Nano kẽm oxit so sánh với ion kẽm trong tăng trưởng năng suất và tác động đối với hệ thống kháng oxy hóa ở đậu tương
Trong tài liệu này, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng gây độc thực vật của các hạt nano kẽm oxit (ZnONPs) trên năng suất hạt, tập trung vào các phản ứng phụ thuộc vào kích thước hạt-, hình thái- và nồng độ của nhiều dấu ấn sinh học bảo vệ chống oxy hóa, trong đậu tương trồng trên đất ( Glycine max cv. Kowsar) trong quá trình vòng đời của nó. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã tổng hợp ba loại ZnONP độc đáo về mặt hình thái (hình cầu / 38nm, hình hoa / 59nm và hình que /> 500nm); tất cả đều có độ tinh khiết cao, cấu trúc tinh thể triclinic và điện tích bề mặt âm; và so sánh độ độc với các ion Zn2+ . Mỗi chậu nhận được hai hạt giống, được đặt trong đất đã được cấy vi khuẩn cố định N ( Rhizobium japonicum) và trồng ngoài trời trong 120 ngày. Phát hiện của chúng tôi đã chứng minh ảnh hưởng đáng kể của kích thước hạt, hình thái và nồng độ phụ thuộc vào nồng độ của ZnONP đối với năng suất hạt, quá trình peroxy hóa lipid và các dấu ấn sinh học chống oxy hóa khác nhau trong đậu tương. Các ZnONP 38nm hình cầu có khả năng bảo vệ tốt nhất so với các ZnONP 59nm hình hoa, các ZnONP> 500nm dạng que và các ion Zn 2+ , đặc biệt lên đến 160 mg/kg. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nhất 400 mg/kg, các ZnONP 38nm hình cầu tạo ra phản ứng ứng suất oxy hóa cao nhất (tổng hợp H 2 O 2 , MDA, SOD, CAT, POX) trong đậu tương so với hai ZnONP khác nhau về hình thái được thử nghiệm. Đường cong phản ứng nồng độ cho ba loại ZnONP và Zn 2+các ion là phi tuyến tính (không đơn điệu) cho tất cả các điểm cuối được đánh giá. Kết quả cũng cho thấy sự khác biệt giữa độc tính nano đặc hiệu của nano kẽm oxit ZnONPs so với độc tính dạng ion Zn 2+ trong đậu tương. Giá trị NOAEL cao hơn 160 mg/kg của chúng tôi cho thấy tiềm năng của ZnONPs được sử dụng làm phân bón nano cho cây trồng trên đất thiếu Zn để cải thiện năng suất cây trồng, chất lượng lương thực và giải quyết tình trạng suy dinh dưỡng trên toàn cầu.
(Bản quyền NanoCMM Technology)
Điểm nổi bật
- Kích thước hạt-, hình thái- và ảnh hưởng phụ thuộc nồng độ của nano kẽm oxit được thử nghiệm.
- Tất cả các hợp chất Zn (ZnONPs, Zn 2+) đã thúc đẩy năng suất hạt lên đến 160 mg/kg.
- Các ZnONP 38nm hình cầu tạo ra ứng suất oxy hóa ít nhất, ngoại trừ ở mức 400 mg/kg.
- Các đường cong nồng độ-phản ứng đối với tất cả các hợp chất Zn là không tuyến tính.
- ZnONP có thể dùng như phân bón nano để làm giàu đất thiếu Zn.
Giới thiệu
Khoa học nano và công nghệ nano ngụ ý nghiên cứu các cấu trúc nano được thiết kế có ít nhất một chiều dưới 100 nm có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm trong nông nghiệp, trị liệu, chẩn đoán, kỹ thuật, công nghiệp thực phẩm và an toàn, xử lý môi trường và cơ sở hạ tầng năng lượng, trong số những sản phẩm khác (Sáng kiến Công nghệ Nano Quốc gia, 2005; Du và cộng sự, 2019 ; Malea và cộng sự, 2019 ). Sản xuất các hạt nano được thiết kế (ENP) cho các ứng dụng nói trên đang phát triển theo cấp số nhân chủ yếu do các đặc tính hóa lý đặc trưng của nano như tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cao, độ phản ứng lớn hơn, độ dẫn điện cao, độ bền cơ học cao và đặc tính kháng khuẩn ( Hou et al ., 2018 ;Pokhrel và cộng sự, 2012 ; Rajput và cộng sự, 2018 ).
Mối quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng ENP trong an toàn thực phẩm và nông nghiệp cũng có thể là do kích thước độc đáo và hành vi liên quan đến bề mặt của chúng ( Nuruzzaman và cộng sự, 2016 ; Dimkpa và cộng sự, 2019 ). Các ENP có thể được sử dụng trong nông nghiệp dưới dạng phân bón nano, chất điều hòa sinh trưởng hoặc như thuốc diệt vi khuẩn nano để giải quyết các bệnh truyền nhiễm từ động vật và thực vật. Hơn nữa, ENP có thể đóng vai trò là cảm biến phát hiện sớm mầm bệnh và / hoặc sự suy giảm dư lượng thuốc trừ sâu do phản ứng cao hơn ( Wang et al., 2016b ; Xiong et al., 2017 ). ZnONP với các đặc tính hóa lý độc đáo có thể được dùng như một loại phân bón mới để cải thiện năng suất cây trồng và chất lượng thực phẩm ( Dimkpa và Bindraban, 2018 ; Hou et al., 2018 ;White và Gardea-Torresdey, 2018 ).
Thực vật là những nhà sản xuất chính trong hầu hết mọi hệ sinh thái mà người tiêu dùng dựa vào đó ( Ma và cộng sự, 2010 ). Do đó, thực vật cũng có thể hấp thụ và vận chuyển các chất độc hại khác nhau bao gồm ENP từ chất rắn sinh học, đất và nước tưới vào các bộ phận ăn được (rễ, lá, hoa, quả, hạt) ( Andreotti và cộng sự, 2015 ; Ogunkunle và cộng sự, 2018 ; Yusefi-Tanha và cộng sự, 2020 ) và là nguồn tiếp xúc với con người và các sinh vật khác ăn thực vật. Cuối cùng, các chất độc hại có thể vận chuyển qua các cấp độ dinh dưỡng khác nhau trong chuỗi thức ăn ( Zhu et al., 2008 ; Ghasemi Siani et al., 2017). ENP có thể tương tác với bề mặt rễ khi ở trong đất hoặc môi trường thủy canh, từ đó ENP có thể đi qua các con đường apoplastic và giao hưởng trong tế bào thực vật và từ đó di chuyển lên để bắn qua bình xylem ( Deng và cộng sự, 2014 ; Lin và Xing , 2008 ; Lin và cộng sự, 2009 ; Schwab và cộng sự, 2016 ). Người ta bắt đầu hiểu rằng độc tính của ENPs đối với sự phát triển của thực vật, sự trao đổi chất, hệ thống phòng thủ và năng suất có thể phụ thuộc vào con đường tiếp xúc, thành phần môi trường, liều lượng, hình thái hạt (kích thước, hình dạng), thành phần hạt và hóa học bề mặt ( Cao et cộng sự, 2017 ; Deng và cộng sự, 2017 ; Pagano và cộng sự, 2017 ; Pokhrel và cộng sự, 2012 ;del Real và cộng sự, 2017 ), bao gồm thành phần hóa học của các vị trí dưới tế bào và phân tích sinh học thực vật ( Dietz và Herth, 2011 ; Lin và Xing, 2008 ; Nuruzzaman và cộng sự, 2016 ; Kranjc và cộng sự, 2018 ; Xiong và cộng sự ., 2017 ). Nâng cao kiến thức về các yếu tố tiềm ẩn ảnh hưởng đến độc tố thực vật, cơ chế gây độc thực vật và các biện pháp giảm thiểu sẽ hỗ trợ việc đánh giá rủi ro trong tương lai của các ENP.
