Nano bạc – Chitosan trị bệnh rụng lá cây cao su do Corynespora cassiicola gây ra
Các hạt nano bạc (AgNPs) đã được điều chế thành công bằng cách chiếu xạ γ -rays dung dịch chứa 1,0–10 mM bạc nitrat và 1% (10000 ppm) chitosan. Các đặc tính quang học và kích thước hạt của AgNPs được xác định tương ứng bằng quang phổ UV-Vis và ảnh TEM. Kích thước của AgNPs tăng lên khi tăng nồng độ bạc hoặc giảm khối lượng phân tử chitosan trong dung dịch được chiếu xạ. Các tinh thể trong ống nghiệm kiểm tra cho thấy AgNPs ức chế sự tăng trưởng của Corynespora cassiicola trên chiết xuất lá cao su với hiệu quả ức chế của 52,1-100% bằng cách xử lý AgNPs với kích thước hạt 15-5 nm, tương ứng. Ngoài ra, hoạt tính kháng nấm đã đạt đến ~ 100% khi bổ sung 90 ppm AgNPs. Các in vivo, xử lý AgNPs qua lá trên cây cao su 9 tháng tuổi cho thấy việc xử lý với 2,5–12,5 ppm AgNPs trên cây khảo nghiệm sau khi cấy bằng cách phun bào tử C. cassiicola đã nâng cao tỷ lệ cây không nhiễm bệnh từ 6,0 lên 93,3%, tương ứng, so với đối chứng không được xử lý. Tác dụng ức chế của AgNPs đối với sự phát triển của nấm C. cassiicola cũng được làm sáng tỏ qua ảnh SEM. AgNPs / chitosan được tổng hợp bằng chiếu xạ γ có triển vọng được sử dụng như một sản phẩm diệt nấm để điều trị C. cassiicola , một loại nấm gây bệnh nghiêm trọng trên cây cao su.
(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)
Quý khách hàng có nhu cầu nano bạc nguyên liệu 15000 ppm dùng trong nông nghiệp vui lòng liên hệ Hotline 098.435.9664 – 0378.622.740
1. Giới thiệu
Cao su (Hevea brasiliensis) là cây công nghiệp dài ngày và cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp. Chúng có giá trị kinh tế rất cao và đã mang lại nhiều lợi nhuận cho nông nghiệp. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam năm 2017, Việt Nam đứng thứ 3 với diện tích trồng cây cao su đạt 971,6 nghìn ha và tổng sản lượng mủ cao su đạt 1.086 nghìn tấn. Tuy nhiên, hiện nay người trồng cao su đang gặp rất nhiều khó khăn do nhiều loại bệnh do vi sinh vật gây ra, trong đó bệnh rụng lá do C. cassiicola gây ra đang ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng và năng suất cao su [1].
Cassiicola bệnh lần đầu tiên được quan sát thấy trên cây cao su ở Sierra Leone (Affrica) vào năm 1936. Nhiều trường hợp được báo cáo hơn ở. Ấn Độ và Malaysia vào năm 1961; Nigeria năm 1968; Thái Lan, Srilanca và Indonesia năm 1985; Brazil và Bangladesh năm 1988 [ 2 , 3]. Mặc dù bệnh rụng lá trên cao su mới chỉ xuất hiện ở Việt Nam từ tháng 8/1999, nhưng bệnh đã lây lan nhanh và rộng ở nhiều tỉnh miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và Duyên hải miền Trung Việt Nam.
Phòng trừ bệnh rụng lá hiện nay vẫn còn là một vấn đề khó khăn do thiếu thuốc trừ bệnh đặc hiệu trong khi người trồng đang sử dụng nhiều sản phẩm hóa học có thể gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường cũng như chất lượng cao su.
