Nano bạc chitosan cộng hưởng với thuốc diệt nấm zineb chống nấm gây bệnh đốm trắng thanh long
Hạt nano bạc chitosan (Ag @ CS) như một hệ thống phân phối thuốc mới đã được phát triển cho thuốc diệt nấm. Trong nghiên cứu này, tác dụng hiệp đồng của các hạt nano bạc (AgNPs), chitosan (CS), và thuốc diệt nấm zineb (Zi) đã được nghiên cứu như vật liệu chống nấm chống lại Neoscytalidium dimidiatumtrong quả thanh long. Cụ thể hơn, Ag @ CS được điều chế bằng cách nhúng các AgNP vào polyme CS và sau đó kết hợp với Zi. Kính hiển vi điện tử truyền qua được sử dụng để xác nhận hình thái và kích thước của Ag @ CS. Đường kính của các hạt nano hình cầu vào khoảng 4,11 ± 0,37 nm. Hơn nữa, sự hình thành nano bạc chitosan được đặc trưng bởi phép phân tích nhiễu xạ tia X và hồng ngoại biến đổi Fourier. Các đặc tính ổn định nhiệt của các hạt nano này cũng được xác định bằng phân tích nhiệt trọng lượng. Đặc biệt hoạt tính kháng nấm của Ag @ CS đã cho thấy khả năng kháng nấm tốt hơn so với từng thành phần đơn lẻ, được phân tích theo phương pháp vùng ức chế đối với N. dimidiatum . Những kết quả này cho thấy những ứng dụng tiềm năng của Ag @ CS trong việc phát triển vật liệu nano để ứng dụng điều trị bệnh nông nghiệp.
(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)
Quý khách hàng có nhu cầu nano bạc nguyên liệu 15000 ppm dùng trong nông nghiệp vui lòng liên hệ Hotline 098.435.9664 – 0378.622.740
1. Giới thiệu
Thanh long hoặc pitahaya ( Hylocereus undatus) thường được biết đến là loại trái cây giàu dinh dưỡng, trở thành cây trồng chính với diện tích lớn, cho thu nhập cao. Nó được coi là một nguồn cung cấp kali, phốt pho, vitamin C (axit ascorbic), canxi, carbohydrate và chất xơ, có thể làm giảm nguy cơ đột quỵ và bệnh tim mạch vành bằng cách ngăn ngừa cholesterol cao và cải thiện hệ tiêu hóa với chất xơ của nó và cũng tránh được bệnh ung thư. Tính đến thời điểm hiện tại, Việt Nam là một trong những quốc gia cung cấp thanh long trên quy mô thương mại cho Trung Quốc, Hồng Kông, Nhật Bản, Singapore và nhiều nước ở Châu Âu.
Theo số liệu của Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng thanh long đạt hơn 28.700 ha với sản lượng 520.000 tấn / năm, chiếm 61,4% xuất khẩu trái tươi hoàn toàn [ 1], [ 2 ]. Tuy nhiên, khi trồng thanh long trên diện tích lớn, nông dân gặp rất nhiều khó khăn trong việc phòng trừ dịch bệnh do vi sinh vật gây ra. Neoscytalidium dimidiatum , tác nhân gây bệnh đốm nâu pitahaya, là một trong những mầm bệnh hại cây trồng nguy hiểm, gây thiệt hại lớn cho cây nông nghiệp, đặc biệt là trên cây thanh long.
Nó không chỉ ảnh hưởng đến năng suất trái cây xuất khẩu mà còn ảnh hưởng đến kết quả kinh tế. Để phòng trừ bệnh thối nâu, thuốc hóa học được sử dụng phổ biến trong nông nghiệp do có tác dụng trị bệnh [ 3 ], [ 4 ], [ 5]. Tuy nhiên, việc sử dụng không đúng loại thuốc hoặc liều lượng không hiệu quả có thể kéo dài thời gian điều trị và giảm năng suất cây trồng. Ngoài ra, hóa chất chất lượng thấp có thể dẫn đến hậu quả tai hại, làm tăng giá thành sản xuất, khả năng kiểm soát thấp, năng suất thấp, lợi nhuận thấp [ 6 ], [ 7 ]. Hơn nữa, dịch bệnh bùng phát đồng nghĩa với việc người chăn nuôi thường sử dụng kháng sinh liều cao dẫn đến lượng thuốc vượt ngưỡng cho phép, có thể tiêu diệt côn trùng có ích trong đất và tạo ra khả năng kháng mầm bệnh [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]. Hệ quả là làm giảm năng suất, chất lượng cây trồng, tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người [ 6 ], [12 ], [ 13 ].
