Nano đồng CuO chống lại bệnh thối rễ trên cây cà chua do nấm Fusarium gây ra
Kết hợp các khái niệm hóa học xanh vào công nghệ nano là một lĩnh vực trọng tâm quan trọng trong khoa học nano. Nhu cầu sản xuất hạt nano oxit kim loại xanh đã tăng lên trong những năm gần đây. Những tác dụng có lợi của việc sử dụng hạt nano trong nông nghiệp đã được xác định. Ở đây, chúng tôi nêu bật một số đặc tính kháng nấm tiềm năng của các hạt nano đồng oxit có nguồn gốc từ chiết xuất lá Zizyphus spina (CuO-Zs-NP), được sản xuất với hình cầu và kích thước hạt xác định là 13–30 nm. Ba liều lượng nano đồng oxit CuO-Zs-NP khác nhau đã được sử dụng và cho thấy hiệu quả kháng nấm đầy hứa hẹn trong ống nghiệm và trong cơ thể sống đối với chủng nấm F. solani đã chọn gây bệnh thối rễ cà chua, được xác định về mặt phân tử với số hiệu truy cập ( OP824846 ). Kết quả trong cơ thể sống chỉ ra rằng, đối với tất cả các nồng độ CuO-Zs-NP, bệnh thối rễ do Fusarium giảm đáng kể từ 72,0 đến 88,6% so với mức độ nghiêm trọng của bệnh là 80,5% ở nhóm đối chứng bị nhiễm. Mặc dù các phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học (Kocide 2000) cho thấy khả năng giảm bệnh và tỷ lệ mắc bệnh tốt hơn với các giá trị (18,33% và 6,67%) tương ứng, so với CuO-Zs-NP ở nồng độ 50 mg/l, tuy nhiên nano đồng CuO-Zs-NP ở nồng độ 250 mg/l cho thấy khả năng giảm bệnh cao nhất (9,17 ± 2,89%) và tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất (4,17 ± 3,80%). Mặt khác, CuO-Zs-NP ở các giá trị khác nhau đã nâng cao tác dụng có lợi của sức sống cây con cà chua ở giai đoạn đầu và sự phát triển sinh trưởng của cây so với phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm thương mại hoặc Trichoderma Biocide. Ngoài ra, phương pháp xử lý CuO-Zs-NP đã mang lại kết quả có lợi cho sự phát triển của cây con cà chua, với sự gia tăng đáng kể sắc tố diệp lục và hoạt động của enzym đối với phương pháp xử lý CuO-Zs-NP. Ngoài ra, việc xử lý bằng nồng độ CuO-Zs-NP thấp dẫn đến sự gia tăng số lượng hạt phấn trưởng thành so với hạt phấn non. Tuy nhiên, dữ liệu cho thấy CuO-Zs-NP có cơ chế kháng nấm độc đáo đối với F. solani , do đó chúng ngụ ý rằng CuO-Zs-NP có thể là tác nhân kiểm soát thân thiện với môi trường hữu ích đối với bệnh thối rễ do nấm Fusarium gây ra ở cây cà chua.
Giới thiệu
Cây cà chua ( Lycopersicon esculentum L.) có tầm quan trọng đáng kể như một loại cây rau, đóng góp vào sản lượng toàn cầu là 130 triệu tấn [ 71 ]. Ở Ai Cập, việc trồng cà chua bao phủ khoảng 32% tổng diện tích đất canh tác, trong đó cây cà chua chiếm khoảng 16% tổng số rau được trồng [ 20 ]. Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) báo cáo rằng Ai Cập có diện tích trồng trọt là 173,28 ha, sản lượng quả cà chua là 6,752 triệu tấn [ 24 ]. Tuy nhiên, nhiều bệnh nhiễm nấm có thể lây nhiễm vào cây cà chua từ dưới đất lên dưới dạng hạt. Những bệnh nhiễm trùng này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng cây trồng, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể [ 96 ], Hamza, Mohamed và Derbalah [ 32 ]; [ 59 , 76 ] .
Fusarium là một chi nấm đáng chú ý được tìm thấy trong đất trồng trọt, bao gồm nhiều loài gây bệnh thực vật [ 58 , 73 ]. Trong số đó, nấm sợi F. solani , thuộc phức hợp loài Fusarium solani (FSSC) [ 16 ] và Nectria haematococca là dạng hữu tính của loài này. Chúng cũng gây thối rễ ở các loại cây trồng như cà chua, dẫn đến mất năng suất nghiêm trọng [ 16 , 75 ]. Mặc dù luân canh cây trồng đã được chứng minh là một phương pháp an toàn để kiểm soát các bệnh lây truyền qua đất như Fusarium solani (Liu, Yang và Du [ 52 ]), nhưng phương pháp này thường không hiệu quả do điều kiện khí hậu và lợi ích kinh tế khác nhau. Phương pháp truyền thống là xử lý hạt giống và sử dụng thuốc diệt nấm hóa học cổ điển trên đồng ruộng đã được sử dụng để giảm và ngăn chặn một số bệnh do Fusarium [ 60 ]; Tuy nhiên, những tác động bất lợi của loại thuốc diệt nấm hóa học này đối với môi trường và sức khỏe con người đã thúc đẩy nông dân tập trung vào việc tạo ra các biện pháp quản lý nông nghiệp vô hại. Do đó, cần phải khẩn trương xác định một chiến lược khả thi và vô hại để ngăn chặn sự lây lan và phát triển của bệnh thối rễ do nấm Fusarium .
Thuốc diệt nấm đồng đã được sử dụng rộng rãi trong việc quản lý bệnh cây trồng do phổ kháng khuẩn rộng và chi phí thấp. Tuy nhiên, thuốc diệt nấm Cu dạng khối dễ bị kết tụ, dẫn đến giảm hoạt tính kháng khuẩn của chúng [ 40 ]. Một con đường khác dẫn đến ô nhiễm môi trường là sản xuất và sử dụng thuốc diệt nấm gốc đồng truyền thống, đặc biệt là ở dạng ion. Theo Keller và Lazareva [ 44 ], một tỷ lệ đáng kể đồng, khoảng 15%, được sản xuất thông qua các quy trình sản xuất được thải vào đất, có khả năng gây ô nhiễm đất nông nghiệp. Điều này đặt ra mối quan ngại quan trọng đối với an toàn thực phẩm, đặc biệt là đối với các loại cây trồng được trồng rộng rãi và tiêu thụ, chẳng hạn như cà chua. Để giải quyết vấn đề này, các báo cáo khác nhau đã chỉ ra rằng các hợp chất gốc Cu và oxit của chúng ở cấp độ nano ổn định hơn và ít có khả năng tương tác với các yếu tố hệ sinh thái hơn so với vật liệu khối của chúng, phản ánh hoạt tính kháng khuẩn được tăng cường hơn [ 95 ]. Ngoài ra, các hạt nano đồng (CuNP) đã được báo cáo là thúc đẩy sự phát triển và tích lũy chất dinh dưỡng ở một số loại cây được xử lý bằng chúng [ 46 , 66 ]. Kết quả là, các nhà nghiên cứu đang đề xuất các phương pháp tổng hợp vật liệu thân thiện với môi trường, với các phân tử sinh học được ưa chuộng hơn các tác nhân khác do đặc tính bảo vệ của chúng [ 26 ]. Quá trình sinh tổng hợp các hạt nano đồng bằng cách sử dụng chiết xuất thực vật làm tác nhân khử và đóng nắp do các đặc tính khử trong chiết xuất lá hoặc quả đã nổi lên như một nhánh quan trọng của quá trình tổng hợp hạt nano khi các phương pháp vật lý và hóa học thông thường quá tốn kém, rủi ro, tốn thời gian và công sức. Tuy nhiên, độc tính thực vật của nhiều hạt nano kim loại, bao gồm bạc, kẽm oxit, titan oxit, đồng và hạt nano sắt, trên cây cà chua đã được đánh giá trong các nghiên cứu khác nhau. Do đó, cần nghiên cứu thêm để so sánh độc tính của chúng với độc tính của các chất tương đương khối lượng lớn của chúng (Karami [ 3 , 14 , 57 , 64 , 80 ].