Chitosan trọng lượng phân tử thấp đã được chứng minh là một sản phẩm tự nhiên, an toàn và hiệu quả cho nông nghiệp [ 4]. Nhiều nghiên cứu đã được báo cáo rằng ngoài tác dụng tăng cường sinh trưởng cho cây trồng, chitosan còn cung cấp cho cây trồng khả năng ngăn ngừa nhiều bệnh nhiễm trùng bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch của tế bào thực vật, được gọi là tác dụng phytoalexin [ 5 – 7 ].
Ngoài ra, hạt nano bạc (AgNPs) đã được nghiên cứu rộng rãi và sử dụng rộng rãi trong thời gian dài do có những đặc tính riêng như ức chế vi khuẩn và nấm, khử mùi hôi ở nồng độ thấp, an toàn với con người và môi trường. Tác dụng chống nấm của nano bạc ổn định trong chitosan đã được nghiên cứu trên các loại nấm gây bệnh như Colletotrichum [ 8 ] và Corticium salmonicolor [ 9].
Hơn nữa, chiếu xạ γ -rays sử dụng nguồn Co-60 được coi là một phương pháp hiệu quả để tổng hợp các hạt nano kim loại quý [ 10 ]. Ưu điểm của phương pháp chiếu xạ là tiết kiệm năng lượng, mặt bằng và nguyên vật liệu, thân thiện với môi trường, v.v. Đặc biệt, quy trình có thể được tiến hành ở nhiệt độ môi trường và thuận lợi cho việc mở rộng quy mô sản xuất hàng loạt với giá thành hợp lý [ 10 – 12 ]. Nghiên cứu này nhằm tổng hợp sản phẩm AgNPs / chitosan an toàn cho người và hiệu quả trong việc trừ bệnh rụng lá do C. cassiicola gây ra trên cây cao su.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu
Bột bạc nitrat (AgNO3 ) tinh khiết được cung cấp bởi Merck Co., Đức. Chitosan với mức độ khử oxy hóa 80% được mua từ Loyou Chemical Co., Ltd., Nhật Bản. Nấm gây bệnh, cụ thể là Corynespora cassiicola , là quà tặng của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam.
2.2. Tổng hợp AgNPs / Chitosan bằng γ -Ray Irradiation
Các dung dịch bạc nitrat ở các nồng độ khác nhau 1,0; 2,5; 5,0; và 10 mM hòa tan trong dung dịch chitosan 1% được bảo quản trong chai thủy tinh và được chiếu xạ với các liều lượng khác nhau từ 8 đến 28 kGy bằng cách sử dụng γ -rays từ nguồn Co-60 (Gamma Chamber 5000, BRIT, Ấn Độ) với suất liều 3 kGy /NS. Nano bạc dung dịch keo tổng hợp bởi γ chiếu xạ ray được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3. Đặc tính của các hạt Nano bạc / Chitosan
Phổ UV-Vis của các mẫu dung dịch nano bạc thu được được pha loãng đến 0,1 mM được tính theo nồng độ Ag + bằng cách sử dụng nước khử ion được đo trên UV-2401PC, Shimadzu, Nhật Bản [ 9 , 11 , 13 ]. Sự phân bố kích thước và kích thước nano bạc được xác định bằng ảnh TEM trên máy đo JEM 1400, JEOL, Nhật Bản, theo phương pháp được mô tả bởi Li et al. [ 11 ] và Phu et al. [ 9 ].
