạn logarit và được rửa ít nhất ba lần bằng nước khử trùng bằng cách ly tâm cho đến khi loại bỏ cặn trung bình. Các bánh tế bào được ngâm lại trong nước khử ion, và nồng độ huyền phù được điều chỉnh theo mật độ quang học (OD = 1,0) ở 600 nm.

Xác định Nồng độ Ức chế Tối thiểu (MIC) và Nồng độ Diệt khuẩn Tối thiểu (MBC)

Để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nano magie oxit MgONPs và MgO bulk, các vật liệu này được pha loãng theo một loạt các nồng độ từ 15,625 đến 1000 μg / mL (1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 và 15,625 μg / mL), và một phương pháp pha loãng vi mô điển hình đã được thực hiện để xác định MIC và MBC của các hóa chất này chống lại R. solanacearum ( Consoli và cộng sự, 2018 ). MIC và MBC được xác định để chỉ ra hoạt tính kìm khuẩn và diệt khuẩn.

Cụ thể, huyền phù 100 μL (1000 μg / mL MgONPs hoặc MgO khối lượng lớn trong môi trường B) được thêm vào các đĩa microtiter polystyrene 96 giếng và sau đó được pha loãng với môi trường B theo tiến trình hình học để thu được nồng độ thử nghiệm cuối cùng được đề cập ở trên. Hỗn hợp nước đã khử trùng và môi trường B dùng làm đối chứng. Sau đó, 1 μL vi khuẩn nuôi cấy (OD ₆₀₀ = 1,0) và 1 μL TTC được cấy vào mỗi giếng chứa đầy MgONPs hoặc huyền phù MgO bulk. Sau đó, các đĩa được giữ ở 30 ° C mà không bị lắc. Nồng độ của các tế bào được theo dõi bởi một đầu đọc vi tấm ELISA. Các phép đo mật độ quang ở 600 nm (OD ₆₀₀ ) được thực hiện cho các thời gian ủ khác nhau (24, 48 và 72 h). Và phương pháp tương tự cũng thích hợp để xác định MIC và MBC của đồng thiodiazole.

Đo lường khả năng tồn tại của tế bào

Đề cập đến một nghiên cứu trước đây ( Tiwari và cộng sự, 2017 ), vi khuẩn sống sót được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và các tế bào R. solanacearum tươi được pha loãng thành 10 ⁵CFU (số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc) / mL. Để đánh giá độc tính, 100 μL được lấy mẫu và cấy trực tiếp lên đĩa môi trường thạch casamino axit peptone glucose (CPG) chứa đầy các nồng độ khác nhau của các kháng thể vi khuẩn MgONPs (50, 100, 150, 200, và 250 μg / mL), MgO bulk (50, 100, 150, 200 và 250 μg / mL), và đồng thiodiazole (50, 100, 150, 200 và 250 μg / mL). Sau khi các tế bào được nuôi cấy 3 ngày trong tủ ấm, CFU được đếm trên các đĩa thạch. Mỗi bộ thí nghiệm được lặp lại bốn lần để đảm bảo khả năng tái tạo dữ liệu. Khả năng tồn tại của ô được tính theo công thức sau:

Khả năng tồn tại của tế bào (%) =×100

trong đó A biểu thị số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên các đĩa đối chứng và A₁ biểu thị số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc sau khi sử dụng các nồng độ khác nhau của xử lý thuốc.

Thử nghiệm đường cong tăng trưởng

Đường cong tăng trưởng được định nghĩa là logarit của kích thước quần thể tương đối như một hàm của thời gian, thường phản ánh sức sống của vi khuẩn. Ở đây, đường cong được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu nano ( Karahan và cộng sự, 2016 ). Đường cong tăng trưởng của R. solanacearum được đo bằng mật độ quang học (OD ₆₀₀) trong 26 giờ trồng trọt. Cụ thể, huyền phù vi khuẩn tinh khiết được cấy vào 30 mL môi trường giàu B trong bình nuôi cấy, sau đó, 200 μL hạt nano hoặc MgO bulk được thêm vào chất lỏng có thể trộn lẫn như đã đề cập ở trên để thu được các nồng độ sau: 50, 100, 150, 200 và 250 μg / mL. Cùng một thể tích nước khử ion đã được sử dụng trong môi trường B để xử lý đối chứng. Tất cả các bình nuôi cấy được duy trì ở 30 ° C với sục khí, và lấy mẫu (2 mL) sau mỗi hai giờ. Mật độ tế bào của R. solanacearum được phát hiện bằng máy quang phổ UV – Vis Nicolet Evolution 300 ở nhiệt độ phòng. Mỗi bộ thí nghiệm được lặp lại ba lần để tính giá trị trung bình.

Hấp phụ trên bề mặt tế bào

Để khám phá sâu hơn cơ chế tương tác tế bào giữa hai bột MgO và tế bào R. solanacearum , hình thái tế bào đã được nghiên cứu bởi SEM (S-3400N, Hitachi, Japan) và TEM (JEM-2100, JEOL, Japan). Các xét nghiệm hấp phụ tế bào tiếp tục được thực hiện theo phương pháp được mô tả trong một nghiên cứu trước đây ( Hartmann và cộng sự, 2010 ; Chen và cộng sự, 2014 ).

Tóm lại, việc nuôi cấy R. solanacearum pha loãng được duy trì trong tủ ấm qua đêm ở 30 ° C với sự khuấy liên tục để đạt được nồng độ 10 ⁹ (OD ₆₀₀ = 1,0). Sau đó, huyền phù vi khuẩn được chuyển vào ống ly tâm để ly tâm ở 5000 × gtrong 4 phút để loại bỏ phần cặn vừa. Tiếp theo, vi khuẩn được trộn với MgONPs hoặc MgO bulk để có được liều lượng cuối cùng là 250 μg / mL. Các mẫu cấy được xử lý chỉ sử dụng nước khử ion được coi là nhóm đối chứng. Tất cả hỗn hợp đã xử lý được ủ trong 4 giờ ở 30 ° C và giá trị 200 g, và vi khuẩn đã xử lý được rửa nhẹ bằng nước khử trùng ba lần và cố định bằng glutaraldehyde (2,5%) trong nước đã khử trùng thêm 1 giờ. Một loạt các nồng độ etanol (30-100%) được sử dụng để khử nước các mẫu cho đến khi vi khuẩn khô hoàn toàn, và sau đó chúng được phủ một lớp vàng. Cuối cùng, những thay đổi hình thái của vi khuẩn sau đó được phân tích bằng SEM và TEM, và các nguyên tố được phát hiện bằng phương pháp quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDS) (Hitachi, Nhật Bản).

Thử nghiệm ngăn chặn sự hình thành màng sinh học

Sự hình thành màng sinh học của R. solanacearum được thực hiện theo một nghiên cứu trước đây với những thay đổi nhỏ ( Zhang và cộng sự, 2014 ). Một cách ngắn gọn, sử dụng màu tím pha lê trong các đĩa microtiter polystyrene 96 giếng, 1 μL huyền phù vi khuẩn mới (OD ₆₀₀= 1,0) đã được thêm vào 199 μL môi trường B với nano magie oxit MgONP hoặc MgO bulk được thêm vào để đảm bảo nồng độ cuối cùng là 0, 50, 100, 150, 200, hoặc 250 μg / mL, và huyền phù được ủ trong các thời gian khác nhau (24 , 48 và 72 giờ) ở 30 ° C mà không lắc để tạo thành màng sinh học. Sau khi phần nổi phía trên được loại bỏ, màu tím pha lê được thêm vào giếng để nhuộm màu. Ethanol (95%) được sử dụng để hấp phụ màu tím tinh thể từ màng sinh học. Các thí nghiệm được tiến hành khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 488 nm. Mỗi thí nghiệm được lặp lại tối thiểu ba lần.

Thử nghiệm Vận động Bơi lội và Co giật

Khả năng di chuyển của vi khuẩn có liên quan đến một số yếu tố độc lực đã biết. Do đó, động cơ bơi và co giật được xác định trong các đĩa được chia nhỏ ( Tahir và cộng sự, 2017 ) để phát hiện hoạt động chuyển động của R. solanacearum tiếp xúc với MgONP và MgO bulk. Tế bào R. solanacearum tươi được nuôi cấy trong tủ ấm qua đêm (OD ₆₀₀ = 1,0). Sau đó, 2 μL công thức nano được cấy vào các môi trường thạch CPG khác nhau ( Addy và cộng sự, 2012 ) có chứa các nồng độ bột MgO khác nhau và được ủ ở 30 ° C. Môi trường thạch CPG chứa 0,3% (w / v) agar được sử dụng để xác định khả năng bơi lội và 1,6% (w / v) agar ( Raza et al., 2016) được sử dụng để xác định nhu động co giật. Sau đó, sau 3 ngày ủ bệnh, các vùng di chuyển của tế bào R. solanacearum được đo. Trong khi đó, các cạnh hình thành khuẩn lạc được quan sát thấy sau khi ủ 2 ngày dưới kính hiển vi. Các thí nghiệm được lặp lại tối thiểu ba lần.