Nghiên cứu này phát hiện ra rằng lá dại Ziziphus spina-christi (L.) có thể tổng hợp hiệu quả các hạt nano đồng có hoạt tính sinh học mà không ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường hoặc ngân sách. Các hạt nano đồng có thể được khử và ổn định hiệu quả bằng cách sử dụng các hợp chất trong lá Z. spina -Christi. Các hợp chất này bao gồm axit gallic, axit ellagic, tannin thủy phân, anthocyanin leucon và glycoside flavanol (Cu-NP). Theo hiểu biết của chúng tôi, chưa có nghiên cứu nào so sánh tác động của việc tiếp xúc với nanocopper với vật liệu rời và thuốc diệt sinh vật gốc Trichoderma đối với cà chua trồng trong đất được thực hiện. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) phát triển các hạt nano đồng CuO thân thiện với môi trường từ chiết xuất lá Zizyphus spina ; (2) đánh giá các đặc tính kháng nấm của nano đồng CuO-Zs-NP đối với tác nhân gây bệnh thối rễ Fusarium trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà kính; và (3) Xác định khả năng di chuyển của các hạt nano gốc đồng và hậu quả tiếp xúc ngắn hạn trong môi trường đất phức tạp. Để thực hiện được điều này, cà chua đã được trồng trong 120 ngày trong đất được bổ sung ba nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau; (3) đánh giá tác động của CuO-Zs-NP lên (sự nảy mầm của hạt, chiều cao cây, trọng lượng cây (tươi, khô) và trọng lượng quả); và (4) định lượng hàm lượng sắc tố diệp lục và hoạt động của enzym (polyphenol oxidase, peroxidase, hydrogen peroxide (H 2 O 2 )) liên quan đến việc sản xuất các loài oxy phản ứng (ROS), được chọn làm mục tiêu cuối cùng để xác định tác động của việc tiếp xúc với nano-đồng. Ngoài ra, nghiên cứu này nhằm lấp đầy những khoảng trống kiến thức liên quan đến các cơ chế cơ bản tác động của CuO-Zs-NP lên vòng đời của cây cà chua, đặc biệt là liên quan đến tác động của chúng đến năng suất và độ phì nhiêu của hạt.
Vật liệu và phương pháp
Hóa chất đạt chuẩn phân tích được sử dụng mà không cần bất kỳ bước tinh chế bổ sung nào trước khi sử dụng. Đồng sunfat pentahydrat (CuSO4.5H2O , 98,0 %), dung dịch amoniac (NH4OH ) và thạch khoai tây dextrose đều được mua từ Công ty (PDA)Sigma-Aldrich. Một chủng nấm Fusarium solani ( OP824846 ) gây bệnh ban đầu được phân lập từ cây cà chua bị thối rễ, nuôi cấy trong ống nghiệm đã khử trùng và được bảo quản để nghiên cứu thêm ở 4 °C trên môi trường PDA.
Chuẩn bị chiết xuất cây Zizyphus spina Christi:
Lá cây Zizyphus spina Christi L (Zs) được hái từ Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp, vườn, Ai Cập, và được rửa nhiều lần dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn còn sót lại. Nước cất được sử dụng để rửa lá. Trong bình 250 mL, 25 g lá tươi được trộn với 100 mL nước cất, và hỗn hợp thu được được khuấy ở 70 °C trong 30 phút để tạo ra dịch chiết nước từ lá cây. Sau khi để dịch chiết nguội đến nhiệt độ phòng, dịch chiết được lọc bằng giấy lọc Whatman số 1 cho đến khi hoàn toàn trong suốt. Sau khi sử dụng trong vòng một tuần, dịch chiết được làm lạnh và sử dụng để sản xuất các hạt nano đồng.
Tổng hợp các hạt nano đồng oxit
Khoảng 10 mL chiết xuất nước 25% từ Zizyphus spina Christi được thêm dần vào 90 mL đồng sunfat 10 mM trong bình Erlenmeyer 250 ml để tổng hợp các hạt nano đồng. Trong khoảng 60 phút, hỗn hợp được khuấy liên tục ở 80 ° C trên máy khuấy từ. CuO-ZsNP cuối cùng đã được tạo ra. Điều này được thể hiện sơ bộ bằng sự xuất hiện của màu xanh lục sẫm và dung dịch CuO-Zs-NP được tạo thành được ly tâm trong 30 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút và loại bỏ phần dịch trong. Để tinh chế CuO-Zs-NP, các viên tạo ra được rửa ba lần bằng nước cất bằng cách ly tâm nhiều lần, sấy khô trong lò chân không ở 60 ° C trong 24 giờ, sau đó nung ở 300 ° C trong 1 giờ và sau đó được đưa vào phân tích đặc tính bằng một số phân tích vi mô và quang phổ.
Đặc tính của hạt nano oxit đồng
Các hạt CuO-Zs-NP thu được đã được xác nhận bằng phương pháp quang phổ UV (Thermo Spectronic, GENESYS-8, Anh, Quartz Cell, chiều dài đường truyền 10 mm). Phân bố kích thước thủy động của các hạt nano được xác định bằng Máy phân tích Zeta Sizer Nano ZS (dòng sản phẩm Malvern Zeta Sizer Nano, Anh).
Hình thái của các hạt nano được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, TECNAI 10Philips, Amsterdam, Hà Lan).
Hơn nữa, để nghiên cứu các nhóm chức năng của nano đồng CuO-ZS-NP, phổ FT-IR đã được xác định ở chế độ truyền qua (4000–400 cm -1 ) bằng máy quang phổ FT-IR BOMEM (MB 147, Canada trên đĩa KBr), một nhà cung cấp thư viện dữ liệu. Một mẫu bột khoảng 100 mg được cho vào KBr cấp phổ và ép thành đĩa dưới áp suất thủy lực.
Phân lập và định danh phân tử của Fusarium
Vào mùa hè năm 2021, cây cà chua biểu hiện các triệu chứng thối rễ do nấm Fusarium đã được thu thập. Các đoạn thân (dài 3–5 cm) biểu hiện các triệu chứng thối rễ đã được rửa kỹ bằng nước máy và sau đó khử trùng bề mặt trong hai phút bằng dung dịch clo 2%. Các mảnh nhỏ được rửa kỹ bằng nước cất hai lần vô trùng (ddH 2 O) và sau đó để khô trên giấy lọc trong điều kiện vô trùng trước khi được đặt vào môi trường PDA (Khoai tây + Dextrose + Agar) được bổ sung 300 µg/ml streptomycin sulfat. Mười bốn ngày được ủ trong tủ ấm 25 ± 2 °C với các mẫu nuôi cấy nấm. Phân tích DNA đã xác nhận vị trí phát sinh loài của nấm sau khi chúng được xác định theo các mycokey được chỉ định sau khi kiểm tra bằng kính hiển vi quang học [ 35 , 63 ]. Các loài Fusarium được phân lập đầu tiên được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 27 °C trong 14 ngày để đạt được nhận dạng phân tử. Các sợi nấm được sản xuất đã được chuẩn bị như đã mô tả trước đây [ 18 ]. Việc chiết xuất DNA nấm được thực hiện theo các bước được nêu trong khuyến nghị của bộ dụng cụ mini thực vật DNeasy (Qiagen, Hilden, Đức).
Xác định phân tử của Fusarium solani
Phân lập F. solani được xác định về mặt phân tử bằng cách sử dụng cùng hỗn hợp PCR và các điều kiện nhiệt độ được nêu để đảm bảo độ chính xác của nó [ 18 ]. Ngoài ra, các đoạn mồi ITS1 và ITS4 được sử dụng để khuếch đại và giải trình tự vùng ITS của rDNA [ 98 ]. Hai microlit DNA bộ gen (10 ng/L), một nửa microlit của mỗi cặp mồi (0,5 mM) và mười hai microlit rưỡi hỗn hợp chính (OmniPCR (MBA01-0100)) được sử dụng trong tổng thể tích là hai mươi lăm microlit [ 15 ]. Ban đầu, chương trình khuếch đại bao gồm chu kỳ biến tính trong 3 phút ở 94 ºC, sau đó là 35 chu kỳ (ở 95 °C trong 15 giây, 53 °C trong 30 giây và 72 °C trong 80 giây). Cuối cùng, bước kéo dài là 72 trong 10 phút. Sản phẩm PCR thu được được hiển thị bằng điện di trên gel agarose 2%. Sử dụng các đoạn mồi xuôi và ngược giống hệt nhau, sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự. Trình tự thực nghiệm của phân lập F. solani đã được lưu trữ trên kho lưu trữ GenBank (NCBI).
