Nano bạc chitosan chống lại Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài

Chitosan chứa nhiều ion kim loại khác nhau như Ag⁺, Cu²⁺, Zn²⁺,Mn²⁺, và Fe²⁺ đã được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Trong nghiên cứu này, các hạt nano bạc (AgNPs) được tổng hợp ở 95°C bằng cách sử dụng chitosan làm chất khử và chất ổn định. Phổ UV-Vis hiển thị cực đại trong khoảng từ 415-420 nm, dải cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng của các hạt nano bạc. Kích thước, hình dạng và đặc tính tập hợp của các hạt nano thu được đã được kiểm tra bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường kết hợp với quang phổ tia X phân tán năng lượng.

Thử nghiệm in vivo sử dụng trái xoài tách biệt. Alphonso cho thấy bệnh thán thư đã bị ức chế đáng kể nhờ composite chitosan-AgNP. Do đó, nghiên cứu này cho thấy rằng sự thối rữa sau thu hoạch ở xoài có thể được giảm thiểu bằng vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP và ứng dụng của nó trên quy mô thương mại cần được khai thác. Thử nghiệm nảy mầm của bào tử trong ống nghiệm chỉ ra rằng hỗn hợp chitosan-AgNP thể hiện hoạt tính kháng nấm đối với Colletotrichum gloeosporioides cao hơn đáng kể so với các thành phần của nó ở nồng độ tương ứng.

Hỗn hợp chitosan-AgNP, ở nồng độ 0,5 và 1%, cho thấy giảm bệnh thán thư lần lượt là 45,7 và 71,3%. Chitosan ở nồng độ 0,5 và 1% cho thấy khả năng giảm bệnh là 35,5 và 41,8% (Bảng 3). Mặt khác, kết hợp chitosan-AgNP composite với 0,1% Tween-80 làm giảm bệnh 75,8% ở nồng độ 0,5% và 84,6% ở nồng độ 1%. Kết hợp Chitosan và Tween-80 ở nồng độ 0,5 và 1% cho thấy tỷ lệ mắc bệnh giảm lần lượt là 51,9 và 65,7%. Trong khi carbendazim ở 0,0001 và 0,001% cho thấy sự ức chế 49,3 và 63,0% khi so sánh với trái cây không được xử lý (Bảng 3). Tỷ lệ mắc bệnh thán thư thấp hơn có ý nghĩa (P <0,01) ở tất cả các nghiệm thức hạt chitosan-AgNP so với các nghiệm thức khác (Bảng 3 và Hình 7).

Diễn giải: Trong hỗn hợp AgNPs-Chitosan Nano bạc khoảng 3000 ppm và chitosan khoảng 2000 ppm. Hỗn hợp AgNPs-Chitosan và Tween 80 (0,1%) thì ở nồng độ 0,5% của hỗn hợp (nano bạc 15 ppm và chitosan 10 ppm) 1% hỗn hợp (nano bạc 30 ppm và chitosan 20 ppm)

(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)

Quý khách hàng có nhu cầu nano bạc nguyên liệu 15000 ppm dùng trong nông nghiệp vui lòng liên hệ Hotline 098.435.9664 – 0378.622.740

1.      Giới thiệu

Chitosan, một dẫn xuất đã khử từ kitin, là polysaccharide mạch thẳng ưa nước phong phú thứ hai được tìm thấy trong tự nhiên sau cellulose. Nó được tạo thành từ các gốc N-acetyl-2 amino-2-deoxy-D-glucose (glucosamine) và 2-amino-2-deoxy-D-glucose (N-acetyl-glucosamine) (Aranaz và cộng sự, 2010). Do các đặc tính sinh học độc đáo của nó, chẳng hạn như không độc tính, khả năng phân hủy sinh học, chức năng sinh học và tính tương thích sinh học, nhiều ứng dụng đã được báo cáo hoặc đơn lẻ hoặc pha trộn với các polyme tự nhiên khác (tinh bột, gelatine và alginat) trong thực phẩm, dược phẩm, dệt may, nông nghiệp, nước ngành điều trị và mỹ phẩm (Harish Prashanth và Tharanathan, 2007).

Vật liệu phân hủy sinh học này cũng có thể cải thiện chất lượng nông sản và kéo dài thời hạn sử dụng bằng cách giảm thiểu sự phát triển của vi sinh vật trong sản phẩm vì bản chất tích điện dương (đa cation) của nó (Zhong và cộng sự, 2009; El Hadrami và cộng sự, 2010). Đặc tính kháng khuẩn của chitosan đã được chứng minh chống lại nhiều vi khuẩn, nấm sợi và nấm men (Kong và cộng sự, 2010).