Các xét nghiệm LIVE / DEAD để suy ra tính toàn vẹn của màng tế bào

Để xác định và xác minh tổn thương màng tế bào vi khuẩn, Bộ công cụ xác định khả năng sống của vi khuẩn BacLight LIVE / DEAD (Molecular Probes, Eugene, OR, United States) đã được sử dụng làm công cụ nhận dạng. Kết quả của các xét nghiệm LIVE / DEAD được biểu thị bằng cường độ huỳnh quang (đỏ hoặc xanh lục) của các tế bào vi sinh vật được nhuộm màu ở một bước sóng nhất định ( Radzig và cộng sự, 2013 ). Cụ thể, R. solanacearumđược nuôi cấy trong môi trường B qua đêm ở 30 ° C mà không lắc. Sau đó, phần nổi phía trên được loại bỏ và môi trường B mới trộn với MgONPs (250 μg / mL) hoặc MgO khối lượng lớn (250 μg / mL) được thêm vào môi trường nuôi cấy và ủ trong 4 giờ. Hỗn hợp thuốc thử nhuộm (SYTO 9 và PI) được thêm vào huyền phù vi khuẩn (rửa trong nước vô trùng) và ủ trong bóng tối trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo, vi khuẩn được quan sát bằng cách quét kính hiển vi laser đồng tiêu (Leica SP8, Đức) ở bước sóng 488 nm trong 0, 2, 4, 8 và 12 giờ.

Quan sát lưu lượng tế bào

Máy đo lưu lượng tế bào được sử dụng để đo những thay đổi trong tán xạ ánh sáng của các tế bào sau khi ủ với các công thức nano ( Kumar và cộng sự, 2011a ). Để đánh giá ảnh hưởng của MgONPs đối với tế bào R. solanacearum , phần nổi trên bề mặt nuôi cấy vi khuẩn được loại bỏ sau khi ly tâm ở 5000 × g trong 4 phút và được ngâm lại trong nước đã khử trùng. Các tế bào (10 ⁶ cfu / mL) được thu thập ở pha sinh trưởng theo logarit được xử lý bằng MgONPs trong 4 giờ và được nhuộm ngay lập tức bằng propidium iodide (PI) trong bóng tối trong 30 phút. Tiếp theo, quá trình chết rụng ở R. solanacearum được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (FACSAria, BD Biosciences, Hoa Kỳ).

Dòng chảy của các vật liệu tế bào chất

Mọi vi khuẩn bình thường đều có một màng tế bào hoàn chỉnh. Một khi màng tế bào bị hư hỏng, các chất (DNA và RNA) trong tế bào sẽ được giải phóng và các chất này có thể được phát hiện bằng máy quang phổ UV – vis dưới ánh sáng UV 260 nm ( Chen và cộng sự, 2013 ). Hỗn dịch vi khuẩn với nano magie oxit MgONPs và MgO bulk (nồng độ từ 0 đến 250 μg / mL) được ủ trong 4 giờ ở 30 ° C. Sau đó, hỗn hợp được lọc để loại bỏ vi khuẩn, MgONP và MgO bulk bằng cách sử dụng bộ lọc loại chốt thoát 0,22 μm. Cuối cùng, giá trị OD được theo dõi dưới ánh sáng cực tím 260 nm.

Xác định các loài oxy phản ứng tương đối (ROS)

Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và tiếp tục phản ứng với ROS để tạo thành hợp chất huỳnh quang dichlorofluorescein (DCF), được phát hiện bằng huỳnh quang ở bước sóng 488 nm ( Applerot và cộng sự, 2012 ). Ở đây, DCFH-DA được sử dụng làm thuốc thử phát hiện để đo ROS nội bào. Vi khuẩn được nuôi cấy qua đêm cho đến khi OD ₆₀₀ đạt đến 1, sau đó ly tâm nuôi cấy (1 mL) ở 5000 × g trong 4 phút để chia mẫu thành ba nhóm. Rotenone xác định ROS cụ thể (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) hoạt động như kiểm soát âm tính, được tiến hành như đã mô tả trước đây ( Li F. và cộng sự, 2015). Tế bào vi khuẩn được tiếp xúc với huyền phù 250 μg / mL MgONPs, 250 μg / mL MgONPs cùng với rotenone và nước đã khử trùng (đối chứng trắng) tương ứng trong 4 giờ. Sau đó, các nhóm huyền phù này được rửa nhẹ bằng nước khử trùng ba lần và được thêm vào 10 μM DCFH-DA ở 30 ° C trong 30 phút trong bóng tối. Cuối cùng, huỳnh quang được xác định bằng cách sử dụng kính hiển vi laser đồng tiêu quét (Leica SP8, Đức) sau khi rửa kỹ mẫu bằng nước đã khử trùng. Các thí nghiệm được lặp lại tối thiểu ba lần.

Sự phá hủy DNA

Tổn thương DNA của các tế bào R. solanacearum được ủ với vật liệu nano đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng gel agarose, như đã mô tả trước đây ( Kumar và cộng sự, 2011a). Cường độ của bậc thang DNA được sử dụng để điều tra sự phân mảnh DNA, và các quy trình sau đây đã được thực hiện. Tế bào vi khuẩn được nuôi trong môi trường B ở 30 ° C qua đêm, và tế bào được chuẩn bị ở nồng độ cần thiết và chuyển vào 50 mL môi trường có chứa MgONPs với nồng độ cuối cùng là 0, 50, 100, 150, 200 và 250 μg / mL. Một mẫu đối chứng được xử lý bằng nước DI. Sau khi xử lý trong 4 giờ, DNA được chiết xuất từ ​​tất cả các vi khuẩn bằng cách sử dụng Bộ DNA vi khuẩn TIANamp (Tiangen, Trung Quốc), và sau đó một lượng DNA tương đương được nhuộm bằng ethidium bromide để điện di trong gel agarose 1%.

Kiểm soát sự héo rũ của vi khuẩn bằng cách sử dụng nano magie oxit MgONP và MgO bulk trong phòng phát triển thực vật

Độc lực và khả năng gây bệnh của R. solanacearum đối với thuốc lá đã được kiểm tra in vivo bằng các thí nghiệm trong chậu ( Tahir et al., 2017 ). Thử nghiệm khả năng gây bệnh được tiến hành với cây thuốc lá (giống “Yunyan 87”) ở giai đoạn sinh trưởng 4 lá già trong giá thể ma trận (Pindstrup Mosebrug A / S, Đan Mạch). Các cây thuốc lá phù hợp đã được chọn và 20 cây được chuẩn bị cho mỗi lần xử lý. Tại đây, cây thuốc lá được cấy 15 mL huyền phù tế bào R. solanacearum (10 ⁷cfu / mL) bằng cách tưới quanh phần gốc của thân, và cây được xử lý bằng nước DI được sử dụng làm mẫu đối chứng. Tiếp theo là trồng trọt trong 24 giờ trong buồng phát triển thực vật ở nhiệt độ 27 ± 1 ° C, độ ẩm tương đối 85–90% và thời gian ánh sáng là 14 giờ, cây được làm ướt và xử lý bằng 50 mL MgONP hoặc hỗn dịch MgO bulk. Quan trọng là, để giảm các lỗi không thường xuyên, tất cả các thử nghiệm được thiết lập trong một thiết kế khối hoàn chỉnh ngẫu nhiên. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà kính nêu trên. Mức độ nghiêm trọng của bệnh được đánh giá trong 21 ngày dựa trên tỷ lệ lá héo; công thức chi tiết như sau.

Chỉ số bệnh tật ( % ) = [ Σ ( n i  ×  v i ) ÷ ( V  ×  N )] × 100,

trong đó ni là số cây có cấp bệnh tương ứng, vi là cấp bệnh, V là cấp bệnh cao nhất (4) và N là số cây kiểm tra trên mỗi nghiệm thức. Mức độ bệnh như sau: 0 – không héo, 1 – 1 lá héo, 2 – 2 lá héo, 3 – 4 lá héo và 4 – héo toàn bộ.

Độc tính của nano magie oxit MgONPs đối với cây thuốc lá tăng trưởng trong phòng

Sự phát triển của thực vật được sử dụng để kiểm tra tác dụng phụ của các hạt nano ( Raliya và cộng sự, 2015 ). Do đó, các nồng độ khác nhau (0, 50, 150 và 250 μg / mL) của MgONPs đã được áp dụng cho thuốc lá ở giai đoạn bốn lá già trong các giá thể ma trận bằng cách tiếp xúc với rễ. Trong các thí nghiệm trên cây thuốc lá, 20 cây được thử nghiệm ở mỗi nghiệm thức trong một buồng sinh trưởng thực vật (các điều kiện môi trường được trình bày chi tiết trong phần khảo nghiệm khả năng gây bệnh). Cuối cùng, các thông số sinh lý về chiều cao cây và sinh khối khô được ghi lại vào ngày thứ 30 sau khi cấy MgONPs.

