Nano bạc điều trị bệnh viêm vú ở bò sữa, đồng thời phục hồi hiệu quả của kháng sinh bằng cách giảm gen kháng thuốc của vi khuẩn sau khi điều trị với nano bạc

Trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh quá mức đã dẫn đến sự phát triển kháng thuốc của các chủng vi khuẩn, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh. Một trong những phương pháp chống lại sự kháng thuốc là liệu pháp kết hợp, bao gồm việc sử dụng các chất ức chế kháng kháng sinh kết hợp với kháng sinh. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đang phát triển một phương pháp mới, bao gồm liệu pháp sử dụng Nano bạc như một chất ức chế, không kết hợp với kháng sinh. Mục đích của nghiên cứu này là nghiên cứu trên 744 con bò mắc bệnh viêm vú thanh dịch và liên quan đến 31 loại kháng sinh: (1) khả năng của liệu pháp điều trị bằng Nano bạc trên bò trong việc điều chỉnh các gen kháng thuốc mecA (S. aureus), blaGES và blaDHA (E. coli), và (2) so sánh kết quả với kết quả thu được khi điều trị bằng thuốc kháng sinh. Dữ liệu thu được sau liệu pháp AgNP cho thấy số lượng chủng S. aureus và E. coli kháng kháng sinh giảm lần lượt 40,3% và 54,5%, trong khi đó, sau liệu pháp kháng sinh, số lượng này tăng lần lượt 48,9% và 114,9%. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập có gen kháng thuốc giảm trung bình 22,7% sau khi điều trị bằng AgNP, trong khi đó, tỷ lệ này tăng trung bình 36,9% sau khi điều trị bằng kháng sinh. Sự giảm số lượng gen kháng thuốc trong các chủng vi khuẩn phân lập do liệu pháp AgNP gây ra là con đường thứ năm để chống lại sự kháng thuốc của vi khuẩn bằng Nano bạc, bên cạnh bốn con đường đã được nhóm nghiên cứu của chúng tôi phát hiện. Những phát hiện này cung cấp thêm hiểu biết về nguồn gốc khả năng chống lại sự kháng thuốc của liệu pháp AgNP.

(NANOCMM TECHNOLOGY)

1. Giới thiệu

Thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ nhân loại khỏi các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đe dọa tính mạng. Tuy nhiên, việc sử dụng quá mức đã dẫn đến việc vi khuẩn phát triển khả năng kháng thuốc kháng sinh, từ đó làm giảm hiệu quả của chúng trong điều trị bệnh. Giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh ngày nay đòi hỏi một cách tiếp cận đa diện mới, bao gồm [ 1 ]: (1) sử dụng thuốc kháng sinh đúng cách, bao gồm lựa chọn đúng loại thuốc kháng sinh, liều lượng và thời gian sử dụng, và tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn, (2) Liệu pháp hướng vào vật chủ, kích thích cơ chế phòng vệ của cơ thể bằng các chất điều hòa miễn dịch và chất kích thích miễn dịch , (3) Liệu pháp tế bào gốc , giúp cải thiện sự tái tạo mô, (4) Liệu pháp virus kháng khuẩn , trong đó thực khuẩn thể (virus của vi khuẩn) hoặc các tác nhân dựa trên virus khác tiêu diệt hiệu quả vi khuẩn kháng thuốc, (5) sử dụng các hạt nano hữu cơ và vô cơ để tối ưu hóa việc phân phối thuốc kháng sinh bao gồm khả năng thâm nhập qua màng tế bào vi khuẩn của thuốc kháng sinh, (6) các chiến lược sử dụng phương pháp gen học và chống plasmid, và (7) Liệu pháp kết hợp sử dụng thuốc kháng sinh cùng với chất ức chế kháng thuốc kháng sinh (ARBs) . ARB còn được gọi là chất tăng cường hóa trị [ 2 ] hoặc chất bổ trợ kháng sinh [ 3 ].

Một số chất ức chế này, ví dụ như sự kết hợp của amoxicillin (kháng sinh β-lactam) và axit clavulanic (chất ức chế β-lactamase) [ 4 ] đã được sử dụng trong lâm sàng. Năm 2017, FDA đã phê duyệt meropenem-vaborbactam, một sự kết hợp của kháng sinh carbapenem và chất ức chế β-lactamase, để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu do vi khuẩn kháng đa thuốc gây ra [ 5 ]. Hầu hết các ARB là kháng sinh tổng hợp được áp dụng trong thực tiễn lâm sàng hiện nay. Các chất ức chế tự nhiên, bao gồm tinh dầu, cũng đang được nghiên cứu để đảo ngược tình trạng kháng thuốc và tránh độc tính của kháng sinh tổng hợp [ 6 ].

ARB tăng cường hiệu quả của các loại kháng sinh hiện tại bằng cách chống lại các cơ chế kháng thuốc mà vi khuẩn sử dụng để chống lại chúng. ARB hoạt động bằng cách ức chế trực tiếp các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn hoặc điều chỉnh phản ứng miễn dịch của vật chủ , cho phép kháng sinh hoạt động hiệu quả hơn [ 7 ]. Các cơ chế làm tăng độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh có thể do thay đổi di truyền và thay đổi không di truyền.

Người ta biết rằng các hạt nano bạc (AgNPs) có hoạt tính diệt khuẩn phổ rộng đối với vi khuẩn, nấm, vi rút và vi khuẩn lao [ 8 ]. Hoạt tính này dựa trên nhiều cơ chế của chúng: sản xuất các loại oxy hoạt tính , tổn thương DNA, làm suy yếu màng tế bào vi khuẩn , ức chế tổng hợp protein [ [9] , [10] , [11] ], v.v. Ưu điểm của Nano bạc nằm ở phổ rộng của các cơ chế kháng khuẩn đồng thời [ 12 ]. AgNPs làm gián đoạn chức năng của vi khuẩn bằng cách gây ra sự hình thành các loại oxy hoạt tính, ức chế hoặc thay đổi các enzyme và protein, giảm tính thấm của màng tế bào và gây mất cân bằng nội môi [ 13 ]. Do có nhiều cơ chế kháng khuẩn, AgNPs đại diện cho một nhóm ARB rất hứa hẹn.

