Nano bạc, nano đồng oxit điều trị nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa và đốm nâu trên cây có múi

Sinh tổng hợp hạt nano (NP) từ nấm xanh là một phương pháp thân thiện với môi trường đầy hứa hẹn để sản xuất quy mô lớn. Trong nghiên cứu này, các hạt nano bạc (Ag) , nano đồng oxit (CuO) và nano kẽm oxit (ZnO) được tổng hợp sinh học bằng cách sử dụng dịch lọc tế bào của một dòng Trichoderma harzianum làm chất khử và ổn định. Cấu trúc, hình thái và các đặc tính hóa lý của các NP được đặc trưng thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua, tán xạ ánh sáng động, tán xạ tia X góc rộng và phân tích nhiệt trọng lượng. Vì công nghệ nano có thể cung cấp các ứng dụng đầy hứa hẹn trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng tôi đã đánh giá khả năng của các hạt nano trong việc giảm sự phát triển của các nấm gây bệnh ở thực vật quan trọng như Alternaria Alternata (gây bệnh đốm nâu ở cây có múi)Pyricularia oryzae (gây bệnh đạo ôn ở lúa)  và Sclerotinia sclerotiorum (gây bệnh thối hạch). Các hạt nano bạc và CuO làm giảm đáng kể sự phát triển của sợi nấm A. Alternata và P. oryzae phụ thuộc vào liều lượng. Đây là báo cáo đầu tiên về quá trình sinh tổng hợp ngoại bào nhiều hạt nano từ T. harzianum và là lần đầu tiên thu được các nano CuO và ZnO từ loài nấm này. Ngoài ra, chúng tôi nhấn mạnh tiềm năng của nano bạc và CuO để kiểm soát các nấm gây bệnh thực vật. Mặt khác, ba loại nano này có thể được sản xuất dễ dàng và bền vững trên quy mô lớn với cơ hội có nhiều ứng dụng trong các quy trình công nghệ sinh học.

Nano bạc trị Đạo ôn trên lúa

(Bản quyền thuộc về NanoCMM Technology)

Quý khách hàng có nhu cầu nano bạc nguyên liệu 15000 ppm dùng trong nông nghiệp vui lòng liên hệ Hotline 098.435.9664 – 0378.622.740

1. Giới thiệu

Hạt nano (NP) là vật liệu siêu nhỏ với kích thước kích thước nhỏ hơn 100 nm, được quan tâm nhiều vì chúng có thể được sử dụng trong một số quy trình liên quan đến khoa học vật liệu, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y tế và ứng dụng chẩn đoán 1 .

Vật liệu nano vô cơ có thể được tổng hợp từ các kim loại nguyên chất như alumin, bạc, vàng, cadimi hoặc từ các oxit kim loại như CuSO 4, TiO 2 và ZnO 2 . Trong số đó, các hạt nano bạc (AgNPs) được đánh dấu do tính chất kháng virus và kháng khuẩn của chúng 3 . Một số NP như oxit kim loại, đóng vai trò rất quan trọng trong việc sản xuất cảm biến, các quá trình xúc tác lớp phủ bề mặt 4, khu vực y tế hoặc kháng khuẩn, cũng như 5 .

Các phương pháp vật lý và hóa học thông thường để tổng hợp NP kim loại, có chi phí cao, năng suất thấp và yêu cầu sử dụng các dung môi độc hại tạo ra các sản phẩm nguy hiểm cho môi trường 6 . Các phương pháp sinh học đã và đang nổi lên như một phương án khả thi về mặt kinh tế để được sản xuất với khối lượng lớn ở cùng quy mô với chi phí hợp lý vì tính đơn giản và các phương pháp thân thiện với môi trường 7 .

Sự vắng mặt của dung môi hữu cơ và sinh tổng hợp trong pha nước dưới áp suất và nhiệt độ phòng là những ưu điểm chính 8 . Vi khuẩn, tảo, thực vật, tảo cát và nấm được coi là nhà máy sản xuất NPs vì các đặc tính của chúng là chất khử và chất ổn định 9. Nấm được quan tâm đặc biệt do sự phát triển nhanh chóng của sợi nấm, tăng diện tích bề mặt, dễ dàng xử lý sinh khối và nuôi cấy trên quy mô lớn. Ngoài ra, khả năng tiết ra một lượng protein đáng kể của chúng sẽ khuếch đại năng suất tổng hợp hạt nano 10 .