2.4. Hoạt động chống nấm của AgNPs / Chitosan
Môi trường chiết xuất lá cao su được sử dụng để nuôi cấy C. cassiicola . Dịch chiết lá cao su được chuẩn bị bằng cách đun sôi 200 g lá cao su tươi (sạch bệnh) trong 1000 ml nước cất trong 45 phút, sau đó lọc để loại bỏ cặn và điều chỉnh pH ~ 6,5. Một lít dịch chiết lá cao su được trộn với 20 g thạch và bổ sung AgNPs ở các cỡ hạt khác nhau 5; 10; và 15 nm, và nồng độ nano bạc thay đổi từ 10 đến 90 ppm trước khi hấp tiệt trùng ở 121 ° C, 1 atm trong 20 phút. Các mẫu nấm có đường kính ~ 4 mm được nuôi cấy trên tâm của đĩa thạch chiết xuất lá cao su và ủ trong điều kiện tối ở 28 ± 2 ° C. Năm tấm lặp lại được áp dụng cho mỗi văn bản nồng độ hoặc kích thước hạt và tất cả các thí nghiệm được lặp lại trong ba lần. Đường kính khuẩn lạc của C. cassiicola trong môi trường được đo 24 giờ một lần và hiệu quả chống nấm của AgNPs / chitosan được tính toán bằng cách sử dụng như sau:
Hiệu quả ức chế (%) = (D-d)/d*100%
Trong đó (mm) và (mm) là đường kính khuẩn lạc nấm trên môi trường có hoặc không có bổ sung nano bạc, tương ứng.
2.5. Phân tích kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Khoảng 5 ml dung dịch chứa 7,5 và 12,5 ppm nano bạc được rải trên các sợi nấm C. cassiicola đã phát triển đầy đủ được trồng trên môi trường thạch chiết xuất lá cao su bằng máy phun. Đối chứng được áp dụng bằng nước cất với cùng thể tích. Tất cả các ứng dụng được thực hiện trong khoảng thời gian bốn ngày và được ủ ở nhiệt độ phòng. Hình ảnh SEM của các mẫu đã qua xử lý được quan sát trên FE-SEM S4800, Hitachi Co., Tokyo, Nhật Bản, ở điện áp gia tốc 10 kV.
2.6. Trong Vivo Tác dụng diệt nấm của nano bạc chống lại C. cassiicola trên cây cao su
Những cây cao su 9 tháng tuổi (sạch bệnh) đã được trồng và bảo dưỡng trong nhà kính trước khi thử nghiệm. Để kiểm tra tác dụng loại trừ của AgNP đối với nấm bệnh C. cassiicola , lá của 210 cây cao su sạch bệnh (30 cây cho mỗi công thức) được làm vết thương đầu tiên trước khi cấy 300 mL C. cassiicola dung dịch chứa 10 4 bào tử nấm / mL. Các mẫu đối chứng được phun lên lá với cùng một lượng nước cất. Sau khi nhiễm bệnh khoảng 7 ngày, số cây nhiễm bệnh đạt khoảng 50% đối với tất cả các công thức; 50 mL dung dịch AgNPs với nồng độ 2,5, 5, 7,5, 10, và 12,5 ppm được phun qua lá 3 ngày một lần, tối đa 3 lần. Số cây bị bệnh và số lá bị bệnh ở mỗi nghiệm thức được quan sát sau 7 ngày trong vòng 28 ngày thí nghiệm. Tỷ lệ bệnh trên cây và lá (DI) được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm (%) và được tính toán bằng cách sử dụng [ 14 ] sau:
Tỉ lệ số cây bệnh = (Tổng số cây bệnh/Tổng số cây đánh giá)*100%
Tỉ lệ số lá bệnh = (Tổng số lá bệnh/Tổng số lá đánh giá)*100%
Mỗi thử nghiệm được thực hiện ba lần và dữ liệu được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phép thử phân tích phương sai (ANOVA). Các giá trị trung bình được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm nhiều phạm vi của Duncan ở mức xác suất là 5%.
