Astaxanthin được cho ăn giúp tăng tốc độ tăng trưởng, cải thiện màu sắc và tăng khả năng chống chịu tình trạng thiếu oxy và stress amoniac (NH3) ở tôm thẻ chân trắng
Astaxanthin (AX) là một loại caroten tự nhiên thường được sử dụng như một chất bổ sung chế độ ăn uống trong ngành nuôi tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương ( Litopenaeus vannamei ). Nghiên cứu này đã đánh giá tác động của astaxanthin tổng hợp hóa học đối với hiệu suất tăng trưởng, tỷ lệ sống, khả năng chống chịu căng thẳng, phản ứng miễn dịch và sắc tố của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương được cho ăn chế độ ăn có bổ sung 5 mức AX trong chế độ ăn có chứa 0, 20, 40, 80 và 160 mg/kg−1. Thử nghiệm cho ăn được tiến hành trong 8 tuần. Kết quả cho thấy những cá thể được cho ăn chế độ ăn có bổ sung AX thể hiện hiệu suất tăng trưởng tốt hơn, có trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW), mức tăng trọng lượng cơ thể (BWG), tỷ lệ tăng trưởng cụ thể (SGR) và Myostatin ( MSTN )cho thấy sự gia tăng phụ thuộc vào liều lượng Astaxanthin. Sau khi kiểm tra tình trạng thiếu oxy cấp tính và stress amoniac, tỷ lệ sống (SR) của tôm được cho ăn với chế độ ăn 40, 80 và 160 mg/kg cao hơn so với nhóm đối chứng.. Các nhóm ăn kiêng AX đã cải thiện khả năng chống oxy hóa của họ để ngăn ngừa tổn thương oxy hóa, bao gồm tăng hoạt động của axit phosphatase (ACP), tổng khả năng chống oxy hóa (T-AOC) và giảm hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT), hàm lượng malondialdehyde (MDA) so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự biểu hiện gen của các enzym chống oxy hóa khác nhau trong gan tụy của tôm được điều chỉnh cao hơn đáng kể như mangan superoxide dismutase (MnSOD) và glutathione S-transferase (GST). Biểu hiện cao của yếu tố gây thiếu oxy-1α (HIF-1α) và glutamate dehydrogenase (GDH-β), glutamine synthetase (GS) trong nhóm 80 và 160 mg kg -1cho thấy tác dụng của chúng đối với quá trình đường phân, điều này rất quan trọng đối với quá trình sản xuất năng lượng yêu cầu. Phân tích hồi quy bậc hai chỉ ra rằng mức tối ưu cho tăng trưởng và sắc tố lần lượt là 126,94 mg kg-1và 138,96 mg kg-1. Tóm lại, Astaxanthin có thể nâng cao hiệu suất tăng trưởng, giảm bớt stress oxy hóa và amoniac, cải thiện khả năng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương.
1 . Giới thiệu
Litopenaeus vannamei là một trong những loài giáp xác biển thương mại quan trọng nhất về mặt kinh tế và thương mại đối với nuôi trồng thủy sản, được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng nhanh, thịt mềm, khả năng chịu đựng căng thẳng tốt, khả năng sinh sản tuyệt vời và giá trị dinh dưỡng cao . Những tính năng vượt trội này dẫn đến giá trị thị trường cao và nhu cầu thị trường ngày càng tăng ( Jin và Du, 2015 , Liang và cộng sự, 2008 , Pan và cộng sự, 2007 ). Tuy nhiên, tôm dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường khác nhau do nuôi thâm canh mật độ cao để tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản , khi hệ thống nuôi trồng thủy sản không được thiết kế tốt hoặc quản lý kém ( Aklakur, 2018 , Fan et al., 2016, Pan và cộng sự, 2007 ). Trong hệ thống nuôi trồng thủy sản, việc thay nước không đủ và lượng thức ăn đầu vào cao sẽ tạo ra hàm lượng amoniac quá mức và gây ra lượng oxy hòa tan (DO) thấp trong nước ( Chen et al., 2012 ), gây ra nhiều rối loạn chức năng sinh lý cơ thể như các loại oxy phản ứng (ROS ) gây ra tổn thương, ức chế miễn dịch và thay đổi mô học ( Hong và cộng sự, 2007 , Harris và cộng sự, 2001 ). Tiếp xúc lâu dài với môi trường cuối cùng dẫn đến dịch bệnh bùng phát và động vật thủy sinh chết ( Jiang et al., 2005). Do những nguy cơ này đối với các hoạt động nuôi trồng thủy sản, việc cải thiện những khả năng này có thể đạt được thông qua việc bổ sung chế độ ăn uống có chất chống amoniac và chất chống oxy hóa, chẳng hạn như vitamin C , α-tocopherol và carotenoids .
Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β, β’-carotene-4,4′-dione), một loại caroten có màu đỏ cam, thường được sử dụng làm chất bổ sung chế độ ăn uống, chất tạo màu và sản phẩm dinh dưỡng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đó là được tìm thấy rộng rãi ở động vật biển trong tự nhiên ( Ambati et al., 2014 , Mezzomo and Ferreira, 2016 ). Cho đến nay, rất nhiều thông tin có giá trị liên quan đến chức năng của astaxanthin đã được phát hiện trong nuôi trồng thủy sản. Nó được báo cáo là có lợi cho sự tăng trưởng, lột xác và sinh sản của động vật thủy sinh ( Ambati et al., 2014 , Lim et al., 2018 , Higuera-Ciapara et al., 2006 , Wade et al., 2017b). Astaxanthin (AX) là sắc tố chính trong tôm, giúp tôm có màu đỏ cam lý tưởng ( Shigeru et al., 1994 ), do đó làm tăng nhu cầu của người tiêu dùng ( Wade et al., 2017a ). Một vai trò quan trọng khác của AX là chức năng chống oxy hóa tế bào đối với động vật, vì nó chứa các loại chất chống oxy hóa và chất thu dọn gốc tự do, đồng thời ức chế quá trình peroxy hóa lipid , có thể làm giảm căng thẳng oxy hóa do các yếu tố môi trường gây ra ( Miki, 1991 ). Do hoạt tính chống oxy hóa tuyệt vời của nó , AX cũng được sử dụng rộng rãi như một chất thúc đẩy và điều hòa hệ thống miễn dịch để tăng cường đáp ứng miễn dịch và khả năng chống chọi với stress của tôm chống lại stress do thiếu oxy (Chien và Shiau, 2005 ), stress do mặn và stress do amoniac ( Flores et al., 2007 , Pan et al., 2003 ). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các enzym chống oxy hóa catalase , superoxide dismutase , peroxidase và các chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) trong huyết tương và gan chuột bị ảnh hưởng bởi AX ( Ranga và cộng sự, 2010 , Saad và cộng sự, 2016 ). Vì vậy, sử dụng AX làm phụ gia thức ăn chăn nuôitrong nuôi giáp xác để cải thiện chất lượng sinh vật có lợi hơn cho việc nâng cao năng suất, điều này đã được báo cáo ở cua và các loại tôm khác. Tuy nhiên, thông tin cơ bản chi tiết về hiệu ứng AX của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei đối với khả năng chống chọi với stress vẫn chưa được biết.