Chi nấm Trichoderma (Ascomycetes, Hyprocreales) chứa các loài có tầm quan trọng kinh tế lớn do chúng sản xuất các enzym công nghiệp, kháng sinh và các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học 11 . Đặc biệt, Trichoderma harzianum là mycoparasite chính được sử dụng để chống lại các tác nhân gây bệnh cho cây trồng. Một tổng quan tài liệu đã chỉ ra rằng một số loài Trichoderma , bao gồm T. harzianum , có thể tổng hợp AgNPs, có tiềm năng lớn như chất kháng khuẩn 12 , 13 , 14 . Tuy nhiên, khả năng của họ trong việc tổng hợp vật liệu nano dựa trên oxit kim loại, có thể có nhiều ứng dụng, vẫn chưa được khám phá 15 ,16 .

Trong nông nghiệp, việc sử dụng nano kim loại có tiềm năng lớn để góp phần cải thiện cây trồng hiện tại và tương lai 17 . Chúng có thể có liên quan trong việc ức chế dịch hại thực vật, theo dõi hoặc phát hiện bệnh thực vật và là một giải pháp thay thế tốt để giảm liều lượng các sản phẩm hóa học làm thuốc trừ sâu. Quan trọng là, các hạt nano có thể cải thiện việc phân phối thuốc hoặc làm chậm quá trình giải phóng thành phần hoạt tính để tăng hiệu quả của chúng 18.

Các hạt nano bạc có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn, nấm và vi rút 3 . Trong sản xuất nông nghiệp, việc sử dụng các hợp chất đồng số lượng lớn đã thành công trong việc giảm thiểu các bệnh hại cây trồng do nấm và vi khuẩn gây ra. Chúng có chi phí hợp lý và ít rủi ro trong việc tạo ra khả năng kháng mầm bệnh, do phương thức hoạt động đa địa điểm của chúng 19 . Đặc biệt, NPs đồng gây ra sự thay đổi biểu hiện của protein như một chìa khóa của việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật 20 . Hơn nữa, các NPs ZnO đã được đặc trưng để có hiệu quả đối với vi sinh vật, và chủ yếu là do đặc tính kháng khuẩn của chúng dựa trên hiệu ứng quang oxy hóa và quang xúc tác và được coi là an toàn sinh học 21 .

Nấm là nguyên nhân chính của khoảng 70% các bệnh thực vật 22 , gây ra thiệt hại đáng kể và gây ra tác động tiêu cực về kinh tế ở một số loại cây trồng ảnh hưởng đến hệ thống nông nghiệp trên toàn thế giới 23 , 24 . Do đó, một số loài nấm đại diện lây nhiễm ồ ạt các cây trồng khác nhau là: Sclerotinia sclerotiorum, ảnh hưởng đến sản xuất đậu tương, cà chua, rau diếp, đậu và hướng dương 25 , Pyricularia oryzae gây bệnh quan trọng nhất trên ngũ cốc như lúa và lúa mì 26 và Alternaria Alternata , là một loại nấm gây bệnh, cơ hội và gây bệnh có phạm vi ký chủ rộng, gây đốm lá và cháy lá trên nhiều bộ phận của cây.27 .

Trong bối cảnh này, mặc dù công việc đáng kể đã được thực hiện để kiểm tra tác động của NPs đối với nấm bệnh thực vật, một số ít trong số đó được thực hiện với NPs tổng hợp sinh học 28 . Do đó, mục đích của nghiên cứu này là cố gắng đánh giá khả năng chiết xuất không tế bào từ chủng vi khuẩn kiểm soát sinh học T. harzianum như một chất khử và chất ổn định để tổng hợp các NP Ag, CuO và ZnO. Theo hiểu biết của chúng tôi, rất ít báo cáo chỉ sử dụng T. harzianum trong việc tổng hợp AgNPs 13 , 14 , 29 và không có báo cáo nào từ loài nấm này về việc tổng hợp các NP CuO và ZnO từ muối sunfat kim loại. Kết quả của chúng tôi đã chứng minh sự hình thành thành công ba loại NP kim loại từ cùng một chủng T. harzianum sử dụng quy trình xanh đơn giản. Các NP sinh học được đặc trưng để xác nhận sự tổng hợp và cấu trúc, và xác định các thông số bao gồm sự phân bố kích thước, chỉ số đa phân vị, thế zeta và hình thái. Hơn nữa, hoạt tính kháng nấm của chúng chống lại các chủng vi sinh vật thực vật A. Alternata , P. oryzae và S. sclerotiorum đã được chứng minh.