Kết quả và thảo luận

Phân tích đặc tính hạt nano

Cấu trúc của vật liệu nano có liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Hơn nữa, kích thước thực của các hạt trong huyền phù khác biệt đáng kể so với kích thước được quảng cáo của bột ban đầu; Hiện tượng này đã được báo cáo bởi các nhà nghiên cứu khác ( Hristovski và cộng sự, 2005 ). Trong đây, chúng tôi đã phân tích các đặc tính vật lý và hóa học đại diện của các nano magie oxit MgONP được sử dụng trong nghiên cứu này. Đầu tiên, ảnh hiển vi SEM và TEM thu được để mô tả hình thái của vật liệu nano. Như thể hiện trong Hình bổ sung S1trong thông tin hỗ trợ, các vi cầu MgO có dạng hạt không đều nhưng hình cầu với tổ chức xốp kết hợp với sự kết tụ một phần và đường kính của các hạt MgONP gần như nằm trong khoảng 50-100 nm. Tương tác tĩnh điện được đo bằng điện thế zeta, thu được bằng máy phân tích kích thước hạt laser Malvern (Malvern, Vương quốc Anh), như trong Hình​ 1. Thế zeta trung bình của các MgONP thể hiện điện tích dương trong phạm vi pH từ 4 đến 8. Khi bột được phân tán trong dung dịch ở pH 9, các hạt nano thể hiện điện tích bề mặt âm dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các điện tích dương trên bề mặt và các ion trong dung dịch. Sau đó, ngoài SEM (Hình bổ sung S1 ), tán xạ ánh sáng động (DLS) và TEM cũng được sử dụng để phân tích sự phân bố kích thước hạt và độ ổn định của các MgONP trong các huyền phù khác nhau. Đối với nước khử ion và dung dịch chiết xuất chất nền, các MgONP dường như chứa các phân bố kích thước hạt tương tự, như được thể hiện trong Hình2B, C. Ngược lại, hầu hết các MgONP được tập hợp lại với nhau trong môi trường B. Dung dịch muối thể hiện các phân tử sinh học, oxy phân tử và ion đậm đặc, được cho là do lực kết dính mạnh giữa các hạt, gây ra sự kết tụ. Hơn nữa, một cuộc điều tra tương tự đã chỉ ra rằng lực hút tĩnh điện giữa các hạt là hiệu ứng của quá trình đông tụ ( Zheng và cộng sự, 2018 ).

Hoạt động kháng khuẩn của nano magie oxit MgONPs chống lại R. solanacearum trong ống nghiệm

Để xác định xem liệu nano magie oxit MgONP có thể ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh thực vật R. solanacearum hay không, người ta đã đo MIC và MBC. Điều quan trọng là phải xác định nồng độ hiệu quả trong ống nghiệm , vì liều lượng khuyến cáo của vật liệu nano phải được xác định để đánh giá tiềm năng sử dụng các vật liệu này để bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp. Theo quan sát trong Bảng bổ sung S1 , MIC và MBC của MgONPs là 200 và 250 μg / mL, ở đó nồng độ gần như tất cả tế bào của R. solanacearum đã bị giết, trong khi liều tương ứng của MgO dạng bulk là 500 và 600 μg / mL, và liều đồng thiodiazole tương ứng là 125 và 200 μg / mL. Mặc dù ba tác nhân này thể hiện sự ức chế mạnh mẽ đối với các vi trùng sống sót ở một nồng độ cụ thể, nhưng MgONPs và đồng thiodiazole có thể hạn chế hoặc tiêu diệt tất cả các tế bào ở nồng độ thấp hơn, cho thấy rằng vật liệu nano có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với vật liệu dạng khối, thậm chí cả tác dụng kháng khuẩn của chúng có thể phù hợp với các tác nhân hóa học.

Hơn nữa, chúng tôi so sánh kết quả với kết quả của một số tác nhân hóa học hiện đang được sử dụng chống lại R. solanacearum theo dữ liệu tham khảo ( Bảng​ 1). Kết quả cho thấy MgONPs có thể tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn ở nồng độ 250 μg / mL, cao hơn một chút so với nồng độ tương ứng của đồng thiodiazole. Tuy nhiên, đối với các chất diệt khuẩn hóa học được sử dụng hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn đã được kiểm tra bằng các phương pháp khác nhau, bao gồm MIC, nồng độ ức chế một nửa (IC ₅₀ ) hoặc nồng độ cho 50% hiệu quả tối đa (EC ₅₀ ). Trong bảng​ 1, giá trị MIC của tinh dầu và streptomycin sulfat thấp hơn nhiều so với MgONPs. Tuy nhiên, streptomycin sulfate đã được công nhận là tích tụ trong cơ thể người thông qua chuỗi thức ăn và gây ra rủi ro ( Gu et al., 2018 ). EC ₅₀ giá trị của cloramphenicol và bismerthiazol tương ứng là 20 và 59,69 μg / mL. So với chloramphenicol và bismerthiazol, liều kháng khuẩn của nano magie oxit MgONPs cao hơn một chút. Tuy nhiên, các thử nghiệm sâu hơn đối với các loại thuốc trừ sâu này đã xác nhận rằng nồng độ gây chết người của MgONPs có thể tương đương với hydroxit đồng và thậm chí còn thấp hơn nồng độ của coumarin và umbelliferone. Quan trọng hơn, tất cả các vật liệu kháng thể đều có thể tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh, nhưng với ưu điểm là không gây độc gen hoặc độc tế bào cho người, MgONPs có tiềm năng rất lớn để kiểm soát bệnh thực vật trong tương lai.

Bảng 1 Một số loại thuốc trừ sâu hóa học chống lại R. solanacearum.

Xem xét một cách tiếp cận trực quan hơn để so sánh hiệu quả của độc tính của nano magie oxit MgONPs, MgO bulk chống lại R. solanacearum , sự phát triển của vi khuẩn được đặc trưng bằng cách theo dõi số lượng tế bào sống sót bằng cách sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc cổ điển ( Cui và cộng sự, 2016 ). Cùng một số lượng vi khuẩn R. solanacearum được cấy trên các đĩa thạch CPG có chứa các nồng độ khác nhau của MgONP và MgO bulk (0, 50, 100, 150, 200 và 250 mg / L), tỷ lệ sống sót của tế bào tương ứng được khảo sát bằng cách đếm tỷ lệ CFU của các nghiệm thức tương ứng với đối chứng. Các đĩa thạch không có thuốc được sử dụng làm nhóm trắng và các bức ảnh tương ứng của các khuẩn lạc R. solanacearum được hình thành đã được ghi lại (Số liệu 3A, B). Đáng chú ý, sau khi tương tác với MgONP và MgO bulk, sự hình thành các khuẩn lạc vi khuẩn trên các đĩa rõ ràng là phụ thuộc vào nồng độ so với đối chứng ( Hình3A, B). Điều đáng chú ý là MgONPs thể hiện độc tính hiệu quả hơn đối với tế bào R. solanacearum so với MgO bulk. Đặc biệt, MgONPs thể hiện tác dụng gây chết đáng kể đối với vi khuẩn ở nồng độ 250 mg / L. Như trong hình​3C, tỷ lệ sống đáng chú ý chỉ đạt 0,80% so với không được điều trị, gần như tử vong hoàn toàn; kết quả này thấp hơn kết quả đối với MgO 250 mg / L (67,78%). Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về độc tính của các hạt nano khác đối với phytopathogens, chẳng hạn như Ag, ZnO và CuO ( Dizaj và cộng sự, 2014 ).

Hình 3 Hoạt tính kháng nấm của nano magie oxit MgONP và MgO bulk chống lại R. solanacearum . Hình ảnh khuẩn lạc R. solanacearum sau khi xử lý MgONP (A) hoặc MgO (B) bulk với các nồng độ khác nhau. Nồng độ trong cả hai nhóm đĩa thạch từ trái sang phải liên tiếp là 0, 50, 100, 150, 200 và 250 μg / mL. Tỷ lệ sống sót của tế bào R. solanacearum (C) và đường cong tăng trưởng sau khi tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của MgONPs (D) và MgO (E) bulk . Các đĩa NA này được nuôi cấy trong 3 ngày ở 30 ° C mà không lắc. Các thanh lỗi trong biểu đồ thể hiện độ lệch chuẩn và ∗ và∗∗ lần lượt chỉ ra p <0,05 và p <0,01.

Sự phân chia của vi khuẩn dựa trên sự phân hạch nhị phân, phương thức lan truyền phổ biến nhất ở vi khuẩn, dẫn đến động lực phát triển của quần thể vi khuẩn có thể được chia thành bốn giai đoạn: giai đoạn trễ, theo cấp số nhân, giai đoạn tĩnh và giai đoạn suy giảm ( Pinho và cộng sự, 2013 ). Khi vi khuẩn tiếp xúc với môi trường tự nhiên không thuận lợi hoặc căng thẳng bất lợi, chẳng hạn như thiếu dinh dưỡng, sự phát triển của cộng đồng vi khuẩn trong các giai đoạn trễ bị cản trở, kích thước quần thể giảm (hoặc bước vào giai đoạn cấp số nhân đang chờ xử lý) và cuối cùng, tỷ lệ tử vong trở nên đáng kể , làm phát sinh các giai đoạn suy giảm so với vi khuẩn được nuôi trong điều kiện bình thường ( Rolfe và cộng sự, 2012 ). Hơn nữa, đường cong tăng trưởng của R. solanacearumđược sử dụng để đánh giá tác dụng kháng khuẩn của MgONPs và MgO khối lượng lớn trong môi trường B. Hoạt tính kháng khuẩn được tích lũy dần dần với sự gia tăng nồng độ của hai nguyên liệu tác nhân. MgONPs dao động từ 50 đến 250 μg / mL đã ức chế đáng kể sự phát triển của R. solanacearum ( Hình3D, E), trong khi ít bị ức chế hơn đối với cùng một nồng độ MgO khối lượng lớn. Độc tính rõ ràng của MgONPs đối với vi khuẩn đã được quan sát thấy ở nồng độ gây chết người (250 μg / mL). Ở nồng độ này, kết quả đường cong sinh trưởng cho thấy hầu như không có sự phát triển của vi khuẩn, chứng tỏ vi khuẩn đã bị tiêu diệt. Tuy nhiên, xử lý với MgO bulk ở cùng nồng độ cho thấy hoạt tính kháng khuẩn yếu hơn. Kết quả chứng minh rằng nano magie oxit MgONPs có thể tiêu diệt tế bào vi khuẩn ở nồng độ thấp. Sự khác biệt này có thể là do các hạt nano có diện tích bề mặt BET cao hơn nhiều và có thể tích lỗ và kích thước nhỏ hơn so với khối lượng lớn MgO ( Jeevanandam và Klabunde, 2002). Ngoài ra, đối với MgONPs, mặc dù sự kết tụ là một vấn đề lớn hơn trong môi trường B so với trong nước ( Hình​2), một số tập hợp có kích thước lớn hơn 100 nm. Quan trọng hơn, điều tra tương ứng ở trên đã chứng minh rằng việc thiếu các tập hợp lớn có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc ức chế R. solanacearum .