Việc đánh giá các thông số sinh hóa (hoạt động của enzyme và biểu hiện gen tương đối) của tôm là rất cần thiết trong việc đánh giá tác động của việc bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn khi bị stress. Tổng khả năng chống oxy hóa (T-AOC) được coi là một chỉ số toàn diện về tình trạng chống oxy hóa và tình trạng sức khỏe của sinh vật ( Griendling và Alexander, 1997 ; Castillo et al., 2006 ). Catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GSH-Px) là các enzym bảo vệ quá trình oxy hóa, có những thay đổi phản ánh trạng thái sinh lýcủa sinh vật hoặc tế bào trong các điều kiện môi trường khác nhau ở một mức độ nhất định. Do đó, chúng có thể được coi là chỉ số sinh lý quan trọng để xác định liệu tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương có phải chịu áp lực từ môi trường bên ngoài hay không ( Li et al., 2021 ). Hơn nữa, là chỉ số trực tiếp của AX đối với các tác động sinh lý và miễn dịch, việc điều chỉnh biểu hiện gen của các enzym chuyển hóa khác nhau có mối quan hệ chặt chẽ với cường độ chuyển hóa của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương đối với phản ứng căng thẳng, chẳng hạn như enzym chống oxy hóa (glutamate dehydrogenase-β, GDH-β; glutamine synthetase, GS) và giải độc amoniac (Mangan superoxide dismutase, MnSOD; glutathione S-transferase, GST) et al. ( Mayzaud và Conover, 1988 , Ahn và cộng sự, 2019). Do đó, quy định về biểu hiện gen tương đối có thể phản ánh rằng các chế độ ăn AX khác nhau ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa sinh lý của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương khi bị căng thẳng.
Cho đến nay, có rất ít tài liệu khám phá ảnh hưởng của AX đối với khả năng chống lại stress amoniac và stress do thiếu oxy ở tôm thẻ chân trắng L. vannamei . Liệu việc bổ sung AX trong chế độ ăn có tác dụng có lợi đối với tỷ lệ sống sót của tôm thẻ chân trắng L. vannamei khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy và amoniac hay không và cơ chế điều hòa miễn dịch vẫn chưa rõ ràng. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện để xác định ảnh hưởng của AX đến năng suất tăng trưởng, màu sắc, khả năng chống oxy hóa và khả năng chống chịu amoniac của tôm thẻ chân trắng L. vannamei . Dữ liệu của chúng tôi góp phần nâng cao hiểu biết về mối quan hệ phản ứng giữa AX và tình trạng thiếu oxy và khả năng chịu đựng amoniac của L. vannamei , có thể cung cấp tài liệu tham khảo cho thức ăn công thức của L. vannamei .
2 . Nguyên liệu và phương pháp
2.1 . Chế độ ăn thử nghiệm
Một sắc tố tổng hợp hóa học (Astaplus®10%; Guangzhou Juyuan Bio-chem Co., Ltd., Guangzhou, China), với hàm lượng astaxanthin tự do là 10%, đã được sử dụng làm nguồn bổ sung AX. Do có sự khác biệt tương đối lớn về lượng AX và các thành phần khác (sucrose, tinh bột ngô , gelatin, natri octenylsuccinat tinh bột, hydroxytoluen butylat hóa) trong nguồn này nên sự đóng góp của các thành phần khác không được xem xét. Công thức chế độ ăn uống cơ bản và phân tích thành phần gần đúng được thể hiện trong Bảng 1 . AX được bổ sung vào chế độ ăn cơ bản ở nồng độ lần lượt là 0, 20, 40, 80 và 160 mg kg -1 . Nồng độ thực tế của AX trong năm chế độ ăn thử nghiệm cũng được thể hiện trongBảng 1 . Tất cả các nguyên liệu khô được nghiền mịn, cân và trộn kỹ, sau đó các thành phần lipid và Astaplus®10% được thêm vào hỗn hợp, và cuối cùng, nước (40% trọng lượng nguyên liệu khô) được thêm vào và trộn kỹ. Khẩu phần có đường kính 1,2 mm được sản xuất bằng cách sử dụng máy đùn một trục vít . Các chế độ ăn được sấy khô trong lò nướng điện ở 40°C cho đến khi độ ẩm giảm xuống <10% và được bảo quản trong túi nhựa ở -20°C cho đến khi sử dụng.
Bảng 1 . Công thức và thành phần gần đúng của năm chế độ ăn thử nghiệm (trọng lượng khô).
2.2 . Thử nghiệm nuôi tôm và quản lý nuôi
Thí nghiệm được tiến hành tại Cơ sở Thâm Quyến, Viện Nghiên cứu Thủy sản Biển Đông thuộc Học viện Thủy sản Trung Quốc (Thâm Quyến, Trung Quốc). Tôm thẻ chân trắng L. vannamei chưa trưởng thành được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Lianzhong Toàn cầu Thâm Quyến (Thâm Quyến, Trung Quốc). Trước khi thí nghiệm cho ăn, tất cả tôm được làm thích nghi với điều kiện thí nghiệm và cho ăn khẩu phần đối chứng trong một tuần. sau khi thích nghi, tôm bị bỏ đói trong 24 giờ và sau đó tổng cộng 800 con tôm khỏe mạnh với trọng lượng cơ thể ban đầu khoảng 0,95 g được phân ngẫu nhiên vào 20 bể sợi thủy tinh hình trụ (500 L, 4 bể cho mỗi chế độ ăn, 40 con mỗi bể). Tất cả tôm được cho ăn chế độ ăn thử nghiệm ba lần mỗi ngày vào lúc 7:00, 12:00 và 18:00 với 6% trọng lượng cơ thể mỗi ngày trong tám tuần. Thức ăn thừa và chất thải phân được loại bỏ bằng siphon hàng ngày. Tỷ lệ tử vong được theo dõi và ghi lại hàng ngày. Việc phân bổ thức ăn được điều chỉnh dựa trên quan sát lượng thức ăn tiêu thụ. Tôm được duy trì trong một hệ thống dòng chảy với nước biển được lọc. Trong thời gian thí nghiệm, các thông số chất lượng nước biển được lưu giữ như sau: pH từ 7,9 – 8,0; nhiệt độ, 26–30 °C; độ mặn 30 ‰; amoniac-N, 0,05–0,07 mg L−1; DO, 5,8–6,7 mg L −1 . Thí nghiệm sử dụng chu kỳ sáng tối tự nhiên.