Một số nghiên cứu đã báo cáo tác động tích cực của các hạt nano đối với sự nảy mầm, tăng trưởng và hiệu suất của cây trồng. Ví dụ, tăng khả năng nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con, cải thiện hiệu quả quang hợp, sinh khối và tổng lượng protein, đường, nitơ và vi lượng đã được quan sát thấy ở một số cây trồng; ví dụ, Vigna radiata và Cicer arietinum ( Mahajan et al., 2011 ), Spinacia oleracea ( Srivastava et al., 2014 ), Cucumis sativus ( Moghaddasi et al., 2017 ), Solanum lycopersicum ( Faizan et al., 2018 ), và Triticum aestivum ( Zhang và cộng sự, 2018 ).C. sativus được trồng trong buồng gel cho thấy sinh khối chồi và rễ tăng lên với ZnONPs (1 mg/L), và tăng chiều dài chồi với ZnONPs so với ZnO dạng hạt lớn ( Moghaddasi et al., 2017 ). Khi ZnONP và các dẫn xuất của chúng, bao gồm cả ZnCl 2 , có sẵn trong đất quá mức, độc tính tiềm ẩn có thể dẫn đến cây trồng ( Liu và cộng sự, 2015 ; Mukherjee và cộng sự, 2014a ; Wang và cộng sự, 2016a ), bao gồm các tác dụng ức chế hạt nảy mầm, sinh trưởng, quang hợp, các đặc điểm sinh lý và sinh hóa, đặc điểm năng suất và chất lượng dinh dưỡng ( Du et al., 2017 ; Zuverza-Mena et al., 2017 ).
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo về stress oxy hóa tiềm ẩn khi tiếp xúc với các ENP khác nhau trong thực vật ( Mukherjee et al., 2016 ). Stress oxy hóa xảy ra khi sự cân bằng giữa hệ thống sản xuất oxy phản ứng (ROS) và hệ thống phòng thủ trong thực vật bị suy giảm.
ROS, được tạo ra như sản phẩm phụ của phản ứng ánh sáng trong lục lạp trong quá trình quang hợp, có liên quan đến độc tính do ENP gây ra ( Ma và cộng sự, 2015 ) vì ROS dư thừa có thể dẫn đến tổn thương DNA, oxy hóa protein, peroxy hóa lipid , tổn thương màng, rò rỉ chất điện giải và cuối cùng là chết tế bào ( Demidchik, 2015 ; Wang và cộng sự, 2018). Để duy trì cân bằng nội môi, thực vật đã phát triển các chiến lược khác nhau cho phép bảo vệ các thành phần tế bào và tiểu tế bào khỏi độc tính tiềm ẩn của các gốc tự do thông qua việc vô hiệu hóa hoặc loại bỏ ROS. Các cơ chế này bao gồm cả chất chống oxy hóa không phải enzym, bao gồm các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (phenolics, ascorbate, a-tocopherols, glutathione, carotenoid và proline) và các enzym như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase ( POD), và ascorbate peroxidase (APX), trong số những chất khác ( Getnet và cộng sự, 2015 ; Ozyigit và cộng sự, 2016 ). Những chất chống oxy hóa này làm giảm tổn thương oxy hóa liên quan đến ENP ở thực vật ( Siddiqi và Husen, 2017). MDA là một trong những sản phẩm phụ của stress oxy hóa và ROS là kết quả của quá trình oxy hóa các axit béo không bão hòa trên màng tế bào ( Gaschler và Stockwell, 2017 ).
Gần đây, chúng tôi đã chỉ ra kích thước hạt (25, 50 và 250 nm) – và ảnh hưởng phụ thuộc vào nồng độ của CuONP đối với quá trình peroxy hóa lipid và các dấu ấn sinh học chống oxy hóa bao gồm SOD, CAT, POX và APX, trong đậu tương được trồng trên đất giàu mycorrhiza trong một thời gian. trong 120 ngày ở môi trường ngoài trời ( Yusefi-Tanha và cộng sự, 2020 ). Đặc biệt, tác động của CuONPs 25nm được phát hiện là cao hơn nhất quán đối với hầu hết các dấu ấn sinh học chống oxy hóa được thử nghiệm so với hai phương pháp xử lý CuONPs kích thước lớn hơn (CuONPs 50nm, CuONPs 250nm) hoặc ion Cu 2+ . Chúng tôi cũng chỉ ra rằng các đường cong nồng độ-phản ứng đối với CuONPs 25nm và Cu 2+các ion là tuyến tính, không giống như đối với các CuONP có kích thước lớn hơn (CuONPs 50nm, CuONPs 250nm), các mối quan hệ là phi tuyến tính, đối với hầu hết các dấu ấn sinh học chống oxy hóa được đánh giá. Các đường cong nồng độ-phản ứng đối với năng suất hạt đối với tất cả các loại hợp chất Cu là tuyến tính (R 2 > 0,65). Năng suất hạt đậu tương cũng cho thấy sự ức chế phụ thuộc vào kích thước hạt và nồng độ với CuONP, và sự ức chế của CuONP 25nm cao hơn đáng kể so với hai ion CuONP hoặc Cu 2+ có kích thước lớn hơn ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm. Kết quả của chúng tôi cho thấy sự khác biệt giữa độc tính cụ thể của nano so với độc tính ion Cu 2+ trong đậu tương ( Yusefi-Tanha et al., 2020 ).
Kẽm (Zn) là vi chất dinh dưỡng cần thiết cho tất cả thực vật vì nó đóng một vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động sinh lý như trong quá trình sinh tổng hợp chất diệp lục, protein và enzym, bao gồm cả trong quá trình trao đổi chất ( Singh và cộng sự, 2018 ). Ví dụ, Zn hiện diện trong các enzym đồng / kẽm-SOD của tế bào và lục lạp có vai trò quan trọng chống lại stress oxy hóa ( Yruela, 2015 ). Các metalloprotein Zn được biết là tham gia vào quá trình sao chép và phiên mã DNA, do đó điều chỉnh sự biểu hiện của gen ( Barker và Pilbeam, 2015 ). Ngoài ra, Zn là một phần cấu trúc của ribosome và chịu trách nhiệm về tính toàn vẹn cấu trúc của nó, đồng thời tham gia vào quá trình tổng hợp axit amin và chuyển hóa nitơ ( Barker và Pilbeam, 2015 ;Kobraee và Shamsi, 2015 ). Zn cũng được tìm thấy trong cấu trúc của các protein ngón tay kẽm (Znf – các mô protein tương đối nhỏ chứa nhiều phần lồi giống như ngón tay tạo liên hệ song song với phân tử mục tiêu của chúng) loại CCCH, các gen mã hóa chúng làm tăng hàm lượng dầu trong hạt đậu tương thông qua việc kích hoạt các gen liên quan đến sinh tổng hợp lipid ( Li và cộng sự, 2017 ). Ngoài ra, Zn kích thích sự cố định N2 trong các loại đậu, chẳng hạn như đậu Pháp ( Phaseolus vulgaris L.), bằng cách thúc đẩy số lượng nốt sần ở rễ ( Hemantaranjan và Garg, 2015 ). Thiếu Zn ở thực vật là một vấn đề toàn cầu quan tâm ( Impa và cộng sự 2013 ), do đó làm nổi bật tiềm năng bổ sung Zn ở dạng hạt nano làm phân bón ( Dimkpa và cộng sự, 2015 ; Du và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, lưu ý rằng ở nồng độ cao hơn, nano kẽm oxit ZnONPs cũng có thể gây độc cho cây trồng ( Dimkpa và cộng sự, 2015 ; Liu và cộng sự, 2015 , wang và cộng sự, 2016a ).
Đậu tương, một trong những cây lương thực được trồng nhiều nhất và quan trọng về mặt kinh tế, rất giàu protein và hàm lượng dầu và được tiêu thụ trên toàn cầu (FAO, 2019; Kanchana và cộng sự, 2016 ). Bón phân cho đất có thể ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng của hạt giống cây trồng như đậu tương ( Zulfiqar et al., 2019 ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm hiểu xem liệu các hạt nano kẽm oxit (ZnONP) có thể đóng vai trò như một loại phân bón nano mới, một loại phân bón có thể cải thiện sức khỏe và năng suất cây trồng. Chúng tôi đã thử nghiệm các phản ứng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ vào năng suất hạt và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa trong đất trồng đậu tương ( Glycine maxcv. Kowsar) trong vòng đời của nó là 120 ngày. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã tổng hợp ba loại ZnONP khác nhau về hình thái (hình cầu / 38nm, giống hoa / 59nm và giống que /> 500nm); tất cả đều có độ tinh khiết cao, cấu trúc tinh thể triclinic và điện tích bề mặt âm.