2. Vật liệu và phương pháp tổng hợp nano bạc, CuO, ZnO

2.1. Chủng nấm và sản xuất sinh khối

Một dòng Trichoderma harzianum từ INBIOTEC Culture Collection IB-363 đã được làm mới trong đĩa Petri đường kính 9 cm có chứa thạch khoai tây-dextrose (Britania) ở 24 ° C trong 7 ngày. Để tạo sinh khối nấm cho quá trình tổng hợp hạt nano, người ta thu hoạch hai phích cắm thạch của sợi nấm non từ đĩa và chuyển vào các bình 500 ml có chứa môi trường lỏng như sau: KH 2 PO 4 (7 g L −1 ); K 2 HPO 4 (2 g L −1 ); MgSO 4 · 7H 2 O (0,1 g L −1 ); (NH 2 ) SO 4 (1 g L −1 ); chiết xuất nấm men (0,6 g L −1); glucozơ (10 g L −1 ). Các bình được ủ trong máy lắc quỹ đạo ở 24 ± 2 ° C và được khuấy ở tốc độ 150 vòng / phút trong 72 giờ trong điều kiện tối. Sau khi tăng trưởng, khoảng 10 g sợi nấm được thu hoạch qua rây nhựa, rửa bằng nước cất hai lần vô trùng để loại bỏ các thành phần môi trường nuôi cấy khỏi sinh khối. Sinh khối nấm được đưa tiếp xúc với 150 mL -1 nước cất hai lần vô trùng trong 48 giờ ở 22 ° C trong bình 500 mL -1 . Sau khi ủ, sinh khối nấm được tách khỏi dịch lọc nuôi cấy không chứa nước (CFCF) bằng cách đưa nó qua giấy lọc Whatman no. 1.

2.2. Tổng hợp các hạt nano kim loại

Các hạt nano bạc, oxit đồng và oxit kẽm được tổng hợp bằng cách sử dụng 50 ml CFCF dạng nước trong các bình bằng cách khuấy dung dịch muối kim loại tương ứng của chúng. Theo đó, lượng AgNO3 , CuSO4.5H2O và ZnSO4.7H2O được thêm vào trong CFCF để tạo ra dung dịch có nồng độ cuối cùng là 1–2 mM. Phản ứng được thực hiện trong điều kiện tối ở 45°C, khuấy mạnh. Ảnh hưởng của pH đến sự tổng hợp các hạt nano đã được nghiên cứu thông qua các thí nghiệm trên phạm vi từ 6 đến 12.

Sự hình thành các hạt nano được quan sát bằng sự thay đổi màu sắc của chúng và được xác nhận thêm bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau được mô tả dưới đây. Đồng thời, đối chứng dương tính là CFCF không có bạc nitrat, đồng hoặc kẽm sunfat, và đối chứng âm tính tương ứng của chúng, 1–2 mM mỗi muối kim loại trên nước khử ion, cũng được kiểm tra để so sánh. Các hạt nano được tách bằng cách ly tâm, (8.000 vòng / phút trong 10 phút) được rửa hai lần bằng nước cất hai lần và làm khô bằng cách đông khô trong 24 giờ. Sau đó, NP được bảo quản trong ống polypropylene trong điều kiện tối và nhiệt độ phòng.

2.3. Đặc điểm hóa lý của các hạt nano kim loại

Huyền phù của các nano bạc, CuO và ZnO tổng hợp được pha loãng trong nước siêu tinh khiết, được siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng và sự phân bố kích thước của chúng được đo bằng tán xạ động của cường độ tán xạ ánh sáng (DLS) bằng cách sử dụng Zetasizer Nano ZS, (Malvern Instruments Ltd., Vương quốc Anh). Phép đo cung cấp đường kính thủy động lực học trung bình của các hạt, các giá trị đỉnh trong phân bố đường kính thủy động lực học và chỉ số phân tán đa giác (PdI) mô tả độ rộng của phân bố kích thước hạt.

Thang đo PdI nằm trong khoảng từ 0 đến 1 (với 0 là monodisperse và 1 là polydisperse) 30. Tất cả các phép đo được thực hiện ba lần với thời gian cân bằng nhiệt độ là 1 phút ở 25 ° C với góc 90 ° C. Chế độ xử lý dữ liệu được đặt thành độ phân giải đa phương thức cao. Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) được thực hiện để xác định sự suy giảm nhiệt NPs bằng cách sử dụng TGAQ500 V20.13 Build 39 (TA Instruments Co., USA) với khoảng 10 mg mẫu, trong môi trường N2 và với tốc độ gia nhiệt là 5 ° C từ nhiệt độ phòng đến 900 ° C dưới luồng gió.