Hoạt động của CuO-Zs-NP chống lại Fusarium solani trong ống nghiệm
Các hạt nano Cu-Zs sản xuất được đã được thử nghiệm hoạt tính kháng nấm đối với F. solani bằng phương pháp pha loãng trên thạch được mô tả trong [ 59 ]. Về vấn đề này, 1 mL ở mỗi nồng độ (50, 100, 250 mg/l) hạt nano CuO-Zs được bổ sung riêng biệt vào các đĩa Petri đã khử trùng chứa 8 ml môi trường PDA đã được khử trùng và đun chảy. Hai dung dịch được trộn theo chuyển động tròn nhẹ nhàng để đồng nhất trước khi đông đặc. Thuốc diệt nấm hóa học thương mại “Kocide 2000, nồng độ 2,5 μg/mL.” và Trichoderma Biocide Trichoderma viride 1,5% WP (Một khuẩn lạc từ môi trường nuôi cấy 7 ngày tuổi được cấy vào bình Erlenmeyer 500 ml với 100 ml PDB để tạo ra số lượng CFU diệt khuẩn tối thiểu là 2 × 106 / gm) được dùng làm đối chứng để so sánh hoạt tính của nó với CuO-Zs-NP được tạo ra, trong khi các đĩa chưa xử lý được sử dụng làm đối chứng âm trong nghiên cứu này. Bình được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong tủ ấm ở 27 °C trong 7–10 ngày. Để thu được dịch nổi không có tế bào, nuôi cấy Trichoderma được ly tâm trong 15 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút và lọc. Cấy vào đĩa Petri 1 ml dịch nổi không có tế bào, sau đó thêm 8 ml môi trường). Sau đó, để đánh giá hiệu quả kháng nấm của phương pháp xử lý CuO-ZS-NP trên F. solani , một đĩa nhỏ (đường kính 0,5 cm) chứa sợi nấm đang phát triển từ rìa của một mẫu nuôi cấy nấm 8 ngày tuổi được đặt vào giữa mỗi đĩa đã chuẩn bị. Các đĩa sau đó được ủ ở 26 °C ± 2 trong 10 ngày. Sự phát triển theo hướng xuyên tâm của sợi nấm được đo trong tất cả các đĩa đã được tiêm chủng để xác định tỷ lệ ức chế bằng công thức:
Tỉ lệ ức chế % = (T-t)*100/T
trong đó ( T ) là sự phát triển theo hướng xuyên tâm của sợi nấm trên đĩa kiểm soát và ( t ) là sự phát triển theo hướng xuyên tâm của sợi nấm trong các phương pháp xử lý [ 18 ]. Tất cả các thí nghiệm trong ống nghiệm đều được tiến hành ba lần trong điều kiện vô trùng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Thử nghiệm độc tính thực vật của nano đồng CuO-Zs-NPs
Thử nghiệm nảy mầm
Hạt giống cà chua được khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 2,5%, sau đó rửa ba lần bằng nước cất đã khử trùng và phơi khô trong không khí. Để đánh giá khả năng nảy mầm, các đĩa 9 ml chứa giấy lọc đã khử trùng được bổ sung các nồng độ khác nhau của CuO-Zs-NP (50, 100 và 250 μg/mL), Kocide 2000 (một loại thuốc diệt nấm thương mại) (Certis, Columbia, MD, Hoa Kỳ) và Trichoderma Biocide đã được sử dụng trong điều kiện vô trùng theo liều khuyến cáo. Hai mươi lăm hạt giống được đặt trên bề mặt giấy lọc đã khử trùng trong mỗi đĩa (4 lần lặp lại/xử lý) bằng kẹp đã khử trùng để đảm bảo tiếp xúc với môi trường. Các đĩa được ủ trong sáu ngày ở 25 °C ± 2 trong buồng tăng trưởng với chu kỳ quang ngày: đêm là 16 giờ:8 giờ. Thí nghiệm được lặp lại hai lần bằng cách sử dụng hai mươi đĩa cho mỗi lần xử lý. Tỷ lệ nảy mầm (GP %) được tính như sau: GP (%) = tỷ lệ nảy mầm trung bình của hạt giống ở nghiệm thức xử lý/tỷ lệ nảy mầm trung bình của hạt giống ở nghiệm thức đối chứng × 100.
Thí nghiệm nhà kính
Chuẩn bị môi trường đất
Để nghiên cứu tác động của việc tiếp xúc với nano-đồng lên cây cà chua trong điều kiện vô trùng, một môi trường đất bao gồm đất cát pha thịt pha với nước khử ion đã được chuẩn bị. Đất được cải tạo bằng các nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau (50, 100 và 250 μg/mL), thuốc diệt nấm hóa học Kocide 2000 (Certis, Columbia, MD, Hoa Kỳ) và Trichoderma Biocide. Độ pH của đất là 7,9 [ 97 ]. Hỗn hợp được trộn kỹ cho đến khi đạt được độ đồng nhất và để lắng trong 24 giờ. Sau đó, bốn chậu cho mỗi lần xử lý được đổ 0,5 L hỗn hợp đất và ba hạt cà chua được trồng trong mỗi chậu. Sau đó, tất cả các chậu được chuyển sang buồng tăng trưởng được kiểm soát về môi trường trong ba tuần theo chu kỳ nhiệt độ 25/20 °C ngày/đêm, độ ẩm tương đối 65 –70% và quang kỳ 14 giờ với cường độ ánh sáng là 340 μmol m −2 s −1 .
Tác dụng của nano đồngCuO-Zs-NPs lên sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây
Hiệu quả của nano đồng CuO-Zs-NP đối với sự nảy mầm của hạt và một số thông số sinh trưởng của cây Lycopersicum esculentus L. đã được đánh giá trong điều kiện nhà kính. Về vấn đề này, mười hạt giống/bản sao của cây cà chua đầu tiên được khử trùng trong 1–2 phút trong dung dịch natri hypoclorit (0,25% w/v). Sau đó, hạt giống được rửa nhiều lần bằng dd H 2 O. Sau đó, chúng được trồng trong các túi nhựa nhỏ đã khử trùng chứa đầy rêu than bùn đã khử trùng (0,5 kg) và được xử lý riêng lẻ với ba nồng độ khác nhau (50, 100, 250 μg mL -1 ) của CuO-Zs-NP trong điều kiện nhà kính. Ngoài ra, xử lý bằng cả thuốc diệt nấm hóa học Kocide 2000 và Trichoderma Biocide cũng được sử dụng để so sánh hiệu quả của chúng đối với sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây so với xử lý CuO-Zs-NP và “đối chứng” hạt giống cà chua không được xử lý. Tất cả các phương pháp xử lý đều được đánh giá theo ba lần lặp lại (3 chậu trong mỗi lần lặp lại và 10 hạt/chậu) ở giai đoạn 3–5 lá, để nghiên cứu hiệu quả của chúng đối với sự nảy mầm của hạt, chiều cao cây con và chỉ số sức sống của cây con theo phương trình sau [ 50 ].
Chỉ số sức sống = Chiều dài cây con × Tỉ lệ nảy mầm hạt giống
Để đánh giá hiệu quả của CuO-Zs-NP chống lại bệnh thối rễ do nấm Fusarium, một hỗn dịch cấy F. solani đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng dịch khoai tây dextrose theo phương pháp của Tesso và cộng sự, [83] với một số sửa đổi. Hỗn dịch bào tử được lắc và ủ ở tốc độ 160 vòng/phút và 30 °C trong sáu ngày. Sau đó, hỗn dịch bào tử được lọc và sử dụng dung dịch đệm phosphat (PBS) vô trùng để đưa nồng độ bào tử đến giá trị mục tiêu (1 X 106 bào tử mL−1).