Vật liệu và phương pháp
Tổng hợp và mô tả đặc tính của các hạt nano kẽm oxit ZnONPs
Các ZnONP với ba hình thái khác nhau (hình cầu / 38nm, hình hoa / 59nm và hình que /> 500nm) được điều chế bằng phương pháp nghiền bi và sol-gel. Chất khử nước kẽm axetat phân tích (Zn (CH3COO)2 .2H2O) và axit citric (C6H8O 7 ) đã được mua từ Merck và được sử dụng như đã nhận. Các chi tiết của quá trình tổng hợp đã được Zandi và cộng sự mô tả trước đây. (2011) . Tóm lại, kẽm axetat và axit citric (ở dạng bột) được trộn theo tỷ lệ mol 1: 1 và nghiền trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Bột đã xay được nung ở 530 ° C trong 10 giờ để thu được ZnONPs (S 1). Các mẫu ZnONP có kích thước hạt lớn hơn cũng được chuẩn bị bằng phương pháp gel sol. Vì mục đích này, một lượng kẽm axetat và axit citric theo tỷ lệ mol 1: 1 đã được hòa tan trong nước cất. Dung dịch được khuấy bằng máy khuấy từ ở 80 ° C khi thu được gel nhớt. Gel được làm khô ở 100 ° C để chuyển thành bột, sau đó được chia thành hai lô; mỗi mẻ được nung ở 800 ° C (S 2 ), hoặc 1000 ° C (S 3) trong bầu khí quyển. Sự hình thành pha và cấu trúc tinh thể của các mẫu được đặc trưng bằng cách sử dụng nhiễu xạ tia X (XRD) trong phạm vi góc quét 2θ = 20-80 ° bằng máy đo nhiễu xạ tia X Philips X’Pert PRO bằng nguồn tia X Cu-Kα ( λ = 1.5406 Å). Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) được sử dụng để xác định hình thái và đường kính của hạt. Tán xạ ánh sáng động (DLS) được sử dụng để ước tính đường kính thủy động lực học (HDD) và điện thế zeta ζ (của các ZnONP được tổng hợp.
Thiết lập thử nghiệm
Các thí nghiệm của chúng tôi tuân theo thiết kế giai thừa hai chiều, bao gồm: ZnCl2 (Zn2+ ; đối chứng dương) và nano kẽm oxit ZnONP với ba hình thái khác nhau (ZnONP; hình cầu / 38nm, giống hoa / 59nm và giống hình que /> 500nm ) và năm nồng độ khác nhau (0, 40, 80, 160 và 400 mg Zn / kg). Để tránh bất kỳ ảnh hưởng nào về mặt không gian, các nghiệm thức tuân theo một thiết kế hoàn chỉnh ngẫu nhiên (RCD) với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức, với tổng số 60 đơn vị thí nghiệm với hai cây mỗi đơn vị ( n = 120 cây). Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện tại Đại học Shahrekord, Iran.
Đặc điểm của đất
Đất được lấy từ tầng mặt (độ sâu 0-30 cm). Để tách gỗ vụn, cục lớn và đá, đất đã được làm khô trong không khí và sàng (mắt lưới 2 mm). Hàm lượng kẽm nền trong đất là 0,892 mg/kg. Đặc điểm lý hóa chính của loại đất này như sau: được phân loại là đất thịt pha bùn (16% cát, 58% phù sa và 26% sét), với độ pH là 7,44, EC là 0,47 dS / m, 9,24 g/kg hữu cơ cacbon, 0,88 g/kg N tổng, và 11,7 và 405 mg/kg P và K có sẵn tương ứng.
Cải tạo đất bằng hợp chất kẽm
Để cải tạo đất, mỗi hợp chất kẽm (Zn 2+ và ZnONP: hình cầu / 38nm, hình hoa / 59nm và hình que /> 500nm) được cân và lơ lửng trong 100 mL nước cất để đạt được nồng độ mong muốn (0, 40, 80, 160 và 400 mg Zn / kg đất). Các huyền phù nano kẽm oxit ZnONP và ion Zn 2+ được khuấy bằng thanh từ tính trong 30 phút ở 25°C trước khi được thêm vào đất. Sau đó, các phương pháp xử lý Zn khác nhau (ZnONP và Zn 2+ ) được thêm vào đất. ZnCl 2 được thêm vào đất dưới dạng dung dịch nước (đối chứng tích cực) để xác định ảnh hưởng tiềm tàng của Zn 2+ đối với đậu tương. Đất chưa được xử lý đóng vai trò là đối chứng tiêu cực. Ba lần lặp lại của mỗi phương pháp điều trị đã được chuẩn bị. Nano kẽm oxit và Zn 2+các ion trong huyền phù nước được trộn bằng tay với 1 kg đất trong 30 phút, trộn lặp lại ba lần với 1 kg đất mỗi lần cho tổng số 4 kg đất trên mỗi chậu (để cho phép trộn đồng nhất) và cân bằng trong môi trường ngoài trời trong 24 giờ trước khi trồng sau đó.
Quản lý cây trồng thông qua quá trình trưởng thành và sản xuất hạt giống
Tóm lại, các mẫu đất đối chứng và cải tạo (4 kg) được cho vào túi PE (polyetylen) và cho vào chậu PE (đường kính 20 cm x chiều cao 20 cm). Mỗi chậu có một lớp lót bên trong bằng lưới PE (tất cả các túi đều có 50 lỗ 5 mm để thoát nước) và dưới đáy được lấp đầy bởi một lớp sỏi đã rửa sạch (500 g), tạo điều kiện thông khí và thoát nước. Thiết kế này cho phép hệ thống rễ vẫn còn trong túi / chậu và tạo điều kiện thuận lợi cho việc lấy cây ra khỏi chậu khi thu hoạch dễ dàng hơn. Hạt đậu tương (giống Kowsar) được lấy từ Viện Cải tiến Giống cây trồng, Karaj, Iran. Chúng được ngâm trong nước cất trong 24 giờ để tạo điều kiện cho quá trình nảy mầm. Hai hạt có kích thước đồng đều được trồng sau khi cấy vi khuẩn cộng sinh đậu tương ( Rhizobium japonicum) ở độ sâu 2,5 cm đất trong 24 giờ sau khi cải tạo đất. Nghiên cứu này được thực hiện trong điều kiện thu nhỏ để hiểu rõ hơn về tác động thực sự của NP trong môi trường. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, các bầu được tưới tùy theo sức chứa của ruộng. Tại mỗi lần tưới, một mẫu nước phụ được đo nồng độ Zn bằng phương pháp quang phổ phát xạ quang plasma kết hợp cảm ứng (ICP-OES). Khi trưởng thành (120 ngày sau khi trồng), cây và hạt giống được thu hoạch. Hạt được làm khô trong không khí và ghi lại trọng lượng.
Xác định các thông số sinh hóa
Hai lá non nhất trên mỗi chậu (mỗi lá một trong hai cây trên một chậu) được lấy mẫu để xác định tất cả các thông số sinh hóa được kiểm tra ( Yusefi-Tanha và cộng sự, 2020 ).
Đo nồng độ malondialdehyde
Mức độ peroxy hóa lipid được xác định bằng cách đo sự hình thành hàm lượng malondialdehyde (MDA) với axit thiobarbituric (TBA) bằng phương pháp của Heath và Packer (1968) . Một cách ngắn gọn, các mẫu mô lá tươi (0,1 g) được đồng nhất trong 1,5 ml axit trichloroacetic 0,1% (TCA). Chất đồng nhất thu được được ly tâm ở 10.000 × g trong 10 phút, và 1 mL phần nổi phía trên được thêm vào 2 ml TCA 20% chứa 0,5% TBA. Dịch chiết được đun nóng trong nồi cách thủy ở 95 ° C trong 30 phút và sau đó được làm lạnh nhanh trong bể nước đá. Sau đó, ly tâm ở 10.000 × g trong 10 phút. Độ hấp thụ của phần nổi phía trên được đọc ở bước sóng 532 và 600 nm so với mẫu trắng. Nồng độ MDA được biểu thị bằng nmol / g FW (bằng cách sử dụng hệ số tắt 155 mM -1 cm -1 ) (Narwal và cộng sự, 2009 ).