3. Kết quả và thảo luận về nano bạc/chitosan
3.1. Tổng hợp bức xạ của các hạt nano bạc / Chitosan bằng chiếu xạ γ -Ray
Trong thí nghiệm này, dung dịch chứa các ion bạc có nồng độ 1; 2,5; 5; và 10 mM ổn định trong chitosan 1% với trọng lượng phân tử (Mw) khoảng 550 kDa được chiếu xạ lần lượt ở 8, 12, 16 và 28 kGy. Huang và cộng sự. [ 15 ] báo cáo rằng các kích thước AgNP khác nhau sẽ dẫn đến các bước sóng hấp thụ cực đại (ƛmax) và cường độ đỉnh khác nhau. Giá trị của dịch chuyển sang bước sóng dài hơn với sự gia tăng của kích thước AgNPs [ 9 , 15 , 16 ]. Có thể thấy từ Hình 1 rằng các giá trị cường độ đỉnh của các mẫu được chiếu xạ trong phổ UV-Vis giảm từ 1,26 xuống 1,02 do sự gia tăng của nồng độ bạc trong mẫu được chiếu xạ từ 1 đến 10 mM, trong khigiá trị của các mẫu này dịch chuyển từ 397 đến 405,5 nm. Ngoài ra, kích thước hạt ước tính từ ảnh TEM của các mẫu nano bạc sau khi chiếu xạ cũng tăng từ 5 đến 10 nm khi nồng độ cúi tương ứng tăng từ 1 đến 10 mM. Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng các hoạt động kháng khuẩn của nano bạc tăng lên khi giảm kích thước hạt [ 17 ]. Vì vậy, để tổng hợp các AgNP với kích thước mong muốn cho các ứng dụng khác nhau, việc lựa chọn nồng độ Ag + ban đầu để điều chế AgNP là rất cần thiết.
Hình 1 Phổ UV-Vis (bên trái) và ảnh TEM (bên giữa) và phân bố kích thước (bên phải) của AgNPs / chitosan với nồng độ Ag + là 1 (a), 2,5 (b), 5 (c) và 10 mM ( NS).
Mặt khác, ảnh hưởng của Mw của chitosan đến kích thước hạt của nano bạc cũng được nghiên cứu. Kết quả trong Hình 2 cho thấy Mw của chitosan ảnh hưởng đến kích thước của nano bạc hình thành trong các mẫu chiếu xạ và sự giảm Mw của chitosan từ 550 xuống 100 kDa dẫn đến sự gia tăng kích thước AgNPs từ 10 đến 15 nm. Mặc dù cơ chế của những hiệu ứng này vẫn chưa được hiểu đầy đủ, sự gia tăng độ nhớt của dung dịch tương ứng với sự gia tăng của chitosan Mw có thể đã làm giảm động lực của AgNP và ngăn chúng kết tụ để tạo thành cụm nano lớn hơn.
Hình 2 Hình ảnh TEM và sự phân bố kích thước của AgNP được ổn định bởi chitosan với Mw là 100 (a), 250 (b) và 550 kDa (c).
3.2. Hoạt động chống nấm trong ống nghiệm của AgNPs / Chitosan chống lại C. cassiicola
Để kiểm tra hiệu quả chống nấm bằng kích thước hạt của mẫu AgNPs / chitosan, AgNPs với kích thước hạt khoảng 5, 10 và 15 nm đã được sử dụng. Có thể thấy trong hình 3 và 4 , kích thước hạt nhỏ có ảnh hưởng mạnh hơn đến sự phát triển của C. cassiicola trên môi trường chiết xuất lá cao su sau 192 giờ ủ so với môi trường lớn. Đặc biệt, việc bổ sung 50 ppm nano bạc với kích thước hạt 15 nm cho thấy tác dụng ức chế mạnh đối với C. cassiicolavới đường kính khuẩn lạc nấm chỉ đạt 43,1 mm so với 90 mm của đối chứng không xử lý và hiệu quả ức chế được tính toán khoảng 52,1%. Hiệu quả chống nấm tăng lên 70,6% khi kích thước hạt giảm xuống 10 nm và đạt gần 100% đối với kích thước hạt 5 nm. Do đó, hiệu quả chống nấm đối với C. cassiicola tăng lên khi kích thước nano bạc giảm. Xu hướng tương tự cũng đã được báo cáo trước đây bởi Carlson et al. [ 17 ]. Ngoài ra, Franci et al. [ 18 ] cũng chỉ ra rằng các AgNP ở kích thước nhỏ hơn sẽ dễ dàng xâm nhập qua thành tế bào hơn và làm thay đổi và ức chế các con đường truyền tín hiệu của tế bào cũng như sự sao chép DNA và làm tổn thương các cơ quan tế bào thông qua phản ứng oxy hóa.