Việc sử dụng AgNPs làm ARBs trong ống nghiệm đã được nghiên cứu và cho thấy kết quả khả quan trong việc phá hủy các cơ chế kháng khuẩn. Dưới đây là một số ví dụ về các nghiên cứu này, trong đó AgNPs ARBs hoạt động như: chất ức chế bơm đẩy [ 14 ], chất ức chế hình thành màng sinh học [ 13 ], chất ức chế bám dính vào vi khuẩn [ [15] , [16] , [17] , [18] , [19] ]. Người ta cũng biết rằng các hạt nano (bao gồm cả AgNPs) có thể điều chỉnh biểu hiện gen trong tế bào động vật có vú, vi khuẩn và thực vật [ 20 ]. Các hạt nano oxit kim loại , dựa trên carbon và dựa trên polymer gây ra những thay đổi biểu hiện trong các gen gây stress oxy hóa . Các hạt nano kích thích các gen liên quan đến sự tăng sinh tế bào , sự biệt hóa và các con đường truyền tín hiệu. Sự điều chỉnh gen bởi các hạt nano khác nhau giữa các sinh vật và loài khác nhau [ 20 ].

Do đó, người ta đã chứng minh rằng AgNPs có thể phá hủy các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn, và vì vậy, AgNPs đã được nghiên cứu rộng rãi như ARB trong liệu pháp kết hợp với kháng sinh. Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy các công trình nghiên cứu chuyên sâu về ảnh hưởng của AgNPs riêng lẻ (không kết hợp với kháng sinh) đối với khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Vì lý do đó, nhóm chúng tôi gần đây đã công bố một loạt các công trình mở đầu cho sự tiến bộ trong việc ứng dụng AgNPs không phải như ARB trong các liệu pháp kết hợp cùng với kháng sinh, mà là một cách tiếp cận mới, khác biệt để chống lại khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Những công trình này được thực hiện trên hàng trăm con bò bị viêm vú [ [15] , [16] , [17] , [18] , [19] , 21 ]. Người ta đã phát hiện ra rằng việc điều trị động vật bằng AgNP dẫn đến sự gia tăng hoạt động của vi khuẩn gram dương và gram âm ( Staphylococcus aureus , Streptococcus dysgalactiae , Escherichia coli và S. epidermidis ) đối với 31 loại kháng sinh [ 15 , 17 , 18 , 21 ]. Hiện tượng này được giải thích bởi thực tế là liệu pháp AgNP làm giảm: (1) khả năng đẩy kháng sinh ra ngoài của vi khuẩn [ 15 , 17 , 18 , 21 ], (2) khả năng bám dính vào tế bào vi khuẩn [ 16 ], (3) hoạt động chống lysozyme [ 16 ] và (4) sự hình thành màng sinh học [ 17 ]. Hơn nữa, trong Tài liệu tham khảo. [ 22 ], chúng tôi đã tiết lộ rằng ba lần điều trị AgNP liên tiếp trong ống nghiệm đã dẫn đến tăng 89–196% độ nhạy cảm trung bình đối với 38 loại kháng sinh (đối với sáu loại vi khuẩn ATCC) và khôi phục 27–47% độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh đã mất hoàn toàn hoạt tính trước khi áp dụng AgNP ban đầu.

Công trình nghiên cứu hiện tại là sự tiếp nối của phương pháp tiếp cận mới do nhóm chúng tôi phát triển, bao gồm việc sử dụng liệu pháp Nano bạc mà không kết hợp với kháng sinh để chống lại tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn trên cơ thể sống . Mục tiêu của công trình nghiên cứu này là nghiên cứu trên 744 con bò bị viêm vú thanh dịch và liên quan đến 31 loại kháng sinh: (1) khả năng của liệu pháp điều trị bằng AgNP trên bò trong việc điều chỉnh sự hiện diện của các gen kháng thuốc mecA ( S. aureus ), blaGES và blaDHA ( E. coli ), và (2) so sánh kết quả với kết quả thu được sau khi điều trị bằng thuốc kháng sinh hàng đầu.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 . Thiết kế thí nghiệm

Nghiên cứu này được thực hiện trên 744 con bò sữa tại trang trại bị viêm vú thanh dịch . Chẩn đoán được thực hiện dựa trên các triệu chứng lâm sàng, sau đó được xác nhận bằng xét nghiệm sinh hóa (California Mastitis Test®, DeLaval, Thụy Điển). Bò được chia thành hai nhóm bằng nhau, mỗi nhóm 372 con. Nhóm thứ nhất gồm những con bò được điều trị bằng Lactobay® (Norbrook Laboratories, Newry, Bắc Ireland, Anh), một loại thuốc kháng khuẩn dạng huyền phù chứa hai loại kháng sinh (ampicillin và cloxacillin). Nhóm thứ hai được điều trị bằng Argovit-C™ (Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Vector-Vita, Novosibirsk, Nga), một dung dịch huyền phù nước của các hạt nano bạc . 372 mẫu phân lập từ sữa của 372 con bò trước và sau khi điều trị bằng Nano bạc và 372 mẫu phân lập từ sữa của 372 con bò trước và sau khi điều trị bằng Lactobay đã được kiểm tra gen kháng thuốc. Các mẫu lấy trước khi điều trị được coi là mẫu tham chiếu (đối chứng).