Thí nghiệm trong cơ thể sống
Phân tích khả năng kháng nấm của CuO-Zs-NP chống lại bệnh thối rễ do nấm Fusarium
Hiệu quả của CuO-ZsNP trong việc chống lại bệnh thối rễ do nấm Fusarium gây ra đã được đánh giá trong một thí nghiệm trong nhà kính sử dụng một dòng cà chua dễ bị nhiễm bệnh ( cv . TH99806). Ba lần lặp lại của mỗi phương pháp xử lý đã được thực hiện, với bốn đến năm cây con trong mỗi lần lặp lại, sử dụng các chậu nhựa đường kính 25 cm chứa ba kilôgam đất thịt pha cát trộn theo tỷ lệ 1:1 (v:v) và hấp tiệt trùng hai lần trong ba mươi phút ở 121 °C. Mỗi thùng chứa được nhiễm 30 mL dung dịch bào tử nấm chứa 1 X106 bào tử mL -1 một tuần trước khi cây con được cấy. Cây con cà chua sau đó được tiếp xúc với các nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau (50, 100 và 250 g mL- 1 ). Nước cất được sử dụng làm đối chứng âm, trong khi thuốc diệt nấm Trichoderma Biocide và Kocide (2,5 g/L) được sử dụng làm đối chứng dương. Sau đó, các phương pháp xử lý được lặp lại sau 30 ngày. Cứ bốn tuần, 1 g L -1 phân NPK hòa tan được bón cho cây và cây được kiểm tra liên tục để tìm các triệu chứng bệnh. Sau 45 ngày, dữ liệu sinh trưởng bao gồm chiều dài cây, trọng lượng sinh khối (tươi + khô), cũng như tỷ lệ mắc bệnh (DI) và mức độ nghiêm trọng (DS) đã được ghi lại. Sinh khối tươi (g) được xác định bằng cách loại bỏ đất thừa khỏi cây con và rễ của chúng, trong khi sinh khối khô (g) được xác định bằng cách sấy chúng trong lò chân không ở 60 ºC trong ba ngày. Mức độ nghiêm trọng của bệnh thối rễ được đánh giá theo Romberg và Davis [ 72 ], sử dụng thang điểm sau (0–4) với một số sửa đổi nhỏ. Thang đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh (Hiển thị rễ cọc màu nâu với phần đầu rễ bị thâm đen từ nhẹ đến nặng): 0 = cây khỏe mạnh không có triệu chứng (không có), 1 = dưới 20%, 2 = 20–50%, 3 = > 50–75% rễ cọc bị thâm đen (nặng) và 4 = > 75–100% lá và rễ bị nhiễm trùng, toàn bộ cây chết và khô héo.
Mức độ nghiêm trọng của bệnh được xác định bằng công thức sau:
Mức độ nghiêm trọng (%) = P × [nV/4N×100]
N là tổng số cây được kiểm tra cho mỗi nghiệm thức, P là số cây bị nhiễm bệnh, V là điểm số của chỉ số bệnh và 4 là tỷ lệ bệnh cao nhất. Ngoài ra, công thức sau được sử dụng để xác định tỷ lệ mắc bệnh (DI):
DI = Số lượng cây chết×100/Tổng số lượng cây
Cà chua được hái khi chín vào ngày thứ 80–105 sau khi cấy, lúc này có thể kiểm tra tính đồng đều và không bị hư hại của cà chua, và xác định trọng lượng quả trung bình trên mỗi cây. Vào ngày thứ 80–105 sau khi cấy, cà chua được thu hoạch ở giai đoạn chín, xác nhận rằng cà chua đồng đều và không bị hư hại, và trọng lượng quả trung bình trên mỗi cây cũng được tính toán.
Nghiên cứu sinh lý
Ước tính chiều cao cây, trọng lượng tươi và khô, trọng lượng quả và hàm lượng diệp lục
Trong tất cả các phương pháp xử lý, các thông số tăng trưởng và tác động sinh lý của CuO-Zs-NP lên chiều cao cây cà chua, trọng lượng khô tươi, trọng lượng quả và mức độ của một số sắc tố quang hợp (diệp lục a, b và tổng hàm lượng diệp lục) cũng được đánh giá. Để ước tính diệp lục, khoảng 100 mg mô lá từ mỗi bộ phương pháp xử lý, bao gồm cả đối chứng được xử lý giả, được cân và chiết bằng 80% axeton trong nước (v/v) cho đến khi diệp lục được giải phóng hoàn toàn vào dung dịch. Sau đó, các huyền phù được lọc và độ hấp thụ ở bước sóng 644 và 663 nm được đo. Nồng độ sắc tố quang hợp được đánh giá dựa trên Venkatachalam et al. [ 88 ]. Sử dụng các phương trình do Lichtenthaler công bố [ 51 ], diệp lục a, b và tổng diệp lục đã được xác định và biểu thị dưới dạng mg/g-1 FW. Diệp lục a = 12,25 × A663 − 2,79 × A645 diệp lục b = 21,50 × A645 − 5,10 × A663.
Ước tính hoạt động của enzyme
Ước tính polyphenol oxidase (PPO)
Để đo hoạt tính PPO, chúng tôi đã sử dụng một kỹ thuật ban đầu được phát triển bởi Kar và Mishra [ 39 ] với một số sửa đổi. Chúng tôi ly tâm 1 g mô lá ở tốc độ 10.000 × g trong 25 phút ở 4 °C sau khi đồng nhất nó trong 2 mL dung dịch đệm natri phosphat 0,1 M (pH 6,5). Chiết xuất enzyme được chuẩn bị từ phần dịch nổi. 3 mL hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,1 mM pyrogallol, dung dịch đệm phosphat 25 mM (pH 6,8) và 0,1 mL chiết xuất enzyme. Hỗn hợp phản ứng được giữ nguyên không có pyrogallol để hiệu chuẩn. Độ hấp thụ ở 420 nm được ghi lại cho mỗi mẫu.
Hoạt động peroxidase (POD)
Phương pháp do Gong và cộng sự [ 29 ] trình bày đã được sử dụng để ước tính mẫu được cung cấp. Các bước đầu tiên bao gồm nghiền 1 g mô lá trong 5 ml dung dịch đệm phosphat 0,05 M (pH 7,0) chứa 10% polyvinylpyrrolidone (PVP-SIGMA) và 0,1 M ethylene di-amine-tetra-acetic acid (EDTA-SIGMA). Để sử dụng phần dịch nổi cho thử nghiệm POD, hỗn hợp thu được được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 °C. Phương pháp của Vetter và cộng sự [ 89 ] đã được sử dụng để đo hoạt động POD, với một số điều chỉnh được thực hiện bởi Gorin và Heidema [ 30 ]. Dung dịch đệm 2-morpholino-ethane-sulfonic acid (MES) 0,1 mM, hydrogen peroxide (H2O2) 0,05% , phenylenediamine 0,10% và 0,10 ml (mL) chiết xuất enzyme được sử dụng trong hỗn hợp thử nghiệm (pH 5,5). Sự thay đổi độ hấp thụ của mỗi mẫu ở bước sóng 485 nm được ghi lại trong 3 phút .
Tỷ lệ thu gom hydro peroxit (H2O2 )
Tỷ lệ phần trăm loại bỏ hydrogen peroxide được xác định từ dung dịch chiết xuất lá methanol ở nồng độ 1mg/10 ml và đo ở bước sóng 230nm theo giao thức của Eswaran và cộng sự [ 21 ]. Về vấn đề này, 1ml dung dịch chiết xuất được trộn nhẹ với 0,6ml (40mM) H2O2 được pha trong đệm phosphat (pH 7,4). Thể tích hoàn chỉnh cuối cùng là 3 ml, sau đó ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu trắng bao gồm đệm phosphat không có H 2 O 2 được sử dụng trong thí nghiệm này. Tỷ lệ phần trăm loại bỏ H2O2 trong các mẫu thực vật được tính theo chỉ định của Eswaran và cộng sự [ 21 ], theo phương trình:
Tỉ lệ hấp thu H2O2 = (A0-A1)×100/A0
trong đó, A0 là độ hấp thụ của mẫu đối chứng và A1 là độ hấp thụ của mẫu đã xử lý.
Xác định hàm lượng Cu trong mô ngọn của cây cà chua
Nồng độ Cu nguyên tố được xác định, như mô tả của Hernández-Hernández et al. [ 34 ]. Đầu tiên, các mô chóp đầu của quả cà chua được thu hoạch khi trưởng thành (120 ngày) và rửa sạch đúng cách để loại bỏ đất và các hạt bụi, sau đó rửa kỹ bằng nước cất và sấy khô trong không khí. Các mô khô được sấy khô trong lò ở 50 ° C trong 72 giờ và nghiền nhẹ thành bột mịn. Quá trình phân hủy 0,2 g vật liệu khô để phân tích hàm lượng Cu được thực hiện bằng cách thêm 30 ml HNO 3 đậm đặc vào cốc thủy tinh 100 ml. Cốc thủy tinh được đậy bằng kính đồng hồ và đun nóng trên vỉ nướng trong khoảng bốn giờ cho đến khi chất hữu cơ phân hủy hoàn toàn. Thể tích HNO 3 được điều chỉnh định kỳ để tránh mẫu bị khô. Khi thu được dung dịch trong suốt không có cặn, dung dịch được làm nguội và lọc bằng giấy lọc Whatman số 42. Dịch lọc thu được được pha loãng với nước khử ion đến thể tích cuối cùng là 50 ml trong bình định mức. Sau đó, pha loãng theo tỷ lệ 1: 10 được chuẩn bị và phân tích để xác định hàm lượng Cu tổng thể bằng máy quang phổ phát xạ nguyên tử plasma cảm ứng (ICP, model ThermoJarrell Ash 7400).