Ước tính hydrogen peroxide (H2O2 )
Hydro peroxit tạo ra trong lá cây được đo theo phương pháp được Nag et al mô tả trước đó. (2000) . Mô lá tươi (1 g) được nghiền thành bột bằng nitơ lỏng và được đồng nhất trong 12 mL axeton lạnh. Sau đó, đồng nhất được lọc qua giấy lọc Whatman. Hỗn hợp được pha loãng bằng cách sử dụng 4 mL thuốc thử titan 16% và 0,2 mL amoni hydroxit 28%. Dịch chiết mô được tiếp tục ly tâm ở 8500 vòng / phút trong 5 phút ở 4 ° C. Phần nổi phía trên được tách ra và sau đó rửa kết tủa hai lần bằng 5 mL axeton. Cuối cùng, thêm 2 mL axit sulfuric (1M), và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 410 nm. Hàm lượng hydro peroxit được tính bằng cách sử dụng đường chuẩn được chuẩn bị theo cách tương tự và được biểu thị bằng nmol / g FW.
Ước tính superoxide dismutase (SOD)
Các mẫu mô (1 g mô lá tươi) được đông lạnh trong nitơ lỏng và đồng nhất trong 10 mL dung dịch đệm kali photphat 0,1 M (pH 7,5). Dịch chiết mô được tiếp tục ly tâm ở tốc độ 20.000 vòng / phút trong 30 phút ở 4 ° C. Phần nổi phía trên được thu thập, tách thành nhiều phần nhỏ và được bảo quản ở -20 ° C để xác định hoạt tính của enzym chống oxy hóa. Hoạt tính SOD được xác định bằng cách đo sự ức chế quang hóa khử nitroblue tetrazolium (NBT) ( Narwal và cộng sự, 2009 ). 1,95 mL dung dịch đệm kali photphat 0,1 M (pH 7,5), 250 μL 150 mM methionin, 250 μL 1,2 mM Na 2EDTA, 250 μL riboflavin 24 μM, 250 μL 840 μM NBT, và 50 μL chiết xuất thực vật đã được chuẩn bị. Phản ứng được bắt đầu bằng sự chiếu sáng và độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 560 nm. Một đơn vị hoạt động của SOD được định nghĩa là lượng enzyme gây ra sự ức chế 50% các phản ứng oxy hóa trên mỗi miligam protein trong dịch chiết.
Ước tính hoạt động của catalase (CAT)
Hoạt động CAT được xác định theo Narwal et al. (2009) bằng cách đo sự giảm độ hấp thụ ở bước sóng 240 nm sau quá trình phân hủy hydro peroxit (H2O2). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 50 μL phần nổi phía trên, 1,95 ml dung dịch đệm kali photphat 0,1 M (pH 7,0) và 100 μL 264 mM H2O2. Sự giảm hấp thụ được phát hiện trong khoảng thời gian 100 giây với khoảng thời gian 5 giây ở nhiệt độ phòng (25 ° C). Một đơn vị hoạt động CAT tương ứng với 1 mMol H2O2 được tiêu thụ mỗi phút trên mỗi mg protein sử dụng hệ số tắt 40 mM -1 cm -1 .
Ước tính hoạt động của guaiacol peroxidase (POX)
Hoạt tính của guaiacol peroxidase (POX) được ước tính theo phương pháp được MacAdam và cộng sự phát triển trước đó. (1992) . Một cách ngắn gọn, 50 μL chiết xuất thực vật được thêm vào 1,35 mL dung dịch đệm kali photphat 0,1 M (pH 6,0), 100 μL 45 mM guaiacole, và 500 μL 44 mM hydrogen peroxide. Sau đó, chúng tôi đo động học của những thay đổi trong độ hấp thụ ở bước sóng 470 nm ở khoảng thời gian 10 giây trong 300 giây ở 25 ° C bằng máy quang phổ UV-Vis. Một đơn vị hoạt động POX tương ứng với 1 mMol tetraguaiacol được tiêu thụ mỗi phút. mỗi mg protein sử dụng hệ số tắt 26,6 mM -1 cm -1 .
Ước tính hoạt động của ascorbate peroxidase (APX)
Hoạt tính APX được đo bằng cách theo dõi tốc độ oxy hóa ascorbate với H2O2, theo phương pháp được phát triển bởi Narwal và cộng sự. (2009) . Sự giảm axit ascorbic, bắt đầu từ hỗn hợp 2,4 mL dung dịch đệm kali photphat 0,1 M (pH 7,0), 250 μL Na2EDTA 1,2 mM, 50 μL 35 mM H2O2, 100 μL axit ascorbic 15 mM, và 200 μL phần nổi phía trên được đo ở bước sóng 290 nm trong khoảng thời gian 500 s ở khoảng thời gian 10 s ở nhiệt độ phòng (25 ° C). Hoạt động được tính toán bằng cách sử dụng hệ số tắt 2,8 mM -1 cm -1 . Một đơn vị APX được định nghĩa là 1 mMol ascorbate bị oxy hóa mỗi phút. mỗi mg protein.
Ước tính lượng H2O2 thu được
Quá trình thu nhặt H2O2 được đo theo phương pháp của Benkebila (2005), đo lường sự giảm độ hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng 230 nm do hoạt động thu gom H2O2 của các chất / chiết xuất được thử nghiệm. Mỗi mẫu được chuẩn bị bằng cách thêm 1 ml dịch chiết thực vật và 600 μL 2 mM H2O2 mới đã chuẩn bị trong dung dịch muối đệm photphat (PBS). Trong một ống khác, một mẫu đối chứng được chuẩn bị bằng cách thêm 1 mL PBS và 600 μL 2 mM H2O2 mới đã chuẩn bị sẵn trong PBS. Sau đó, các hỗn hợp được để trong 10-15 phút. ở nhiệt độ phong. Sau đó, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 230nm.
Phân tích thống kê
Dữ liệu được phân tích với phân tích phương sai hai chiều (ANOVA) để kiểm tra sự tương tác giữa các yếu tố bằng cách sử dụng phép thử chênh lệch ít có ý nghĩa nhất sử dụng SAS (SAS Inc., phiên bản 9.4). Sự khác biệt được coi là đáng kể ở p<0,05 và các phương tiện được tách ra bằng cách sử dụng thử nghiệm LSD được bảo vệ của Fisher. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Để xác định xem các đường cong nồng độ-đáp ứng là tuyến tính (đơn điệu) hay phi tuyến tính (không đơn điệu), chúng tôi kết hợp việc kiểm tra trực quan các đường cong với một quy tắc quyết định đơn giản: nếu giá trị hệ số xác định (R bình phương) cho đường hồi quy tuyến tính là 65 % hoặc cao hơn các đường cong nồng độ-phản ứng được coi là tuyến tính, cho thấy rằng phản ứng của cây thay đổi tuyến tính với nồng độ được áp dụng theo mối quan hệ: y = ax + b; trong đó y biểu thị biến phụ thuộc, x biểu thị biến độc lập và a và b là các tham số của mô hình. Các giá trị bình phương R được tính toán được trình bày trong Bảng S1 Thông tin Bổ sung (SI) .
Kết quả
Đặc điểm của hạt nano
Phân tích các mẫu XRD cho thấy rằng các mẫu ở dạng tinh thể triclinic với nhóm không gian p63mc, không có bất kỳ dấu vết tạp chất nào đáng chú ý. Các mẫu XRD của các mẫu bột được thể hiện trong Hình 1 . Hình thái và đường kính hạt trung bình của các ZnONP được đo bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM). Hình ảnh hiển vi FE-SEM đại diện của các mẫu ZnONPs và sự phân bố kích thước hạt của chúng (PSD) được trang bị cho hàm phân bố chuẩn (như thể hiện trong phương trình 1 bên dưới; Rostamnejadi và cộng sự, 2017 ) được trình bày trong Hình 1 :
Hình 1. Ảnh hiển vi FE-SEM của ba nano kẽm oxit khác biệt về mặt hình thái: A) S1 (hình cầu / đường kính 38nm); B) S2 (giống hoa / đường kính 59nm); và C) S3 (đường kính hình que /> 500nm và chiều dài> 1μm). Sự phân bố kích thước hạt (PSD) của mẫu S1 (D) và mẫu S2 (E). F) Các mẫu XRD của các mẫu bột của ba ZnONP khác biệt về hình thái: S1, S2 và S3.