2.2 . Mô tả các phương pháp điều trị

Lactobay® là thuốc kháng khuẩn dùng đường tiêm nội tuyến vú dưới dạng hỗn dịch chứa hai loại kháng sinh làm hoạt chất (1,5% muối natri ampicillin và 4% muối natri cloxacillin ). Trong thú y, Lactobay® được sử dụng như thuốc điều trị đầu tay cho bệnh viêm vú . Lactobay® được tiêm cho bò qua đường nội tuyến vú với liều 5 g, cách nhau 12 giờ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quá trình điều trị được thực hiện trong 6 ngày cho đến khi bò hồi phục hoàn toàn.

Argovit-C™, được sản xuất bởi Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Vector-Vita, Novosibirsk, Nga, là một loại thuốc thú y, do Tiến sĩ Vasily Burmistrov cung cấp. Thuốc được sử dụng để điều trị và phòng ngừa các bệnh về đường tiêu hóa ở bê. Argovit-C™ là một huyền phù nước ổn định của các hạt nano bạc (AgNPs) với nồng độ 200 mg/mL (20% theo trọng lượng). Nồng độ của bạc kim loại và chất ổn định hữu cơ (hỗn hợp gồm 70% collagen thủy phân và 30% polyvinylpyrrolidone) lần lượt là 12 mg/mL (1,2% theo trọng lượng) và 188 mg/mL (18,8% theo trọng lượng). Phần còn lại 800 mg/mL (80% theo trọng lượng) là nước cất. Hình ảnh TEM ( Hình 1 ) cho thấy các hạt nano bạc có hình cầu với đường kính trung bình là 14,95 ± 10,1 nm. Dải hấp thụ ở 454 nm trong phổ UV–Vis là đặc trưng cho cộng hưởng plasmon bề mặt của AgNPs. AgNPs được đặc trưng bởi hai đường kính thủy động học với cực đại ở 44 và 164 nm. Điện thế Zeta là 9,6 ± 0,6 mV. chết tế bào khối u không gây miễn dịch trong Tài liệu tham khảo [ 23 ]. Argovit-C™ được dùng cho động vật trong nhóm thử nghiệm bị viêm vú nghiêm trọng (n = 372) qua đường nội sọ sau khi pha loãng Argovit-C™ 10 lần với liều 10 mL mỗi ngày một lần trong 4 ngày cho đến khi hồi phục hoàn toàn. Nồng độ AgNP sau khi pha loãng 10 lần là 1200 μg/mL bạc kim loại hoặc 20.000 μg/mL AgNPs nguyên chất (bạc kim loại có chất ổn định). 10 mL dung dịch được dùng chứa 12 mg bạc kim loại hoặc 200 mg AgNPs có chất ổn định. Do đó, liều lượng được dùng cho mỗi bầu vú của mỗi con bò mỗi ngày là 12 mg bạc kim loại hoặc 200 mg bạc nano có chất ổn định.

Hình 1. Ảnh HR-TEM của các hạt nano AgNPs Argovit-C thu được trên kính hiển vi điện tử JEM 2010 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản).

2.3 . Lấy mẫu

Các mẫu sữa được lấy từ những con bò bị viêm vú trước và sau khi điều trị bằng Lactobay® hoặc Argovit-C™ trong điều kiện chăn nuôi tại vùng Novosibirsk trong giai đoạn 2018–2020. Để lấy mẫu, núm vú được lau sạch bằng tăm bông thấm cồn ethyl 70°. 10 ml sữa được thu thập vào các ống nghiệm sạch, tránh để núm vú tiếp xúc với thành ống nghiệm. Ống nghiệm chứa sữa được đậy kín bằng nút gạc bông, và tên hoặc số hiệu của con bò được ghi trên nhãn của ống nghiệm. Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 8–10 °C trước khi bắt đầu thử nghiệm. Trong vòng 3–4 giờ, các mẫu được chuyển đến để xét nghiệm.

2.4 . Phân lập và định danh S. aureus và E. coli

Các chủng S. aureus và E. coli kháng thuốc đã được phân lập và xác định từ dịch tiết tuyến vú trước và sau khi bò được điều trị bằng chế phẩm Lactobay® hoặc Argovit-C™. Việc phân lập S. aureus được thực hiện bằng cách sử dụng chất phụ gia chọn lọc Staph-Strepto Supplement (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, Ấn Độ). Môi trường Endo được sử dụng để phân lập E. coli . Việc xác định hệ vi sinh vật được phân lập từ động vật được thực hiện bằng cách xem xét các đặc tính nuôi cấy, hình thái và sinh hóa của vi khuẩn theo các phương pháp được chấp nhận rộng rãi “Cẩm nang xác định vi khuẩn của Bergey” [ 24 ].

2.5 . Số lượng chủng phân lập có khả năng kháng thuốc

Các nghiên cứu về khả năng kháng thuốc của các chủng S. aureus và E. coli phân lập từ sữa bò bị viêm vú tiết dịch đã được tiến hành ex vivo với 31 loại kháng sinh. Các nghiên cứu về khả năng kháng thuốc được thực hiện trước và sau khi điều trị bằng các loại thuốc thuộc các nhóm dược lý khác nhau (Argovit-C™ và Lactobay®).

Để xác định các chủng phân lập có vi sinh vật kháng 31 loại kháng sinh, phương pháp khuếch tán đĩa tiêu chuẩn đã được sử dụng theo tiêu chí của Ủy ban Châu Âu về Đánh giá Độ nhạy cảm với Kháng sinh (Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm Độ nhạy cảm với Kháng khuẩn. Kiểm soát Chất lượng Nội bộ Thường xuyên và Mở rộng để Xác định MIC và Khuếch tán Đĩa theo Khuyến nghị của EUCAST, 2018). Trong trường hợp khuyến nghị cho các loại kháng sinh cụ thể không được bao gồm trong Tài liệu tham khảo [ 25 ], chúng được lấy từ Tài liệu tham khảo [ 26 ].