Tác dụng của xử lý Cu lên hạt phấn hoa
Để phân tích hạt phấn, một số mẫu nụ hoa đã được thu thập từ tất cả các cây cà chua đã xử lý và chưa xử lý. Về vấn đề này, các nụ hoa có kích thước đáng tin cậy đã được chọn ngẫu nhiên và cố định trong dung dịch cố định Carnoy mới pha (hỗn hợp cồn etylic, cloroform và axit axetic băng theo tỷ lệ thể tích 6:3:1). Sau đó, bao phấn được nhuộm bằng dung dịch nhuộm aceto carmine 1%. Độ phì nhiêu của phấn hoa được đánh giá bằng các thử nghiệm khả năng nhuộm.
Việc nhuộm hạt phấn hoa được sử dụng như một phương pháp thay thế cho khả năng sinh sản; phấn hoa không nhuộm hoặc bị nghiền nát được coi là vô trùng; và hạt phấn hoa vỡ cũng được tính vào số lượng [ 19 , 33 ].
Kích thước của hạt phấn hoa lớn hơn 1,5 lần so với đường kính phấn hoa thông thường (n) được coi là phấn hoa chưa được khử (2n). Các hạt phấn hoa mới nhìn thấy với các đặc điểm rõ ràng cuối cùng đã được chụp ảnh bằng hệ thống thị kính kính hiển vi hình ảnh kỹ thuật số HiROCAM (Máy ảnh quang học độ phân giải cao) [ 47 ].
Phân tích thống kê
Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) đã được thực hiện trên dữ liệu thu thập được [ 7 ]. Sử dụng phần mềm SPSS phiên bản 22.0, các giá trị trung bình được so sánh bằng phép kiểm định Chênh lệch ít có ý nghĩa nhất (LSD) (P < 0,05). Dữ liệu hiển thị ở đây là giá trị trung bình của ba bộ kết quả từ mỗi thí nghiệm, được lặp lại ba lần (SD). Khả năng trực quan hóa dữ liệu được cung cấp khi sử dụng MINITAB V.14 với R-studio V.4.1.3. Phần mềm GraphPad Prism 9 cũng được sử dụng để tạo và chỉnh sửa biểu đồ. Kích thước hạt được đo bằng Image J (phiên bản 1.53f) và Origin 2018 được sử dụng để tạo biểu đồ phân bố kích thước hạt.
Kết quả và thảo luận
Tổng hợp xanh CuO-Zs-NPs
Để tạo thành CuO-Zs-NP, dung dịch 90 mL đồng sunfat được trộn với 10 mL chiết xuất lá Zizyphus spina theo tỷ lệ 9:1 (v/v) và khuấy liên tục trong 60 phút ở 80 °C. Màu của dung dịch chuyển từ xanh lam sang xanh lục đậm trong quá trình phản ứng, cho thấy sự hình thành CuONP. Điều này đã được xác nhận bằng phương pháp quang phổ UV-vis, cho thấy phổ điện tử do hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) gây ra [ 2 , 5 , 12 , 28 ]. Các nghiên cứu trước đây cũng đã báo cáo vai trò chức năng của tannin, saponin, phenol và ancaloit có trong chiết xuất nước Zizyphus spina được sử dụng làm chất phủ và chất ổn định để tổng hợp xanh CuO-Zs-NP và khả năng tham gia của chúng trong việc khử Cu + thành Cu0 [ 1 , 45 , 68 , 93 ]. Cơ chế tổng hợp được minh họa trong Hình 1 .
Hình 1 Sơ đồ biểu diễn cho thấy cơ chế có thể tổng hợp CuO-Zs-NPs
Đặc tính của các hạt nano oxit đồng tổng hợp sinh học (CuO-Zs-NPs)
Sự hấp thụ tia UV của CuO-NP
Bằng cách phân tích phổ UV-vis, một đỉnh hấp thụ mạnh nằm ở khoảng 290 nm đã được quan sát thấy, biểu thị sự tổng hợp thành công các hạt nano CuO (NP) (Hình 2 A). Vị trí và chiều rộng của đỉnh liên quan đến kích thước trung bình và phân bố kích thước của các hạt nano. Đỉnh này được cho là do sự chuyển đổi liên dải của các electron lõi trong đồng và sự khác biệt về khoảng cách dải liên quan đến các hiệu ứng kích thước lượng tử, phù hợp với sự hình thành của nhiều hạt nano CuO khác nhau [ 27 ]. Hơn nữa, đỉnh hấp thụ của các hạt nano CuO bị kích thích được ghi nhận ở 290 nm ở nhiệt độ 23 °C, cho thấy sự phân bố kích thước phân tán đơn trong hỗn hợp [ 69 ]. Những kết quả này tương thích với những kết quả được báo cáo bởi Jing và cộng sự (2019), chứng minh sự hình thành các hạt nano CuO ổn định [ 62 ].
Hình 2 Đặc tính của CuO-Zs-NPs sản xuất: A : Phân tích quang phổ UV-vis của CuO-Zs-NPs sản xuất và chiết xuất thực vật, B : Phân tích phân bố kích thước CuO-Zs-NPs và C : Hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của CuO-Zs-NPs đã hình thành
Hình thái và phân bố kích thước của nano đồng CuO-NP
Hình thái và phân bố kích thước của các hạt nano đồng CuO-Zs-NPs (NPs) được tổng hợp thông qua con đường sinh tổng hợp đã được kiểm tra bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), một kỹ thuật đặc trưng quan trọng để có được các phép đo định lượng về kích thước hạt, phân bố kích thước, hình dạng và vân mạng. Ảnh TEM cho thấy sự xuất hiện của các hạt nano đồng CuO-Zs-NP hình cầu với phạm vi kích thước hạt từ 13,4 − 30,9 nm (Hình 2 C). Các phép đo phân bố kích thước bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động được phát hiện là phù hợp với phân tích TEM, mang lại kích thước hạt trung bình ở mức 34,1 ± 4,379 nm (Hình 2 B). Tuy nhiên, những thay đổi nhỏ trong hai phép đo có thể là do nhiều biến số. Tán xạ ánh sáng động (phân tích phân bố) nghiên cứu đường kính hạt thủy động trong dung dịch, dựa trên chuyển động Brown của các hạt trong dung môi. Hơn nữa, nhiệt độ, độ nhớt và hệ số khuếch tán tịnh tiến của hạt đều ảnh hưởng đến đường kính thủy động trong dung môi. Đường kính thủy động lực học cũng tính đến tất cả kích thước phân tử và lớp hydrat hóa của phân tử nước.
Phân tích FT-IR
Để nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học thực vật của chiết xuất lá cây đinh lăng và các nhóm chức hóa học tiềm năng của chúng, chịu trách nhiệm khử và ổn định hạt nano đồng CuO-Zs, phân tích FT-IR cũng được thực hiện trên các hạt nano CuO sản xuất được để xác định cấu trúc hóa học của chúng. Như được mô tả trong Hình 3 , phổ FT-IR cho thấy các dải hấp thụ của chiết xuất lá cây đinh lăng tập trung tại 3448,99, 2063,66, 1635,32, 1559,35, 1417,91, 1035,30, 867,98, 701,67, 676,9, 647,76 và 470,7 cm -1 (Hình 3 A). Dải hấp thụ rộng tại 3448,99 cm -1 có thể là do dao động kéo giãn của (–OH), trong khi đỉnh tại 2063,66 là do alen (C = C), và 1635,32 cm -1 có thể là do nhóm amin orenone. Trong khi đỉnh tại 1559,35 là do sự kéo giãn C = C của vòng thơm, trong các amid bậc ba, flavonoid, terpenoid, tanin và saponin. Ngoài ra, đỉnh tại 1417 cm -1 có thể là do sự kéo giãn CN trong imin hoặc oxim, hoặc sự kéo giãn CN trong các amin mạch thẳng và 1035,30 có liên quan đến sự kéo giãn CO trong ancol, phenol, ete hoặc este cũng có thể là do sự kéo giãn CN trong các amin thơm.