2.3 . chuẩn bị lấy mẫu
Khi kết thúc thử nghiệm cho ăn, tôm bị bỏ đói trong 24 giờ và sau đó tất cả những con tôm còn sống trong mỗi bể được cân và đếm để xác định trọng lượng cơ thể cuối cùng và tỷ lệ sống. Năm con tôm của mỗi bể được thu thập ngẫu nhiên và bảo quản ở -20°C để phân tích xác định nồng độ AX và gần đúng cơ thể. Một mẫu tan máu được thu thập từ xoang bụng của sáu con tôm trong mỗi bể. Sau đó, các mẫu tan máu được trộn nhẹ nhàng trong ống Eppendorf không có RNase, sau đó giữ ở 4 ° C qua đêm. Sau đó, nó được ly tâm ở 8000 g trong 10 phút ở 4 ̊C để thu được huyết thanh. Sau đó, gan tụy và cơ của tôm được mổ xẻ và đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80°C để tiếp tục xác định biểu hiện gen và các hoạt động enzym. Ba con tôm được lấy mẫu ngẫu nhiên từ mỗi bể để đo màu.
2.4 . thí nghiệm căng thẳng
Sau một thử nghiệm cho ăn kéo dài 8 tuần, các thí nghiệm về tình trạng thiếu oxy và stress amoniac đã được thực hiện tương ứng. Tổng cộng có 200 cá thể trong 5 nhóm chế độ ăn uống không được điều trị là nhóm đối chứng, trong khi những con tôm còn lại được điều trị bằng tình trạng thiếu oxy và căng thẳng amoniac. Khi kết thúc thử nghiệm thử thách, các mẫu máu và gan tụy được lấy ra khỏi tôm sống để kiểm tra chất chống oxy hóa và miễn dịch.
2.4.1 . Thí nghiệm căng thẳng thiếu oxy
Tổng cộng có 150 cá nhân trong năm nhóm ăn kiêng đã được thu thập cho thí nghiệm căng thẳng do thiếu oxy. Ba mươi con tôm cho mỗi chế độ ăn được chuyển vào ba túi nhựa (ba lần lặp lại, 10 cá thể được chỉ định ngẫu nhiên cho mỗi lần lặp lại) trước đó chứa đầy 10 L nước biển mới mà không cần bổ sung hoặc sục khí oxy ( Lu et al., 2019 ). Mỗi túi nhựa được buộc chặt và tỷ lệ sống sót được ghi lại mỗi giờ cho đến thời gian gây chết trung bình. Cuối cùng, thử nghiệm căng thẳng kéo dài trong khoảng thời gian 6 giờ. Oxy hòa tan được đo lúc ban đầu và sau 6 giờ quan sát. Tôm được theo dõi cẩn thận và tỷ lệ sống được ghi lại mỗi giờ cho đến thời gian gây chết trung bình. Nhiệt độ nước, độ pH và độ mặn trong túi được giữ lần lượt ở 26–30 °C, 7,9–8,0 và 30‰.
2.4.2 . Thí nghiệm căng thẳng amoniac
Tương tự, tổng cộng 150 cá nhân trong năm nhóm ăn kiêng đã được thu thập cho thí nghiệm căng thẳng amoniac. Ba mươi con tôm cho mỗi chế độ ăn (ba lần lặp lại, 10 cá thể được chỉ định ngẫu nhiên cho mỗi lần lặp lại) đã trải qua một thí nghiệm về stress amoniac. Dung dịch thử amoniac được chuẩn bị bằng cách thêm amoni clorua (NH 4 Cl) vào mỗi bể. Đề cập đến các nghiên cứu trước đây, một loại amoniac nồng độ cao (∼10 mg L -1 ) đã được thiết kế cho thí nghiệm ( Lu et al., 2019 ). Cuối cùng, nồng độ 12,85 mg L −1 NH 3-N được xác định theo Tiêu chuẩn quốc gia của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa (GB3097–1997) dựa trên độ mặn 30‰, độ pH 8,0 và nhiệt độ 26℃ vào thời điểm đó. Trong quá trình kiểm tra căng thẳng, tỷ lệ sống của tôm được theo dõi cẩn thận và ghi lại mỗi giờ cho đến thời gian chết trung bình. Quá trình thử nghiệm căng thẳng amoniac kéo dài trong khoảng thời gian 6,5 h.
2.5 . Thành phần gần đúng, AX và phân tích màu sắc
Độ ẩm, protein thô, tro thô và lipid thô của khẩu phần thí nghiệm và toàn bộ cơ thể được xác định theo quy trình AOAC ( AOAC, 1995 ). Độ ẩm được xác định bằng cách sấy khô trong tủ sấy ở 105°C trong 24 giờ; Hàm lượng protein thô được phân tích bằng phương pháp Kjeldahl sau khi phân hủy bằng axit (1030-auto-analyzer; Tecator, Hoganas, Thụy Điển); Tro thô được xác định sau khi đốt trong lò múp ở 550°C cho đến khối lượng không đổi; Lipid thô được đo thông qua phương pháp chiết xuất ether dầu hỏa bằng Soxtec System HT (Soxtec System HT6; Tecator).
Phân tích định lượng hàm lượng AX tự do trong chế độ ăn thử nghiệm và mô tôm được thực hiện bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo phương pháp của Wade et al. (2005) , với những sửa đổi nhỏ. AX được chiết xuất từ tôm xay và chế độ ăn với 50 ml acetone. Sau đó, chiết xuất axeton được lọc qua phễu thủy tinh cát, và cặn rắn được chiết hai lần với 30 ml axeton trong bể nước 40 ̊C để chiết tiếp cho đến khi chiết xuất toàn bộ về cơ bản là không có sắc tố .để có được trích xuất AX hoàn toàn miễn phí. Các dung môi được chuyển vào bình cầu đáy tròn và làm khô bằng cách bay hơi quay chân không ở 45°C. Dung dịch mẫu thu được bằng cách hòa tan cặn với 20 ml metanol cho đến khi phân tích HPLC. Quá trình phân tách HPLC được thực hiện trên cột Shimadzu VP-ODS (150 L × 4,6: kích thước hạt 5 µm). AX tự do được xác định ở bước sóng 470nm. Pha động, với tốc độ dòng 0,8 ml tối thiểu -1 , như sau: metanol (A), diclometan (B), axetonitril (C), H 2 O (D) (A: B: C: D = 85 :5:5:5). Thể tích tiêm là 20 μl. Nồng độ AX tự do được tính toán bằng cách sử dụng các diện tích cực đại theo tiêu chuẩn AX về nồng độ đã biết.