2.6 . Phát hiện gen kháng thuốc bằng PCR

Việc xác định các gen kháng thuốc kháng sinh được thực hiện qua hai giai đoạn. Các chủng vi khuẩn kháng thuốc theo kiểu hình được chọn lọc, sau đó tiến hành chiết xuất DNA bằng DNA-express® (NPF Litech, Moscow, Nga) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ở giai đoạn thứ hai, các mẫu DNA được phân lập được kiểm tra bằng PCR sử dụng hệ thống CFX96 (Bio-Rad Laboratories, CA, Hoa Kỳ). PCR được thực hiện với bộ thuốc thử định dạng Fluoropol-RV của cấu hình OneStep (NPF Litech, Moscow, Nga). Gen BlaDHA và blaGES được sử dụng để phát hiện khả năng kháng penicillin , cephalosporin và carbapenem của Enterobacteriaceae ( E. coli ) [ 28 ]. Gen MecA được sử dụng để phát hiện khả năng kháng kháng sinh beta-lactam của S. aureus [ 29 ].

Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu (NPF Litech, Moscow, Nga) cho các gen mecA, blaGES và blaDHA ( Bảng 1 ). Tất cả các gen được phát hiện trong điều kiện nhiệt độ do nhà cung cấp chỉ định: giai đoạn biến tính ban đầu ở 95 °C trong 2 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ ở 95 °C trong 15 giây, 60 °C trong 30 giây và 72 °C trong 40 giây, với giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 75 °C trong 5 phút. Kết quả nghiên cứu được xác định dựa trên sự hiện diện hoặc vắng mặt của điểm giao nhau giữa đường cong huỳnh quang với đường ngưỡng được đặt ở mức thích hợp. Giá trị chu kỳ ngưỡng được thiết lập theo hướng dẫn sử dụng của hệ thống thử nghiệm được áp dụng. Các mồi được sử dụng bởi hệ thống phát hiện PCR được mô tả trong bảng sau ( Bảng 1 ) (dữ liệu do nhà cung cấp cung cấp).

Bảng 1 . Các mồi đặc hiệu cho các gen mecA, blAGES và blaDHA được sử dụng trong nghiên cứu PCR.

3. Kết quả

3.1 . Số lượng chủng phân lập chứa các loại vi khuẩn khác nhau

Trong các nghiên cứu vi sinh vật học về sữa từ bò bị viêm vú, vi sinh vật thuộc chi Staphylococcus spp. được phân lập trong 54,5% mẫu ( S. aureus – 38,1%; S. epidermidis – 16,4%), Streptococcus spp. trong 32,9% ( Str. dysgalactiae – 15,3%; Str. agalactiae – 10,7%; Str. pyogenes – 6,9%) và E. coli trong 12,6% mẫu ( Bảng 2 ). Nghiên cứu hiện tại tập trung vào các chủng S. aureus và E. coli phân lập được vì chúng lần lượt là đại diện cho vi khuẩn gram dương và gram âm, có tỷ lệ đóng góp cao trong sữa của bò bị nhiễm viêm vú ( Bảng 2 ).

Bảng 2. Sự đóng góp của các loại vi khuẩn khác nhau trong tuyến tiết sữa của bò bị viêm vú.

3.2 . Sự thay đổi về số lượng chủng vi khuẩn kháng thuốc sau điều trị

3.2.1 . S. aureus

Hình 2 A và B trình bày số lượng chủngS. aureus kháng thuốc từ bò bị viêm vú huyết thanh trước và sau khi điều trị bằng Argovit-C™ và Lactobay®, tương ứng. Các hình này cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa số lượng chủngS. aureus đối với mỗi loại trong số 31 loại kháng sinh trước và sau mỗi lần điều trị. Số lượng chủngS. aureusgiảm sau khi điều trị bằng Argovit-C™ so với số lượng chủng phân lập trước khi điều trị ( Hình 2 A). Ngược lại, số lượng chủng kháng thuốc tăng lên sau khi điều trị bằng Lactobay® ( Hình 2 B) đối với tất cả các loại kháng sinh.

Hình 2. Số lượng chủng S. aureus kháng thuốc từ bò bị viêm vú tiết dịch trước (cột màu xám) và sau (cột màu) điều trị bằng Argovit-C™ (A) và Lactobay® (B).

Hình 3 cho thấy sự khác biệt tương đối về số lượng chủng phân lập kháng thuốc sau và trước khi điều trị đối vớiS. aureus. Sự khác biệt này đối với cả hai loại vi khuẩn được tính bằng công thức (1) :

Sự khác biệt tương đối (%) = (N_sau – N_trước) × 100%/N_trước

Trong đó, N _trước là số lượng chủng vi khuẩn kháng thuốc trước khi điều trị, N _sau là số lượng chủng vi khuẩn này sau khi điều trị. Công thức này được sử dụng để tính toán số lượng chủng vi khuẩn kháng kháng sinh hoặc chủng vi khuẩn chứa gen kháng thuốc.

Hình 3. Sự khác biệt tương đối (%) về số lượng chủng S. aureus kháng kháng sinh phân lập từ bò bị viêm vú sau và trước khi điều trị bằng thuốc kháng sinh (cột màu đỏ) hoặc AgNPs (cột màu xanh). Giá trị trung bình được thể hiện bằng đường chấm chấm.

Đối với cả 31 loại kháng sinh, số lượng chủng S. aureus kháng kháng sinh sau khi điều trị bằng thuốc Lactobay® tăng lên (các cột màu đỏ trong Hình 3 ), trong khi sau khi điều trị bằng AgNPs, số lượng này giảm xuống (các cột màu xanh lá cây trong Hình 3 ). Sự khác biệt trung bình (%) sau khi sử dụng Nano bạc là -40,3%, trong khi sau khi sử dụng Lactobay® là +48,9%.