Nó có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật vì chức năng kép của nó; tác dụng diệt nấm và diệt khuẩn và tạo ra các phản ứng phòng vệ (Kendra và Hadwiger, 1984; Sudarshan và cộng sự, 1992; Tsai và Su, 1999; Bautista-Banos và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, mức độ khử oxy hóa, pH của dung dịch chitosan và sinh vật mục tiêu (Helander và cộng sự, 2001; Jeon và cộng sự, 2001; Zhong và cộng sự, 2009).

Hoạt tính chống nấm của chitosan chống lại Colletrotichum gloeosporioides đã được báo cáo (Ali và cộng sự, 2010). Hoạt tính kháng nấm của chitosan cũng đã được báo cáo trên các loài nấm mốc Alternaria Alternata, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer và Phytophthora capsici (El Ghaouth et al., 1992; Xu et al., 2007). Chitosan có khả năng tạo chelat cao với các ion kim loại khác nhau như Ag⁺, Cu²⁺, Zn²⁺,Mn²⁺, và Fe²⁺ trong điều kiện axit và các phức kim loại chitosan này có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (Kong và cộng sự, 2010).

Tính chất kháng khuẩn của bạc nguyên tố (Ag) đã được nghiên cứu rộng rãi và đã tìm thấy nhiều ứng dụng trong y học hơn bất kỳ ion kim loại vô cơ nào khác, đồng thời không gây hại cho tế bào người (Russell và cộng sự, 1994).

Bạc có thể được sử dụng để quản lý mầm bệnh thực vật theo cách tương đối an toàn hơn so với thuốc diệt nấm tổng hợp (Park và cộng sự, 2006) vì nó hiển thị nhiều phương thức tác động ức chế (Clement và Jarrett, 1994). Các nghiên cứu trước đây cung cấp bằng chứng về khả năng ứng dụng của bạc để kiểm soát nấm bệnh ở cây trồng như Bipolaris sorokiniana, Magnaporthe grisea (Jo et al., 2009), Golovinomyces cichoracearum hoặc Sphaerotheca fusca (Lamsal et al., 2011) và Raffaelea sp. (Kim và cộng sự, 2009).

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đáng kể đã được thực hiện để kết hợp các hạt nano bạc vào sợi siêu mỏng cho nhiều ứng dụng quan trọng, chẳng hạn như sử dụng vật liệu băng vết thương trong lĩnh vực y tế (Zhuang và cộng sự, 2010).

Chitosan đã được sử dụng như một chất khử và chất ổn định để tạo thành AgNPs (Murugadoss và Chattopadhyay, 2008). Tương tác liên kết giữa chitosan và các hạt nano bạc dẫn đến sự ổn định của vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP và do đó, các hạt nano bạc gắn với chuỗi polyme sẽ phân tán trong dung dịch khi hòa tan composite.

Xoài (Mangifera indica L.) là cây ăn quả nhiệt đới quan trọng về mặt thương mại ở Ấn Độ, chiếm> 54% tổng số xoài được sản xuất trên toàn thế giới. Ấn Độ xuất khẩu xoài tươi sang hơn 50 quốc gia (Tharanathan và cộng sự, 2006). Bệnh thán thư do C. gloeosporioides gây ra là bệnh quan trọng nhất sau thu hoạch của xoài (Arauz, 2000) và gây thối rữa trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

Thuốc diệt nấm hóa học là cách hiệu quả nhất để kiểm soát sự thối rữa sau thu hoạch của xoài, nhưng việc sử dụng chúng đã gây ra sự phát triển tính kháng thuốc diệt nấm và làm gia tăng xung đột trong cộng đồng (Lin et al., 2011).

Thuốc diệt nấm Benzimidazole đã được sử dụng để kiểm soát bệnh Colletotrichum trong 38 năm qua và nhiều trường hợp kháng thuốc đã được báo cáo do phương thức tác dụng rất cụ thể của nó (Hewitt, 1998; Peres và cộng sự, 2004).

Theo quan điểm của khả năng kháng thuốc diệt nấm benzimidazole trên diện rộng trên các loài Colletotrichum, các chiến lược kiểm soát hóa chất an toàn thay thế bản địa cần được phát triển để quản lý các bệnh thán thư trước và sau thu hoạch.