Đáng chú ý, những tác dụng ức chế này được thể hiện rõ ràng nhất trong giai đoạn phát triển theo lôgarit, có lẽ bởi vì các vi khuẩn non được sản xuất ồ ạt ở giai đoạn này là nhạy cảm nhất. Tương tự, các nhà nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng tính nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm E. coli và Pseudomonas aeruginosa đối với graphene oxide là cao nhất trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, trong đó vi khuẩn biểu hiện những thay đổi sinh lý và vi khuẩn khá kháng trong giai đoạn tĩnh, trong đó các tế bào không phát triển ( Das và cộng sự, 2011 ). Là chất kháng khuẩn vô cơ, MgONPs đã trực tiếp thể hiện một phổ độc tính rộng chống lại một số loại mầm bệnh, chẳng hạn như Gram âm ( E. coli ) và Gram dương ( S. aureus) vi khuẩn ( Cai et al., 2017 ) và thậm chí cả nấm Aspergillus niger và Penicillium oxalicum ( Sierra-Fernandez et al., 2017 ); tuy nhiên, vẫn còn thiếu các nghiên cứu về cơ chế chi tiết. Tóm lại, kết quả của các thí nghiệm trên khẳng định rằng MgONPs thể hiện đặc tính kháng khuẩn chủ yếu khi có mặt của R. solanacearum.

Thiệt hại về hình thái được quan sát bởi SEM và TEM

SEM thường được áp dụng để quan sát những thay đổi hình thái tế bào bên ngoài, và TEM có thể được sử dụng kết hợp và áp dụng cho các phần vi khuẩn để khám phá những thay đổi siêu cấu trúc trong các tế bào gây bệnh ( Sun và cộng sự, 2017 ). Chúng tôi sử dụng cả SEM và TEM để khảo sát sự tương tác giữa hai dạng MgO và tế bào vi khuẩn để so sánh những thay đổi tế bào của tế bào không được xử lý và được xử lý trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân.

Sự toàn vẹn của hình thái được duy trì ở nhóm không được xử lý ( Hình​4a). Ngược lại, các khuẩn lạc vi khuẩn tiếp xúc với MgONPs (250 μg / mL) bị phá vỡ nghiêm trọng, biểu hiện sự co rút (các mũi tên màu vàng trong Hình​4c). Tuy nhiên, đối với vi khuẩn được xử lý bằng MgO bulk, chỉ những phần nhỏ của màng tế bào trở nên thô ráp (các mũi tên màu vàng trong Hình​4b); Các phần của cấu trúc tế bào rỗng và méo mó đã được quan sát thấy. Như quan sát trong các hình ảnh TEM ( Hình​ 6) và được chỉ ra bởi các tế bào rỗng (mũi tên màu đỏ), các MgONP có thể phá hủy hoặc phân hủy thành tế bào để xâm nhập vào tế bào vi khuẩn; thiệt hại này cuối cùng có thể dẫn đến rò rỉ thành phần nội bào, dẫn đến chết tế bào ( Hình6d, e), phù hợp với kết quả của một nghiên cứu trước đây ( Jin và He, 2011 ).

Hình 4 Ảnh hiển vi SEM của R. solanacearum sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Các ô tròn và nguyên vẹn là ô điều khiển. (a) Sau khi xử lý với 250 μg / mL MgO bulk, có thể nhìn thấy các lỗ nhỏ ở (b) , trong khi các tế bào được ủ với 250 μg / mL nano magie oxit MgONP có các hố sâu và các tế bào vỡ. (c) Các màn hình phía dưới là phần được phóng to của các hình chữ nhật màu vàng phía trên.

Hình 6 Hình ảnh TEM của tế bào R. solanacearum được xử lý bằng nước DI (a) , 250 μg / mL MgO (b) và 250 μg / mL MgONPs (c) . Hỗn dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm được bổ sung các dạng MgO khác nhau và ủ ở 30 ° C trong 2 giờ. (d) Quan sát màng vi khuẩn bị hư hỏng của vi khuẩn được xử lý bằng nano magie oxit MgONP bằng TEM. (e) Độ hấp thụ dòng chảy của vật liệu tế bào chất (DNA và RNA) ở bước sóng 260 nm sau khi các tế bào được ủ với các nồng độ khác nhau của MgO và MgONPs. Các thanh lỗi trong biểu đồ thể hiện độ lệch chuẩn và ∗∗ cho biết p <0,01.

Ngoài ra, một máy quang phổ phân tán năng lượng (EDS) với phân tích SEM ( Hình​5c) được sử dụng để xác định sự hấp phụ của nano magie oxit MgONPs trên bề mặt tế bào và hiện tượng tương tự đã được quan sát thấy trong các điều kiện được xử lý bằng MgO bulk ( Hình​5b). Chúng tôi suy đoán rằng cả hai loại bột MgO đều bám vào thành tế bào vi khuẩn và thu được kết quả như mong đợi. Cụ thể, trong vùng được phóng to, so với các ô đối chứng có một ô tròn mà không có bất kỳ nguyên tố Mg nào ( Hình5a), cấu trúc hình thái bóng và giống hình que, sau khi ủ với nano magie oxit MgONPs, đã quan sát thấy những bất thường đáng kể về hình thái tế bào và bao không hoàn chỉnh ( Hình​4c). Tuy nhiên, ở nồng độ cao (250 μg / mL) của lượng lớn MgO, không có bất thường rõ ràng nào về hình thái bề mặt của hầu hết các tế bào ( Hình​4b), trong khi vẫn có một nguyên tố Mg hiển nhiên trên bề mặt tế bào ( Hình​5b). Hoạt động kháng khuẩn tăng cường rõ ràng của MgONPs đã thu hút sự chú ý của chúng tôi để xác định cơ chế kháng khuẩn của chúng. Về trung tâm phản ứng hấp phụ và bề mặt, bề mặt của MgO chứa một số lượng lớn các vị trí hoạt động, chẳng hạn như axit Mg ²⁺ , O ^– , Lewis, nhóm hydroxyl giới hạn, nhóm hydroxyl tự do, và các lỗ trống cation và anion ( Jeevanandam và Klabunde, 2002 ), có thể có lợi cho hoạt động kháng khuẩn của nó. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng với kích thước giảm dần của các hạt bột, phân tử bề mặt là phần nhỏ, do đó cải thiện một số tính chất, chẳng hạn như tốc độ hòa tan và hoạt tính xúc tác ( Dizaj và cộng sự, 2014 ). Hơn nữa, Sawai et al. (1996)tiết lộ rằng MgONP có mức độ độc hại khác nhau tùy thuộc vào các loại vi khuẩn khác nhau; Quan sát thấy sự ức chế tốt hơn đối với vi khuẩn hình que (như E. coli và Bacillus subtilis ) so với vi khuẩn hình cầu. Về mặt này, MgONPs có các ứng dụng tiềm năng như là chất diệt khuẩn hình que và có thể được áp dụng đáng kể cho R. solanacearum. Hơn nữa, theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, là một loại vi khuẩn Gram âm, R. solanacearum là một tế bào vi khuẩn tích điện âm. Thật thú vị, người ta đã báo cáo rằng lực hút tĩnh điện giữa các tế bào tích điện âm và các hạt nano tích điện dương có thể đóng một vai trò quan trọng trong độc tính của các hạt nano đối với vi sinh vật (Seil và Webster, 2012 ). Các hạt nano tích điện trái dấu liên kết chặt chẽ và dễ dàng với bề mặt tế bào, do đó gây ra sự kết tụ và sau đó làm tăng độc tính đối với vi khuẩn ( Le Ouay và Stellacci, 2015 ). Mặc dù sự tương tác của các hạt nano với tế bào R. solanacearum không có nghĩa là làm thay đổi các chức năng tiếp theo của tế bào, nhưng tác hại to lớn đối với thành tế bào là cảm hứng, bởi vì những bất thường của R. solanacearum là dấu hiệu của cơ chế kháng khuẩn chính của hạt nano. Do đó, những tương tác này có thể là một con đường quan trọng để thâm nhập vào tế bào vi khuẩn để cuối cùng tiêu diệt vi khuẩn.

Hình 5 Quét hình ảnh hiển vi điện tử với phép phân tích quang phổ tia X (EDS) phân tán năng lượng của (a) R. solanacearum , (b) các tế bào được xử lý với 250 μg / mL MgO bulk, và (c) những tế bào được xử lý với 250 μg / mL  nano magie oxit MgONPs.

Đo tính toàn vẹn màng tế bào vi khuẩn

Có một bao tế bào chắc chắn bao bọc các tế bào vi khuẩn Gram âm. Vỏ tế bào, được cấu tạo bởi polyme peptidoglycan, xác định hình dạng tế bào và bảo vệ nó khỏi quá trình ly giải thẩm thấu ( Bindhu và cộng sự, 2016 ). Hơn nữa, các chỗ trống oxy của MgONPs nằm ở bề mặt của tế bào hoặc gần bề mặt hạt ( Dizaj và cộng sự, 2014 ). Do đó, điều cần thiết là phải xác định thêm liệu hoạt tính kháng khuẩn của MgONPs có thể được cho là do tổn thương trực tiếp của màng tế bào chất hay không.