3.2.2 . Vi khuẩn E. coli

Kết quả đối với E. coli cho thấy mô hình tương tự như đối với S. aureus ( Hình 4 ). Sau khi điều trị cho bò bằng Argovit-C™, số lượng chủng E. coli kháng kháng sinh giảm, và sau khi điều trị bằng Lactobay®, số lượng này tăng lên ( Hình 4 A và B tương ứng). Kết quả của Hình 2 và Hình 4 cho thấy việc sử dụng Nano bạc AgNPs hiệu quả hơn Lactobay® trong việc giảm số lượng chủng kháng kháng sinh.

Hình 4. Số lượng chủng E. coli kháng thuốc từ bò bị viêm vú tiết dịch trước (cột màu xám) và sau (cột màu) điều trị bằng Argovit-C™ (A) và Lactobay® (B).

Hình 5 cho thấy sự khác biệt tương đối (%) về số lượng chủngE. colikháng kháng sinh phân lập được từ bò bị viêm vú sau và trước khi điều trị bằng thuốc kháng sinh và AgNPs được tính theo công thức (1) . Sự khác biệt trung bình sau khi sử dụng AgNPs là -54,5%, trong khi sau khi sử dụng Lactobay® là +114,9%.

Hình 5. Sự khác biệt tương đối (%) về số lượng chủng E. coli kháng kháng sinh phân lập được từ bò bị viêm vú trước và sau khi điều trị bằng thuốc kháng sinh (cột màu đỏ) hoặc AgNPs (cột màu xanh). Giá trị trung bình được thể hiện bằng đường chấm chấm.

3.3 . Phát hiện các gen liên quan đến khả năng kháng kháng sinh

Hình 6 trình bày số lượng các chủng phân lập cógenmecA(màu xanh lam),blaGES(màu đỏ) vàblaDHA (màu xanh lục) liên quan đến kháng kháng sinh được phát hiện từ sữa của những con bò bị viêm vú trước và sau khi điều trị bằng Nano bạc AgNPs và thuốc kháng sinh Lactobay®. Kết quả cho thấy số lượng chủng phân lập có gen kháng thuốc giảm sau khi điều trị bằng AgNP ( Hình 6 A) và tăng sau khi điều trị bằng Lactobay® ( Hình 6 B).

Hình 6. Số lượng chủng phân lập có chứa các gen mecA (màu xanh), blaGES (màu đỏ) và blaDHA (màu xanh lá cây) liên quan đến kháng kháng sinh được phát hiện từ sữa của những con bò bị viêm vú trước và sau khi điều trị bằng AgNPs (A) và thuốc kháng sinh (B). MecA là gen của S. aureus , blaGES và blaDHA là gen của E. coli.

Cuối cùng, Hình 7 trình bày dữ liệu của Hình 5 dưới dạng sự khác biệt tương đối được tính theo công thức (1) . Sự khác biệt tương đối trung bình (%) sau khi sử dụng Nano bạc AgNPs là −22,7 %, trong khi sau khi sử dụng Lactobay® là +36,9.

Hình 7. Sự khác biệt tương đối (%) về số lượng chủng phân lập có gen mecA , blaGES và blaDHA được phát hiện liên quan đến kháng kháng sinh khi điều trị bằng thuốc kháng sinh (cột màu đỏ) hoặc AgNPs (cột màu xanh).

4. Thảo luận

Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn ngay từ đầu đã buộc chúng phải liên tục đấu tranh không chỉ trong môi trường bệnh viện mà còn trong lĩnh vực thú y với các bệnh như viêm vú bò [ 29 ]. Đặc biệt trong bệnh lý do viêm vú bò gây ra, việc cộng đồng vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng kháng sinh gây ra tổn thất kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi bò sữa [ 30 , 31 ].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo sự khác biệt về khả năng kháng kháng sinh được tìm thấy trong các mẫu sữa từ 744 con bò bị viêm vú, được chia thành hai nhóm, mỗi nhóm 372 con bò. Sáu chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu sữa: S. aureus, S. epidermidis , Str. dysgalactiae, E. coli, Str. agalactiae và Str. pyogenes, từ đó hai chủng đại diện (Gram dương: S. aureus và Gram âm: E. coli ) được chọn để đo khả năng kháng kháng sinh của chúng trước và sau khi được điều trị bằng thuốc kháng sinh Lactobay® hoặc bằng Argovit-C™ Nano bạc AgNPs. Đối với cả hai chủng, kết quả thu được cho thấy sự giảm rõ rệt khả năng kháng bất kỳ loại kháng sinh nào trong số 31 loại kháng sinh được đánh giá sau khi điều trị bằng AgNPs, trái ngược với sự gia tăng khả năng kháng tất cả các loại kháng sinh sau khi điều trị bằng Lactobay®.

Hình 3 và Hình 5 trình bày sự khác biệt tương đối về số lượng chủng vi khuẩn kháng thuốc trước và sau khi điều trị, được tính toán bằng công thức 1. Các số liệu này cho thấy khả năng kháng kháng sinh sau khi điều trị bò bằng kháng sinh đã tăng lên, nhưng khi sử dụng Nano bạc AgNP thì khả năng kháng kháng sinh lại giảm xuống, ở cảS. aureusvàE. coli. Giá trị trung bình của những khác biệt này cho thấy sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc của chủng vi khuẩn. Ví dụ, đối vớiS. aureus, sự khác biệt này là 48,9% ( Hình 3 ), trong khi đối vớiE. coli, sự khác biệt là 114,9% ( Hình 5 ), gấp hơn hai lần. Tổng lợi ích của việc sử dụng liệu pháp Nano bạc AgNP thay vì liệu pháp Lactobay® về khả năng kháng kháng sinh lần lượt là 89,2% và 169,4% đối vớiS. aureusvàE. coli( Hình 3 , Hình 5 ). Điều này cho thấy hai loại vi khuẩn được nghiên cứu có cơ chế kháng thuốc khác nhau, có thể là doS. aureusthuộc nhóm vi khuẩn Gram dương trong khiE. colithuộc nhóm vi khuẩn Gram âm [ 24 , 32 ].