Gần đây, các hạt nano bạc (AgNP) đã được kết hợp với các loại sợi nano và thuốc khác nhau để tăng hiệu quả kháng khuẩn cho các ứng dụng kháng khuẩn. Từ đầu thế kỷ XX, Ag đã được sử dụng như một trong những thành phần tiêu biểu trong thuốc thay thế và thực phẩm chức năng [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]. Nó cũng đã được sử dụng trong ngành công nghiệp ảnh từ những năm 1800, khử trùng nước uống và khử trùng bể bơi [ 19 ], [ 20 ].
Hơn nữa, Kokura [ 21] báo cáo rằng AgNPs ở nồng độ thấp có đủ hiệu quả bảo quản chống lại vi khuẩn và nấm và không xâm nhập vào da người bình thường trong ứng dụng mỹ phẩm. Quan trọng là, các hoạt động kháng khuẩn của AgNPs cũng được nghiên cứu thành công trong nghiên cứu của Kyung-Hwan Cho ở 5–10 ppm [ 22 ] và ở 20 ppm trong nghiên cứu của Sotiriou [ 23 ].
Một số thử nghiệm độc lập tế bào đã được hoàn thành trên các sản phẩm AgNPs của Phòng thí nghiệm Biotech Hoa Kỳ. Ở 10–22 ppm, không có thiệt hại nào được tìm thấy khi các sản phẩm AgNPs được thử nghiệm với tế bào người hoặc khỉ, có nghĩa là chúng hoàn toàn không gây độc tế bào [ 24 ], [ 25 ], [ 26].
Ngoài ra, chitosan (CS), một chất tạo sinh học ưa nước tự nhiên dồi dào, thường được chọn để kết hợp với AgNPs do tính tương hợp sinh học không giới hạn, khả năng phân hủy sinh học, độ ổn định tốt hơn và độc tính thấp [ 8 ], [ 27 ], [ 28 ], [ 29 ], [ 30 ]. Nhiều nghiên cứu cho thấy polyme này hoạt động như chất kích thích sinh trưởng thực vật giúp cây chống lại sự lây nhiễm từ hoạt động của vi sinh vật [ 8 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ], có tính kháng khuẩn tốt [ 8 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], và kích thích khả năng miễn dịch của hệ thống thực vật [37 ], [ 38 ]. Với những ưu điểm này, sự kết hợp của CS và AgNPs (Ag @ CS) là một cách tiếp cận tiềm năng cho các mục tiêu kháng khuẩn.
Kết quả là, phức hợp nano sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn bất kỳ thành phần nào hoạt động đơn lẻ. Hệ thống này đáng được chú ý vì là một trong những ứng dụng mở rộng của nano bạc chitosan có thể hoạt động như một chất diệt nấm an toàn cho công nghệ nano và nông nghiệp.
Trong nghiên cứu này, zineb (Zi) kết hợp với nano bạc chitosan (Ag @ CS-Zi) chống lại N. dimidiatum đã được phát triển. Việc tổng hợp AgNP được bao bọc trong CS tạo biopolyme đã được nghiên cứu để sản xuất các hợp chất nano sinh học có đặc tính kháng nấm nâng cao. Nghiên cứu tập trung vào việc tổng hợp nano bạc chitosan và thử nghiệm các đặc tính diệt nấm của chúng. Ngoài ra, các hạt nano được đặc trưng bởi hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), nhiễu xạ tia X (XRD), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và phân tích trọng trường nhiệt (TGA).