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm bằng Bộ công cụ khả năng sống của vi khuẩn BacLight LIVE / DEAD, đây là một phương pháp thuận tiện và hiệu quả cao để theo dõi tính toàn vẹn của màng tế bào. Thuốc nhuộm huỳnh quang có các vị trí liên kết nội bào cụ thể có thể được sử dụng để tiết lộ thông tin sinh lý quan trọng của vi khuẩn ( Sun và cộng sự, 2017 ). Sau khi nhuộm bằng kit LIVE / DEAD trong một thời gian ngắn, các tế bào có màng bị tổn thương được coi là đã chết hoặc đang chết sẽ nhuộm màu đỏ, trong khi các tế bào có màng nguyên vẹn sẽ có màu xanh lục. Số liệu8d, e hiển thị hình ảnh huỳnh quang của R. solanacearum với sự hiện diện của nano magie oxit MgONPs hoặc MgO bulk trong 2, 4, 8 và 12 giờ. Trong các hình ảnh đối chứng, tất cả các tế bào còn sống vì chúng được nhuộm màu xanh lá cây. Tuy nhiên, sau khi ủ với 250 mg / mL MgONPs hoặc MgO bulk, hình ảnh ngày càng thể hiện huỳnh quang đỏ khi thời gian ủ tăng lên. Hơn nữa, có một số lượng lớn tế bào chết và ít tế bào sống trong hình ảnh của các mẫu được xử lý bằng MgONP. Từ kết quả, chúng ta có thể kết luận rằng hoạt tính kháng khuẩn của MgONPs và MgO bulk xảy ra theo cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian, và những kết quả này càng khẳng định rằng các hạt nano gây ra sự ức chế cao hơn, điều này cũng phù hợp với các kết quả đã công bố trước đây trên vật liệu nano dựa trên carbon ( Chen và cộng sự, 2016). Hiệu quả của graphene và CNTs trong việc bất hoạt vi khuẩn E. coli và B. subtilis tăng lên khi tốc độ lắc, thời gian và nồng độ ngày càng tăng ( Liu và cộng sự, 2010 , 2011 ). Trên thực tế, số lượng lớn các hạt nano được thiết kế kỹ thuật (ENP) đã được chứng minh là cũng thể hiện những hiệu ứng này, chẳng hạn như ZnO, CuO và AgNPs ( Ivask và cộng sự, 2014 ). Hơn nữa, một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hạt nano quercetin được trang trí bằng hạt nano bạc thực sự đã giết chết các tế bào vi khuẩn, thay vì chỉ gây hại cho các tế bào ( Sun và cộng sự, 2017 ), nhưng MgONPs tương đối ít được nghiên cứu hơn.

Hình 8 Ảnh hưởng của nano magie oxit MgONPs và MgO bulk đến tính trạng vận động của R. solanacearum . Hình ảnh là nhu động co giật (a) và nhu động bơi (e) của R. solanacearum sau khi ủ với các nồng độ khác nhau của MgONPs và MgO bulk. Hình ảnh kính hiển vi đại diện bên trái cho thấy một số chi tiết, nhu động co giật (b) của đối chứng chưa được xử lý, (c) với MgO bulk 200 μg / mL, và (d) với MgONPs 200 μg / mL và nhu động bầy đàn (f) của đối chứng chưa xử lý, (g) với MgO khối lượng lớn 200 μg / mL, và (h) với MgONPs 200 μg / mL. Các mũi tên chỉ ra rìa thuộc địa ngoại vi rộng hơn củaR. solanacearum . Các thanh lỗi trong biểu đồ đại diện cho độ lệch chuẩn, và ∗ và ∗∗ lần lượt chỉ ra p <0,05 và p <0,01.

Phép đo dòng chảy tế bào thường cho phép phát hiện nhanh chóng sự xâm nhập của các hạt nano trong vi khuẩn sống ( Kumar và cộng sự, 2011a ). Ngoài ra, E. coli biểu hiện mức độ khử cực màng tế bào cao và một lượng lớn rò rỉ trong quá trình xử lý hạt nano, được xác định từ phân tích đo tế bào dòng chảy ( Kumar và cộng sự, 2011b ). PI là một loại fluorochrome không có khả năng đi qua màng tế bào nguyên vẹn nhưng có thể đi qua các tế bào bị thương hoặc chết. Sau khi xâm nhập vào tế bào, DNA sợi kép được nhuộm màu được quan sát bằng cách sử dụng ánh sáng cực tím. Ở đây, theo phân tích tế bào dòng kết hợp với PI, chúng tôi thu được một đánh giá nhanh chóng và chính xác về tổn thương cấu trúc tế bào. Như minh họa trong Hình​7c, tỷ lệ tế bào apoptotic của R. solanacearum tăng lên 41,5% so với đối chứng (2,1%) ( Hình7a) khi được ủ với 250 μg / mL MgONPs. Tuy nhiên, lượng lớn MgO với cùng liều lượng chỉ đạt được tỷ lệ tế bào apoptotic là 7,5% ( Hình7b). Nói chung, sự hiện diện dữ liệu của các MgONP được trình bày đã làm tăng tính thấm màng của tế bào R. solanacearum , có thể dẫn đến tổn thương hoặc chết tế bào.

Hình 7 Hình ảnh đo tế bào dòng chảy của tế bào R. solanacearum sau khi ủ với (a) nước vô trùng, (b) lượng lớn MgO, và (c) nano magie oxit MgONPs. Hình ảnh hiển vi huỳnh quang đồng bộ thu được bằng cách sử dụng Bộ đếm và khả năng sống của vi khuẩn BacLight LIVE / DEAD trong các thời gian khác nhau (0, 2, 4, 8 và 12 giờ) xử lý với (d) MgONPs và (e) lượng lớn MgO. Các tế bào có huỳnh quang màu xanh lá cây đại diện cho vi khuẩn sống, trong khi các tế bào màu đỏ là đại diện cho vi khuẩn chết.

Trong thử nghiệm này, các tế bào được xử lý bằng vật liệu nano trong môi trường B in vitro , trong đó các MgONP phản ánh các khả năng hòa tan khác nhau ( Hình​2). Kết quả này không có gì đáng ngạc nhiên, vì người ta biết rằng các hạt nano kim loại vẫn phân tán trong các điều kiện dung dịch khác nhau. Ngoài ra, một phân tích chi tiết đã phân biệt các tác dụng ức chế đối với R. solanacearum . Các MgONP cho thấy sự phân bố kích thước hạt tương tự trong nước khử ion và dung dịch chiết nền. Ngược lại, nhiều hạt tập hợp trong môi trường B chứa dung dịch muối hơn. Tương tự như vậy, các báo cáo trước đây đã tiết lộ rằng trong môi trường giàu KNO ₃ ^, sự tương tác giữa các vật liệu hữu cơ bề mặt và NP khiến AgNP dễ kết tụ hơn so với trong nước cất ( Zook và cộng sự, 2012). Nhìn chung, mặc dù một số kết tụ xảy ra trong môi trường B, các nano magie oxit MgONP vẫn thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ. Có vẻ như hành vi này có ít hoặc không ảnh hưởng đến hoạt động độc tính chống lại các mầm bệnh.

Trong khi đó, sự rò rỉ của vi khuẩn chắc chắn có thể xác định xem màng tế bào bị hư hại do MgONPs hay MgO bulk bởi vì, một khi màng tế bào bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài, các phân tử lớn, chẳng hạn như DNA và RNA sẽ bị rò rỉ ra ngoài và tăng nhanh độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm khi sử dụng Quang phổ UV – vis. Hình 6e cho thấy rằng hai nhóm MgO A ₂₆₀ tăng lên một cách phụ thuộc vào liều lượng. Giá trị A ₂₆₀ chỉ ra rằng các màng đã bị phá hủy nghiêm trọng, đặc biệt là khi có 250 μg / mL MgONPs. Trong trường hợp này, sự rò rỉ tế bào chất tăng mạnh, như được chỉ ra trong Hình​Hình 7d so với hình​ 7e, với khả năng thấm qua màng đáng kể. Jin và He (2011) cũng quan sát thấy một loạt các tổn thương tế bào sau khi đưa MgONPs với E. coli và Salmonella Stanley , chứng minh sự biến dạng và tổn thương của màng tế bào, dẫn đến sự rò rỉ của các tạp chất tế bào và cuối cùng dẫn đến tử vong.

Ngăn chặn sự hình thành của màng sinh học và tính di động

Tương tự như các vi khuẩn gây bệnh khác, R. solanacearum bám vào các bề mặt và tập hợp lại để tạo thành màng sinh học. Màng sinh học là các cộng đồng tế bào vi khuẩn được bao bọc trong một ma trận cao phân tử ngậm nước tự sản xuất bám vào bề mặt sống ( Zhang và cộng sự, 2014 ). Điều quan trọng là, sự hình thành các màng sinh học là một hệ thống mô hình mới, và các màng sinh học này có thể bảo vệ vi khuẩn khỏi các cuộc tấn công miễn dịch của vật chủ và có thể góp phần vào sự tồn tại của vi khuẩn trong quá trình nhiễm trùng tiềm ẩn và sống hoại sinh ( Bridier et al., 2011 ). Do đó, ở một mức độ nào đó, vi khuẩn mất khả năng hình thành màng sinh học có thể cho thấy ít độc lực hơn khi xâm nhập và xâm nhập trực tiếp vào mô vật chủ. Do đó, trong nỗ lực tìm hiểu cơ chế mà MgONPs đã kích hoạtR. solanacearum , chúng tôi đề xuất thêm để xác định xem sự hình thành màng sinh học có bị ức chế hay không.