Có nhiều công trình nghiên cứu trong tài liệu dành cho việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của S. aureus và E. coli [ 30 , 31 , 33 , 34 ]. Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy công trình nào dành riêng cho hiệu ứng mà chúng tôi nghiên cứu trong công trình này, cụ thể là hiệu ứng của việc điều trị động vật bằng kháng sinh đối với khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tất cả các công trình dành riêng cho khả năng kháng kháng sinh của S. aureus và E. coli đều dành cho các chủ đề gần giống với chủ đề này, nhưng không chính xác là chủ đề này. Ví dụ, trong Tài liệu tham khảo [ 30 ], các tác giả đã phân tích các mẫu sữa từ bò bị viêm vú. Các tác giả đã đo khả năng kháng của các chủng S. aureus đối với các loại kháng sinh khác nhau liên quan đến các gen kháng kháng sinh khác nhau. Từ 22,7 đến 36,7% số chủng phân lập kháng tetracycline , gentamicin , streptomycin , kanamycin và penicillin . Tuy nhiên, chỉ có 10,2% số chủng phân lập kháng methicillin , và không tìm thấy khả năng kháng vancomycin . Trong Tài liệu tham khảo [ 32 ], sự khác biệt về khả năng kháng kháng sinh ở ba chủng vi khuẩn phân lập từ sữa của bò bị viêm vú đã được xác định trong khoảng thời gian 10 năm (năm 2006 và năm 2016) [ 31 ]. Năm 2016, so với năm 2006, sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh ở các chủng tụ cầu khuẩn dương tính với coagulase và ở E. coli đã được phát hiện, trong khi ở Streptococcus , khả năng kháng thuốc không tăng. Gần đây, Zhang et al. [ 33 ] đã báo cáo rằng 5,84–92,85 % trong số 298 chủng S. aureus phân lập từ mẫu sữa của bò bị viêm vú có khả năng kháng 5 nhóm kháng sinh khác nhau [ 34 ].

Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi đã phân tích trước và sau các liệu pháp điều trị bằng kháng sinh hoặc Nano bạc AgNP về hành vi của các gen liên quan đến khả năng kháng thuốc mà cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương đều có: mecA (gen của S. aureus ) , và blaGES , và blaDHA (gen của E. coli ) mà cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương đều có [ 28 ]. Hình 6A cho thấy tỷ lệ số lượng chủng phân lập có ba gen kháng kháng sinh được phát hiện có xu hướng giảm sau khi điều trị bằng AgNP, trong khi sau khi điều trị bằng kháng sinh Lactobay®, tỷ lệ này có xu hướng tăng. Điều quan trọng cần lưu ý là ở cả hai loại vi khuẩn ( S. aureus và E. coli ), Nano bạc AgNP làm giảm khả năng phát hiện các gen mecA, blaDHA và blaGES , điều này cho thấy sự hiện diện thấp hơn của các gen này trong các mẫu DNA của cả hai chủng vi khuẩn sau khi điều trị bằng AgNP [ 19 , 20 ]. Số lượng chủng phân lập có 3 gen kháng thuốc được nghiên cứu sau khi điều trị bằng AgNPs giảm trung bình 22,7%, trong khi sau khi điều trị bằng Lactobay®, số lượng này tăng trung bình 36,9% ( Hình 7 ). Như vậy, sự khác biệt tương đối tổng thể giữa điều trị bằng Lactobay® và AgNPs là 59,6%. Rất có thể AgNPs cũng sẽ thực hiện chức năng tương tự trong việc đảo ngược một phần khả năng kháng kháng sinh của các vi khuẩn khác thuộc nhóm Gram dương hoặc Gram âm.

Do đó, chúng tôi không tìm thấy bất kỳ dữ liệu nào trong tài liệu nghiên cứu về sự thay đổi số lượng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh và số lượng các chủng vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh trong các mẫu sữa bò bị viêm vú sau khi điều trị bằng kháng sinh, hoặc bằng Nano bạc AgNPs hoặc bằng các loại thuốc khác. Vì vậy, về mặt này, báo cáo này là độc nhất vô nhị. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng số lượng các chủng vi khuẩn có gen kháng thuốc được phát hiện tăng lên sau khi điều trị bằng thuốc kháng sinh , nhưng giảm đi sau khi điều trị bằng AgNP. Sự giảm số lượng các chủng vi khuẩn mang gen kháng thuốc được phát hiện trong các chủng sau khi điều trị bằng AgNP ( Hình 6 , Hình 7 ) tương quan với sự giảm số lượng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh được quan sát thấy ( Hình 2 , Hình 3 , Hình 4 , Hình 5 ). Mặc dù dữ liệu về việc giảm tỷ lệ gen kháng thuốc bằng cách sử dụng AgNPs còn khan hiếm, nhưng các tác dụng kháng khuẩn tương tự đã được báo cáo với các hợp chất tự nhiên dựa trên hạt nano khác . Ví dụ, tinh dầu Lippia origanoides được bao bọc nano đã chứng minh hoạt động mạnh mẽ chống lại Salmonella Enteritidis , hỗ trợ tiềm năng của các chất phytochemical được tăng cường bằng hạt nano như là chất thay thế kháng sinh trong hệ thống sản xuất động vật Atencio-Vega et al., 2024 (Đánh giá tác dụng của chiết xuất tinh dầu Lippia origanoides được bao bọc nano đối với Salmonella serovar Enteritidis như một chất thay thế tự nhiên cho kháng sinh trong ngành công nghiệp gia cầm [ 35 ].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu rộng hơn cho thấy tiềm năng của liệu pháp dựa trên hạt nano trong điều trị nhiễm trùng da và quản lý kháng thuốc kháng sinh trong thú y [ 27 ]. Người ta đã chỉ ra rằng việc ứng dụng NP trong điều trị nhiễm trùng da đại diện cho một phương pháp chuyển đổi có tiềm năng cách mạng hóa da liễu thú y . Các đặc tính độc đáo của NP, bao gồm khả năng thâm nhập được tăng cường, hiệu quả kháng khuẩn, giảm tác dụng phụ , giải phóng thuốc kéo dài và khả năng khắc phục kháng thuốc kháng sinh, khiến chúng trở thành những hướng đi đầy hứa hẹn cho tương lai của liệu pháp điều trị nhiễm trùng da ở động vật [ 27 ].