Hơn nữa, các hoạt động chống nấm của composite đối với nấm đã được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp vùng ức chế trên đĩa thạch dextrose khoai tây (PDA). Kết quả mong đợi là lượng CS, Ag và Zi được sử dụng sẽ giảm so với lượng bình thường trong khi khả năng kháng nấm vẫn cho kết quả như mong đợi. Nghiên cứu này được kỳ vọng sẽ tạo ra một loại thuốc chống vi khuẩn đáng kể, là một loại thuốc diệt nấm an toàn cho nông nghiệp.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu
Chitosan được mua từ Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ) (CS, 150.000 triệu USD, 75–85% đã khử amin), axit axetic (CH 3 COOH), bạc nitrat (AgNO 3 ) và natri hydroxit (NaOH ) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Zi Bul 80 WP được mua từ Công ty Cổ phần Bảo vệ Thực vật Sài Gòn (Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam) (80% Zi C 4 H 6 N 2 S 4 Zn) được mua từ Công ty Cổ phần Bảo vệ Thực vật Sài Gòn (Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam) ). Tất cả các thuốc thử và dung môi đã được sử dụng mà không cần tinh chế thêm.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Tổng hợp Ag @ CS và Ag @ CS-Zi:
Ag @ CS được tổng hợp bằng cách sử dụng CS làm polyme khử và bảo vệ và AgNO 3 với NaOH bằng cách khử hóa học. Ban đầu, CS (0,2 g, hòa tan trong 10 ml dung dịch 1% thể tích CH 3 COOH, pH 3,5) được trộn với AgNO 3 (2,5 ml, 1,0 × 10 −2 m ) trong điều kiện khuấy liên tục trong 30–45 phút. Sau bước này, thu được hỗn hợp AgNO 3 và dung dịch CS. Tiếp theo, dung dịch NaOH (10 ml, 1 m) được thả vào hỗn hợp bằng bơm tiêm. Sau 15–20 phút, các quả cầu màu vàng nâu được rửa để loại bỏ cặn, và Ag @ CS được đặt trong tủ lạnh để ngăn chặn quá trình khử Ag tiếp tục. Cuối cùng, Zi được kết hợp với Ag @ CS bằng cách ngâm nó trong nước ở nhiệt độ phòng trong điều kiện khuấy liên tục trong 24 giờ. Tỉ lệ thể tích 2: 1 giữa dung dịch Zi và Ag @ CS đã được sử dụng trong quá trình hợp lực.
2.2.2 Thử nghiệm tác dụng chống nấm của Neoscytalidium dimidiatum :
Để kiểm tra tác dụng chống nấm, phương pháp đĩa giấy đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Đầu tiên, đĩa thạch PDA (truyền khoai tây ở 200,00 g / l, dextrose 20,00 g / l, và thạch 15,00 g / l) được chuẩn bị. Thứ hai, huyền phù tế bào chứa các khuẩn lạc nấm được trải trực tiếp trên bề mặt thạch. Sau đó, các giấy lọc hình tròn (đường kính 5 mm) có chứa AgNP, CS và hợp chất Ag @ CS đã hòa tan được đưa vào đĩa. Đường kính vùng ức chế được đo. Sự khác biệt giữa các mẫu đối chứng và mẫu đã xử lý đã được kiểm tra ý nghĩa khi sử dụng thử nghiệm (p <0,05).
2.2.3 Đặc tính:
Các đặc điểm hình thái của các hạt nano tổng hợp được TEM xác định bằng cách sử dụng FEI Tecnai G2 20 S-Twin ở 100 kV. Để đặc trưng cho các cấu hình phân hủy nhiệt của vật liệu tổng hợp CS hoặc Ag @ CS, TGA được thực hiện trên TGA (Q500 V20.10 Bluid 36) và 5 mg mẫu của cả hai vật liệu tổng hợp được đo với tốc độ dòng nitơ ở tốc độ gia nhiệt 10 ° C / phút -1 từ 30 ° C đến 800 ° C. Phổ FT-IR được ghi lại bằng Máy đo phổ FT-IR Spectrum Tensor27, sử dụng Máy đo phổ FT-IR dạng viên KBr trong phạm vi 500–4500 cm −1 với độ phân giải 4 cm −1 . Các mẫu XRD thu được ở nhiệt độ phòng sử dụng bức xạ Cu K-α (λ = 1.5406 Å) với dải 2θ = 10 ° –90 ° và tốc độ quét 0,03 s −1. Các AgNP được chuẩn bị bằng cách thêm 20 μl dung dịch CH 3 COOH và 1 ml H 2 O cất vào Ag @ CS và sau đó được xoáy trong 3-5 phút. Ag @ CS đã được thả xuống lưới bằng một micropipette để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Đặc tính của các hạt nano
3.1.1 Kích thước và hình thái hạt
Hình thái và kích thước của nano bạc chitosan được cung cấp bởi TEM (Hình 1). Các hạt được phân tách tốt và phân tán hợp lý có dạng hình cầu và kích thước không quá 5 nm. Kích thước của Ag @ CS được đo để thu được đường kính trung bình thích hợp bằng 4,11 ± 0,37 nm, và kết quả này cũng phù hợp với các mẫu XRD. Sự phân bố kích thước của các hạt cho thấy chúng có độ phân tán cao. Các hạt nano được tổng hợp tách rời hoàn toàn với nhau mà không bị vón cục, giúp tăng hiệu quả tương tác giữa chúng với thuốc và môi trường xung quanh. So với hình dạng của AgNP và CS, Ag @ CS không có sự khác biệt đáng kể về hình dạng và phân bố kích thước, có nghĩa là CS có thể hoạt động như một chất ổn định tốt để ngăn chặn sự kết tụ của AgNP và làm cho chúng có sự phân bố kích thước hẹp trong quá trình liên kết chéo [ 32 ], [ 39]. Trong quá trình tổng hợp AgNPs, mà không có bất kỳ hóa chất bảo quản nào khác, CS hoạt động như tác nhân phân tán loại bỏ sự kết tụ của các hạt. Năm 2011, M. Carmen Rodriguez đã điều tra AgNPs trung bình dưới 2 nm [ 40]. Kích thước này khá nhỏ để nạp thuốc hoặc kết hợp với các thành phần khác. Các đặc tính hóa lý của các hạt nano phụ thuộc vào kích thước và tính chất bề mặt của chúng. Theo các báo cáo trước đây, các hạt nano có kích thước từ 4 nm đến 10 nm, cho phép chúng tương tác với môi trường xung quanh vì tác dụng tăng cường tính thẩm thấu và lưu giữ. Kích thước hạt trung bình của các hạt nano gần như hình cầu là 4 nm, đây là kích thước phù hợp để các hạt có thể hiệp lực và đảm bảo tính ổn định và đặc hiệu cho mục đích cuối cùng của chúng. Nhờ đó, hiệu quả được tăng lên đáng kể.