Các mẫu đo tán xạ tia X góc rộng (WAXS) của các nano bạc dạng bột, CuO và ZnO được ghi lại bằng thiết bị XEUSS 2.0 XENOCS. Các mẫu đã được đăng ký với một máy dò tia X có điểm ảnh đếm photon 2D Pilatus 100 k (DECTRIS, Swizerland) được đặt gần mẫu với góc nghiêng 36 °. Cường độ tán xạ, I (2θ), được ghi lại dưới dạng hàm của góc tán xạ 2θ với λ = 0,15419 nm là trung bình có trọng số của bước sóng tia X của Cu-K α12vạch phát xạ. Do kích thước chùm tia nhỏ ở mẫu (1 mm × 1 mm) nên không tính đến hiệu ứng làm mờ. Các mẫu được giữ trong chân không trong hai cửa sổ kapton. Các phép đo được thực hiện ở chế độ truyền. Mỗi mẫu được thu nhận ở hai mẫu khác nhau để phát hiện khoảng cách trong 10 phút, nhằm bao phủ phạm vi từ 15 ° đến 60 ° 2θ.

Hình thái học của các hạt nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được thực hiện để chuẩn bị một giọt mẫu NPs Ag, CuO hoặc ZnO trong nước được bao gồm trong một lưới đồng phủ carbon, được làm khô và giữ trong chân không trước khi tải lên giá đỡ mẫu. Hình ảnh thu được bằng thiết bị JEOL, JEM-2100 (Nhật Bản) hoạt động ở điện áp gia tốc 200 kV với máy quang phổ phân tán năng lượng (EDS). Ảnh hiển vi thu được ở độ phóng đại 150.000 × và sự phân bố kích thước hạt của các NP được đánh giá bằng phần mềm ImageJ 1.45.

2.4. Hoạt động sinh học của NP tổng hợp

Ảnh hưởng của các nano bạc, CuO và ZnO tổng hợp sinh học lên sự phát triển của sợi nấm đối với nấm gây bệnh thực vật A. Alternata, P. oryzae và S. sclerotiorum từ bộ sưu tập nuôi cấy INBIOTEC đã được đánh giá. Do đó, một thử nghiệm poisson đã được thực hiện đặt một nút 5 mm sợi nấm non của mỗi phytopathogen ở trung tâm của đĩa Petri có chứa thạch khoai tây-dextrose được bổ sung với 5, 10 và 20 ppm của mỗi hạt nano và giữ trong 7 ngày ở 24 ± 2 ° C dưới 12 h L / D quang chu kỳ. Các mẫu cấy đối chứng âm tính của các chủng nấm chỉ phát triển trong thạch khoai tây-dextrose. Sau khoảng thời gian đó, người ta đo được đường kính của sợi nấm. Tác động tăng trưởng của từng loại NP tổng hợp từ T. harzianumsự căng thẳng đã được đánh giá dựa trên sự phát triển của chính chúng. Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần.

2.5. Phân tích thống kê

Trong các thử nghiệm độc tính, sự phát triển của sợi nấm được so sánh với đối chứng âm tính tương ứng của chúng và dữ liệu thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phân tích phương sai một cách (ANOVA). Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán và kiểm tra bằng phép thử Tukey ở p  <0,05. Phân tích được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism v. 6.0.

3. Kết quả và thảo luận nano bạc, CuO, ZnO

3.1. Sinh tổng hợp và đặc tính của các hạt nano

Từ CFCF trong nước của T. harzianum, các NP oxit bạc, đồng và kẽm, đã được tổng hợp thành công trong các thí nghiệm riêng biệt sau khi thêm 1–2 mM bạc nitrat, sunphat đồng hoặc sunphat kẽm. Sự hình thành các NP kim loại được chứng minh bằng cách thay đổi huyền phù màu CFCF sau khi thêm muối tương ứng của chúng trong điều kiện khuấy liên tục ở 45 ° C trong điều kiện bóng tối. Mặc dù phản ứng pH từ 6 đến 12 được đánh giá, sự kết tủa nhanh chóng của các NP được quan sát thấy trong vòng 10 phút, khi CFCF ban đầu ở pH 6 được kiềm hóa bằng NaOH đến pH 12.

Ngay lập tức nhận thấy sự giảm Ag + thành Ag 0 bởi CFCF. sau khi thêm AgNO 3 chuyển từ màu vàng nâu nhạt sang màu nâu sẫm dạng keo do sự hình thành AgNPs 3031 . Trong khi đó, sự hình thành các NP CuO xảy ra sau quá trình khử các ion sunphat từ Cu +2 thành Cu 0 , được quan sát bằng sự thay đổi ngay lập tức dung dịch CFCF màu xanh lam thành màu vàng nâu nhạt được tạo ra chuyển thành màu nâu sẫm dạng keo sau khi khuấy liên tục 32 . Ngược lại, từ không màu chuyển sang màu trắng nhạt được quan sát thấy trong CFCF sau khi thêm ZnSO 4 , trong đó Zn +2 bị khử thành Zn 0 tạo thành dung dịch chứa ZnO NP được chứng minh bằng kết tủa bột trắng mịn 33 , sau cùng điều kiện đã đề cập ở trên. Do đó, đây là tác phẩm đầu tiên trong đó một con T. harzianum duy nhất CFCF có thể tổng hợp ba loại NP kim loại trong cùng điều kiện.