Sự giảm khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể xảy ra thông qua ba chiến lược chính: 1) giảm áp lực chọn lọc đối với sự kháng thuốc, 2) quay trở lại trạng thái nhạy cảm với thuốc, và 3) áp dụng các biện pháp can thiệp cụ thể bằng cách sử dụng các tác nhân làm giảm khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Chiến lược đầu tiên xảy ra khi sự tiếp xúc của vi khuẩn với kháng sinh giảm hoặc bị loại bỏ. Điều này có thể được thực hiện bằng cách giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh với liều lượng và thời gian thích hợp, ngăn ngừa nhiễm trùng thông qua vắc-xin, vệ sinh tốt, cách ly bệnh nhân nhiễm bệnh hoặc tạo ra môi trường không có kháng sinh [ 36 ] . Chiến lược thứ hai xảy ra khi các tế bào vi khuẩn quay trở lại trạng thái nhạy cảm hơn với kháng sinh thông qua: sự đảo ngược phân tử (quay trở lại trình tự gen nhạy cảm hơn với kháng sinh) và chi phí thích nghi (quay trở lại trạng thái ít kháng thuốc hơn và cạnh tranh hơn) [ 36 ]. Chiến lược thứ ba xảy ra dưới ảnh hưởng của các tác nhân đặc biệt phá hủy các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn và bằng cách đó, cải thiện hiệu quả của kháng sinh. Trong các thí nghiệm của chúng tôi, sự tiếp xúc với dư lượng kháng sinh không bị giảm hoặc loại bỏ vì không gian nuôi nhốt động vật không được xử lý bằng các biện pháp loại bỏ kháng sinh. Rõ ràng, trong trường hợp của chúng tôi, sự giảm kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn xảy ra thông qua liệu pháp AgNP.

Chúng tôi không tìm thấy bất kỳ công trình nào chuyên đo lường sự thay đổi về số lượng chủng phân lập có gen kháng thuốc sau khi điều trị động vật bằng AgNPs. Nghiên cứu liên quan chặt chẽ nhất đến nghiên cứu hiện tại của chúng tôi được trình bày trong Tài liệu tham khảo [ 37 ], trong đó các chủng Str. agalactiae thu được từ 200 mẫu sữa của bò sữa bị viêm vú lâm sàng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy độ nhạy cảm của Str. agalactiae với 15 loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi sau khi điều trị bằng sự kết hợp của Nano bạc AgNPs và dầu quế đã tăng lên. Sau khi tiếp xúc với MBIC50 của AgNPs, sự biểu hiện của các gen rogB, pilA và pilB giảm xuống mức thấp hơn (lần lượt là 0,673 ± 0,053, 0,775 ± 0,048 và 0,795 ± 0,005 lần) so với mức ban đầu (1 ± 0,05). Cần lưu ý rằng ba gen này không phải là gen kháng thuốc một cách nghiêm ngặt và trong trường hợp này, chúng phân tích sự biểu hiện gen chứ không phải phát hiện. Gen PilA liên quan đến khả năng vận động, bám dính, hình thành màng sinh học và độc lực; gen pilB duy trì pili loại IV, một cấu trúc được vi khuẩn sử dụng để vận động và bám dính; và RogB đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện của các gen độc lực ở Streptococcus nhóm B. Công trình này gần với công trình của chúng tôi vì nó trình bày kết quả trên các chủng phân lập từ 200 con bò sữa, sự thay đổi độ nhạy cảm của Str. agalactiae với 15 loại kháng sinh và sự thay đổi trong việc ức chế gen sau khi vi khuẩn tương tác với sự kết hợp của AgNPs và dầu quế. Tuy nhiên, mặc dù có một số điểm tương đồng trong các công trình này, vẫn không thể so sánh trực tiếp kết quả của chúng vì: 1) trong Tài liệu tham khảo [ 37 ], Nano bạc AgNPs tương tác trong ống nghiệm với vi khuẩn phân lập từ sữa, trong khi trong công trình của chúng tôi, bò được điều trị bằng Nano bạc AgNPs và chỉ sau khi bò hồi phục, vi khuẩn phân lập từ sữa mới được nghiên cứu; 2) trong Tài liệu tham khảo [37], [ 36 ] vi khuẩn tương tác với sự kết hợp của AgNPs với dầu quế (có đặc tính kháng khuẩn), trong khi trong nghiên cứu của chúng tôi, bò được điều trị bằng AgNPs đơn thuần, 3) trong Tài liệu tham khảo [ 37 ] sự ức chế các gen liên quan đến độc lực đã được phân tích, trong khi trong nghiên cứu của chúng tôi, sự ức chế hoặc sự hiện diện của các bản sao gen kháng thuốc đã được nghiên cứu, và 4) trong Tài liệu tham khảo [ 37 ] Str. agalactiae đã được nghiên cứu, trong khi trong nghiên cứu của chúng tôi, S. aureus và E. coli đã được nghiên cứu . Ứng dụng của AgNPs in vivo hiện nay vẫn tập trung vào chủ đề làm giảm độc lực của vi khuẩn [ [38] , [39] , [40]].