Mười hai con tôm sống sót từ mỗi chế độ ăn đã được chụp ảnh. Sau đó, tất cả chúng được đưa vào bể nước sôi (> 95 ° C) trong 3 phút. Sau khi đun sôi trong một phút, màu nấu chín được đánh giá bằng hình ảnh kỹ thuật số và tính điểm chủ quan; Màu sắc của tôm sống và tôm đã nấu chín được định lượng bằng các thông số màu (L* = độ sáng, a* = độ đỏ, b* = độ vàng) bằng máy so màu (Minolta Chroma Meter CR400, Konica Minolta Sensing Inc., Osaka, Japan). Giá trị của L* nằm trong khoảng từ 0 đối với màu đen thuần khiết đến 100 đối với màu trắng thuần khiết, a* đại diện cho thang màu đỏ-lục và b* đại diện cho thang màu xanh lam-vàng. Xét thấy màu sắc khác nhau ở các phần khác nhau của tôm, màu sắc của ba phần của tôm (đầu, thân và đuôi) được đọc bằng máy so màu.
2.6 . Xét nghiệm các thông số liên quan đến chất chống oxy hóa và liên quan đến miễn dịch
Gan tụy được đồng nhất hóa (1:9) bằng cách thêm dung dịch nước muối lạnh và các chất đồng nhất được ly tâm ở 3500 g trong 10 phút ở 4°C, và chất nổi trên bề mặt gan tụy lạnh được sử dụng để xác định hoạt tính của enzyme. Hàm lượng protein tổng số trong phần nổi phía trên được xác định bằng Bộ xét nghiệm protein BCA (Q045–3, Viện kỹ thuật sinh học Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc). Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), acid phosphatase (ACP), khả năng chống oxy hóa toàn phần(T-AOC) và malondialdehyd (MDA) trong huyết thanh và gan tụy được đo theo hướng dẫn của bộ dụng cụ thương mại (Viện kỹ thuật sinh học Jiancheng Nam Kinh, Giang Tô, Trung Quốc). Hoạt tính SOD được xác định bằng phương pháp xanthine oxidase (hydroxylamine). CAT xúc tác H 2O2và phản ứng này có thể nhanh chóng dừng lại khi thêm amonimolybdat. H 2O2 còn lại được kết hợp với amoni molybdat để tạo ra hợp chất màu vàng nhạt. Hoạt tính CAT được phân tích bằng cách xác định sự khác biệt của độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm. ACP có thể xúc tác phenyl photphat thành phenol tự do và axit photphoric. Trong điều kiện kiềm, phenol có thể phản ứng với 4-aminoantipyrin để tạo ra dẫn xuất quinone màu đỏ . Do đó, hoạt tính của ACP được phân tích theo sự thay đổi sắc thái đỏ ở bước sóng 520 nm. Phương pháp khử Fe 3+ được áp dụng để phát hiện T-AOC. Phương pháp axit thiobarbituric (TBA) được sử dụng để xác định hàm lượng MDA.
2.7 . Phân tích PCR thời gian thực định lượng
Tổng số RNA được chiết xuất bằng cách sử dụng RNeasy ® Mini Kit (QIAGEN cat. nos. 74104, Đức). RNA được định lượng bằng phân tích quang phổ và chất lượng được đánh giá bằng cách sử dụng điện di trên gel agarose ở mức 1%. Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên bằng phiên mã ngược đã được thực hiện dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất về Bộ thuốc thử PrimeScript™ RT (TaKaRa cat. nos. RR047A, Nhật Bản). PCR thời gian thực cho các gen mục tiêu được thực hiện bằng cách sử dụng GoTaq® qPCR Master Mix (Promega cat. nos. A6002, USA) và được định lượng trên LightCycler 480 (Roche Applied Science, có trụ sở tại Thụy Sĩ). Hệ số kéo dài 1 α (EF1α) đã được sử dụng làm gen tham chiếu. Trình tự của các gen được đánh giá được lấy từ NCBI GenBank. Trình tự đoạn mồi cụ thể của từng gen được thiết kế bằng phần mềm Primer Premier 5.0 ( Bảng 2 ). RT-PCR bao gồm bước biến tính ở 95°C trong 4 phút, sau đó là 40 chu kỳ khuếch đại ở 95°C trong 5 giây, ủ ở 60°C trong 15 giây và kéo dài ở 72°C trong 15 giây. Mức độ biểu hiện tương đối của các gen được tính toán dựa trên phương trình của 2 −ΔΔCT( Livak và Schmittgen, 2001 ). Mỗi dữ liệu được tạo thành ba bản sao độc lập.
Bảng 2 . Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu này.
2.8 . Phân tích thống kê
ANOVAs một chiều được sử dụng để kiểm tra tầm quan trọng của các tác động điều trị tổng thể đối với hiệu suất tăng trưởng, sắc tố, astaxanthin trong cơ thể của tôm nuôi trong 8 ngày cuối tuần với các mức độ khác nhau, và tỷ lệ sống và astaxanthin trong cơ thể của tôm được sử dụng trong thí nghiệm stress thiếu oxy và stress amoniac. thử nghiệm, tiếp theo là thử nghiệm đa phạm vi của Duncan (DMRT). Hồi quy bậc hai được sử dụng để ước tính mức AX trong chế độ ăn uống tối ưu. Tất cả các số liệu thống kê được thực hiện bằng gói SPSS (phiên bản 19.0) và tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình với lỗi tiêu chuẩn (SE). Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được coi là có ý nghĩa ở mức 0,05.
3 . Kết quả
3.1 . Hiệu suất tăng trưởng và thành phần toàn thân
Hiệu suất tăng trưởng, đặc biệt là tăng trọng lượng cơ thể và tỷ lệ tăng trưởng cụ thể, là một chỉ số quan trọng về sản lượng và hiệu quả nuôi tôm. Trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW) của tôm ăn chế độ ăn AX80 và AX160 cao hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn AX0 (P <0,05) ( Bảng 3 ). Tương tự, mức tăng trọng lượng cơ thể (BWG) và tỷ lệ tăng trưởng cụ thể (SGR) của tôm được cho ăn chế độ ăn AX160 cao hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn AX0 (P <0,05). Không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ sống (SR) và hiệu quả sử dụng thức ăn (FE) của tôm giữa tất cả các nghiệm thức thức ăn (P > 0,05).
Bảng 3 . Ảnh hưởng của mức astaxanthin trong chế độ ăn đến năng suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn.
Thành phần gần đúng của toàn bộ cơ thể tôm trong số tất cả các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn được cho ăn các chế độ ăn có bổ sung các mức AX khác nhau được trình bày trong Bảng 4 . Không có sự khác biệt đáng kể về độ ẩm , protein thô, tro và lipid thô của toàn bộ cơ thể giữa tất cả các nghiệm thức ăn kiêng (P > 0,05). Mức độ biểu hiện Myostatin (MSTN) trong cơ của tôm ăn chế độ ăn AX160 cao hơn so với tôm ăn chế độ ăn AX0 (P <0,05), phù hợp với kết quả BWG ( Hình 1 ) .