3.2. Các đặc tính hóa lý của các hạt nano sinh học

Sự phân bố kích thước của các hạt nano bạc AgNPs sinh học từ T. harzianum được xác định bởi DLS cho thấy đường kính thủy động trung bình là 582,4 nm ± 112,78 nm với giá trị PDI 0,36 ± 0,07 và đường kính trung bình Z là 657,93 nm ± 127,62 nm. Hồ sơ phân bố là đơn thể (Hình  1 a) cho thấy sự thay đổi kích thước thấp và ổn định lý hóa tốt. Trong trường hợp các NP CuO, hai cực đại được phát hiện (Hình  2a) dao động pic1 kích thước trung bình là 276,43 nm ± 76,77 nm và pic 2, 58,87 nm ± 10,00 nm với giá trị PDI 0,49 ± 0,06 và đường kính trung bình Z là 249,30 nm ± 61,24 nm. Đối với các NPN ZnO, chỉ xác định được một pic có kích thước 517,8 nm ± 50,1 nm và đường kính trung bình Z 792,4 nm ± 60,5 nm với giá trị PDI 0,563 ± 0,05 và phân bố hẹp của kích thước NPN ZnO lần lượt được chỉ ra.

Hình 1 Sự phân bố kích thước và hình thái của các hạt nano bạc

Hình 1 Sự phân bố kích thước và hình thái của các hạt nano bạc được tổng hợp sinh học bằng Trichoderma harzianum chủng IB-363. ( a ) tán xạ ánh sáng động (DLS, n = 3), ( b ) phân tích theo dõi hạt nano (n = 3), và ( c ) kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) kết hợp với phân tích quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDS) ( d ) Dạng WAXS, Các ngôi sao màu trắng đại diện cho các đỉnh nhiễu xạ Ag 2 O (COD: 00-101-0486).

Hình 2 Sự phân bố kích thước của các hạt nano CuO

Hình 2 Sự phân bố kích thước của các hạt nano CuO được tổng hợp sinh học bằng nấm Trichoderma harzianum chủng IB-363 ( a ) tán xạ ánh sáng động (DLS, n = 3), ( b ) phân tích theo dõi hạt nano (n = 3), và ( c ) kính hiển vi điện tử truyền qua ( TEM) cùng với phân tích quang phổ tia X tán sắc năng lượng (EDS) ( d ) Mẫu WAXS cho các NP CuO. Các ngôi sao tương ứng với nhiễu xạ CuO 1 (00-721-2242) và các mũi tên màu đỏ đối với Cu (OH) 2 (00-900-9157).

Hình 3 Sự phân bố kích thước của các hạt nano ZnO

Hình 3 Sự phân bố kích thước của các hạt nano ZnO tổng hợp sinh học với nấm Trichoderma harzianum chủng IB-363. ( a ) tán xạ ánh sáng động [DLS, n = 3), ( b ) phân tích theo dõi hạt nano (n = 3), ( c )] kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) kết hợp với phân tích quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDS) ( d ) Dạng WAXS cho các NP của ZnO .

Do đó, kết quả của chúng tôi chỉ ra sự hình thành ba loại hạt nano ở quy mô nano trong môi trường nước. Điều đáng chú ý là không có sự tăng cân nào xảy ra, như trong Hình. 1 a, 2 a và 3 a, cho thấy rằng các nano bạc, CuO và ZnO được tổng hợp sinh học vẫn còn nguyên vẹn, không bị oxy hóa trong môi trường nitơ. Trong tất cả chúng, giá trị PDI cho thấy độ phân tán đa sắc thấp đến trung bình.

Phân tích suy giảm nhiệt (TGA) của các nano bạc, CuO và ZnO từ 25 đến 900 ° C trong môi trường nitơ cho thấy các khía cạnh khác nhau của từng NP nghiên cứu. Đối với các NP AgNP và CuO, hai khoảng giảm trọng lượng chính đã được quan sát (Hình 1 b, 2 b). Trong cả hai, tâm đầu tiên ở khoảng 100 ° C, trong khoảng 2% có thể liên quan đến sự bay hơi của nước hấp phụ. Tổn thất thứ hai nằm trong khoảng từ 100 đến 400 ° C, đối với AgNPs là khoảng 25% và được gán cho sự phân hủy nhiệt của các hợp chất hữu cơ sinh học, có thể hiện diện trên bề mặt 13 , 14 , 34 của chúng .