Các nghiên cứu trước đây cho thấy chitosan ức chế đáng kể sự phát triển của Colletotrichum sp. thậm chí ở nồng độ thấp hơn (Bautista-Banos và cộng sự, 2003; Munoz và cộng sự, 2009). Sanpui và cộng sự. (2008) đã chứng minh rằng vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP có hiệu quả cao trong việc ức chế một số vi khuẩn hơn là chitosan một mình.

Vì không có nghiên cứu nào được thực hiện về các hoạt động chống nấm của vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng chitosan có thể hữu ích trong việc bảo vệ thực vật do chức năng kép của nó là phản ứng phòng vệ ở thực vật và tác dụng chống nấm, và hoạt tính của nó có thể được tăng cường kết hợp với ion kim loại ở dạng hạt nano. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá tổng hợp chitosan-AgNP về hoạt tính kháng nấm của nó đối với C. gloeosporioides in vitro và hiệu quả của nó trong việc giảm bệnh thán thư trên quả xoài.

2.      VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Hóa chất

Chitosan có trọng lượng phân tử thấp (85% được khử béo), và giấy lọc Whatman số 1 được mua từ Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. Nitrat bạc (AgNO3, 99,9%) được cung cấp bởi Merck, Ấn Độ. Axit axetic (băng, 99-100%) là từ hóa chất tốt SD, Ấn Độ. Tween-80 và natri hydroxit được mua từ Phòng thí nghiệm HiMedia, Ấn Độ. Tất cả các hóa chất đã được sử dụng như đã nhận mà không cần tinh chế thêm. Chúng tôi đã sử dụng nước cất hai lần và nước khử ion trong suốt quá trình nghiên cứu (Hệ thống MilliQ / Millipore, Billerica, MA, Hoa Kỳ).

• Tổng hợp chitosan-AgNP

Các hạt nano được điều chế bằng cách áp dụng phương pháp tổng hợp một nồi của Sanpui et al. (2008) với những sửa đổi nhỏ. Một cách ngắn gọn, dung dịch nước 100 ml chứa 0,2 g chitosan được giữ trên máy khuấy từ với bếp điện ở nhiệt độ 95 ± 1 ° C với sự khuấy liên tục. Tiếp theo là thêm 2,0 ml dung dịch mới chuẩn bị có các nồng độ khác nhau (10, 15, 20, 25 và 30 mM) của bạc nitrat và 300 μl NaOH 0,3M, tương ứng. PH của dung dịch được đo là 10,0. Sự hình thành AgNPs xảy ra tự nhiên trong khoảng một phút, bằng cách chuyển dung dịch thu được sang màu vàng cho thấy sự hình thành AgNPs trong môi trường.

Phản ứng được để tiếp tục trong 30 phút nữa và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Chất rắn màu vàng dạng bột sau đó được thu thập bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman số 1. Bột được rửa bằng nước khử ion bốn lần, sau đó làm khô trong không khí và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

• Phép đo phân tích và đặc tính

Quang phổ tử ngoại nhìn thấy (UV – vis) của tất cả các mẫu hạt nano kích thước tổng hợp được ghi lại ở nhiệt độ phòng bằng cách sử dụng TECAN vô hạn 200 (Seestrasse, Mannedorf, Thụy Sĩ) trong phạm vi 250–550 nm. Phép đo tán xạ ánh sáng động (DLS) và điện thế Zeta của các mẫu chất lỏng được thực hiện bằng cách sử dụng Zeta pals (Brookhaven Instrument Corporation, Holtsville, NY, USA) ở 25 ° C. Kích thước, hình dạng và đặc tính tập hợp của các hạt nano được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM).

Đối với các nghiên cứu FESEM, một giọt huyền phù nước của hạt nano đã được đặt trên cuống nhôm bằng băng carbon hai mặt và giữ khô ở 70 ° C trong ba giờ. Sau đó, các mẫu được giữ trong bình hút ẩm có chứa silica gel trong 72 giờ, và các hạt vàng được bắn tung tóe trên vật liệu phủ để ngăn chặn hiệu ứng tích điện và được giữ dưới áp suất chân không trong 30 phút trước khi phân tích. Các mẫu được kiểm tra trong FESEM bằng kính hiển vi mô hình Zeiss-Ultra 55 (Carl Zeiss Promenade, Jena, Đức) được trang bị khả năng phạm vi quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDS).

Số lượng bạc có trong nanocompozit được ước tính bằng cách sử dụng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử. Dung dịch gốc của bạc ở nồng độ 1000 μg/mL được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,574 g AgNO3 (tương đương với 1 g bạc kim loại) trong axit nitric: nước (1: 1) và pha loãng thành 1000 ml với nước Milli Q và lưu trữ trong bóng tối. Một máy quang phổ hấp thụ nguyên tử dòng Thermo M (Thermo Electron Corporation: Chromatography and Mass Spectrometry, River Oaks Parkway San Jose, CA, USA) được sử dụng với đèn cathode rỗng màu bạc, ở dòng hoạt động 2 mA và a bước sóng và dải quang phổ lần lượt là 328,1 và 1 nm.