Hình 3 Phân tích phổ FT-IR của chiết xuất lá cây đinh lăng ( A ) và CuO-Zs-NP được hình thành ( B )
Trong Hình 3B , các dải hấp thụ FT-IR của nano đồng CuO-Zs-NP tập trung tại các vị trí 3188,67, 2345,33, 2153, 2093, 1959, 1613, 1414, 1063, 605 và 453 cm -1 (Hình 3B ). Dải hấp thụ rộng tại 3188,67 cm -1 có thể là do dao động kéo giãn của (–OH), trong khi đỉnh tại 2345,33 là do Carbon dioxide (O = C = O) và 2153 cm -1 có thể là do sự hiện diện của các hợp chất gốc Si. Đỉnh tại 1613 là do sự uốn cong N–H trong các amid bậc một, chẳng hạn như amino acid, và sự kéo giãn C = C trong các amid bậc ba—flavonoid, terpenoid, tanin và saponin. Ngoài ra, đỉnh ở 1414 cm -1 có thể là do sự kéo dài C = N trong imin hoặc oxim, hoặc sự kéo dài CN trong amin mạch thẳng, và 1063 có thể liên quan đến sự kéo dài CO trong ancol, phenol, ete hoặc este cũng có thể là do sự kéo dài CN trong amin thơm. Trong khi đỉnh ở 605 và 453 chỉ ra sự hình thành liên kết O, những dữ liệu này được cho là của [ 37 ].
Xác định phân tử của Fusarium solani
Việc xác định phân tử tác nhân gây bệnh thối rễ cà chua đã được thực hiện bằng cách sử dụng vùng đệm phiên mã nội bộ (ITS) của DNA ribosome. Trình tự ITS của chủng nấm phân lập cho thấy sự tương đồng 100% với trình tự của chủng F. solani với số hiệu truy cập ( MW216959.1 ) có sẵn trên cơ sở dữ liệu GenBank. Vùng ITS đã xác định của chủng F. solani sau đó được gán vào cơ sở dữ liệu GenBank với số hiệu truy cập ( OP824846 ).
Hiệu quả hoạt động kháng nấm trong ống nghiệm của CuO-Zs-NPs
Hoạt tính kháng nấm của nano đồng CuO-Zs-NP đã được thử nghiệm ở nhiều nồng độ khác nhau (50, 100 và 250 μg/mL), được gọi tương ứng trong bản thảo là (CuO50, CuO100 và CuO250), so sánh với tiền chất đồng dạng khối “Kocide 2000” là thuốc diệt nấm hóa học và TricodermaBiocide về khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm trên F. solani phân lập được trong ống nghiệm. Hoạt tính kháng nấm của nano đồng CuO-Zs-NP tăng theo nồng độ tăng (Hình 4 ). Cụ thể, mức độ ức chế tăng trưởng cao nhất đạt được ở nồng độ 250 mg/l đối với CuO-Zs-NP. Với giá trị đáng kể là 91,17 ± 1,28, so với Kocide 2000 là thuốc diệt nấm hóa học và Trichoderma Biocide ( Trichoderma viride 1,5% WP) cho thấy các giá trị là 88,20 ± 3,57 và 77,09 ± 5,88% sau mười ngày ủ (Bảng 1 ; Hình 4 ). Điều thú vị là, phân tích thống kê chỉ ra rằng khi kiểm tra tác dụng chống nấm của ba nồng độ CuO-Zs-NP đã thử nghiệm, nồng độ NP là một yếu tố đáng kể. Hơn nữa, điều này phù hợp với một số nghiên cứu cho thấy CuO-NP thể hiện nhiều chế độ hoạt động ức chế chống lại các mầm bệnh vi khuẩn [ 31 ]. Ngoài ra, Lopez-Lima et al. [ 53 ] đã thử nghiệm Cu-NP ở các liều lượng khác nhau về hoạt động chống nấm trong ống nghiệm đối với Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL). Ngoài ra, CuO-NP 0,5 mg/mL ức chế sự phát triển của FOL sợi nấm lên đến 67,3%, so với 15,6% của thuốc diệt nấm thương mại gốc đồng hydroxit, giúp chúng có lợi đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh tấn công cây trồng. Hơn nữa, điều này sẽ giúp giảm đáng kể nguy cơ tiếp xúc với thuốc diệt nấm hóa học nguy hiểm. Hơn nữa, điều này sẽ góp phần đáng kể vào việc giảm thiểu tác động nguy hiểm của thuốc diệt nấm hóa học độc hại, đặc biệt là đối với cây trồng ăn được và rau tươi như cà chua [ 17 , 41 ]. Nhìn chung, những phát hiện của chúng tôi ủng hộ việc CuO-Zs-NP được coi là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho thuốc diệt nấm truyền thống trong bảo vệ cây trồng.
Hình 4 Hoạt động kháng nấm của nano đồng CuO-Zs-NP ở các nồng độ khác nhau cũng như thuốc diệt nấm thương mại (Kocide 2000) và thuốc diệt nấm Trichoderma đối với Fusarium solani trên môi trường PDA A : Hoạt động ức chế của nano đồng CuO-Zs-NP đối với sự phát triển của sợi nấm F. solani trên môi trường PDA so với thuốc diệt nấm Trichoderma và thuốc diệt nấm hóa học, B : Trên đường kính khuẩn lạc (cm) C: Trên tỷ lệ phần trăm ức chế tăng trưởng (%)
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ CuO-Zs-NPs khác nhau (50, 100, 250) mg/l, thuốc diệt nấm hóa học và thuốc diệt nấm Trichoderma đến sự phát triển của sợi nấm và tỷ lệ ức chế tăng trưởng (%) của F. solani
Thử nghiệm độc tính thực vật
Tác động của CuO-Zs-NP đến sự nảy mầm của hạt cà chua
Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của CuO-Zs-NP và chất tương tự (thuốc diệt nấm) so với thuốc diệt nấm Trichoderma lên sự nảy mầm của hạt và chiều dài cây con của hạt cà chua đã được đánh giá in vitro. Tỷ lệ nảy mầm và chỉ số nảy mầm của hạt cà chua được xử lý bằng CuO-Zs-NP 50, 100 và 250 µg/ml so với hạt đối chứng không xử lý được thể hiện trong Hình 5 .
Hình 5 Ảnh hưởng của CuO-Zs-NPs 50, CuO-Zs-NPs 100 và CuO-Zs-NPs 250, thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma lên A tỷ lệ nảy mầm hạt, B chiều cao cây con, C chiều dài rễ và D chỉ số sức sống cây con của cây cà chua
Dữ liệu trình bày trong Hình 5 cho thấy tất cả các phương pháp xử lý CuO-Zs-NP đều có tác động cảm ứng đáng kể đến sự nảy mầm của hạt giống, dao động từ 97,02 ± 1,53–98,67 ± 1,53 in so với hạt giống đối chứng chưa xử lý cho giá trị ” 97,07 ± 1,54. Mặc dù các phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học và Trichoderma Biocide cho giá trị cảm ứng cao hơn (lần lượt là 98,33 ± 0,00, 98,0 ± 1,15) đối với sự nảy mầm của hạt giống cà chua, nhưng CuO-Zs-NP ở mức 250 mg/l cho thấy tác động cảm ứng cao nhất đến sự nảy mầm của hạt giống so với các phương pháp xử lý khác. Kết quả cũng chỉ ra rằng việc bổ sung CuO-Zs-NP, đặc biệt là ở mức 100 và 250 μg/mL, không ảnh hưởng tiêu cực đến số lượng hạt nảy mầm so với các hạt giống khối lượng lớn. Mặc dù phương pháp xử lý bằng Trichoderma Biocide cho thấy hiệu quả tốt hơn đối với sự nảy mầm của hạt giống so với phương pháp xử lý bằng CuO-Zs-NP ở mức 50 μg/ml.
Ảnh hưởng của xử lý CuO-Zs-NPs đến sự nảy mầm và sức sống sinh trưởng của hạt giống
Ở giai đoạn 3–5 lá, tác dụng của CuO-Zs-NP ở nồng độ (50, 100 và 250) mg/l lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua trong môi trường đất cũng được đánh giá và so sánh riêng lẻ với cách xử lý tương ứng của chúng (thuốc diệt nấm hóa học thương mại Kocide 2000) và Trichoderma Biocide (Hình 5 A). Kết quả cho thấy tất cả các cách xử lý đều không có tác dụng kích thích đáng kể đến sự nảy mầm của hạt so với đối chứng không xử lý. Mặt khác, kết quả cũng chỉ ra rằng việc bổ sung CuO-Zs-NP, đặc biệt ở mức 100 và 50 μg/mL, không ảnh hưởng tiêu cực đến số lượng hạt nảy mầm so với các chất tương ứng dạng khối. Tương tự như vậy, tác dụng cảm ứng độc đáo của CuO-Zs-NP, đặc biệt ở mức 100 mg/l, cũng được nhận thấy ở các thông số sinh trưởng khác của cà chua như chiều cao cây con, sinh trưởng rễ cà chua và chỉ số sức sống (Hình 5 (BD) và 6 ). Tác động đáng kể, phụ thuộc vào liều lượng đến chiều cao cây con, chiều dài rễ và Chỉ số sức sống cây con đã được quan sát thấy trong tất cả các phương pháp xử lý bằng CuO-Zs-NP so với phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm Trichoderma hoặc thuốc diệt nấm kocide (Hình 5 B–D). Điều thú vị hơn là các phương pháp xử lý bằng CuO-Zs-NP cho thấy tác dụng cảm ứng nhiều hơn đến chiều dài rễ và sự phát triển của cây con, trái ngược với phương pháp xử lý khối lượng lớn cho thấy tác dụng bất lợi đáng chú ý (Hình 5 ). Những dữ liệu này đã được xác nhận bởi Pradhan et al. [ 66 ] đã thử nghiệm Cu-NP trên đậu xanh và thấy rằng Cu-NP kích thích sự phát triển của cây tốt hơn đồng sunfat. Ngược lại, Bakshi và Kumar [ 8 ] đã đánh giá tác dụng của Cu-NP đối với cây kinh giới và báo cáo rằng tác dụng tiêu cực hoặc tích cực của các hạt nano phụ thuộc vào loại cây, nồng độ hạt nano và trạng thái oxy hóa của Cu (Hình 6 ).