Như được minh họa trong Hình bổ sung S2a, b , các MgONP làm giảm đáng kể sự phát triển của màng sinh học, và sự hình thành màng sinh học giảm dần khi xử lý bằng MgO bulk. Trong cả hai trường hợp, tương tự như các thử nghiệm khả năng tồn tại, hiệu quả ức chế có xu hướng trở nên mạnh hơn khi nồng độ tăng lên. Điều thú vị là các màng sinh học giảm đột ngột sau khi ủ với MgONPs trong 24 giờ, nhưng tác động ức chế của lượng lớn MgO là vừa phải. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với các nghiệm thức nồng độ thấp (50, 100 và 150 μg / mL) của MgONPs trong 48 và 72 giờ ủ không dẫn đến những thay đổi đáng kể về tính di động trong tế bào vi khuẩn. Chỉ các nghiệm thức 200 và 250 μg / mL thể hiện tác dụng ức chế cao đối với R. solanacearumhình thành màng sinh học khi các tế bào tiếp xúc với các hạt nano trong 48 giờ và 72 giờ tương ứng. Sự hình thành màng sinh học đã giảm lần lượt là 60,7 và 71,2% sau 24 giờ và 67,1 và 72,3% sau 72 giờ so với đối chứng.

Lấy cảm hứng từ một nghiên cứu trước đây, đối với vi khuẩn gây bệnh, bám bề mặt thường là bước khởi đầu trong quá trình sinh bệnh và tập hợp, đặc biệt là đối với R. solanacearum ( Addy và cộng sự, 2012 ). Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng các MgONP đã hạn chế sự hình thành màng sinh học, ngụ ý rằng chúng không chỉ ngăn chặn quá trình lây nhiễm của R. solanacearum trên cây chủ mà còn cải thiện tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Do đó, các hạt nano có các ứng dụng tiềm năng như là chất kháng khuẩn nông nghiệp hiệu quả cao. Hơn nữa, một cơ chế kháng khuẩn tương tự cũng được đề xuất bởi các nhà nghiên cứu khác, những người đang nghiên cứu độc tính của kim loại và các hạt nano kim loại chống lại vi khuẩn ( Radzig và cộng sự, 2013 ).Radzig và cộng sự. (2013) phát hiện ra rằng khả năng tồn tại của tế bào E. coli AB1157 trong màng sinh học đã giảm đáng kể bởi AgNPs ở nồng độ từ 100 đến 150 μg / mL.

Ngoài ra, một nghiên cứu kết hợp về nano magie oxit MgONPs và hoạt động chuyển động của chúng đã cung cấp một góc nhìn độc đáo để hiểu cách MgONPs ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học. Đáng ngạc nhiên là đã có sự giảm đáng kể trong cả hoạt động bơi lội và co giật của vi khuẩn khi được cấy vào môi trường thạch có chứa các hạt nano. Như mong đợi, tỷ lệ ức chế nhu động của MgONPs lần lượt là 95,60 và 93,40% đối với bơi và co giật, so với đối chứng không phơi sáng ( Hình8a, e). Phần rìa khuẩn lạc ngoại vi trong điều kiện kiểm soát đã phát triển chiều dài và chiều rộng tương đối rộng, trong khi khuẩn lạc của nghiệm thức MgONP thì nhẵn. Sau khi tiếp xúc với liều lượng 250 μg / mL, nhu động co giật của R. solanacearum được giới hạn ở mức 0,93 mm khi có mặt MgONP và 8,80 mm khi có mặt MgO. Ngược lại, của đối chứng là 14,10 mm. Hình ảnh kính hiển vi đại diện dưới 200 μg / mL được hiển thị trong Hình 8b–d. Khả năng bơi bị hạn chế ở 1,33 mm với 250 μg / mL MgONPs, và giới hạn ở 14,30 mm đối với cùng một nồng độ MgO khối lượng lớn so với đối chứng (30,20 mm) ( Hình 8e). Các hiệu ứng ức chế điển hình quan sát được trong thí nghiệm này được thể hiện trong Hình​8f–h. Nhìn chung, những kết quả này cung cấp cái nhìn sâu sắc về cách thức các MgONP ảnh hưởng đến các hành vi sinh học này, điều này có ý nghĩa quan trọng nhất đối với việc hiểu rõ độc lực của R. solanacearum , đặc biệt là liên quan đến sự xâm nhập và sinh sống của cây ký chủ. Hiện tượng này suy ra rằng các điều kiện bất lợi có thể gây ảnh hưởng đến sự biểu hiện phiên mã của các gen liên quan đến khả năng vận động của R. solanacearum ( Tahir và cộng sự, 2017 ). Tuy nhiên, nó vẫn không đủ để tiêu diệt tế bào vì màng sinh học bảo vệ vi khuẩn bên trong khỏi tác động của chất diệt khuẩn, mặc dù các nghiên cứu khác đã cho thấy hiệu suất ổn định trong việc kiểm soát sự hình thành màng sinh học ( Tahir và cộng sự, 2017 ).

Tích lũy stress oxy hóa nội bào và thiệt hại DNA do MgONPs gây ra

Xem xét hoạt tính mạnh hơn của nano magie oxit MgONPs so với MgO bulk chống lại R. solanacearum , như được chỉ ra trong các nghiên cứu ở trên, chúng tôi chỉ sử dụng MgONPs trong các nghiên cứu tiếp theo để nghiên cứu thêm các cơ chế độc tính. Oxy là cần thiết cho hầu hết các sinh vật sống, nhưng nó cũng là tiền chất của ROS, có thể làm hỏng các thành phần tế bào như protein, lipid và axit nucleic ( Applerot và cộng sự, 2012 ). Nhiều nghiên cứu trước đây về độc tính tế bào vật liệu nano tập trung vào stress oxy hóa như một con đường phổ biến cho cơ chế gây độc. Đáng chú ý, việc sản xuất ROS có thể dẫn đến tổn thương màng vì quá trình peroxy hóa lipid, gây rò rỉ vật liệu tế bào và ảnh hưởng đến hoạt động hô hấp, cuối cùng gây ra chết tế bào ( Le Ouay và Stellacci, 2015). Hơn nữa, nói chung, trong số một số con đường của stress oxy hóa, một con đường liên quan đến stress oxy hóa qua trung gian ROS và các tác động độc hại thường được chấp nhận do vật liệu nano gây ra liên quan đến việc sản xuất ROS ( Horst et al., 2013 ).

Như thể hiện trong Hình​9a–c, sự gia tăng đáng kể cường độ huỳnh quang DCF sau khi xử lý với 250 μg / mL nano magie oxit MgONPs đã được quan sát thấy so với chỉ dùng nước (đối chứng trắng) và rotenone ức chế ROS (đối chứng âm). Ti thể là nơi quan trọng để tạo ra ROS. Tuy nhiên, rotenone, một chất nhặt rác của chuỗi vận chuyển điện tử ty thể, có thể làm giảm đáng kể hàm lượng ROS ( Li F. và cộng sự, 2015 ). Do đó, mức độ huỳnh quang cho thấy MgONPs đã góp phần tạo ra ROS. Việc sản xuất ROS làm tăng căng thẳng oxy hóa trong tế bào, do đó gây ra DNA, protein và tổn thương tế bào ( Le Ouay và Stellacci, 2015). Kết quả chỉ ra rằng hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ của nano magie oxit MgONPs có thể liên quan đến việc tạo ROS, xảy ra trên bề mặt và trong tế bào vi khuẩn. Do đó, ROS nên được coi là mối liên hệ với hoạt tính kháng khuẩn của các loại bột này vì các chất oxy hóa mạnh này được biết là rất bất lợi cho các tế bào khỏe mạnh chuyển hóa đầy đủ chức năng ( Le Ouay và Stellacci, 2015 ). Ví dụ, một khi gốc tự do O _{2 được} ^hình thành, phù hợp với kết quả của một nghiên cứu trước đó ( Krishnamoorthy và cộng sự, 2012a ), thông qua hoạt động phản ứng khử đơn điện tử của O ₂ ^– , xúc tác trống oxy của tinh thể MgO có thể hòa tan oxy trong nước trên bề mặt. O₂ ^– có đặc tính oxy hóa mạnh và có khả năng thâm nhập vào tế bào, do đó cuối cùng giết chết vi khuẩn ( Sirelkhatim và cộng sự, 2015 ). Các cơ chế tương tự cũng được tìm thấy trong quá trình apoptosis của tế bào ung thư khi bị stress MgONP ( Krishnamoorthy et al., 2012b ).

Hình 9 Sự hình thành ROS trong tế bào R. solanacearum sau thời gian ủ bệnh 4 giờ mà không có (a) , chỉ với (b) MgONP và với (c) rotenone trước khi xử lý MgONPs. ROS được phát hiện bằng các phép đo huỳnh quang sử dụng chỉ thị DCF. (d) Phân tích điện di DNA bộ gen trong tế bào R. solanacearum được xử lý với các nồng độ nano magie oxit MgONP khác nhau trong 4 giờ. Các làn 1, 2, 3, 4 và 5 đại diện cho các nghiệm thức với lần lượt là 250, 200, 150, 100 và 50 μg / mL MgONP.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các MgONP trực tiếp bám vào thành tế bào xung quanh của R. solanacearum , làm tăng đáng kể hàm lượng nguyên tố Mg ( Hình​5c), và trong khi chờ đợi, các hạt nano tạo ra ROS nội bào và ngoại bào, dẫn đến tổn thương màng và bào quan ( Hình​ 4c,6c). Sau đó, thiệt hại này gây ra rò rỉ tế bào chất, chẳng hạn như protein và DNA, trong tế bào ( Hình​ 9) và cuối cùng dẫn đến bất hoạt tế bào.