Ví dụ, sự mất trọng lượng của CuO NP là khoảng 7%, cho thấy độ bền nhiệt của hợp chất hơn 90% ở 400 ° C 35. Đối với cả hai NP, sự thay đổi thành phần được hoàn thành ở 400 ° C, trong đó giảm trọng lượng ổn định lên đến 900 ° C. Ví dụ, trong trường hợp của các NP ZnO, tốc độ mất khối lượng cao liên tục xảy ra trong khoảng từ 300 đến 900 ° C trong khoảng 15%, do sự bay hơi của nước được hấp thụ trên bề mặt, và có thể ở nhiệt độ cao hơn do đến sự phân hủy kẽm sunfat (Hình  3 b). Đây là báo cáo đầu tiên về các NP CuO hoặc ZnO được tổng hợp sinh học, thông qua phương pháp TGA sử dụng CFCF từ Trichoderma kết hợp với các muối sunphat. Theo tài liệu, chỉ đối với ZnO, một kiểu suy giảm tương tự, như được quan sát trong nghiên cứu của chúng tôi, phù hợp với Moharran và cộng sự. 36trong đó NPs được điều chế bằng phương pháp hóa lý dựa trên sự thủy phân và ngưng tụ của kẽm axetat dihydrat bằng kali hydroxit trong môi trường cồn ở nhiệt độ thấp.

Phân tích XRD xác nhận bản chất tinh thể của các NP với các đỉnh tương ứng với nano bạc, Cu và Zn. Mẫu XRD cho AgNPs (Hình  1 d) tiết lộ độ nhiễu nano tại các đỉnh nhiễu xạ tại 38,11, 46,18, 63,44, 77,21 và 2,11 được ấn định. Mô hình WAXS cho thấy các đỉnh trùng hợp với dạng tính toán của khối Ag 2 O. Như trong Hình  2 d đối với các NP CuO, có thể quan sát thấy bốn đỉnh hấp thụ mạnh ở các góc 29, 37, 44 và 62, theo Khatami et al. . 5 . Dạng WAXS, trình bày các đỉnh trùng hợp với dạng tính toán của CuO đơn tà, Các đỉnh bổ sung đã được xác định là Cu (OH) 2 , có cấu trúc tinh thể trực thoi. Đối với các NP của ZnO, như được quan sát trong Hình  3d, dạng WAXS cho thấy tất cả các đỉnh phù hợp với dạng tính toán của ZnO lục giác. Sự khác biệt về chiều rộng cho thấy sự hình thành các cấu trúc dị hướng, với sự phát triển ưu tiên theo hướng 002.

Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua xác nhận rằng ba loại NP tổng hợp kim loại nằm trong phạm vi nano. Hình dạng của AgNPs gần như hình cầu với ít tập hợp kết tụ và phân bố kích thước từ 5 đến 18 nm (Hình  1 c). Có thể đề xuất hai cách giải thích về quan sát này: thứ nhất, sự kết tụ có thể xuất hiện do sự tích tụ có thể có của các protein và enzym, có thể được tiết ra trong quá trình sinh tổng hợp, và thứ hai, quá trình lọc có thể ngăn cản sự đi qua của các phân tử protein khác nhau được tạo ra trong quá trình quá trình sinh tổng hợp. Cùng một loại hạt nano, thu được từ chủng T. harzianum của chúng tôi , có hình dạng và kích thước tương tự như những hạt mà Guilguer et al đã quan sát được. 13 và Elamawi et al.30 từ T. harzianum và T. longibrachiatum tương ứng.

Các sợi phân tán và kéo dài có hình dạng đối với các NP CuO đã được quan sát (Hình  2 c) và kích thước nằm trong khoảng từ 38 đến 77 nm chiều rộng và 135–320 nm chiều dài. Do đó, hình thái của các NP CuO sinh học được tổng hợp trong nghiên cứu của chúng tôi từ T. harzianum là báo cáo đầu tiên cho đến nay. Trong tài liệu, các NP CuO tổng hợp sinh học phổ biến nhất chủ yếu là từ các loài thực vật khác nhau, trong đó các dạng hình cầu hoặc hình khối đã được quan sát thấy 37 . Có rất ít báo cáo về các NP CuO được tổng hợp từ các loài Trichoderma . Liên quan nhất đến nghiên cứu của chúng tôi là quá trình tổng hợp nội bào từ T. koningiopsis, trong đó NPs thu được từ sinh khối đã chết, nơi một số ít tập hợp có dạng hình cầu với đường kính trung bình là 87,5 nm.38 .