Trong quan hệ này <d> là kích thước hạt trung bình và σ là độ lệch chuẩn. Phân tích của chúng tôi trên ảnh hiển vi FE-SEM của các mẫu S1 cho thấy các hạt có hình dạng gần như hình cầu với đường kính hạt trung bình là 38 nm nhưng với sự đóng gói dày đặc xuất hiện như khả năng xảy ra kết tụ. Các mẫu S2 có hình thái giống như hoa với đường kính hạt trung bình là 59 nm. Các mẫu S3 cho thấy các hạt hình cầu có đường kính trung bình lớn hơn 500 nm trên đỉnh microrods có đường kính khoảng 1μm và chiều dài 10-50 μm. Tất cả các mẫu nano kẽm oxit (S1-S3) đều mang điện tích âm cao với thế zeta trên 44,0 mV nhưng có đường kính thủy động lực học thay đổi (HDD) ( Bảng 1 ), một kết quả phù hợp với các phân tích FE-SEM.
Bảng 1. Phép đo tán xạ ánh sáng động (DLS) của đường kính thủy động lực học (HDD) và giá trị thế zeta đối với: (S 1 ) ZnONP-38nm hình cầu, (S2) ZnONP-59nm hình hoa và (S3) ZnONP dạng que> 500nm.
Tác động đến năng suất hạt giống
Kết quả của chúng tôi cho thấy ảnh hưởng của các loại hợp chất kẽm ( Zn type ), nồng độ kẽm (C) và tương tác của Zn type × C có ý nghĩa thống kê đến năng suất hạt ở đậu tương ( p <0,0001) ( Bảng 2 ). Nói chung, năng suất hạt của tất cả các hợp chất Zn tăng lên phụ thuộc vào nồng độ lên đến 160 mg/kg, nhưng ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm (400 mg/kg) năng suất hạt giảm đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn ( Hình 2 ). Năng suất hạt cao nhất đối với các ZnONP 38 nm hình cầu so với các ZnONP 59 nm hình hoa hoặc hình que> 500 nm. Năng suất hạt thường thấp nhất đối với nghiệm thức ion Zn 2+ so với cả ba loại xử lý ZnONPs ( Hình 2), cho thấy tác dụng ức chế của ion Zn 2+ đối với năng suất hạt giống so với ZnONP được thử nghiệm. Hơn nữa, năng suất hạt cao nhất là 160 mg/kg đối với tất cả các loại hợp chất Zn. Nhìn chung, các đường cong đáp ứng nồng độ đối với tất cả các loại hợp chất Zn là không tuyến tính ( Hình 2 ; xem Bảng SI S1 cho các giá trị bình phương R) và rằng các phản ứng phụ thuộc vào kích thước hạt và hình thái học.
Hình 2. Sản xuất hạt giống trong đất trồng đậu tương được xử lý bằng các nano kẽm oxit và ion kẽm (ZnONP-38nm hình cầu, ZnONP-59nm dạng hoa, ZnONP dạng que> 500nm và các ion Zn 2+ ) theo hàm số của nồng độ (0, 40, 80 160, 400 mg Zn / kg đất). Các thanh lỗi thể hiện giá trị trung bình ± SD. Các chữ cái khác nhau phía trên thanh biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức p <0,05.
Bảng 2. Phân tích phương sai ( p- value) đối với sản xuất hạt giống và các thông số sinh hóa của đậu tương trồng trong đất được xử lý với các loại hợp chất kẽm nồng độ khác nhau.
Tác động đến sản xuất hydrogen peroxide (H2O2 )
ANOVA của chúng tôi cho thấy ảnh hưởng của loại Zn , C và loại Zn × C đến sản xuất H2O2 của lá ở đậu tương là đáng kể ( p <0,0001) ( Bảng 2 ). Chúng tôi đã quan sát ảnh hưởng của kích thước hạt-, hình thái- và nồng độ phụ thuộc vào nồng độ của ZnONP đối với việc sản xuất H2O2 trong lá đậu tương ( Hình 3 ). Với nồng độ tăng dần, sản lượng H2O2 giảm đáng kể lên đến 160 mg/kg đối với tất cả các hợp chất Zn; trong khi ở 400 mg/kg, H2O2sản lượng tăng lên đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn, ngoại trừ xử lý ZnONP dạng que > 500 nm không cho thấy sự thay đổi đáng kể so với đối chứng ( Hình 3 ). Nhìn chung, các kết quả này cho thấy rằng tất cả các hợp chất Zn đều có khả năng bảo vệ đậu tương lên đến 160 mg/kg và các phản ứng là phi tuyến tính ( Hình 3 ; xem Bảng SI S1 cho các giá trị R bình phương).
Hình 3. Những thay đổi trong sản xuất hydrogen peroxide (H2O 2 ) ở lá ( A ) và hàm lượng malondialdehyde (MDA) ở lá ( B ), trong đất trồng đậu tương được xử lý bằng các nano kẽm oxit và ion kẽm (ZnONP-38nm hình cầu, ZnONP-59nm giống hoa , ZnONP dạng que> 500nm, và các ion Zn 2+ ) là hàm của nồng độ (0, 40, 80, 160, 400 mg Zn / kg đất). Các thanh lỗi thể hiện giá trị trung bình ± SD. Các chữ cái khác nhau phía trên thanh biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức p <0,05.
Tác động đến sự tích tụ malondialdehyde (MDA)
Sự tích tụ của phức hợp MDA-TBA được đo để ước tính quá trình peroxy hóa lipid trong mô lá. Kết quả của chúng tôi cho thấy hàm lượng MDA bị ảnh hưởng bởi loại Zn ( p <0,0001), C ( p <0,0001) và tương tác của chúng ( loại Zn × C) ( p <0,0001) ( Bảng 2 ). Chúng tôi đã quan sát ảnh hưởng của kích thước hạt-, hình thái- và nồng độ phụ thuộc vào nồng độ của nano kẽm oxit đối với mức MDA trong lá đậu tương ( Hình 3 ). Với nồng độ tăng dần, hàm lượng MDA giảm đáng kể lên đến 160 mg/kg đối với tất cả các hợp chất Zn; trong khi ở mức 400 mg/kg, hàm lượng MDA tăng đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn, ngoại trừ xử lý ZnONP dạng que> 500 nm không cho thấy sự thay đổi đáng kể nào so với đối chứng (Hình 3B ). Như mong đợi, kết quả MDA phản ánh kết quả sản xuất H2O2 trong lá cho thấy mối quan hệ tương hỗ giữa sản xuất H2O2 và sự tích tụ MDA-TBA khi peroxy hóa lipid. Nhìn chung, các phản ứng peroxy hóa lipid là không tuyến tính ( Hình 3 ; xem Bảng SI S1 cho các giá trị bình phương R).
Tác động đến hoạt động của superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và guaiacol peroxidase (POX)
Hoạt động của nhiều enzym chống oxy hóa (SOD, CAT và POX) trong lá đậu nành tiếp xúc với các hợp chất Zn khác nhau được trình bày trong Hình 4 . Ảnh hưởng của loại Zn ( p <0,0001), C ( p <0,0001) và thuật ngữ tương tác ( loại Zn × C) ( p <0,0001) có ý nghĩa thống kê đối với hoạt động của các enzym chống oxy hóa (SOD, CAT và POX) trong đậu tương lá. Tương tự như quá trình sản xuất H2O2 và sự tích tụ MDA tiếp theo được nêu ở trên, chúng tôi đã quan sát ảnh hưởng của kích thước hạt-, hình thái- và nồng độ phụ thuộc vào nồng độ của ZnONP đối với các hoạt động SOD, CAT và POX trong lá đậu tương ( Hình 4). Với nồng độ tăng dần, các hoạt động của enzym chống oxy hóa này đã giảm đáng kể lên đến 160 mg/kg đối với tất cả các hợp chất Zn; trong khi ở 400 mg/kg, các hoạt tính của enzym này tăng lên đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn, ngoại trừ xử lý ZnONP dạng que> 500 nm cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong hoạt động của enzym so với đối chứng ( Hình 4 ). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy rằng cả ba hoạt động của các enzym chống oxy hóa đều phù hợp với xu hướng đối với các phản ứng tổng hợp H2O2 và tích lũy MDA, và các phản ứng của các enzym là không tuyến tính ( Hình 4 ; xem SI Bảng S1 cho R- giá trị bình phương).