Bảng 4 . Ảnh hưởng của mức astaxanthin trong chế độ ăn đối với thành phần cơ thể của L. vannamei được cho ăn ở các mức AX khác nhau (%).
Hình 1 . Ảnh hưởng của mức astaxanthin (AX) trong chế độ ăn đối với hồ sơ biểu hiện Myostatin ( MSTN ) mRNA trong cơ của L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn . Giá trị là phương tiện, với các lỗi tiêu chuẩn của chúng (bốn lần lặp lại n = 4). Các thanh có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ( P < 0,05). Mức AX trong năm chế độ ăn thử nghiệm được tham khảo trong Bảng 1 .
3.2 . Hàm lượng astaxanthin và màu sắc tôm
Kết quả cho thấy hàm lượng xác định AX trong khẩu phần tương tự như các mức bổ sung ( Bảng 5 ). Hơn nữa, hàm lượng AX trong mô tôm tăng lên khi tăng mức độ bổ sung AX. Đối với gan tụy , có sự tích tụ đáng kể AX tự do ở tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX40, AX80 và AX160 (P <0,05). Hàm lượng AX tự do trong vỏ và cơ cho thấy xu hướng tương tự với gan tụy. Kết quả cho thấy AX được lắng đọng chủ yếu ở gan tụy, sau đó là vỏ và cơ.
Bảng 5 . Ảnh hưởng của mức astaxanthin trong chế độ ăn đối với hàm lượng astaxanthin tự do trong các mô khác nhau ở L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn (mg kg -1 ).
Tất cả các nhóm chế độ ăn uống đều có sự khác biệt rõ rệt về màu sắc của tôm sống và tôm đã nấu chín ( Hình 2 ). Màu sắc cơ thể thay đổi từ xanh nhạt sang đỏ nhạt và nâu nhạt bắt đầu từ nhóm AX20, trong khi tôm ăn khẩu phần bổ sung astaxanthin (AX20, AX40, AX80 và AX160) có màu đỏ hơn sau khi nấu chín và màu đậm dần khi hàm lượng AX tăng.
Hình 2 . Màu sắc của tôm thẻ chân trắng L. chưa nấu chín và đã nấu chín được cho ăn 5 mức astaxanthin (AX) trong chế độ ăn trong 8 tuần. Mức AX trong năm chế độ ăn thử nghiệm được tham khảo trong Bảng 1 .
Các thông số ba màu (L*, a*, và b*) được sử dụng để xác định hiệu ứng đo màu của Ax trên đầu, thân, đuôi tôm thí nghiệm. Sau khi điều trị, không có sự thay đổi đáng kể nào về giá trị độ sáng (L*) ở tất cả các nhóm ăn kiêng ( Bảng 6 ). Sau khi nấu chín, tôm thu được các giá trị về độ sáng (L*), độ đỏ (a*) và độ vàng (b*) lớn hơn so với tôm chưa nấu chín. Ngoài ra, xu hướng tăng màu đỏ (a*) và độ vàng (b*) được quan sát thấy với chế độ ăn uống AX cao hơn. Các giá trị về màu đỏ (a*) và độ vàng (b*) ở tôm được cung cấp thức ăn bổ sung AX lớn hơn nhiều so với tôm được cho ăn chế độ ăn đối chứng (P <0,05).
Bảng 6 . Ảnh hưởng của hàm lượng astaxanthin trong khẩu phần đối với màu sắc của tôm thẻ chân trắng L. vannamei được cho ăn năm khẩu phần trước và sau khi nấu.
3.3 . Tỷ lệ sống sót sau khi bị stress do thiếu oxy và stress do amoniac
Trong tình trạng căng thẳng do thiếu oxy, SR hàng giờ của tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX40, AX80 và AX160 thay đổi ít hơn so với tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX0 theo thời gian và sự thay đổi nhỏ nhất được tìm thấy ở tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX160 (Hình 3 a) . Khi kết thúc giai đoạn căng thẳng do thiếu oxy, SR cuối cùng của tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX40, AX80 và AX160 cao hơn đáng kể so với tôm ăn bằng chế độ ăn AX0 (P <0,05) ( Hình 3 c). Các kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở tình trạng căng thẳng do amoniac ( Hình 3 b, d).
Hình 3 . Tỷ lệ sống hàng giờ và cuối cùng của L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn: trong tình trạng thiếu oxy (a) và stress amoniac (b); sau tình trạng thiếu oxy (c) và stress amoniac (d). Dữ liệu dành cho giá trị trung bình dựa trên ba lần xác định độc lập. Giá trị là phương tiện, với các lỗi tiêu chuẩn của chúng (ba lần lặp lại n = 3). Các thanh có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ( P < 0,05). Mức astaxanthin (AX) trong năm chế độ ăn thử nghiệm được tham khảo trong Bảng 1
3.4 . Hoạt động của enzyme chống oxy hóa
Các chỉ số chống oxy hóa trong gan tụy của tôm được nuôi bằng các chế độ ăn thử nghiệm khác nhau được thể hiện trong Bảng 7 . Khi bắt đầu thí nghiệm, lượng oxy hòa tan được đo là 6,72 mg L -1 , trong khi lượng oxy hòa tan khi kết thúc được đo lại là 0,9 mg L -1. Trước khi bị căng thẳng cấp tính, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong các hoạt động của SOD và CAT giữa tất cả các phương pháp điều trị bằng chế độ ăn kiêng (P> 0,05), tuy nhiên, hoạt động của hai enzyme này đã giảm khi tăng lượng bổ sung AX. T-AOC tăng lên khi tăng lượng bổ sung AX và hàm lượng MDA giảm đáng kể trong các nhóm AX40, AX80 và AX160 (P <0,05). Sau khi bị căng thẳng do thiếu oxy và amoniac, các hoạt động T-AOC, SOD và CAT của tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX160 cao hơn đáng kể so với tôm được cho ăn bằng chế độ ăn đối chứng (P <0,05). Hàm lượng MDA thấp nhất được quan sát thấy ở nghiệm thức AX160 (P <0,05). Các hoạt động của ACP trong huyết thanh và gan tụy sau khi bị thiếu oxy và stress amoniac được thể hiện trong Hình 4. Sau khi bị căng thẳng do thiếu oxy, điều trị bằng AX160 có hoạt tính ACP trong huyết thanh và gan tụy cao hơn đáng kể so với điều trị bằng AX0 (P <0,05). Sau khi bị stress amoniac, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong hoạt động của ACP trong huyết thanh giữa tất cả các phương pháp điều trị (P> 0,05), trong khi hoạt động của ACP cao nhất trong gan tụy xảy ra ở tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX160 (P <0,05).