Gần đây hơn, các NP CuO được tổng hợp từ CFCF của T. asperellum dưới dạng kết tụ dày đặc và hình cầu giống như hình dạng 12 . Zhu và cộng sự đã quan sát thấy hình thái tương tự của các NP CuO. 39 người đã điều chế các NP CuO bằng cách thêm NaOH rắn vào dung dịch nước của đồng axetat sau khi đun nóng dung dịch từ nhiệt độ phòng lên đến 100 ° C. Những điều kiện này đã hình thành các hạt hình elip có đường kính 100 nm tương tự như trong công trình của chúng tôi. Quy trình này điều hòa tốc độ tạo mầm và tăng trưởng của các hạt CuO dẫn đến sự kết tụ của các tinh thể CuO và tạo ra các hạt elipsoit phân tán cao. Hơn nữa, Alishah et al. 40, các NP CuO kéo dài quan sát được trong điều kiện tổng hợp thủy nhiệt có đường kính trung bình là 328,27 nm.

Hình thái của các NP ZnO sinh học giống như một cấu trúc hình quạt và bó hoa như trong Hình  3 c. Và kích thước nằm trong khoảng 27–40 nm chiều rộng và 134–200 nm. Theo đề xuất của Ludi và Niederberger 41 , loại cấu trúc NPs này chỉ được quan sát trong các quy trình vô cơ của quá trình hình thành tinh thể bằng cách sử dụng rượu benzyl, trong đó các tinh thể nano sơ cấp và sự gắn kết có định hướng và tái tạo bề mặt của chúng xảy ra bên trong các khối kết tụ. Ngoài ra, Pacholsky et al. 42 báo cáo rằng trong các dung dịch chứa nước kiềm, sự hấp phụ của OH hoặc H 2O cũng như phản ion, nên khác nhau. Do đó, các điện tích bề mặt khác nhau có thể cản trở hoặc cho phép gắn định hướng trong các mặt phẳng khác nhau, vì nó xảy ra trong sự phát triển tinh thể trong quá trình khoáng hóa sinh học. Người ta đã xác định rằng pH đóng một vai trò quan trọng trong việc mô hình hóa hình thái và kích thước của các NP cũng như pH tăng, số lượng trung tâm tạo mầm cũng tăng 43 . Do đó, nghiên cứu của chúng tôi là báo cáo đầu tiên về hình dạng bất thường của các NP ZnO được tổng hợp sinh học bằng cách sử dụng CFCF của T. harzianum được xác định bởi môi trường kiềm.

Như mong đợi, sự khác biệt giữa các kích thước được xác định bởi DLS và TEM là do kỹ thuật mô tả đặc tính. Mặc dù DLS cho thấy bán kính thủy động lực học của các hạt nano, TEM cho thấy kích thước thực của chúng. Do đó, DLS lớn hơn kích thước thực của các hạt nano.

Người ta biết rằng ảnh hưởng của các điều kiện phản ứng có thể có những tác động khác nhau đến hình thái của các tinh thể nano tổng hợp. Các điều kiện trong công việc của chúng tôi rất đơn giản và giá cả phải chăng để đáp ứng, do nhiệt độ khoảng 45 ° C và các điều kiện kiềm sau khi thêm NaOH lên đến pH 12; tất cả những điều này tạo ra sự kết tủa nhanh chóng của ba loại NP.

3.2. Tiềm năng của các nano bạc,CuO, ZnO để kiểm soát nấm thực vật

Tiềm năng của các nano bạc, CuO và ZnO để kiểm soát A. Alternata , P. oryzae và S. sclerotiorum đã được khảo nghiệm khi mạ môi trường nuôi cấy nấm được bổ sung 5, 10 và 20 ppm của mỗi loại NP và đường kính của sự phát triển của sợi nấm là đo sau 7 ngày. Cả NP Ag và CuO đều làm giảm đáng kể sự phát triển sợi nấm của A. alterta và P. oryzae ở nồng độ phụ thuộc vào liều lượng. Như được thể hiện trong Hình  4 a dưới xử lý Ag, đường kính sợi nấm của A. alterta giảm 18% ở 5 ppm, 42% ở 10 ppm và 52% ở 20 ppm. Mặt khác, sự phát triển sợi nấm của P. oryzaeđã giảm 22%, 46% và 68% cho mỗi liều NP tương ứng.

Hơn nữa, khi xử lý CuO, tác dụng ức chế tương tự so với  nano bạc đã được quan sát thấy (Hình  4 b). Cả khi xử lý bằng Ag và CuO, mặc dù không thấy ảnh hưởng đến đường kính của sợi nấm đối với S. sclerotiorum, nhưng vẫn quan sát thấy một sợi nấm nhỏ và kích thước hạch nấm nhỏ với sự phân bố ở mép đĩa (không được hiển thị). Mặt khác, khi xử lý bằng ZnO NPs, mặc dù có xu hướng làm giảm sự phát triển của sợi nấm của mầm bệnh thực vật, nhưng những kết quả này không có ý nghĩa thống kê (dữ liệu không được hiển thị).