Hình 4. Những thay đổi trong superoxide dismutase ở lá (SOD) ( A ), catalase (CAT) ( B ), và guaiacol peroxidase (POX) ( C ), các hoạt động trong đất trồng đậu tương được xử lý bằng các nano kẽm oxit và ion kẽm (ZnONP-38nm hình cầu, hoa- như ZnONP-59nm, ZnONP dạng que> 500nm và các ion Zn 2+ ) là hàm của nồng độ (0, 40, 80, 160, 400 mg Zn / kg đất). Các thanh lỗi thể hiện giá trị trung bình ± SD. Các chữ cái khác nhau phía trên thanh biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức p <0,05.
Tác động lên các hoạt động thu gom ascorbate peroxidase (APX) và H2O2
Các tác động lên hoạt động thu gom APX và H2O2 trong lá đậu tương tiếp xúc với các hợp chất Zn khác nhau được mô tả trong Hình 5 . ANOVA cho thấy ảnh hưởng của nồng độ Zn (C) và thời hạn tương tác ( loại Zn × C) có ý nghĩa thống kê lên hoạt tính APX ( p <0,0001) trong lá đậu tương. Trong khi đó, ảnh hưởng của loại Zn , C và số hạng tương tác (loại Zn × C) đều có ý nghĩa thống kê lên quá trình thu nhặt H2O2 ( p <0,0001) trong lá đậu tương. Nhìn chung, phản ứng APX của đậu tương khi tiếp xúc với các loại hợp chất Zn khác nhau trái ngược với phản ứng của H 2 O2 hoạt động nhặt rác được quan sát.
Hình 5.Những thay đổi trong hoạt động hấp thụ peroxidase ascorbate (APX) ( A ) và H2O2 ( B ) trong đất trồng đậu tương được xử lý bằng các loại hợp chất kẽm khác nhau (ZnONP-38nm hình cầu, ZnONP-59nm dạng thực vật, ZnONP dạng que> 500nm , và các ion Zn 2+ ) như một hàm của nồng độ (0, 40, 80, 160, 400 mg Zn / kg đất). Các thanh lỗi thể hiện giá trị trung bình ± SD. Các chữ cái khác nhau phía trên thanh biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức p <0,05.
Đối với hoạt tính APX, đo tốc độ oxy hóa ascorbate khi có thêm H2O2, chúng tôi quan sát ảnh hưởng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ của nano kẽm oxit trong lá đậu tương ( Hình 5A ). Với nồng độ ngày càng tăng, hoạt tính APX đã giảm đáng kể lên đến 160 mg/kg đối với tất cả các hợp chất Zn được thử nghiệm; trong khi ở 400 mg/kg, hoạt độ APX tăng đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn so với đối chứng ( Hình 5A ). Hơn nữa, các nano kẽm oxit 38nm hình cầu có khả năng bảo vệ tốt nhất so với tất cả các hợp chất Zn khác được thử nghiệm (ZnONP 59nm hình hoa, ZnONP> 500nm dạng que và các ion Zn 2+ ) lên đến 160 mg/kg; nhưng ở nồng độ cao nhất (400 mg/kg) xu hướng độc tính đảo ngược, tức là, Zn 2+các ion có khả năng bảo vệ tốt nhất so với các ZnONP 38nm hình cầu. Nhìn chung, ở mức 400 mg/kg tất cả các hợp chất Zn cho thấy hoạt tính APX (phản ứng bảo vệ) cao hơn đáng kể so với đối chứng ( Hình 5A ). Hơn nữa, các phản ứng APX đối với tất cả các hợp chất Zn là phi tuyến tính ( Hình 5A ; xem Bảng SI S1 cho các giá trị bình phương R).
Phân tích của chúng tôi về khả năng thu nhặt H 2 O 2 của các ZnONP khác nhau cho thấy ảnh hưởng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ của các ZnONP trong lá đậu tương ( Hình 5B ). Với nồng độ ngày càng tăng, việc thu gom H 2 O 2 đã giảm đáng kể lên đến 160 mg/kg đối với tất cả các hợp chất Zn được thử nghiệm; trong khi ở 400 mg/kg, hoạt động thu gom tăng đáng kể đối với tất cả các hợp chất Zn so với đối chứng ( Hình 5B ). Hơn nữa, các ZnONP 38nm hình cầu có hiệu quả thấp nhất trong việc loại bỏ H 2 O 2 ở lá so với tất cả các hợp chất Zn khác được thử nghiệm (ZnONP 59nm dạng hoa, ZnONP dạng que> 500nm và Zn 2+ion) lên đến 160 mg/kg; nhưng ở nồng độ cao nhất (400 mg/kg) thì xu hướng nhặt rác đã đảo ngược đối với các NP, tức là các ZnONP 38nm hình cầu có hiệu quả nhất trong việc nhặt rác H 2 O 2 ở lá so với hai nano kẽm oxit khác được thử nghiệm (các ZnONP 59nm giống hoa, dạng que> 500nm ZnONP). Trong khi đó, ở 400 mg/kg, ion Zn 2+ cho thấy tiềm năng thu hồi H 2 O 2 nhiều nhất so với cả ba loại ZnONP. Nhìn chung, các phản ứng thu nhặt H 2 O 2 của lá đối với tất cả các hợp chất Zn là phi tuyến tính ( Hình 5B ; xem Bảng SI S1 cho các giá trị bình phương R).
Thảo luận
Các nghiên cứu trước đây đã ghi nhận độc tính khác nhau của nano kẽm oxit trong đậu tương và các cây khác. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu này chỉ tập trung vào một kích thước nano kẽm oxit, do đó hạn chế hiểu biết của chúng ta về cách một số yếu tố hóa lý chính như kích thước, hình thái (hình dạng) và điện tích bề mặt có thể đóng vai trò như thế nào đối với độc tính nano. Ví dụ, tiếp xúc với các ZnONP 18 nm dẫn đến tăng hàm lượng chất diệp lục, chiều cao chồi và năng suất hạt trong lúa mì mùa đông, trong khi sinh khối thực vật vẫn không bị ảnh hưởng ( Dimkpa và cộng sự, 2018 ). Việc bón lá các hợp chất nano kẽm oxit, CuO và B2O3 cho thấy sự gia tăng đáng kể về sinh khối đậu tương, số lượng hạt, sinh khối hạt và sự hấp thu các chất dinh dưỡng vi mô và vĩ mô ( Dimkpa và cộng sự, 2017a). Tần suất vỏ đậu tăng lên ở đậu tương tiếp xúc với ZnONPs, trong khi kích thước và số lượng hạt trung bình trên mỗi quả không khác nhau giữa các nghiệm thức ( Priester và cộng sự, 2012 ). Sinh khối lúa mì và năng suất hạt đã tăng lần lượt 72% và 55% khi xử lý bằng ZnSO 4 , trong khi xử lý nano kẽm oxit ZnONPs dẫn đến tăng sinh khối và năng suất hạt tương ứng 63% và 56% so với đối chứng ( Du et al., 2019 ). Tuy nhiên, ở Vigna unguiculata được trồng trong đất được bổ sung các ion Zn 2+ hòa tan hoặc nano kẽm oxit cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về sự phát triển của cây giữa hai hợp chất Zn ( Wang và cộng sự, 2013). Sự hấp thụ của thực vật và vận chuyển VQG đến các bộ phận của cây trồng trên không đã được ghi nhận trước đây đối với các loại phơi nhiễm VQG khác (Mueller và Nowack, 2008; Shang và cộng sự, 2019), dẫn đến giảm sinh khối thực vật (Ma và cộng sự, 2015a; Shang và cộng sự al., 2019). Như đã thảo luận trước đây, Zn cần thiết cho thực vật để thực hiện nhiều hoạt động sinh lý như sinh tổng hợp protein và enzym, chất diệp lục và hoạt động bình thường của các quá trình trao đổi chất ( Singh và cộng sự, 2018 ). Trong nghiên cứu này, năng suất hạt cao nhất đối với các ZnONP 38nm hình cầu so với các ZnONP 59nm dạng hoa hoặc các ZnONP> 500nm dạng hình que ( Hình 2 ) lên đến 160 mg Zn / kg ở nghiệm thức. Năng suất hạt giống thường bị giảm khi xử lý ion Zn 2+ so với cả ba loại xử lý ZnONPs ( Hình 2), cho thấy tác dụng ức chế của các ion Zn 2+ đối với sự phát triển của hạt đậu tương so với các ZnONP đã được đánh giá. Mặc dù chúng tôi không đo lường khả năng hấp thụ ZnONP trong đậu tương, nhưng có thể các quá trình sinh hóa được thảo luận ở trên (Chandra và cộng sự, 2014; Shaw và Hossain, 2013; Da Costa và Sharma, 2016) có thể đã bị thay đổi khi tiếp xúc với chất hòa tan Các ion Zn 2+ và ZnONP, có khả năng thúc đẩy (ở 40-160 mg/kg) hoặc ức chế (ở 400 mg/kg) năng suất hạt. Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi cho thấy các hiệu ứng khác biệt của ZnONPs so với các xử lý ion Zn 2+ ( Hình 2 ). Hơn nữa, nhu cầu năng lượng giảm do giảm các enzym chống oxy hóa (SOD, CAT, POX và APX) ( Kurutas, 2016 ;Yusefi-Tanha và cộng sự, 2020 ) được thể hiện lên đến 160 mg/kg của các xử lý ion ZnONP hoặc Zn 2+ có thể giải thích năng suất hạt tăng và phản ứng nghịch đảo ở 400 mg/kg của xử lý ion ZnONP hoặc Zn 2+ .