Hình 6 Tác dụng của CuO-Zs-NPs 50, CuO-Zs-NPs 100 và CuO-Zs-NPs 250, thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma đối với sự phát triển của cây giống cà chua
Hiệu quả của CuO-Zs-NP chống lại bệnh thối rễ do nấm Fusarium gây ra trên cây cà chua
Hoạt tính kháng nấm của CuO-Zs-NP ở ba nồng độ khác nhau (Cu50, Cu100, Cu250) đã được nghiên cứu sâu hơn trong thí nghiệm in vivo nhằm xác định hiệu quả của phương pháp xử lý trong việc kiểm soát bệnh thối rễ do nấm Fusarium gây ra trên cây cà chua (Hình 7 ). Mức độ nghiêm trọng của bệnh được ghi nhận trong 90 ngày sau khi tiêm chủng (dpi) trên tất cả các cây cà chua đã xử lý. Để so sánh, thí nghiệm bao gồm các cây được xử lý bằng thuốc diệt nấm đồng Kocide 2000 và thuốc diệt nấm sinh học Trichoderma làm đối chứng hóa học và sinh học thương mại.
Hình 7 Tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh thối rễ do nấm Fusarium trên cây cà chua bị nhiễm bệnh sau khi xử lý bằng CuO-Zs-NP ở nồng độ (50, 100, 250) mg/L, thuốc diệt nấm hóa học và thuốc diệt nấm sinh học Trichoderma so với đối chứng dương tính và âm tính
Chỉ sau 15 ngày sau khi tiêm chủng, các dấu hiệu bệnh ở cây cà chua được xử lý giả đã xuất hiện rõ ràng và cây bị suy yếu rõ rệt; ngược lại, các triệu chứng bệnh ở cây cà chua được xử lý rất ít và bị trì hoãn rất nhiều. Các biện pháp xử lý đối chứng trên cây cà chua bằng thuốc diệt nấm hóa học tương đương, Kocide 2000 hoặc Trichoderma Biocide cũng làm chậm và giảm các triệu chứng bệnh, nhưng ở mức độ thấp hơn so với CuO-Zs-NP. Giảm đáng kể bệnh thối rễ do nấm Fusarium đã được ghi nhận ở tất cả các nồng độ CuO-Zs-NP so với đối chứng chỉ được xử lý bằng tác nhân gây bệnh (đối chứng bị nhiễm bệnh) (80,5%). Không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy về tỷ lệ phần trăm mức độ nghiêm trọng của bệnh ở những cây tiếp xúc với 50 hoặc 100 mg/l CuO-Zs-NP. Mặc dù các phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học (thuốc diệt nấm Kocide) đều cho thấy khả năng giảm bệnh và tỷ lệ mắc bệnh tốt hơn với giá trị lần lượt là 18,33% và 6,67% so với CuO-Zs-NP ở nồng độ 50 mg/l, tuy nhiên, CuO-Zs-NP ở liều 250 mg/l đạt được khả năng giảm bệnh cao nhất (9,17 ± 2,89%) và tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất (4,17 ± 3,80%).
Các thông số sinh lý và tăng trưởng
Tác động đến chiều cao, trọng lượng và hàm lượng diệp lục của cây
Ba tháng sau khi gieo hạt, tác dụng của CuO-Zs-NP đối với cây con cà chua đã được kiểm tra về chiều dài cây, trọng lượng tươi và khô, và trọng lượng của quả thu được (Hình 8 ). Kết quả cho thấy tất cả CuO-Zs-NP đều có tác dụng thúc đẩy chiều cao cây và trọng lượng cà chua (tươi, khô, quả). Về vấn đề này, CuO-Zs-NP ở nồng độ (50, 100 và 250) mg/l cho thấy tác dụng cảm ứng lên chiều cao cây cà chua với các giá trị lần lượt là 57,67 ± 12,5, 62,33 ± 7,37 và 65,33 ± 12,32, so với 54,67 ± 3,05, 55,67 ± 3,51 và 37 ± 2,65 khi xử lý bằng thuốc diệt nấm Kocide 2000, thuốc diệt nấm Trichoderma và đối chứng âm tính (Hình 9 ). Tương tự như vậy, tác dụng cảm ứng độc đáo của CuO-Zs-NP, đặc biệt là ở nồng độ 250 mg/l, cũng được ghi nhận trong dữ liệu được báo cáo về trọng lượng tươi, trọng lượng khô và trọng lượng quả cà chua. Nhìn chung, dữ liệu của chúng tôi chỉ ra hiệu quả của Cu-Zs-NP trong việc giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh và tăng tất cả các thông số tăng trưởng và sản xuất, điều này đã được Hernández-Hernández và cộng sự xác nhận [ 34 ]. Ngoài ra, sự gia tăng trọng lượng khô có thể là kết quả của việc NP thúc đẩy hoạt động của hệ thống quang hợp I, II (PSI và PSII), cùng với trạng thái oxy hóa khử của plastoquinone trong chuỗi vận chuyển điện tử [ 79 ].
Hình 8 Tác động của nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau (50, 100, 250 mg/L), thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma lên trọng lượng tươi A , trọng lượng khô B , chiều cao cây C và trọng lượng quả D của cây cà chua bị nhiễm F. solani
Hình 9 Ảnh hưởng của nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau (50, 100, 250 mg/L), thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma trên cây cà chua trồng trong chậu thí nghiệm xử lý bằng F. solani so với nhóm đối chứng
Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ CuO-Zs-NP khác nhau lên nồng độ và thành phần diệp lục trong lá cây cà chua. Nồng độ diệp lục tổng số ở nghiệm thức đối chứng lá cây cà chua là 0,36 ± 0,014 mg/g trọng lượng tươi, trong khi ở nghiệm thức CuO-Zs-NP (lần lượt là 250,100 và 50) là 0,68, 0,61 và 0,57. Tuy nhiên, thành phần của chl khác biệt đáng kể, thể hiện qua sự giảm tỷ lệ chl a/b ở nghiệm thức CuO-Zs-NP 250 (0,56), tỷ lệ này tăng lên khi giảm nồng độ CuO-Zs-NP so với nghiệm thức đối chứng âm (0,60) (Hình 10 ). Trong khi tỷ lệ chl a/b tăng ở cả phương pháp xử lý sinh học và phương pháp xử lý thuốc diệt nấm Cu lên lần lượt là 0,66 và 0,67, và cả phương pháp đối chứng và CuO-Zs-NPs 50 đều có giá trị cha/chb tương tự nhau.