Hình 3 Hoạt tính kháng nấm chống lại C. cassiicola của các AgNPs với các kích thước hạt khác nhau. (a) Đường kính của khuẩn lạc nấm trên môi trường chiết xuất lá cao su sau 192 giờ ủ và (b) hiệu quả ức chế.
Hình 4 Sự phát triển của C. cassiicola sau 192 giờ ủ trên môi trường chiết xuất lá cao su có bổ sung AgNPs với các kích thước hạt khác nhau.
Mặt khác, các hoạt động chống nấm của AgNPs đã được chứng minh là tăng lên khi tăng nồng độ bạc [ 9 , 19 – 21 ]. Trong nghiên cứu này, các AgNP có kích thước 10 nm ổn định trong 1% chitosan (Mw ~ 550 kDa) được sử dụng để đánh giá các hoạt tính kháng nấm in vitro chống lại C. cassiicola ở các nồng độ AgNPs khác nhau. Kết quả từ Hình 5 và 6 chỉ ra rằng, sau 10 ngày ủ bệnh, sự ức chế sinh trưởng đối với C. cassiicola trên các đĩa môi trường nuôi cấy được bổ sung AgNPs 10 và 30 ppm với hiệu quả ức chế tương ứng từ 6,3 đến 18,5% là khá thấp. Trong khi đó, sự phát triển củaC. cassiicola bị ức chế rõ ràng khi bổ sung 50 ppm với đường kính khuẩn lạc nấm chỉ 50 mm so với 90 mm trên đĩa đối chứng không được xử lý (hiệu quả ức chế ~ 66,4%). Tuy nhiên, hoạt tính ức chế của nano bạc tăng lên khi nồng độ phụ gia tăng lên 70 ppm (hiệu suất ức chế ~ 91,7%) và sự phát triển của C. cassiicola bị ức chế hoàn toàn khi nồng độ bạc đạt 90 ppm với hiệu suất ức chế ~ 100%.
Hình 5 Hoạt tính kháng nấm đối với C. cassiicola của AgNPs (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. (a) Đường kính khuẩn lạc nấm trên môi trường chiết xuất lá cao su sau 192 giờ ủ và (b) hiệu quả ức chế
Hình 6 Sự phát triển của C. cassiicola sau 216 giờ ủ trên môi trường chiết xuất lá cao su có bổ sung các nồng độ AgNP khác nhau.
3.3. Trong Vivo Hoạt động chống nấm của AgNPs / Chitosan chống lại C. cassiicola
Có một số báo cáo cho thấy tác dụng kháng khuẩn của AgNPs chống lại vi khuẩn và nấm [ 9 , 22 , 23 ]. Tuy nhiên, cho đến nay, hiếm có báo cáo trong tài liệu về các nghiên cứu in vivo về tác dụng của AgNPs chống lại nấm trên thực vật. Trong nghiên cứu này, tác dụng chống nấm của AgNPs đối với C. cassiicola đã được khảo sát trực tiếp trên cây cao su. AgNPs với nồng độ 2,5 đến 12,5 ppm được áp dụng trên các cây cao su thử nghiệm thông qua bón lá. Ngoài ra, AgNP đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh khi được phun sau khi nhiễm nấm. Kết quả từ Bảng 1 cho thấy thiệt hại của các cây cao su bị nhiễm bệnh doCó thể giảm thiểu nấm C. cassiicola bằng AgNP. Đặc biệt, DI thực vật giảm từ 30 đến 6,3% bằng cách xử lý AgNPs với nồng độ tương ứng từ 2,5 đến 12,5 ppm. Hơn nữa, có thể thấy từ Bảng 1 và Hình 7 rằng việc xử lý AgNPs cũng giảm thiểu đáng kể DI để lại của cây bị nhiễm bệnh và tỷ lệ DI để lại tỷ lệ nghịch với nồng độ AgNPs được xử lý. Những kết quả này phù hợp với phát hiện trước đây về loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư cho cây tiêu được báo cáo bởi Lamsal et al. [ 8 ]. Nguyên nhân có thể được giải thích là sau khi phun, AgNPs có thể bám vào và giết chết sợi nấm bệnh trong mô thực vật [ 24 ,25 ].