Khả năng chịu đựng của thực vật đối với việc tiếp xúc với các hạt nano gốc kim loại được xác định bởi khả năng bảo vệ các hệ thống chống oxy hóa hiệu quả nhằm loại bỏ hoặc loại bỏ ROS (H 2 O 2 , OH – ) dư thừa trong tế bào và mô. Các nghiên cứu trước đây cho thấy độc tính của ZnO số lượng lớn thấp hơn so với nano kẽm oxit ( Amooaghaie và cộng sự, 2016 ; Mukherjee và cộng sự, 2014a ), và các ZnONP có kích thước nhỏ đã được biến đổi thành các tập hợp có kích thước lớn hơn trong tế bào thực vật, làm phức tạp việc đánh giá độc tính ( Lee và cộng sự, 2013 ). Độc tính gây ra bởi nồng độ Zn cao hơn (400 mg Zn / kg) được biểu hiện như sự can thiệp tiềm tàng với các hoạt động của enzym chống oxy hóa chính như được mô tả trong Hình. 2– 5A . H 2 O 2 là chất độc đối với tế bào, đặc biệt là ở mức độ cao hơn, vì vậy thực vật phải duy trì sự cân bằng trong tế bào để giảm thiểu mức độ của nó để tránh stress oxy hóa và peroxy hóa lipid tiềm ẩn ( Das và Roychoudhury, 2014 ). Các công trình trước đây cho thấy ROS tăng lên khi tiếp xúc với nồng độ cao hơn của ZnONP <100nm (500 mg Zn/kg) trong lúa mì ( Dimkpa và cộng sự, 2012 ) hoặc ZnONP 90nm (800 mg/kg đất) trong ngô ( Liu và cộng sự, 2015 ). Gốc hydroxyl (OH – ), phản ứng mạnh nhất trong số tất cả các ROS, được tạo ra từ H2O2 là kết quả của quá trình khử phân tử, và có thể tách nguyên tử hydro khỏi nhóm metylen (CH2) trong chuỗi bên của axit béo không bão hòa đa của chất béo màng, do đó bắt đầu quá trình peroxy hóa lipid (Shaw và cộng sự, 2014). Quan sát của chúng tôi về ảnh hưởng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ của ZnONP đối với sự tích tụ MDA trong đậu tương như một phản ứng đối với quá trình tổng hợp H2O2 và quá trình peroxy hóa lipid trong lá là duy nhất cho nghiên cứu độc tính nano ( Hình 3 ). Nair và Chung (2014a) quan sát thấy sự gia tăng đáng kể H2O2 trong rễ cây đậu tương khi tiếp xúc với các nồng độ CuONP khác nhau. Giảm quá trình peroxy hóa lipid (mức MDA) được quan sát khi tiếp xúc với ZnONP dạng que> 500nm, đặc biệt là ở nồng độ cao nhất (400 mg/kg), có thể cho thấy sự thiếu vận chuyển hạt trong cây do kích thước hạt lớn hơn và giống như que hình thái, có thể mang lại sự bảo vệ đáng kể cho tính toàn vẹn của màng tế bào so với hai loại ion ZnONP và Zn 2+ khác. Những kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó cho thấy ngưỡng tác dụng bảo vệ vượt quá mức độc tính có thể biểu hiện đối với ZnONPs trong tế bào rễ hành ( Kumari và cộng sự, 2011 ).
Hernandez-Viezcas và cộng sự. (2011) báo cáo tăng hoạt động CAT ở rễ, chồi và lá ở các nồng độ khác nhau (500-4000 mg/L) của nghiệm thức ZnONPs 10nm, nhưng ở nồng độ cao hơn 500 mg/L hoạt tính APX bị giảm. Allium cepa tiếp xúc với ZnONPs ~ 85nm (200, 400 và 800 mg/L) dẫn đến giảm hoạt động CAT, nhưng không ảnh hưởng đến mức ROS và hoạt động của glutathione peroxidase ( Ghosh và cộng sự, 2016 ). Ở dương xỉ sống nổi dưới nước ( Salvinia natans ), việc tiếp xúc với ZnONPs 25nm (1-50 mg/L) không cho thấy ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật, nhưng dẫn đến tăng hoạt động SOD và CAT ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm ( Hu et al., 2014), cho thấy phản ứng ứng suất oxy hóa tăng lên của dương xỉ ở 50 mg Zn / L. Ở 500 và 750 mg Zn / kg, hoạt tính của enzym CAT giảm trong thân và lá đã được ghi nhận đối với các hợp chất Zn khác nhau trong cỏ linh lăng ( Bandyopadhyay và cộng sự, 2015 ). Phát hiện của chúng tôi cho thấy MDA và nhiều dấu ấn sinh học chống oxy hóa (SOD, CAT và POX) đã bị thay đổi theo kiểu tương tự bởi loại hợp chất Zn, nồng độ và tương tác của chúng ( Bảng 2 , 3 ; Hình 3). Cụ thể hơn, kết quả cho thấy ảnh hưởng của kích thước hạt, hình thái và nồng độ phụ thuộc vào nồng độ của ZnONP đối với MDA và các dấu ấn sinh học chống oxy hóa, bao gồm SOD, CAT và POX, trong đậu tương được trồng trong 120 ngày. Nhìn chung, lên đến 160 mg Zn / kg nghiệm thức có tác dụng bảo vệ đáng kể đã được quan sát thấy trong đậu tương bởi tất cả các loại hợp chất Zn được thử nghiệm.
Bảng 3.Phân tích phương sai ( p -value) đối với hoạt động của các enzym chống oxy hóa của đậu tương trồng trong đất được xử lý với các loại nano kẽm oxit và ion kẽm ở nồng độ khác nhau.