2.4. Nảy mầm của bào tử C. gloeosporioides đã qua xử lý bằng hỗn hợp chitosan-AgNP

1. gloeosporioides phân lập (Cm 50 NCBI số gia nhập EF025937) thu hồi từ xoài được trồng trên thạch khoai tây dextrose (PDA) trong 7 ngày dưới ánh sáng huỳnh quang trắng mát (67,5 mmol m-2 s-1) ở 25 ± 1 ° C để thúc đẩy bào tử. Bào tử được rửa sạch khỏi đĩa PDA với 5 ml nước cất vô trùng và được điều chỉnh thành 1,5 x 10⁶ bào tử /ml bằng máy đo huyết cầu (Than và cộng sự, 2008).

Một dung dịch 50 µl chứa các nồng độ khác nhau của hỗn hợp chitosan-AgNPs (được nạp với 30 mM AgNO3) và chitosan (0,1, 1, 10, 100 và 1000 µg/ml) được hòa tan trong 0,1% (v / v) axit axetic được thêm vào giếng của phiến kính khoang chứa 50 µl huyền phù bào tử.

Một thể tích tương đương (50 µl) nước cất vô trùng với 0,1% (v / v) axit axetic được thêm vào giếng đối chứng. Tất cả các phiến kính trong khoang được đặt trong một buồng ẩm có độ ẩm ~ 95% và được ủ trong 12 giờ ở 25 ± 1 ° C, sự nảy mầm của bào tử trong 20 trường được chọn lọc được xác định ở độ phóng đại 400x dưới kính hiển vi trường sáng Zeiss (Phạm vi Axio. A1, Gottingen, Đức).

Bào tử được coi là nảy mầm khi chiều dài của ống mầm bằng hoặc vượt quá chiều dài của bào tử. Phần trăm ức chế sự nảy mầm của bào tử so với đối chứng được tính theo công thức sau. I = (C-T / C) x100, Trong đó, I = tỷ lệ phần trăm ức chế sự nảy mầm của bào tử trong mầm bệnh thử nghiệm, C = số lượng bào tử nảy mầm trong đối chứng và T = số lượng bào tử nảy mầm trong quá trình xử lý. Mỗi nghiệm thức có ba lần lặp lại và mỗi lần lặp lại chứa chín trang trình bày. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.

2.5. Chuẩn bị lớp phủ

Các dung dịch phủ được chuẩn bị bằng cách hòa tan hỗn hợp chitosan-AgNPs với 30 mM AgNO3 và chitosan (0,5 và 1,0% w / v) tương ứng ở 40 ° C trong dung dịch axit axetic 0,5% (v / v), vì chitosan chỉ hòa tan trong môi trường axit. Sau đó, Tween 80 ở 0,1% (v / v) được thêm vào để cải thiện tính thấm ướt. Hỗn hợp thu được được khuấy mạnh khi đun nóng bằng máy khuấy từ trong 2 giờ cho đến khi chitosan được hòa tan (Garcia và cộng sự, 2010).

2.6. Hoạt động phủ và chống nấm của vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP đối với sự phát triển của bệnh thán thư trên quả xoài

Những trái xoài cv. ‘Alphonso’ được thu thập từ cây 15 tuổi được trồng trong trang trại thực nghiệm của Viện Nghiên cứu Làm vườn Ấn Độ, Bangalore, Ấn Độ đã được sử dụng trong các thí nghiệm. Những quả khỏe mạnh được chọn ở giai đoạn bán chín có kích thước và trọng lượng tương đương nhau (250 g). Quả được rửa trong vòi nước chảy và khử trùng bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorit 0,1% trong 2 phút, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng ba lần và làm khô trong không khí.

Trái cây được nhúng trong 15 phút trong nước vô trùng (đối chứng), axit axetic 0,5%, chitosan (0,5% và 1%) và hỗn hợp chitosan-AgNPs được nạp với 30 mM AgNO3 (0,5% và 1%) có và không thêm 0,1 % Tween-80 (v / v).

Việc kiểm tra hóa học đối với carbendazim ở 0,001, 0,01%, 0,001 và 0,0001% cũng được thực hiện để phủ xoài và sau đó trái cây đã phủ được làm khô trong không khí trong 30 phút ở 25 ° C. Quả xoài sau đó bị thương ở cùng một bên (xa và gần) đến độ sâu 2 mm bằng cách chọc thủng chúng bằng một chiếc ghim đã khử trùng.