Trong loạt bài báo gần đây của nhóm chúng tôi, phương pháp luận bao gồm việc điều trị một nhóm động vật bằng AgNPs và một nhóm khác bằng thuốc kháng sinh, sau đó so sánh sự thay đổi về đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ các động vật trước và sau mỗi lần điều trị cũng như giữa các lần điều trị, đã được đề xuất. Phương pháp luận này có thể là một cách tiếp cận hữu ích để phát triển hơn nữa nghiên cứu về ảnh hưởng của AgNPs đến khả năng kháng thuốc của vi khuẩn và các cơ chế kháng thuốc trong điều kiện in vitro .

Các kết quả đã công bố trước đây từ nhóm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng việc điều trị bằng AgNP trên hàng trăm con bò sữa bị viêm vú đã giúp giảm thời gian hồi phục từ 26,8% đến 48,4% so với thời gian hồi phục sau khi điều trị bằng thuốc kháng sinh hàng đầu. Phương pháp điều trị này đã làm tăng độ nhạy cảm của bốn loại vi khuẩn ( S. aureus, Str. dysgalactiae, S. epidermidis , E. coli ) với 31 loại kháng sinh trung bình từ 9,5% đến 21,2%, trong khi sau khi điều trị bằng thuốc kháng sinh hàng đầu, độ nhạy cảm giảm từ 11,3% đến 27,3%. Những phát hiện này thể hiện nghiên cứu chuyển dịch với những ứng dụng đầy hứa hẹn trong tương lai. Việc ức chế biểu hiện gen kháng thuốc do điều trị bằng Nano bạc AgNP trên cơ thể sống , được phát hiện trong nghiên cứu này, là con đường thứ năm để chống lại sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn. Con đường này, cùng với bốn con đường đã được tiết lộ trước đó thông qua ức chế: (1) bơm đẩy ra, (2) hình thành màng sinh học và (3) bám dính vào tế bào và (4) kích hoạt hoạt động của lysozyme ( Hình 8 ), cung cấp thêm thông tin chi tiết về nguồn gốc của khả năng chống lại sự kháng thuốc của AgNP đã được tiết lộ.

Hình 8. Sơ đồ trình bày năm lý do gây ra hiện tượng hoạt động trở lại của thuốc kháng sinh sau liệu pháp AgNP ở bò và các tài liệu tham khảo của chúng (Bogdanchikova et al., 2024; Garibo Ruiz et al., 2022; Maklakova et al., 2024; Nefedova et al., 2022, 2023).

Điều quan trọng cần nhấn mạnh là nghiên cứu này là bước đầu tiên trong việc hiểu cách AgNP có thể điều chỉnh các gen kháng thuốc của vi khuẩn trong cơ thể sống . Trong tương lai, trong điều kiện thử nghiệm trên cơ thể sống hoặc thử nghiệm lâm sàng , cần phải nghiên cứu: (1) cơ chế phân tử mà Nano bạc AgNP làm giảm số lượng bản sao của các gen kháng thuốc trong các chủng phân lập, cụ thể là gen mecA trong S. aureus và các gen blaGES và blaDHA trong E. coli ; (2) xác định xem việc ức chế các gen kháng thuốc có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng gây bệnh khác ở cả hai loại vi khuẩn hay không; (3) xác định thời gian kéo dài của hiệu ứng ức chế này; và (4) nghiên cứu các tác động điều hòa gen do AgNP gây ra ở các vi khuẩn khác, v.v.

5. Kết luận

Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu hiện tại là công trình đầu tiên cho thấy việc điều trị bò bị viêm vú bằng AgNP dẫn đến giảm số lượng chủng S. aureus và E. coli kháng kháng sinh trung bình lần lượt là 40,3% và 54,5%. Ngược lại, liệu pháp điều trị bằng thuốc kháng sinh Lactobay® lại làm tăng số lượng chủng này (trung bình lần lượt là 48,9% và 114,9%). Tỷ lệ các chủng phân lập có gen kháng thuốc mecA ( S. aureus ) và blaGES và blaDHA ( E. coli ) giảm trung bình 22,7% sau khi điều trị bằng AgNP. Ngược lại, chúng tăng trung bình 36,9% sau khi điều trị bằng kháng sinh. Việc sử dụng 744 con bò và 31 loại kháng sinh cho thấy tính hệ thống của nghiên cứu này.

Việc ức chế biểu hiện gen kháng thuốc do liệu pháp động vật với Nano bạc AgNPs gây ra, được phát hiện trong nghiên cứu này, là con đường thứ năm để chống lại sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn bằng AgNPs. Con đường này, cùng với bốn con đường (đã được nhóm chúng tôi tiết lộ trước đây), hoạt động thông qua việc ức chế: (1) bơm đẩy, (2) sự hình thành màng sinh học và (3) sự bám dính vào tế bào và (4) sự hoạt hóa hoạt động của lysozyme , cung cấp thêm hiểu biết về nguồn gốc khả năng của liệu pháp Nano bạc AgNP trong việc chống lại sự kháng thuốc.

nguồn tham khảo: Silver nanoparticle treatment partially restores antibiotic activity by reducing the number of isolates with antibiotic-resistant genes in cows with mastitis
Claudio H. Mejia-Ruiz a, Ekaterina Nefedova b, Nikolay N. Shkil b, Carlos R. Romo-Quiñonez a, Alexey Pestryakov c, D. Garibo d e, Nina Bogdanchikova d