Bảng 7 . Ảnh hưởng của mức astaxanthin trong chế độ ăn đối với các thông số liên quan đến chất chống oxy hóa của gan tụy ở L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn.
Hình 4 . Hoạt động của acid phosphatase (ACP) trong huyết thanh và gan tụy của tôm thẻ chân trắng L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn sau khi bị thiếu oxy (a) và stress amoniac (b). Giá trị là phương tiện, với các lỗi tiêu chuẩn của chúng (ba lần lặp lại n = 3). Các thanh có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ( P < 0,05). Mức astaxanthin (AX) trong năm chế độ ăn thử nghiệm được tham khảo trong Bảng 1 .
3.5 . Biểu hiện tương đối của gen liên quan đến chống oxy hóa và liên quan đến căng thẳng của tôm sau khi bị căng thẳng cấp tính
Ảnh hưởng của AX trong chế độ ăn uống đối với hồ sơ biểu hiện mRNA của gen liên quan đến chất chống oxy hóa và gen liên quan đến căng thẳng trong gan tụy của tôm sau khi bị căng thẳng cấp tính đã được thử nghiệm. Sau khi bị căng thẳng do thiếu oxy, tôm ăn chế độ ăn AX160 có mức độ biểu hiện MnSOD, GST và HSP70 cao hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn đối chứng (P < 0,05) ( Hình 5)). Mức độ biểu hiện của HIF-1α ở tôm ăn chế độ ăn AX80 và AX160 cao hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn đối chứng (P <0,05). Sau khi bị stress amoniac cấp tính, mức độ biểu hiện của MnSOD và GS ở tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX160 được điều chỉnh tăng đáng kể so với tôm được cho ăn bằng chế độ ăn AX0 (P <0,05). Mức độ biểu hiện của GST và GDH-β ở tôm ăn chế độ ăn AX80 và AX160 cao hơn đáng kể so với tôm ăn chế độ ăn đối chứng. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của HSP70 mRNA ở tôm được nuôi bằng chế độ ăn AX40 và AX160 được điều chỉnh giảm đáng kể (P <0,05).
Hình 5 . Ảnh hưởng của nồng độ astaxanthin (AX) trong chế độ ăn đối với hồ sơ biểu hiện mRNA của gen liên quan đến chống oxy hóa và căng thẳng trong gan tụy của L. vannamei được cho ăn năm chế độ ăn sau khi thiếu oxy (c) và stress amoniac (d). Giá trị là phương tiện, với các lỗi tiêu chuẩn của chúng (ba lần lặp lại n = 3). Các thanh có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ( P < 0,05 ).
3.6 . Mức astaxanthin trong chế độ ăn tối ưu
Hồi quy bậc hai đã được sử dụng để ước tính mức AX trong chế độ ăn uống tối ưu liên quan đến hiệu suất tăng trưởng ( Hình 6 a) và sắc tố da ( Hình 6 b). Điểm dừng ở mức 126,94 mg kg -1 chế độ ăn kiêng AX được ước tính bằng cách sử dụng phương trình hồi quy y = −0,0047 x 2 + 1,1932 x + 623,39, R 2 = 0,9975 trên phép đo mức tăng trọng lượng cơ thể. Hồi quy bậc hai ở mức 138,96 mg kg− 1 chế độ ăn AX được ước tính bằng cách sử dụng phương trình hồi quy y = −0,3616x 2 + 5,0249x – 0,7578, R² = 0,8819 trên phép đo độ đỏ (a*) của thân tôm đã nấu chín.
Hình 6 . Mối quan hệ giữa tăng trọng lượng cơ thể (BWG) (a), sắc tố da (Đỏ a*) (b) và astaxanthin (AX) sau khi thử nghiệm cho ăn dựa trên phân tích hồi quy bậc hai. Giá trị là phương tiện, với các lỗi tiêu chuẩn của chúng (bốn lần lặp lại n = 4).
4 . Cuộc thảo luận
4.1 . Ảnh hưởng của astaxanthin trong chế độ ăn uống đến hiệu suất tăng trưởng
Hiệu suất tăng trưởng tốt hơn ở tôm được cho ăn chế độ ăn astaxanthin có lẽ là do vai trò điều tiết quan trọng của AX trong quá trình chuyển hóa trung gian của động vật thủy sinh, có thể góp phần vào việc sử dụng các chất dinh dưỡng và cuối cùng là cải thiện hiệu suất tăng trưởng ( Wang và cộng sự, 2018 , Wade và cộng sự ., 2017a ). Niu et al. (2012) báo cáo một kết quả tương tự rằng BWG và SGR của tôm sú Penaeus cho ăn 0,1% và 0,2% AX cao hơn so với đối chứng. Nhỏ và cộng sự. (1997) phát hiện ra rằng AX có thể rút ngắn chu kỳ lột xác của tôm bằng cách tăng ecdysteroid mức độ, có lợi cho việc cải thiện tăng trưởng. Một nghiên cứu trước đây về chế độ ăn bổ sung AX trên cua đã cho thấy kết quả tương tự rằng AX trong chế độ ăn có ảnh hưởng tích cực đến năng suất tăng trưởng ( Amar et al., 2001 , Segner et al., 1989 ) ( Hình 5 c, d).
Đáng chú ý, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hiệu suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng L. vannamei được cho ăn 160 mg/kg -1 chế độ ăn AX đã được cải thiện đáng kể (P <0,05), điều này có thể liên quan đến sự gia tăng biểu hiện của MSTN trong cơ. Myostatin có tác dụng điều chỉnh tiêu cực sự phát triển và biệt hóa cơ bằng cách ức chế đồng thời quá trình tổng hợp protein ở động vật có vú ( Hadjipavlou et al., 2008 ). Tuy nhiên, MSTN đóng vai trò ngược lại ở tôm và mức độ biểu hiện của nó điều chỉnh tăng trưởng tích cực ( Santis et al., 2011 , Suo et al., 2017). Do đó, sự khác biệt trong biểu hiện MSTN giải thích rõ hơn hiệu suất tăng trưởng cao hơn được quan sát thấy ở tôm được nuôi bằng astaxanthin. Tuy nhiên, một số nghiên cứu chỉ ra rằng hiệu suất tăng trưởng của động vật thủy sản không bị ảnh hưởng bởi AX trong chế độ ăn uống. Chien và Shiau (2005) cho rằng AX tổng hợp không thể cải thiện đáng kể năng suất sinh trưởng của M. japonicas . Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở Portunus trituberculatus ( Han et al., 2018 ). Các tác động khác nhau của AX đến năng suất sinh trưởng của động vật thủy sinh có thể là do sự khác biệt về loài thí nghiệm, sức khỏe động vật, hệ thống nuôi trồng thủy sảnvà phương pháp cho ăn. Các nghiên cứu chuyên sâu hơn là cần thiết để làm sáng tỏ cơ chế thực tế cơ bản của AX trên động vật thủy sinh.