Mỗi vị trí vết thương sau đó được cấy 20 µl huyền phù bào tử (1,5 x 10⁶ bào tử / ml) C. gloeosporioides. Trái cây đã qua xử lý và đối chứng sau đó được đặt lên lưới thép trong hộp nhựa (cao 45 cm x dài 40 cm x rộng 15 cm) có chứa nước, duy trì độ ẩm tương đối ~ 95% và ủ ở 24 ± 1 ° C trong 7 ngày. Diện tích tổn thương (Cm2) được tính điểm riêng biệt bằng cách đo chiều dài và bề rộng của từng vị trí nhiễm trùng. Thí nghiệm được thực hiện với ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 12 quả, do đó, tổng số quả cho mỗi nghiệm thức là 36 quả. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.

2.7. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) để xác định nguồn gốc ý nghĩa và theo sau là kiểm tra Fishers để tách các phương tiện và phương pháp điều trị bằng cách sử dụng Graph pad Prism V.500 cho windows (Phần mềm Graph pad, San Diego, California , HOA KỲ). Giá trị trung bình được so sánh giữa những người điều trị bằng sự khác biệt ít nhất có ý nghĩa (LSD) ở mức 1% (p <0,01). Dữ liệu phần trăm được biến đổi arcsin trước khi phân tích theo y = arcsin [sqr (_ / 100)].

3.      KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM NANO BẠC CHITOSAN VÀ TWEEN 80

Tổng hợp và mô tả đặc tính của vật liệu tổng hợp nano bạc chitosan. Như đã chứng minh bằng cách tạo ra bột màu vàng, quá trình khử Ag + thành Ag NPs đã được quan sát thấy khi có mặt NaOH và ở nhiệt độ cao. Điều này chỉ ra rằng chitosan tạo ra Ag-NP trong điều kiện kiềm. Chitosan hoạt động như một chất khử và cũng là chất ổn định để sản xuất NP.

Chất bột màu vàng không tan trong nước. Bột màu vàng của composite được hòa tan trong axit axetic và đo phổ UV-Vis. Phổ cho thấy với sự gia tăng nồng độ của AgNO3, có sự tăng dần cường độ của đỉnh trong khoảng từ 415-420 nm (Hình 1), dải cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng (SPR) của các hạt nano bạc, chỉ ra sự hình thành của hạt nano bạc.

Hình 1. Phổ hấp thụ UV-Vis của composite chitosan-AgNP hòa tan trong 0,1% (v / v) axit axetic trong nước. Nồng độ của các ion bạc trong dung dịch ban đầu được sử dụng để điều chế NP lần lượt là a) 10 mM, b) 15 mM, c) 20 mM, d) 25 mM và e) 30 mM AgNO3. Lượng chitosan dùng để tổng hợp là 0,2g trong 100 ml

 Kết quả cho thấy rằng với sự gia tăng nồng độ của ion bạc, nồng độ của sự hình thành các hạt nano bạc đã tăng lên. Bảng 1 cho thấy các cấu trúc phân bố kích thước của vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP được tải với các nồng độ khác nhau của AgNO3. Đường kính thủy động lực học trung bình của các hạt nano được nạp 10, 15, 20, 25 và 30 mM AgNO3 lần lượt là 495, 590, 616, 592 và 595 nm khi phân tích với DLS.

Bảng 1. Kết quả của sự tán xạ ánh sáng động và điện thế zeta

Điện thế zeta được tăng cường đáng kể với sự gia tăng nồng độ của AgNO3 (Bảng 1). Vật liệu tổng hợp Chitosan-AgNP có thế zeta thay đổi từ +50,08 mV đến +87,75 mV. Khi cùng một mẫu được sử dụng cho các nghiên cứu DLS được phân tích thông qua SEM, các hạt chitosan-AgNP có dạng hình cầu với cấu trúc đặc rắn có kích thước hạt trong khoảng 10-15 nm (Hình 2). Khi thành phần nguyên tố của chitosan-AgNP được xác định bằng EDS, tín hiệu bạc được phát hiện, cho thấy sự hiện diện của một lượng bạc đáng kể trong nano composite (Hình 3).

Hình 2. Ảnh hiển vi SEM; a) Tổng hợp chitosan, b) AgNO3, c) Hỗn hợp chitosan-AgNP (30 mM AgNO3) ở 50 K X, và d) Độ phóng đại 300 K X.