Như mong đợi, các MgONP hòa tan được tích điện dương trong dung dịch trung tính, tạo điều kiện cho các tương tác tĩnh điện với vi khuẩn tích điện âm. Thật vậy, một kết luận tương tự đã được đưa ra bởi một báo cáo trước đây ( Liu và cộng sự, 2018 ). Tế bào vi khuẩn R. solanacearum được kết hợp với MgONP bằng lực tĩnh điện. Trong khi đó, các ion Mg được giải phóng khỏi các MgONP và được vận chuyển đến tế bào chất ( Jin và He, 2011 ). Hơn nữa, các phần của MgONP dễ dàng phản ứng với nước để tạo thành Mg (OH) ₂ , có thể trực tiếp xuyên qua thành tế bào, xâm nhập vào tế bào và sau đó gây chết tế bào ( Dong et al., 2010 ). Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào cơ chế kháng khuẩn Mg (OH) _{2 (}Dong và cộng sự, 2011 ; Pan và cộng sự, 2013 ). Trọng tâm này không có gì đáng ngạc nhiên, vì người ta biết rằng Mg (OH) ₂ , là một loại kiềm ít tan trong nước, có thể làm mất OH ^– trong nước và làm tăng giá trị pH. Hành vi này cũng có tác động đến O ₂ ^– , bền hơn trong môi trường kiềm, và góp phần vào hiệu quả kháng khuẩn cao hơn ( Yao và cộng sự, 2018 ). Hơn nữa, thực tế này đã chứng minh rằng hoạt động của MgONPs như một tác nhân diệt khuẩn mạnh không chỉ giới hạn trong một cơ chế mà liên quan đến các hệ thống phức tạp và đa dạng.

Để kiểm tra sự hư hại trực tiếp của DNA R. solanacearum bởi các MgONP, DNA phân lập được chiết xuất từ ​​các tế bào vi khuẩn được xử lý bằng MgONP được phân tích bằng điện di trên gel agarose. Các dải cường độ DNA bộ gen có thể được quan sát trong Hình9d. Có thể thấy rằng cường độ của dải DNA bộ gen khi xử lý bằng MgONPs thấp hơn so với đối chứng, thể hiện sự phân mảnh DNA đáng kể. Ngoài ra, khi nồng độ của nano magie oxit MgONPs tăng lên, cường độ của dải DNA bộ gen được quan sát thấy giảm đáng kể. Tương tự như vậy, các nghiên cứu khác đã đánh giá cơ chế kháng khuẩn của các loại bột kim loại khác ( Zheng và cộng sự, 2018 ). Đặc biệt, các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các hạt nano có thể ức chế sự tổng hợp của các thành phần thành tế bào, protein tế bào, DNA và RNA của vi khuẩn ( Raghupathi và cộng sự, 2011 ). Tóm lại, các kết quả đã chứng minh rằng MgONPs có thể cải thiện đáng kể hoạt động độc tính của nguyên tố Mg thông qua các tương tác tiếp xúc trực tiếp với R. solanacearum.

Mặc dù có đặc tính kháng khuẩn yếu hơn so với các nano magie oxit MgONP, nhưng không thể bỏ qua các bất thường nhỏ của tế bào R. solanacearum và thậm chí cả tác dụng ức chế khi xử lý bằng MgO bulk. Như được chỉ ra bằng các quan sát trực tiếp, một số cơ chế khả thi đã được đề xuất để mô tả các tế bào chịu nhiều tổn thương đối với cấu trúc vi mô của chúng do bị tổn thương cả về vật lý và hóa học. Các vết thương có lẽ không chỉ do các cạnh sắc của MgO tiếp xúc với màng mà còn do sự giải phóng Mg ²⁺ , sự hòa tan của O ₂ ^– , sự hấp phụ trên tế bào và một số lượng lớn các phản ứng oxy hóa khử phức tạp. Theo một đánh giá trước đây ( Le Ouay và Stellacci, 2015 ), chúng tôi đã suy đoán rằng việc giải phóng Mg²⁺ có thể là bước chính của hoạt động kháng khuẩn khi tiếp xúc với vi khuẩn. Do đó, khi kích thước của các kim loại giảm, đặc tính diệt khuẩn có thể được thúc đẩy bằng cách tăng giải phóng các ion; ví dụ, nanomet thể hiện vai trò ưu tiên trong hiệu quả kháng khuẩn ( Zheng và cộng sự, 2018 ), nhưng cơ chế này không phải là cơ chế duy nhất. Một khía cạnh quan trọng khác là hình dạng và sự hòa tan của kim loại, có ảnh hưởng đến tác dụng kháng khuẩn ( Misra và cộng sự, 2012 ). Cần lưu ý rằng sự khác biệt về thể tích lỗ của hai vật liệu đã được kiểm tra về sự tương tác với vi sinh vật và được phát hiện là đóng một vai trò quan trọng trong tác dụng kháng khuẩn ( Stark, 2011). Trong các trường hợp, chắc chắn rằng những tác dụng hiệp đồng này của MgONPs là nguyên nhân gây ra tác dụng kháng khuẩn đáng kể đối với R. solanacearum so với MgO bulk

Hiệu quả kiểm soát của MgONPs và MgO bulk trên bệnh héo rũ của vi khuẩn thuốc lá do R. solanacearum In Vivo gây ra

Để chứng minh rằng nano magie oxit MgONPs ức chế bệnh héo do vi khuẩn gây ra bởi R. solanacearum , các thí nghiệm trong chậu đã được tiến hành trong điều kiện nhà kính in vivo . Cây thuốc lá được cấy R. solanacearum thông qua việc cấy vào rễ không bị thương và mức độ nghiêm trọng của bệnh được tính 2 ngày một lần. Từ hình​10, có thể thấy rằng việc áp dụng MgONPs trong thí nghiệm trong nhà kính đã làm giảm đáng kể sức phá hoại của bệnh héo xanh vi khuẩn so với đối chứng không được xử lý. Xử lý với 250 μg / mL MgONPs làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh, dẫn đến chỉ số héo 62,5% sau 21 ngày ( Hình10a), trong khi với sự có mặt của hàm lượng MgO khối lượng lớn bằng nhau, chỉ số héo 93,20% đã được quan sát, so với chỉ số héo 98,5% trong đối chứng ( Hình10b). Các trạng thái phát triển của thực vật được hình dung theo các bức ảnh quang học. Việc áp dụng MgONPs có thể làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh héo xanh do vi khuẩn trên cây thuốc lá, như trong Hình10e, và một số lá mềm được quan sát thấy khi cây được xử lý với 250 μg / mL nano magie oxitMgONPs trái ngược với cây không được xử lý, biểu hiện của cây héo và chết toàn bộ ( Hình10c). Ngay cả với lượng lớn MgO với nồng độ đồng đều, cây cối sẽ héo và chết ( Hình10 ngày). Tuy nhiên, kết quả chỉ ra rằng sự kết dính của các MgONP trên bề mặt rễ cây thuốc lá đã xảy ra và hiện tượng tương đồng cũng đã được quan sát thấy với các vật liệu nano khác ( Ocsoy và cộng sự, 2013 ). Mặc dù vậy, vẫn có sự giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh sau khi tương tác với MgONPs, có khả năng ức chế một phần độc lực và khả năng gây bệnh của R. solanacearum . Quan trọng hơn, MgONPs thể hiện nhiều ưu điểm, chẳng hạn như không độc hại thực vật, yêu cầu liều lượng thấp và ổn định nhiệt kết hợp với không độc hại, cũng như không độc đối với con người, tạo ra triển vọng ứng dụng tuyệt vời cho bảo vệ thực vật ( Khot và cộng sự, 2012). Trước đây, người ta đã quan sát thấy rằng bằng cách sử dụng MgONPs ở nồng độ lên đến 1%, MgONPs đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh bằng cách gây ra tính kháng toàn thân của cây cà chua đối với R. solanacearum ( Imada et al., 2016 ). Tương tự, một số lượng lớn vật liệu nano đã được quan sát để kiểm soát các phytopathogens khác trong quản lý cây trồng nông nghiệp. Vật liệu nano oxit graphene cho thấy tác dụng kháng khuẩn cao đối với vi sinh vật gây bệnh khi được áp dụng cho vi khuẩn Pseudomonas syringae và Xanthomonas campestris pv. undulosa và thậm chí cả hai loại nấm gây bệnh ( F. graminearum và Fusarium oxysporum ) ( Chen và cộng sự, 2014). Hơn nữa, Mg là một nguyên tố khoáng cần thiết cho sức khỏe cây trồng đã được sử dụng để cân bằng dinh dưỡng và tham gia vào một loạt các chức năng sinh lý (tham gia vào quá trình bảo vệ, độc lực hoặc bệnh sinh của cây). Là một đóng góp quan trọng, lợi ích của Mg có thể dẫn đến việc tăng sức đề kháng của các mô để giảm thiểu bệnh tật, đây là một công cụ chưa được sử dụng hết để cản trở tỷ lệ mắc bệnh ( Huber và Jones, 2013 ). Cần phải đề cập rằng huyền phù nano magie oxit MgONP có thể giải phóng vài chục nghìn nguyên tử Mg, và trong nghiên cứu sau đây của chúng tôi, người ta quan sát thấy rằng MgONPs có thể được hấp thụ vào mô thực vật và cung cấp các chất dinh dưỡng thuận lợi cho sự phát triển của cây (dữ liệu chưa được công bố); một tác dụng tương tự cũng đã được chứng minh trên cây dưa hấu bởi Wang et al. (2013). Tiếp theo, chúng tôi sẽ mở rộng các nghiên cứu này bằng cách khám phá ảnh hưởng của MgONPs đối với các loài thực vật khác nhau.