4.2 . Ảnh hưởng của astaxanthin đến colorcoloration
Động vật giáp xác nói chung không có khả năng tổng hợp carotenoids de novo ( Velu et al., 2003 ), dường như astaxanthin trong chế độ ăn uống bổ sung bù đắp cho lượng carotenoids không đủ tích lũy trong quá trình nuôi thâm canh. Trong nghiên cứu hiện tại, tôm được nuôi bằng chế độ ăn AX có màu đỏ cam đậm hơn so với tôm tự nhiên ( Barclay và cộng sự, 2006 , Boonyaratpalin và cộng sự, 2001 ), cho thấy tác động tích cực của AX đối với màu sắc của tôm. Thông số màu sắc (L*, a* và b*) là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá màu sắc của giáp xác ( Smith et al., 1992). Mặc dù giá trị L* cơ thể của tôm không bị ảnh hưởng bởi các chế độ ăn khác nhau nhưng giá trị a* và b* của tôm được cho ăn bằng chế độ ăn bổ sung astaxanthin cao hơn đáng kể so với đối chứng. Ngoài ra, các thông số màu đỏ (a*) khác biệt đáng kể (P <0,05) so với đối chứng tăng lên khi tăng lượng bổ sung AX, hỗ trợ kết quả của chúng tôi về nồng độ Axe toàn cơ thể. Trong nghiên cứu này, hàm lượng AX tự do trong gan, vỏ và cơ tăng lên cùng với sự gia tăng nồng độ AX trong chế độ ăn uống và hiệu quả tạo sắc tố của gan tụy cao hơn so với vỏ và cơ trong tất cả các phương pháp điều trị. Kết quả tương tự cũng thu được ở tôm sú P. monodon và tôm Kuruma ( Niu et al., 2012 , Chien và Jeng, 1992). Hàm lượng AX trong mô ảnh hưởng trực tiếp đến màu sắc của động vật giáp xác ( Supamattaya et al., 2005 ), và tổng hàm lượng caroten trong phần gan tụy của tôm cao hơn so với vỏ và cơ ( Yanar et al., 2012 ). . Nhìn chung, những kết quả này cho thấy rằng tôm thẻ chân trắng L. vannamei có thể sử dụng tốt AX trong khẩu phần ăn để cải thiện màu đỏ của cơ thể.
4.3 . Ảnh hưởng của astaxanthin đến khả năng chống oxy hóa của tôm sau stress
Việc tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) trong quá trình kiểm tra căng thẳng có thể dẫn đến tổn thương oxy hóa nghiêm trọng ( Mascio et al., 1991 ). Người ta chấp nhận rộng rãi rằng thiệt hại do ROS gây ra ở các sinh vật có thể được hạn chế nhờ hoạt động của các chất chống oxy hóa enzym ( Sowmya và Sachindra, 2012 ). Trước đây, hệ thống chống oxy hóa bao gồm SOD và CAT được coi là cơ chế bảo vệ trong cơ thể của động vật giáp xác, giúp loại bỏ ROS quá mức, ngăn ngừa stress oxy hóa và bảo vệ sinh vật chống lại các tác nhân gây căng thẳng từ môi trường xung quanh ( Marklund, 1974 ). T-AOC được coi là một chỉ số toàn diện về tình trạng chống oxy hóa và tình trạng sức khỏe của sinh vật ( Castillo et al., 2006). Trong nghiên cứu hiện tại, thử nghiệm căng thẳng gây chết được sử dụng để đánh giá tình trạng sức khỏe bằng cách đo khả năng chịu đựng căng thẳng của tôm thí nghiệm. Kết quả cho thấy nhóm bổ sung AX hoạt động tốt hơn nhóm đối chứng ở LT 50 . Đầu tiên, sự khác biệt đáng kể (P <0,05) đã được tìm thấy giữa kiểm soát và điều trị liên quan đến tỷ lệ sống sót. Thứ hai, so với tôm đối chứng, tôm ăn AX vẫn cho thấy hoạt tính enzyme chống oxy hóa cao hơn, khi chế độ ăn astaxanthin làm tăng T-AOC, mặc dù hoạt động của SOD và CAT giảm trong gan tụy. Những kết quả này phù hợp với kết quả trên Zhang et. al. (2013) và Wu et al. (2017). Chúng tôi suy đoán rằng hoạt động của các enzym chống oxy hóa trong gan tụy giảm đáng kể khi tiếp xúc với stress oxy hóa gia tăng, dẫn đến sinh học tế bào liên quan bị suy yếu và AX có thể bắt đầu các phản ứng khác để điều chỉnh hệ thống phòng thủ chống oxy hóa, cuối cùng làm tăng T-AOC.
AX có thể điều chỉnh sự biểu hiện của các gen enzyme chống oxy hóa của tôm và cải thiện khả năng chống lại tình trạng thiếu oxy và stress amoniac. Ví dụ, MnSOD xúc tác O 2- thành hydro peroxide (H 2 O 2 ) và oxy phân tử. Superoxide do ROS tạo ra chủ yếu được loại bỏ bởi MnSOD trong ma trận ty thể. Kết quả RT-PCR trong nghiên cứu này chỉ ra rằng AX có thể tăng cường khả năng phòng vệ nội sinh bằng cách điều chỉnh tăng sự biểu hiện của các gen enzyme chống oxy hóa bao gồm các gen MnSOD và GST ở cấp độ mRNA, do đó cung cấp khả năng bảo vệ chống lại stress oxy hóa. Trương và cộng sự. (2013) thu được kết quả tương tự ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei. Những kết quả này cho thấy AX có thể phát huy tác dụng thông qua việc ảnh hưởng đến hoạt động của các enzym chống oxy hóa và/hoặc sự biểu hiện của các gen enzym chống oxy hóa. MDA là một trong những sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid trong mô và có độc tính sinh học mạnh ( Li et al., 2013 ). Trong nghiên cứu của chúng tôi, cả trước và sau căng thẳng, hàm lượng MDA cho thấy xu hướng ngược lại. Những kết quả này cho thấy rằng AX có thể ức chế quá trình peroxy hóa lipid và tăng cường khả năng chống oxy hóa của L. vannamei , tương tự như các nghiên cứu trước đây ( Li và cộng sự, 2014 ), bao gồm cả AX tự nhiên ( Xie và cộng sự, 2018 , Long và cộng sự. , 2017 ).