Hình 1 Ảnh TEM (A) và sự phân bố kích thước hạt (B) của Ag @ CS.
3.1.2 Phân tích FT-IR
Sự tồn tại của liên kết hóa học giữa CS và AgNPs được kiểm tra bằng FT-IR (Hình 2 ). Các đỉnh đặc trưng của Ag @ CS ở 3421 cm −1 và CS ở 3424 cm −1 phù hợp với dao động kéo dài của NH-amin trong các nhóm amin. Các lipid kéo dài alkan CH, cụ thể là -CH 2 và -CH 3 nhóm CS và Ag @ CS, được thể hiện trong các dải từ 2920 cm −1 đến 2924 cm −1 . Các dải của CS ở 1658 cm −1 và của Ag @ CS ở 1630 cm −1 có liên quan đến các nhóm amin của amit. Đỉnh C = C của các nhóm amin thơm liên kết với đỉnh 1380 cm −1 . Các dải giữa 1076 cm −1và 1085 cm −1 được chỉ định là carbonyl kéo dài protein có trong CS. Có thể thấy rằng thông qua các nhóm amin tự do, AgNPs liên kết với protein là chất ổn định làm giảm AgNO 3 tạo thành AgNPs trong quá trình xử lý. Bên cạnh đó, đỉnh AgNPs ở 1492 cm −1 và -NH 2 kéo dài ở 1423 cm −1 của CS dịch chuyển thành 1380 cm −1 trong đường cong tổng hợp các hạt nano. Nó minh họa rằng các nhóm -NH 2 hoặc -OH của CS được kết hợp với Ag + / Ag 0 thông qua liên kết tĩnh điện. Kết quả này cũng đã được khẳng định qua nghiên cứu của Vigneshwaran [ 41 ]. Hơn nữa, dải của nhóm OH ở 3421 cm −1và độ giãn của amin chính ở 1659 cm -1 không được hiển thị, điều này chứng tỏ sự gắn Ag vào nguyên tử nitơ. Những kết quả này cho thấy sự hiện diện của liên kết tĩnh điện giữa CS và Ag, tạo ra hỗn hợp Ag @ CS.
Hình 2 Phổ FT-IR của nano bạc chitosan (A) và CS (B).
3.1.3 Phân tích nhiễu xạ tia X
Hình 3 minh họa các mẫu XRD của Ag @ CS. Sự phản xạ rộng ở 9 ° là do sự kết tinh của CS trong vật liệu tổng hợp. Bên cạnh đó, các phản xạ Bragg ở 38,16 °, 46,12 °, 64,09 °, 77,01 ° và 86 ° được gán cho các nhiễu xạ từ các mặt phẳng được lập chỉ mục (2.336), (1.947), (1.380), (1.237) và (1.129) của hạt nano Ag kim loại. Dạng AgNPs và kết quả CS tinh khiết cho thấy cấu trúc tinh thể không thay đổi của AgNPs sau khi được đưa vào CS polyme.
Hình 3. Mẫu XRD của Ag @ CS.