Hình 10 Hoạt động kháng khuẩn của nano magie oxit MgONPs và MgO bulk chống lại R. solanacearum in vivo . Các chỉ số bệnh của cây thuốc lá được khảo sát sau khi xử lý với các nồng độ khác nhau (50, 100, 150, và 250 μg / mL) của (a) lượng lớn MgO và (b) MgONP. Tất cả các nhà máy đã được kiểm tra trong thiết lập theo một thiết kế khối hoàn chỉnh ngẫu nhiên và các thanh lỗi đại diện cho SEM. Các bức ảnh quang học 15 ngày sau khi tưới với (c) nước cất và (d) 250 mg / mL MgO bulk và (e) MgONP được chụp bằng máy ảnh Nikon để khảo sát hiệu quả kiểm soát.

Thử nghiệm Độc tính của Nhà máy Thuốc lá trong Phòng Phát triển Thực vật

Độc tính nano, như một khái niệm mới nổi, đang ngày càng thu hút sự chú ý với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ nanomet ( Ruotolo và cộng sự, 2018 ). Vì nano magie oxit MgONPs đã được xác nhận là một chất diệt khuẩn xuất sắc trong nghiên cứu của chúng tôi, nên cần phải điều tra mối quan tâm về những tác dụng phụ sau đó của việc sử dụng chúng trên cây trồng và những tác động có hại tiềm ẩn đối với môi trường và sức khỏe con người.

Trong nghiên cứu này, thuốc lá được sử dụng để đánh giá độc tính và sinh khả dụng của nano magie oxit MgONPs. Thuốc lá được tiếp xúc với MgONPs với nồng độ từ 0 đến 250 μg / mL trong giá thể ma trận trong 30 ngày trong buồng thực vật. Như trong hình​ 11, chiều cao và trọng lượng của cây thuốc lá tăng lên sau khi được xử lý bằng MgONPs. Cụ thể, nồng độ 50 μg / mL không có ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng phần nền. Ngoài ra, chiều cao và trọng lượng trung bình của cây dưới 150–250 μg / mL có thể so sánh cao với đối chứng, đặc biệt đối với 250 μg / mL MgONPs ( Hình11C). So với đối chứng, các cây được xử lý với 50, 150 và 250 μg / mL MgONPs cho thấy chiều cao phần mặt đất là 11,5, 11,77 và 12,87 cm ( Hình11A), với mức tăng tương ứng là 50,72, 54,26 và 68,68%. Hơn nữa, trọng lượng khô ở phần mặt đất tăng 47,77% với việc xử lý 250 μg / mL MgONPs ( Hình11B) là hiệu ứng tốt nhất so với những cái khác. Do đó, người ta đã xác định rằng 0–250 μg / mL MgONPs có thể tăng cường sự phát triển của cây thuốc lá.

Hình 11 Ảnh hưởng của nano magie oxit MgONPs đến chiều cao cây và trọng lượng cây thuốc lá sau 30 ngày xử lý. (A) Chiều cao cây và (B) trọng lượng khô cho thấy sự phát triển sau khi tiếp xúc với các nồng độ MgONP khác nhau. (C) Đại diện cho sự phát triển của cây thuốc lá được xử lý với 250 μg / mL MgONPs (3 cây bên trái) và với nước (3 cây bên phải), tương ứng. Thanh lỗi trong biểu đồ biểu thị độ lệch chuẩn, và ∗ và ∗∗ lần lượt cho biết p <0,05 và p <0,01.

Một kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây ( Rathore và Tarafdar, 2015 ), trong đó lúa mì đạt năng suất cây trồng cao hơn với việc áp dụng MgONPs, thậm chí còn cho thấy khả năng cải thiện khả năng huy động chất dinh dưỡng bản địa và sức khỏe của đất. Nhiều báo cáo cũng quan sát thấy rằng các hạt kích thước nano kim loại khác nhau giúp tăng cường sự phát triển của thực vật ( Tarafdar và cộng sự, 2014 ); ví dụ, các hạt nano TiO _{2 như một chất diệt khuẩn quang xúc tác có thể được kết hợp vào phân bón để cải thiện năng suất cây trồng thông qua quá trình quang hấp thụ nitơ (} Raliya và cộng sự, 2015 ). Ngoài ra, một số báo cáo tiết lộ rằng các hạt nano làm tăng dòng chảy hydro và hấp thụ chất dinh dưỡng bằng cách tạo ra các lỗ chân lông mới ( Castiglione et al., 2011) và thậm chí tăng cường hàm lượng chất diệp lục trong cây ( Shah và cộng sự, 2015 ). Do đó, nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp một dấu hiệu cho thấy rằng nano magie oxit MgONPs trong khoảng nồng độ từ 0 đến 250 μg / mL có thể được sử dụng như một cách hiệu quả để bảo vệ thực vật và đồng thời, chúng có thể cải thiện sản xuất nông nghiệp. Các kết quả có thể được đánh giá thêm để đảm bảo sử dụng an toàn MgONPs trong nông nghiệp.

Nhìn chung, MgONPs, là tác nhân kháng khuẩn tiềm năng, đang nổi lên như một loại phương pháp điều trị rõ rệt cho bệnh héo xanh do vi khuẩn. Theo Hình 12, có một phương thức tương tác trực tiếp giữa MgONPs và R. solanacearum , và nhiều cơ chế kháng khuẩn đã được đề xuất. Sau khi các tế bào tiếp xúc với huyền phù hạt nano, các MgONP có thể làm xáo trộn mạnh mẽ các chức năng thiết yếu của màng tế bào đồng thời, chủ yếu là do các MgONP tích điện dương bám trực tiếp vào R. solanacearum tích điện âm.Đầu tiên, các MgONP làm hỏng cấu trúc thành tế bào và màng do tổn thương cơ học hoặc sản xuất ROS để bắt đầu rò rỉ tế bào chất trong tế bào. Sau đó, các MgONP ức chế sự kết tụ màng sinh học trên bề mặt và làm giảm khả năng di chuyển của vi khuẩn. Ngoài ra, sau khi xâm nhập vào tế bào, ROS có thể phá hủy DNA, cuối cùng dẫn đến cái chết của vi khuẩn. Cuối cùng, MgONPs đã làm giảm đáng kể các bệnh hoang dã so với đối chứng không được điều trị.

Hình 12 Sơ đồ tương tác giữa nano magie oxit MgONPs và R. solanacearum và cơ chế độc tính của MgONPs. Trong quá trình này, các tế bào vi khuẩn được tổng hợp với các MgONP. Các tương tác dẫn đến phá hủy màng tế bào, gây rò rỉ tế bào chất và hình thái bất thường, đồng thời ức chế hoạt động của màng sinh học và khả năng vận động. Ngoài ra, các MgONP gây ra sự hình thành ROS và một khi các loài oxy hóa xâm nhập vào tế bào chất, chúng làm hỏng và phân mảnh DNA, cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào.

Sự kết luận

Trong nghiên cứu này, nano magie oxit MgONPs thể hiện đặc tính kháng khuẩn vượt trội đối với R. solanacearum ở nồng độ cực thấp (250 μg / mL) so với MgO bulk, có thể ngăn ngừa bệnh cho cây chủ. Hoạt tính kháng khuẩn của MgONPs cho thấy sự ức chế phụ thuộc nồng độ đáng kể khi tiếp xúc mật thiết với R. solanacearum. Hơn nữa, các MgONP được hấp thụ và phân tán trên thành tế bào vi khuẩn, dẫn đến phá hủy hoặc làm tan rã thành tế bào, sau đó thâm nhập vào tế bào vi khuẩn, dẫn đến rò rỉ nội bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào. Dữ liệu cho thấy sự phá hủy tính toàn vẹn của màng tế bào có liên quan đến tổn thương vật lý và sản xuất stress oxy hóa trên vi khuẩn hoặc màng tế bào. Ngoài ra, việc sản xuất phân mảnh DNA và độc tính gen có lẽ được kết nối với oxy phản ứng. Sự ức chế nhu động bơi và chuyển động co giật có thể cho thấy rằng các hạt nano cũng làm giảm sự hình thành màng sinh học của R. solanacearum, làm giảm đáng kể sự lây nhiễm vi khuẩn cho cây ký chủ. Tóm lại, chúng tôi kỳ vọng rằng nano magie oxitMgONPs có thể đưa ra một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn làm chất kháng khuẩn và có thể được mở rộng cho các phytopathogens khác trong các ứng dụng tiềm năng để kiểm soát bệnh thực vật trong tương lai.

Nguồn: Magnesium Oxide Nanoparticles: Effective Agricultural Antibacterial Agent Against Ralstonia solanacearum

Lin Cai,^1,‡ Juanni Chen,^1,‡ Zhongwei Liu,² Hancheng Wang,³ Huikuan Yang,¹ and Wei Ding^1,*†