4.4 . Tác dụng của AX đối với khả năng miễn dịch và khả năng chống lại căng thẳng
Do thiếu hệ thống miễn dịch thích nghi và chủ yếu dựa vào hệ thống miễn dịch bẩm sinh, giáp xác dễ bị tổn thương hơn trước một số yếu tố bên ngoài ( Wang và Wang, 2013 ). Đối với nuôi trồng thủy sản, điều cực kỳ quan trọng là giảm thiểu các điều kiện bất lợi có thể gây ra căng thẳng lớn hơn và làm suy yếu sinh vật chủ. Chien và Shiau (2005) phát hiện tôm sú P.cho ăn chế độ ăn AX cấp độ cao đã làm tăng SR sau thử thách DO thấp. Trong nghiên cứu hiện tại, việc tăng cường SR ở tôm dưới áp lực amoniac cao và oxy thấp cho thấy chế độ ăn AX có thể làm tăng sức đề kháng của tôm chống lại các áp lực môi trường. Là một phosphatase quan trọng, ACP tham gia vào các quá trình trao đổi chất khác nhau, vì vậy nó có thể được sử dụng để đánh giá sức đề kháng của sinh vật đối với các yếu tố gây căng thẳng bên ngoài ( Xue và Renault, 2000 ). Một số nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng động vật được cho ăn chế độ ăn có chứa chất kích thích miễn dịch có thể làm tăng hoạt động của ACP trong huyết thanh ( Chang et al., 2018 , Deng et al., 2015). Tương tự, hoạt động ACP cao hơn đáng kể trong AX160 chỉ ra rằng AX trong chế độ ăn thích hợp có thể tăng cường hiệu quả chức năng của hệ thống miễn dịch giáp xác. Hơn nữa, HSP70, như một thành phần quan trọng của bộ máy tế bào để đánh giá chức năng miễn dịch của động vật giáp xác, có thể được sử dụng như một protein phản ứng với căng thẳng để tham gia bảo vệ căng thẳng, chống chết theo chương trình và đáp ứng miễn dịch (Franzellitti và Fabbri, 2005 ) . Sự tái điều hòa của HSP70 trong gan tụy do tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy và stress amoniac đã được quan sát thấy ( Franzellitti và Fabbri, 2005 ). Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của HSP70gen được điều chỉnh giảm trong các nhóm được bổ sung AX so với nhóm đối chứng khi bị căng thẳng cấp tính. Những kết quả này chỉ ra rằng chế độ ăn kiêng astaxanthin có thể làm giảm bớt một phần tác động tiêu cực do căng thẳng cấp tính gây ra. Ở tôm sú Penaeus , Niu et al. (2014) đã báo cáo rằng mức độ biểu hiện của HSP70 mRNA trong tình trạng thiếu oxy cao hơn đáng kể so với điều kiện bình thường .
HIF-1α là một yếu tố phiên mã dị thể, có thể điều chỉnh hàng chục gen liên quan đến chất vận chuyển oxy và làm cho động vật sống sót tốt hơn trong điều kiện thiếu oxy ( Hardy et al., 2012 ). Sau khi bị căng thẳng do thiếu oxy, mức độ biểu hiện HIF-1α ở tôm được cho ăn bằng chế độ ăn có bổ sung astaxanthin cao hơn so với tôm được cho ăn bằng chế độ ăn đối chứng. Karnakhov và cộng sự. (1977) đã báo cáo rằng các chuỗi liên kết đôi liên hợp caroten có đặc tính nhận điện tử và cho điện tử tốt, cho phép chúng gắn các phân tử oxy. Khi sinh vật ở trạng thái thiếu oxy, oxy trong chất tích lũy nội bào caroten có thể làm giảm bớt sự thiếu hụt oxy và làm cho các sinh vật dưới nước chống lại tình trạng thiếu oxy tốt hơn ( Oshima et al., 1993). Trương và cộng sự. (2013) cũng chỉ ra rằng AX có thể làm giảm bớt một phần phản ứng stress oxy hóa của L. vannamei trong tình trạng thiếu oxy. Như vậy, kết quả này cũng khẳng định AXE có thể tham gia chuyển hóa oxy của tế bào động vật và cung cấp oxy cho tế bào. GDH-β và glutamine GS là các enzyme chủ chốt trong việc duy trì nồng độ nitơ amoniac bình thường ở tôm khi bị căng thẳng ( Mayzaud và Conover, 1988 ), giữ cân bằng hàm lượng amoniac thông qua các phản ứng khử amin (DeBerardinis và cộng sự, 2007). GDH phân hủy amoniac để tạo ra axit glutamate và sau đó GS xúc tác glutamate và lượng amoniac dư thừa để tổng hợp glutamine ( Cooper, 2012 , Silvia et al., 2004). Stress có thể gây ra mức độ biểu hiện của gen GDH và GS trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng L. vannamei ( Liu et al., 2012 ). Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh mức độ biểu hiện của GDH và GS đã tăng lên sau khi tiếp xúc với amoniac, điều này chỉ ra rằng L. vannamei có thể tạo ra sự biểu hiện của gen GDH-β và GS dưới áp lực của amoniac, do đó làm giảm hàm lượng amoniac. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của GDH-β và GS trong gan tụy đã tăng lên đáng kể, điều này cho thấy rằng AX trong chế độ ăn uống có thể tăng cường khả năng giải độc amoniac của tôm thẻ chân trắng L. vannamei bằng cách xúc tác quá trình chuyển đổi amoniac. Tóm lại, những thay đổi về mức độ biểu hiện của HSP70, HIF-1α, GDH-β và GS có thể góp phần giúp chúng ta hiểu hơn về cơ chế phản ứng trao đổi chất của tôm thẻ chân trắng L. vannamei dưới áp lực thiếu oxy và amoniac.
5 . Phần kết luận
Tóm lại, kết quả của chúng tôi đã chứng minh việc bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn uống có thể đạt được hiệu suất tăng trưởng và màu sắc tốt hơn. Hơn nữa, việc bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn uống có thể làm tăng khả năng chống oxy hóa và điều chỉnh sự biểu hiện của các gen liên quan đến phản ứng miễn dịch và khả năng chịu đựng căng thẳng của L. vannamei . Đáng chú ý, các nhóm tôm được cho ăn 80 và 160 mg/kg astaxanthin đã thực hiện những thay đổi thích ứng xảy ra ở mức độ chống oxy hóa cao nhất trong gan tụy với khả năng chống stress, cung cấp thông tin có giá trị và cơ sở lý thuyết cho việc áp dụng AX trong nuôi trồng thủy sản.
Xiaopin Zhao a 1, Gongpei Wang a c 1, Xuange Liu a, Dingli Guo a, Xiaoli Chen a, Shuang Liu a, Sheng Bi a, Han Lai a, Jimei Zhu b, Dan Ye c, Haifang Wang b, Guifeng Li a