3.1.4 Phân tích đo nhiệt độ
Để phân tích độ bền nhiệt của nano bạc chitosan và CS, TGA được thể hiện trên hình 4. Trong khoảng 50–800 ° C, các mẫu cho thấy hai giai đoạn giảm trọng lượng rõ rệt: (1) Từ 50 đến 150 ° C, 10% trọng lượng đã bị mất do sự bay hơi nước trong mẫu Ag @ CS (50–100 ° C), trong khi CS, đã được làm khô, vẫn giảm trọng lượng ở nhiệt độ cao hơn 100 ° C (thấp hơn sự phân hủy thông thường của CS). Điều này là do CS ban đầu không chỉ thoát ra khỏi chuỗi polyme dài mà còn nhiều CS oligomer ngắn dẫn đến ổn định nhiệt trong thời gian ngắn; (2) từ 150 đến 800 ° C, sự phân hủy nhiệt của phức Ag @ CS thấp hơn so với CS. Kết quả này chỉ ra rằng khi nhúng AgNPs vào CS polyme, Ag có thể phá vỡ cấu trúc của CS trong quá trình hòa tan trong axit và bazơ; do đó, độ giảm khối lượng của CS tác dụng với Ag cao hơn CS ban đầu.
Hình 4. Đường cong đo nhiệt của CS (A) và Ag @ CS (B).
3.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm
Hoạt tính kháng nấm của Ag, Zi, Ag @ CS và Ag @ CS-Zi được ước tính đối với N. dimidiatum bằng phương pháp khuếch tán thạch. Đĩa đối chứng trắng là huyền phù tế bào tinh khiết mà không có bất kỳ thành phần nào khác. Để so sánh với khả năng chống nấm hiệu quả, bốn nồng độ khác nhau của Ag, Zi, Ag @ CS và Ag @ CS-Zi đã được sử dụng làm mẫu so sánh (Bảng 1 ).
Bảng 1. Đường kính của vùng bị ức chế của Ag, Ag @ CS và Ag @ CS-Zi.
Theo bảng, khả năng kháng nấm khá thấp khi chỉ sử dụng AgNPs. Tuy nhiên, khi Ag được kết hợp với CS, khả năng diệt nấm tăng lên đáng kể (Hình 5). Đường kính của vùng ức chế là 15,00 ± 0,00 mm ở 5 ppm, tốt hơn hoàn toàn so với đường kính có nồng độ ở 10 ppm (13,33 ± 0,58 mm). Khi Zi được kết hợp với Ag @ CS, khả năng kháng nấm đã tăng lên đáng kể. Trong khi Zi tinh khiết ở 500 ppm và 1000 ppm không có khả năng loại bỏ nấm, vùng ức chế của Ag @ CS-Zi tăng lên 12,00 ± 0,00 mm, gần bằng đường kính khi sử dụng 5 ppm Ag (12,33 ± 0,58 mm) và nhiều cao hơn khi sử dụng 5000 ppm của Zi (9,00 ± 0,00 mm). Đường kính vùng ức chế của Ag @ CS-Zi ở 2500 ppm của Zi là 20,67 ± 0,58, cho thấy hoạt tính kháng nấm cao của nó so với từng thành phần riêng lẻ. Đặc biệt, tác dụng hiệp đồng của Ag @ CS ở 2 ppm và Zi ở 5000 ppm cho thấy khả năng chống co bóp mạnh và cao. Sau một loạt các thử nghiệm,
Hình 5. Các vùng ức chế trung bình được quan sát thấy của AgNPs (A), Zi (B), Ag @ CS (C) và Ag @ CS-Zi (D) chống lại Neoscytalidium dimidiatum.
4. Kết luận
Trong nghiên cứu này, AgNPs được kết hợp với CS đã được chức năng hóa, giúp cải thiện tính ổn định và hiệp đồng với thuốc diệt nấm để tăng cường hoạt tính kháng nấm. Theo kết quả phân tích FT-IR và XRD, nano bạc chitosan chứa thuốc diệt nấm đã được tổng hợp thành công. Hình ảnh TEM cho thấy Ag @ CS gần như hình cầu với đường kính 4,11 ± 0,37 nm. Nghiên cứu đã chứng minh rằng Ag @ CS có kết quả tốt trong việc tiêu diệt nấm. Khả năng chống nấm của Ag làm tăng tác dụng diệt nấm của CS. Dựa trên nano bạc chitosan, các phương pháp tiếp cận mới cho nhiều loại kháng nấm, kháng khuẩn, kháng vi rút và các chất khác có thể được phát triển và cải tiến. Đây được coi là một bước quan trọng của kháng sinh trong nông nghiệp nhằm góp phần giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật và loại bỏ các sản phẩm độc hại.
Nguồn tham khảo: Synergistic antifungal effect of fungicide and chitosan-silver nanoparticles on Neoscytalidium dimidiatum