Bảng 1 Ảnh hưởng của nồng độ AgNPs đến việc loại bỏ C. cassiicola sau khi được cấy vào cây cao su.
Hình 7 Các cây cao su bị nhiễm C. cassiicola và được xử lý bằng AgNPs (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. Kiểm tra: cây không xử lý bằng bào tử nấm và AgNPs; phòng trừ: cây bị nhiễm bào tử nấm trước khi xử lý chỉ bằng nước cất.
Sự ức chế của AgNPs đối với sự nảy mầm của sợi nấm C. cassiicola đã được phân tích thông qua SEM để làm sáng tỏ ảnh hưởng của AgNPs đối với sự phát triển của nấm. Hình ảnh SEM trong Hình 8 cho thấy AgNPs đã làm hỏng sợi nấm rõ ràng, trong khi sợi nấm được xử lý bằng nước (đối chứng) dường như vẫn còn nguyên vẹn. Sợi nấm bị trũng và hư hại do tác động của AgNPs. Các sợi nấm được quan sát ở ngày thứ tư sau khi xử lý 7,5–12,5 ppm AgNPs cho thấy sự biến dạng trong sự phát triển của sợi nấm và hình dạng của các thành sợi nấm. Các lớp vách ngăn sợi nấm cũng bị xé ra trên các sợi nấm bị hư hại ở ngày thứ tư và nhiều sợi nấm bị sụp đổ.
Hình 8 Ảnh SEM của sợi nấm C. cassiicola được xử lý bằng AgNPs. Sợi nấm phát triển trên đĩa môi trường thạch chiết xuất lá cao su được phun với nước như một đối chứng hoặc thể tích tương đương 7,5 và 12,5 ppm của dung dịch AgNPs 10 nm. Ảnh được chụp vào ngày thứ tư sau khi điều trị.
4.Kết luận hiệu quả nano bạc
AgNPs với các kích thước hạt khác nhau đã được tổng hợp thành công bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 sử dụng chitosans với các Mw khác nhau làm chất ổn định. Các sản phẩm AgNPs / chitosan tổng hợp cho thấy tác dụng ức chế mạnh đối với C. cassiicola trên môi trường chiết xuất lá cao su với hiệu quả kháng nấm đạt ~ 100% khi xử lý 50 ppm AgNPs với kích thước 5 nm hoặc 90 ppm AgNPs với kích thước 10 nm . Việc xử lý lá bằng dung dịch AgNPs 5-12,5 ppm làm giảm mạnh tỷ lệ bệnh của cây cao su cũng như tỷ lệ bệnh trên lá cao su bị nhiễm nấm C. cassiicola . Do đó, AgNPs / chitosan được tổng hợp bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 được coi là một phương pháp xanh có thể được sử dụng như một sản phẩm diệt nấm có tiềm năng và hiệu quả để kiểm soátC. cassiicola , một loại nấm gây bệnh nguy hiểm trên cây cao su.
Nguồn tham khảo:
Le Thi An Nhien,1,2 Nguyen Duc Luong,2 Le Thi Thuy Tien,2 and Le Quang Luan