Hình 3. Ảnh SEM và phổ EDS tương ứng cho composite chitosan-AgNP

Ngoài ra, tín hiệu carbon có nguồn gốc từ băng carbon được sử dụng để phủ vật liệu và tín hiệu vàng vì vàng phún xạ trên bề mặt của phim để ngăn chặn hiệu ứng sạc và cải thiện độ dẫn điện (Bảng 2). Hỗn hợp nano được điều chế từ 30 mM AgNO3 có 30,281 mg bạc trên gam hỗn hợp hạt nano chitosan-Ag khi phân tích qua máy quang phổ hấp thụ nguyên tử.

Bảng 2. Thành phần hóa học của các nguyên tố có trong hỗn hợp chitosan-AgNP xác định bằng EDS.

• Hoạt tính kháng nấm của composite chitosan-AgNP

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của hỗn hợp chitosan và chitosan-AgNP (Hình 4) được nạp với 30 mM AgNO3 (thế zeta là 87,75 mV) đối với sự nảy mầm của C. gloeosporioides ở bào tử được xác định và thể hiện trong Hình 6.

Hình 4. Phân bố kích thước và phân bố tiềm năng zeta của hỗn hợp chitosan-AgNPs được xử lý bằng AgNO3 30 mM

Composite chitosan-AgNP (xử lý bằng 30 mM AgNO3) làm giảm rõ rệt sự nảy mầm của C. gloeosporioides ở các bào tử so với chitosan. Hỗn hợp Chitosan-AgNP với nồng độ 0,1 (0,00001%), 1,0 (0,0001%) và 10,0 µg / ml (0,001%) đã ức chế sự nảy mầm của bào tử lần lượt là 44, 70 và 78%. Sự nảy mầm của bào tử bị ức chế hoàn toàn với nồng độ 100,0 µg / ml (0,01%) (Hình 5). Sự nảy mầm bình thường của C. gloeosporioides được tìm thấy trong nước cất khử trùng với 0,1% (v / v) axit axetic sau 12 giờ ủ trên lam kính. Sự nảy mầm hoàn toàn của bào tử được quan sát ở 0,1% axit axetic, do đó sự phân tán của vật liệu tổng hợp với nồng độ axit axetic thấp không gây ra bất kỳ tác dụng phụ nào. Kết quả cho thấy rằng xử lý composite chitosan-AgNP ngăn chặn sự nảy mầm và được thấy là có hiệu quả hơn so với đối chứng.

Hình 5. Ảnh hưởng của chitosan và composite chitosan-AgNP đến sự nảy mầm của C. gloeosporioides bào tử sau 12 giờ ủ.

Hình 6. Ảnh hưởng của hỗn hợp chitosan-AgNP đến sự nảy mầm của C. gloeosporioides ở bào tử a) Bào tử bình thường, b) Kiểm soát nước với 0,1% (v / v) axit axetic (sự hình thành appressoria), c) Sự nảy mầm của bào tử trong chitosan (100 pg / ml) với 0,1% (v / v) axit axetic, d) Ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của bào tử bằng hỗn hợp chitosan-AgNP

• Ảnh hưởng của hỗn hợp chitosan-AgNP đến bệnh thán thư hại xoài

Hỗn hợp chitosan-AgNP, ở nồng độ 0,5 và 1%, cho thấy giảm bệnh thán thư lần lượt là 45,7 và 71,3%. Chitosan ở nồng độ 0,5 và 1% cho thấy khả năng giảm bệnh là 35,5 và 41,8% (Bảng 3). Mặt khác, kết hợp chitosan-AgNP composite với 0,1% Tween-80 làm giảm bệnh 75,8% ở nồng độ 0,5% và 84,6% ở nồng độ 1%. Kết hợp Chitosan và Tween-80 ở nồng độ 0,5 và 1% cho thấy tỷ lệ mắc bệnh giảm lần lượt là 51,9 và 65,7%. Trong khi carbendazim ở 0,0001 và 0,001% cho thấy sự ức chế 49,3 và 63,0% khi so sánh với trái cây không được xử lý (Bảng 3). Tỷ lệ mắc bệnh thán thư thấp hơn có ý nghĩa (P <0,01) ở tất cả các nghiệm thức hạt chitosan-AgNP so với các nghiệm thức khác (Bảng 3 và Hình 7).