Là chất chống oxy hóa quan trọng trong lục lạp, tế bào và ty thể ( Demidchik, 2015 ), SOD xúc tác gốc superoxide (O2 – ) và chuyển đổi thành H2O2 và O2 , do đó đóng vai trò chính trong việc chống lại stress oxy hóa ( Shekhawat, 2013 ; Ahmed và cộng sự, 2018 ). Kết quả cho thấy rằng hoạt động SOD của lá tăng lên (O2 – + 2H + → H2O2 + O2 ) ở nghiệm thức 400 mg Zn / kg có thể đã thúc đẩy sản xuất H 2 O 2 như trong Hình 3A. Tuy nhiên, hoạt độ tổng thể của SOD thấp hơn tới 160 mg Zn / kg nghiệm thức đối với tất cả các hợp chất Zn được thử nghiệm ( Hình 3A ). Mức Superoxide (O2 – ) được phát hiện tăng với 400-3.200 mg Zn / kg ZnONP (90 ± 10 nm) và sự gia tăng đáng kể hoạt động SOD đã được ghi nhận ở liều cao nhất trong ngô ( Wang và cộng sự, 2016a ) . Ở Gossypium hirs, sự gia tăng hoạt động của SOD và POX đã được báo cáo cùng với sự giảm peroxy hóa lipid sau đó với các phương pháp điều trị bằng ZnONPs ( Venkatachalam et al., 2017 ). Những kết quả này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi. Các enzym như CAT, POX và APX được biết là xúc tác khử H 2 O 2vào nước và oxy trong lục lạp tế bào, cytosol, ty thể và / hoặc peroxisomes (Anjum và cộng sự, 2016). Những chất này và các chất chống oxy hóa khác có thể hoạt động độc lập hoặc cùng nhau thông qua nhiễu xuyên âm và giảm mức độ thiệt hại do oxy hóa và độc tính ở thực vật ( Ahmed et al., 2017a và 2017b ). Các enzym CAT, POX và APX dường như hoạt động đồng thời. Ở đây, hoạt động APX thấp ( Hình 5A ) kéo theo các hoạt động CAT và POX cao hơn đối với các ion ZnONP và Zn 2+ ( Hình 4B, C ) – một phát hiện phù hợp với các kết quả trước đây của chúng tôi được ghi lại cho các xử lý CuONPs trong đậu tương ( Yusefi-Tanha et al ., 2020). Xu hướng tổng thể của hoạt động APX khi xử lý bằng hợp chất Zn đã bị đảo ngược so với sự tích tụ MDA và các phản ứng SOD, CAT và POX trong lá đậu tương ( Hình 5A ). Trong khi đó, việc thu gom H2O2 bởi các hợp chất Zn cho thấy một xu hướng tương tự như các phản ứng MDA, SOD, CAT và POX ( Hình 5B). Hơn nữa, chúng tôi đã ghi nhận một ngưỡng rõ ràng là 160 mg Zn / kg, vượt quá ngưỡng mà các phản ứng của đậu tương khi tiếp xúc với tất cả các hợp chất của Zn được phát hiện là âm tính đối với tất cả các điểm cuối được đo. Việc chúng tôi sử dụng cấu trúc tinh thể có độ tinh khiết cao, giống nhau (ba lớp) và điện tích bề mặt (âm) cho cả ba kích thước và các nano kẽm oxit khác nhau về mặt hình thái cho phép chúng tôi kiểm tra cụ thể các hiệu ứng phụ thuộc vào kích thước và hình thái của ZnONP trong đậu tương. Kết quả của chúng tôi cho thấy ảnh hưởng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ của nano kẽm oxit đối với năng suất hạt, quá trình peroxy hóa lipid và các dấu ấn sinh học chống oxy hóa khác nhau trong đậu tương trồng trên đất. Các phát hiện thêm cho thấy độc tính duy nhất của nano kẽm oxit so với Zn 2+ dạng ion trong đậu tương.
Ước tính khoảng 50% đất canh tác được sử dụng trong nông nghiệp có thể chứa lượng Zn hòa tan giảm, dẫn đến giảm năng suất cây trồng và chất lượng dinh dưỡng kém của ngũ cốc và các chất dẫn xuất ( Moreira và cộng sự, 2018 ). Chất hữu cơ được biết là ảnh hưởng đến sự sẵn có của Zn trong đất đối với cây trồng bằng ZnONPs hoặc xử lý Zn số lượng lớn ( Moghaddasi et al., 2017 ; Medina-Velo et al., 2017 ; Dimpka et al., 2020). Gần đây, Dimkpa et al. (2020) đã ghi lại những ảnh hưởng có lợi của các ZnONP 18nm trên các tiêu chí khác nhau (chiều dài chồi, chiều cao cây, sinh khối chồi, chất diệp lục, năng suất hạt, chồi / hạt Zn 2+ hấp thụ, hạt Ca 2+ và Mg 2+hấp thu) được đo ở lúa mì trong điều kiện hạn hán mô phỏng (ở độ ẩm đồng ruộng 40%) và / hoặc với phân hữu cơ (phân bò). Ở một nửa nồng độ, ZnONPs (2,17 mg ZnO / kg) cho thấy các tác động tích cực tương tự hoặc lớn hơn so với các nghiệm thức ZnO số lượng lớn (bột> 1000nm). Những phát hiện này rất có ý nghĩa ở chỗ khả năng phản ứng cao hơn của ZnONPs có thể chứng minh bền vững hơn (trên cơ sở khối lượng) so với việc bón phân khối lượng lớn Zn vào đất ( Dimkpa và cộng sự, 2020 ). Phát hiện của chúng tôi cũng cho thấy triển vọng của ZnONPs sẽ được sử dụng làm phân bón nano (lên đến 160 mg Zn / kg) để bổ sung nguyên tố Zn cho cây trồng ( Singh và cộng sự, 2013), giảm stress oxy hóa và thúc đẩy năng suất hạt giống. Sau đó, thông qua các bộ phận thực vật ăn được như lá và hạt, Zn có khả năng sinh học đối với con người cao tới 70% trong khi mức hấp thụ trung bình là khoảng 33% ( Turnlund et al., 1984 ; Cousins, 1985 ; FAO / WHO, 2004 ). Là một vi chất dinh dưỡng thiết yếu, thiếu Zn có liên quan đến thiểu năng sinh dục, thiếu máu và tăng trưởng thấp còi ở người ( Roohani và cộng sự, 2013 ); do đó, bổ sung nano cho cây trồng trong quá trình sinh trưởng với lượng Zn cần thiết (điều này có thể phụ thuộc vào loại đất) có thể là một khái niệm khả thi — một khái niệm có thể thay đổi cuộc chơi, đặc biệt, đối với những người dựa vào chế độ ăn nhiều thực vật như như ngũ cốc và đậu và những người tiêu thụ ít thịt hơn ( Roohani và cộng sự, 2013 ).
Đánh giá các giá trị bình phương R cho tất cả các điểm cuối được đo cho thấy các đường cong đáp ứng nồng độ phi tuyến tính (R 2 <0,65) (xem Bảng SI S1 ). Hơn nữa, kết quả của chúng tôi cho thấy không có mức tác dụng ngoại ý quan sát được (NOAEL) là 160 mg/kg đối với cả ba loại nano kẽm oxit khác nhau, bao gồm cả ion Zn 2+ , đối với tất cả các điểm cuối được đo (xem điều khoản TOC), ngoại trừ việc thu gom H2O2 ( Hình 5B ). Tác dụng bảo vệ do ZnONP mang lại lên đến 160 mg/kg trong đậu tương có thể là do vai trò của Zn như một vi chất dinh dưỡng thiết yếu trong nhiều enzym và protein, là chìa khóa cho sự tăng trưởng, phát triển của cây trồng và năng suất cây trồng ( Moreira và cộng sự, 2018 ).
Sự kết luận
Tóm lại, phát hiện của chúng tôi đã chứng minh ảnh hưởng phụ thuộc vào kích thước hạt, hình thái và nồng độ của ZnONP đối với năng suất hạt, quá trình peroxy hóa lipid và các dấu ấn sinh học chống oxy hóa khác nhau được đo trong đậu tương trồng trên đất. Các nano kẽm oxit ZnONP 38nm hình cầu có khả năng bảo vệ tốt nhất so với các ZnONP 59nm hình hoa, các ZnONP> 500nm dạng que, hoặc các ion Zn 2+ , đặc biệt lên đến 160 mg/kg. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nhất 400 mg/kg, các nano kẽm oxit ZnONP 38nm hình cầu tạo ra phản ứng ứng suất oxy hóa cao nhất (tổng hợp H 2 O 2 , MDA, SOD, CAT, POX) trong đậu tương so với hai ZnONP khác nhau về hình thái được thử nghiệm. Các đường cong nồng độ-phản ứng cho ba loại ZnONP và Zn 2+các ion là phi tuyến đối với tất cả các điểm cuối được đánh giá. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy sự khác biệt giữa độc tính nano đặc hiệu của ZnONPs so với độc tính dạng ion Zn 2+ trong đậu tương. Hơn nữa, giá trị NOAEL cao hơn 160 mg/kg cho thấy tiềm năng sử dụng ZnONPs làm phân bón nano cho cây trồng trên đất thiếu Zn để cải thiện năng suất cây trồng, chất lượng lương thực và giải quyết tình trạng suy dinh dưỡng trên toàn cầu.
Elham Yusefi-Tanha, Sina Fallah, Ali Rostamnejadi, Lok Raj Pokhrel