Hình 4 Tác dụng ức chế sự phát triển của sợi nấm

Hình 4 Tác dụng ức chế sự phát triển của sợi nấm Alternaria Alternata và Pyricularia oryzae trên môi trường thạch khoai tây-dextrose có chứa ( a ) AgNP hoặc ( b ) CuO NP trong 7 ngày.

Điều thú vị là ba NP tổng hợp sinh học không cho thấy tác động có hại đối với sự phát triển của T. harzianum ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm, so với đối chứng âm tính của chúng. Như đã báo cáo về các loài nấm như T. harzianum và T. asperellum có thể chuyển hóa các kim loại nặng khác nhau 44 , do đó, không có gì ngạc nhiên nếu T. harzianum có thể được ứng dụng kết hợp với các hạt nano, nhưng sự phát triển sẽ không bị ảnh hưởng.

Mặc dù tác động của độc tính AgNPs đã được chứng minh chống lại các nấm bệnh thực vật 14 khác nhau , nhưng đây là lần đầu tiên A. Alternata , P. oryzae và S. sclerotiorum được khảo nghiệm đồng thời với ba loại NP được tổng hợp từ một dòng T. harzianum duy nhất . Chúng tôi đề xuất, do cùng tác động độc tính giữa các nano bạc và đồng so với các phytopathogens này.

Vì các NP ZnO không độc hại đáng kể đối với nấm bệnh được thử nghiệm trong nghiên cứu này, các vi sinh vật khác có thể được coi là mục tiêu cho các thử nghiệm tiếp theo. Hơn nữa, các loại NP này đã được báo cáo là tác nhân kháng khuẩn rất hiệu quả chống lại một loạt các loài vi khuẩn, và do bề mặt cao so với tỷ lệ thể tích của chúng nên chúng có các đặc tính hóa lý độc đáo 45 . Ngoài ra, các nghiên cứu khác đã chứng minh tiềm năng kháng nấm của ZnO NPs chống lại các mầm bệnh nấm khác bao gồm Fusarium sp., Botrytis cinerea , Penicillium expansum , Aspergillus niger và Rhizopus stolonifer 18 , 46 ,47 .

Trong các nghiên cứu sau này, có thể một khả năng khác để tăng cường hiệu ứng của ZnO chống lại các phytopathogens có thể là sự hợp nhất có thể có của các NP để tạo ra các hạt nano lưỡng kim như được chứng minh bởi Paszkiewicz et al. 48, trong đó nghiên cứu họ phát hiện ra rằng sự kết hợp của Cu và Ag làm tăng sức mạnh độc tính của chúng như một hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm.

4. Kết luận hiệu quả nano bạc, CuO, ZnO

Trong công trình này, việc tổng hợp thành công ba loại là nano bạc, CuO và ZnO từ T. harzianum đã được thực hiện theo một phương pháp xanh, giá cả phải chăng và không độc hại. Đây là báo cáo đầu tiên trong đó dịch lọc nuôi cấy tế bào không chứa nước (CFCF) từ một chủng nấm duy nhất, có thể tổng hợp các loại NP kim loại khác nhau bằng cách sử dụng quy trình một bước dựa trên điều kiện kiềm. Những kết quả đầy hứa hẹn này cung cấp những hiểu biết mới để tạo ra các NP khác nhau tận dụng sự đơn giản của phương pháp tối đa hóa tiềm năng của một chủng đơn lẻ.

Các đặc tính hóa lý của mỗi NP kim loại cho thấy sự phân bố kích thước hẹp, độ ổn định nhiệt và phổ XRD tinh thể, và đặc biệt là cho đến nay, hình thái quan sát được đối với các NP CuO và ZnO là rất hiếm. Hiệu quả kháng khuẩn của các NP Ag và CuO cho thấy các tác dụng ức chế tương tự chống lại sự phát triển xuyên tâm của sợi nấm A. Alternata, P. oryzae và sự hình thành hạch nấm của S. sclerotiorumtheo cách phụ thuộc vào liều lượng, làm nổi bật tiềm năng của chúng đối với các ứng dụng nông nghiệp. Mặc dù không có đặc tính kháng nấm Các NP của ZnO có thể được thử nghiệm chống lại các vi sinh vật mục tiêu khác. Đáng chú ý, NPs thu được trong nghiên cứu này có thể có ứng dụng mạnh mẽ trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, mỹ phẩm, quần áo và công nghiệp thực phẩm. Kết luận, việc sử dụng nấm không gây bệnh T. harzianum có thể là một công cụ tốt để xử lý sản xuất trên quy mô lớn.

Nguồn tham khảo: Mycosinthetized Ag, CuO and ZnO nanoparticles from a promising Trichoderma harzianum strain and their antifungal potential against important phytopathogens