Bảng 3. Hiệu quả của hỗn hợp chitosan-AgNP và phương pháp điều trị bệnh thán thư hại xoài do C. gloeosporioides

* Giá trị trong ngoặc đơn cho biết phần trăm ức chế kiểm soát. Phần trăm ức chế được tính toán dựa trên dữ liệu thu thập được sau bảy ngày kể từ ngày cấy. Phần trăm ức chế được tính theo công thức [C-T / C] (100)], trong đó C là kích thước vết bệnh trên quả đối chứng và T là kích thước vết bệnh trên quả đã xử lý (cm2). Dữ liệu phần trăm được biến đổi arcsin trước khi phân tích theo y = arcsin [sqr. (_ / 100)]. Dữ liệu là phương tiện và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Mỗi thí nghiệm có ba lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại chứa 12 quả và hai điểm cấy. Mỗi giá trị hàng theo sau bởi một chữ cái viết thường khác nhau khác nhau đáng kể ở p <0,01, theo thử nghiệm LSD của Fishers. Cv xoài BHealthy. Alphonso, được xử lý bằng composite chitosan-AgNP với nồng độ khác nhau so với các hóa chất thử nghiệm và đối chứng khác, được đặt trong hộp nhựa (cao 45 cm x dài 40 cm x rộng 15 cm) có chứa nước để duy trì độ ẩm và được sử dụng để xét nghiệm sinh học chống lại C. gloeosporioides Cm 50

Hình 7. Ảnh hưởng của nanocomposite đối với xoài chống lại bệnh thán thư a) Đối chứng, b) carbendazim (0,001%), c) 1% chitosan, và d) 1% Chitosan-AgNP composite với Tween-80

4.      THẢO LUẬN HIỆU QUẢ NANO BẠC CHITOSAN

Cấu trúc chitosan khác nhau về khối lượng phân tử và mức độ khử oxy hóa. Nhóm amin và hydroxyl chính trong chitosan cho thấy ái lực cao đối với các ion kim loại bằng cách chelation. Chitosan một poly- mer phân hủy sinh học và không độc hại khi có mặt NaOH và ở nhiệt độ cao làm giảm và ổn định AgNO3 thành các hạt nano bạc.

Các nồng độ bạc nitrat khác nhau được giảm xuống các hạt nano bạc tương ứng ở nhiệt độ cụ thể. Sự hình thành hạt nano được xác định bằng quang phổ UV-Vis. Phổ hấp thụ UV-Vis cho thấy đỉnh sắc nét trong khoảng từ 415-420 nm, dải cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) đặc trưng của các hạt nano bạc (Wei và cộng sự, 2009), hỗ trợ sự hình thành các hạt nano bạc trên nền chitosan. Đối với huyền phù nano, phân bố kích thước và điện thế zeta là các thông số đặc trưng quan trọng (Muller và cộng sự, 2001).

Khi phân tích vật liệu tổng hợp Chitosan-AgNP với các nồng độ khác nhau của AgNO3 được phân tích với DLS, các mẫu cho thấy sự phân bố kích thước trong khoảng 495 – 616 nm. Thế zeta là ± 30 mV là yêu cầu tối thiểu đối với lực đẩy tĩnh điện của kích thước nano bền về mặt vật lý, cho biết mức độ đẩy giữa các hạt mang điện tích tương tự và tính ổn định của các hạt nano trong dung dịch (Muller et al. , 2001; Du và cộng sự, 2009). Điện thế zeta được tăng cường đáng kể với sự gia tăng tải bạc vào nanocompozit trong khoảng từ +50,08 đến +87,75 mV. Những dữ liệu này chỉ ra rằng các vật liệu nano được điều chế với các đặc tính khác nhau của AgNO3 có độ ổn định cao.

Để phù hợp với sự hiện diện của các hạt nano bạc trong hỗn hợp, các phép đo SEM đã được thực hiện, các vị trí tổng hợp chitosan-AgNP cho thấy các hạt hình cầu với cấu trúc dày đặc có kích thước hạt trong khoảng 10-15 nm. Sự giảm kích thước đáng kể của nanocompozit có thể được giải thích bằng hai cách giải thích chính, thứ nhất là sự liên kết của một số lượng lớn các phân tử nước với nanocompozit khi chúng tôi khảo sát thông qua DLS, trong khi trong trường hợp ảnh SEM, nước đã bị loại bỏ trong quá trình chuẩn bị mẫu. Sự khác biệt đáng kể thứ hai là do các hạt chitosan lớn hiện diện trong dung dịch khối lượng lớn trong quá trình phân tích DLS, trong khi trong SEM không có hạt nào lớn hơn được xem xét để đo đường kính. EDS được chụp trong quá trình chụp ảnh SEM cho thấy tín hiệu bạc nổi bật, cho thấy sự hiện diện của bạc trong nanocompozit.

Những tổn thất chủ yếu sau thu hoạch của xoài là do nhiễm nấm, rối loạn sinh lý và tổn thương thực thể, lớp phủ chitosan có khả năng kéo dài thời gian bảo quản và kiểm soát sự thối rữa của xoài (Kittur et al., 2001). Các nhà nghiên cứu đã sử dụng một số loại tinh dầu thực vật làm thuốc trừ bệnh thực vật sau thu hoạch để quản lý bệnh thán thư trên quả xoài (Abd-AllA và Haggag, 2013). Mohamed và cộng sự. (2013) cho thấy hoạt tính antifun-gal của màng chitosan trên sự ức chế C. gloeosporioides liên quan đến xoài.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá khả năng ứng dụng của composite chitosan-AgNP làm vật liệu bao phủ trái cây để ức chế sự phát triển của nấm C. gloeosporioides. Nanocomposites cho thấy hiệu quả lớn hơn trong việc giảm tỷ lệ mô trái cây bị thối rữa.

Riêng Tween không có tác dụng đáng kể trong việc ức chế bào tử, nhưng việc bổ sung chất hoạt động bề mặt không ion Tween 80 vào nanocompozit đã tăng cường tính thấm ướt và tính kết dính của dung dịch phủ, không cho phép sự phát triển bình thường của bào tử và giảm bệnh tật cao hơn so với các phương pháp điều trị khác.

Trước đây, các hạt nano chitosan với tiềm năng zeta tăng cường đã cho thấy tác dụng ức chế tuyệt vời đối với vi sinh vật (Qi và cộng sự, 2004). Trong nghiên cứu này, hỗn hợp nano bạc chitosan làm giảm rõ rệt sự nảy mầm của C. gloeosporioides ở bào tử so với đối chứng và các đối chứng khác.

Ở xoài, giai đoạn sau thu hoạch của bệnh thán thư do C. gloeosporioides gây ra là giai đoạn có ý nghĩa kinh tế và tàn phá nặng nề nhất, và giai đoạn này được liên kết trực tiếp với giai đoạn đồng ruộng nơi sự lây nhiễm xảy ra trên quả đang phát triển và sự lây nhiễm vẫn nằm yên dưới dạng appresoria và các sợi nấm dưới vảy cho đến khi bắt đầu chín (Arauz, 2000). Hiện nay, việc loại bỏ nhiễm trùng tĩnh lặng đạt được về mặt thương mại bằng các phương pháp điều trị bằng nhiệt và hóa chất hoặc kết hợp cả hai (McMillan, 1987).

Kiểm soát nhiệt độ và thời gian là rất quan trọng, bởi vì trái cây có thể dễ bị nhũn do tiếp xúc quá nhiều với nhiệt, và quá trình này tốn nhiều thời gian và công sức. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng vật liệu tổng hợp chitosan-AgNP có hiệu quả hơn chitosan trong việc ức chế sự nảy mầm của bào tử C. gloeosporioides và ức chế bệnh thán thư trên xoài. Ở dạng nano, bạc có vẻ độc hơn so với các loại bạc có kích thước lớn. Do đó, những vật liệu nano này có thể được phủ lớp phủ ngoài như một vật liệu phủ trong việc ngăn chặn các vi khuẩn C. gloeosporioides không phát triển trên xoài để tránh thất thoát sau thu hoạch.

5.      Phần kết luận

Các hạt nano bạc có kích thước 10-15 nm được điều chế bằng cách sử dụng chitosan trọng lượng phân tử thấp làm chất khử và ổn định ở 95 ° C. Các kết quả của phổ UV-Vis, EDS và FESEM đã xác nhận sự hiện diện của các hạt nano bạc và cấu trúc của composite chitosan-AgNP. Kết quả là hỗn hợp này đã ức chế thành công sự nảy mầm ở bào tử của C. gloeosporioides và cũng làm giảm tỷ lệ bệnh thán thư trên xoài. Điều này có thể tìm thấy các ứng dụng trong việc ngăn ngừa nhiễm khuẩn Colletotrichum trên xoài để ngăn chặn những thiệt hại lớn về cây trồng và thúc đẩy xuất khẩu

Nguồn tham khảo: Antifungal activity of chitosan-silver nanoparticle composite against Colletotrichum gloeosporioides associated with mango anthracnose

P. Chowdappa*, Shivakumar Gowda, C. S. Chethana and S. Madhura
Indian Institute of Horticultural Research, Hesaraghatta Lake Post, Bangalore-560 089, India