Hình 10 Ảnh hưởng của nồng độ CuO-Zs-NPs khác nhau (50, 100, 250 mg/L), thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma lên Diệp lục a, b, tổng diệp lục và tỷ lệ Chl a/b của cây cà chua được xử lý bằng F. solani
Hoạt động quang hợp tăng cường được quan sát thấy ở thực vật tiếp xúc với các hạt nano (NP) có thể là do sự điều hòa tăng của các gen liên quan đến quá trình quang hợp, chẳng hạn như psaA (quang hợp, I P700chlorophyll apoprotein A1), pet A (quang hợp chuyển điện tử A), HSP90.1 (protein chặn nhiệt 1) và psbA (quang hợp, II protein trung tâm phản ứng A) [ 84 ]. Ngoài ra, NP có thể tạo thành phức hợp với các protein phức hợp thu hoạch ánh sáng (LHC) trong râu của quang hợp, do đó cải thiện khả năng hấp thụ ánh sáng [ 85 ]. Hơn nữa, NP có thể tăng cường đồng hóa CO 2 bằng cách tăng cường hoạt động của beta-carbonic anhydrase (BCA) và các enzyme Rubisco trong các phản ứng không phụ thuộc vào ánh sáng [ 42 , 43 ]. Việc thúc đẩy hoạt động quang hợp của NP cũng chịu trách nhiệm cho việc tăng sinh khối tươi và khô của cây cà chua so với thuốc diệt nấm hóa học hoặc thuốc diệt nấm Trichoderma. Hiệu ứng này là do NP làm tăng khả năng hấp thụ ánh sáng, tăng tốc quá trình vận chuyển năng lượng giữa các hệ thống quang hợp, thúc đẩy quá trình quang phân nước và tạo điều kiện cho quá trình giải phóng oxy [ 43 ]. Hơn nữa, kết quả cho thấy hàm lượng diệp lục a (ch-a), b (ch-b) và tổng diệp lục tăng đáng kể ở cây cà chua được xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP so với các phương pháp xử lý khác. Nồng độ nano đồng CuO-Zs-NP có tác động đáng kể đến hàm lượng diệp lục (Hình 10 ), với CuO100 và 250 gây ra sự gia tăng khoảng 50% diệp lục a và khoảng 40% diệp lục b so với đối chứng. Tương tự, nano đồng CuO50 cũng dẫn đến sự gia tăng vừa phải diệp lục a và b, mặc dù với lượng tương đối nhỏ hơn. Tất cả các phương pháp xử lý đều cho thấy hàm lượng diệp lục b tăng, nhưng cây cà chua được xử lý bằng CuO50, CuO100 hoặc CuO250 cho thấy sự gia tăng đáng kể so với cây được xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học Kocide 2000, thuốc diệt sinh vật hoặc các mẫu đối chứng chưa xử lý. Tác dụng kích thích của CuO-Zs-NP lên quá trình sản xuất các sắc tố này có thể là do khả năng tăng cường dinh dưỡng cho cây trồng bằng cách thúc đẩy quá trình hấp thụ nitơ. Quá trình này có thể làm tăng đáng kể nồng độ chất dinh dưỡng trong cây, dẫn đến cải thiện sinh trưởng và tăng nồng độ hợp chất phenolic, giúp tăng cường sản xuất sắc tố [ 82 ]. Ngoài ra, giai đoạn thứ hai của kỹ thuật kích thích sinh học đối với hạt nano CuO liên quan đến quá trình chuyển đổi sinh học vật liệu lõi thành các ion bên trong tế bào chất. Cụ thể, quá trình này chuyển đổi các hạt nano CuO thành các ion Cu. Quá trình chuyển đổi này có thể liên quan đến sự gia tăng nồng độ diệp lục, điều này cho thấy các ion có thể tham gia vào việc thúc đẩy sinh trưởng và quang hợp của cây trồng. Nhìn chung, giai đoạn kích thích sinh học thứ hai này dường như là một bước quan trọng trong việc tăng cường hiệu quả của các hạt nano CuO cho các ứng dụng nông nghiệp [82].38 ]. Sự gia tăng nồng độ diệp lục a và b có thể được giải thích bởi thực tế là các phương pháp xử lý bao gồm liều lượng khác nhau của CuO50, CuO100 và CuO250 đã kích thích sự phát triển rễ mạnh mẽ. Các phương pháp xử lý có thể cải thiện sức sống của rễ như ở ngô, cho phép cây trồng hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường sinh trưởng [ 55 ]. Ngoài việc cải thiện khả năng hấp thụ ánh sáng của cây trồng thông qua hệ thống quang hợp, việc tăng nồng độ diệp lục được cho là một phản ứng tự nhiên với các kích thích từ môi trường [ 65 ].
Tỷ lệ diệp lục a/b thường được dùng làm tiêu chí để ước tính phản ứng của cây trồng đối với các căng thẳng về môi trường [ 78 ]. Một số căng thẳng có thể khiến diệp lục a chuyển đổi thành b thông qua enzyme Chl-a oxygenase [ 13 ]. Sự giảm tỷ lệ Chla/Chlb được quan sát thấy trong nghiên cứu này có thể là do nano đồng CuO-Zs-NP thúc đẩy hoạt động của enzyme này [ 94 ]. Điều này dẫn đến sự gia tăng nồng độ Chlb và giảm tỷ lệ, cho thấy nồng độ PSII cao hơn so với PSI. Phát hiện này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu trước đây cho thấy Chlb có nhiều trong PSII [ 11 , 81 ]. Mức PSII tăng trong lá cho thấy hiệu quả hấp thụ năng lượng mặt trời cao hơn. Chl-b cũng đóng vai trò quan trọng trong việc sắp xếp màng thylakoid và điều chỉnh LHC [ 90 ]. Những kết quả này xác nhận các mô tả trước đó về sự gia tăng vật chất khô của cây và hiệu quả quang hợp.
Tóm lại, CuO-Zs-NP đã được chứng minh là thúc đẩy sự phát triển rễ mạnh mẽ và tăng nồng độ diệp lục ở cây cà chua. Sự giảm tỷ lệ Chla/Chlb được quan sát thấy có thể là do hoạt động tăng lên của enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp Chlb từ Chla. Những phát hiện này cho thấy CuO-Zs-NP có tiềm năng ứng dụng trong việc cải thiện sinh trưởng và năng suất cây trồng.
Tác dụng của CuO-Zs-NPs lên hoạt động enzym của cây được xử lý
Trong thí nghiệm trong chậu, để hiểu rõ hơn về sự tương tác của F. solani với cây cà chua sau khi sử dụng CuO-Zs-NP ở các nồng độ khác nhau. Một số enzyme liên quan đến khả năng phòng vệ đã được kiểm tra. Dữ liệu thu được cho thấy việc tiêm chủng F. solani đã cải thiện hoạt động của tất cả các enzyme liên quan đến khả năng phòng vệ được kiểm tra trong tất cả các phương pháp xử lý so với cây đối chứng không được tiêm chủng. CuO-Zs-NP đã làm thay đổi đáng kể hoạt động của enzyme polyphenol oxidase và peroxidase trong lá cà chua (Hình 11 ). Sự tương tác của CuO-Zs-NP ở nồng độ 50, 100 và 250 mg/l đã làm tăng hoạt động của enzyme polyphenol oxidase lên 75, 150 và 375% tương ứng so với cây cà chua khỏe mạnh không được xử lý và cây cà chua bị nhiễm bệnh cho thấy hoạt động của enzyme polyphenol oxidase lần lượt là 0,024 và 0,014 U/phút/gam. Ngược lại, xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học và Trichoderma Biocide làm tăng hoạt động của polyphenol oxidase lên lần lượt là 75% và 150%.
Hình 11 Ảnh hưởng của CuO-Zs-NPs 50, CuO-Zs-NPs 100 và CuO-Zs-NPs 250, thuốc diệt nấm hóa học “Kocide 2000” và thuốc diệt nấm Trichoderma lên một số hoạt động của enzym “polyphenol oxidase, Peroxidase, H2O2 Scavenging” của cây cà chua khi bị nhiễm F. solani
Mặt khác, enzyme peroxidase tăng lên lần lượt là 350, 386 và 762% khi so sánh với cây cà chua khỏe mạnh và bị nhiễm bệnh không được xử lý, cho thấy hoạt động của enzyme peroxidase lần lượt là 0,13, 0,048 U/phút/gam. Ngược lại, xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học và Trichoderma Biocide làm tăng hoạt động peroxidase lần lượt là 415 và 762%. Ngoài ra, hoạt động của các chất dọn hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) như một phản ứng chống oxy hóa đối với stress oxy hóa có thể do xử lý nano đồng CuO-Zs-NP gây ra đã được xác định trong lá cây cà chua. Kết quả chỉ ra rằng cả xử lý nano đồng CuO-Zs-NP và xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học đều thể hiện mức độ hoạt động dọn H 2 O 2 cao hơn so với xử lý bằng thuốc diệt nấm Trichoderma và đối chứng không xử lý (Hình 11 ).
Nhìn chung, kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng việc sử dụng nano đồng CuO-Zs-NP ngoại sinh có thể tăng cường khả năng kháng bệnh của cây cà chua chống lại nhiễm trùng F. solani . Phát hiện này phù hợp với các báo cáo trước đây chứng minh rằng một số hợp chất có nguồn gốc, khi được sử dụng bên ngoài, có thể gây ra khả năng kháng bệnh ở cây chủ bằng cách nâng cao mức độ enzyme phòng vệ của cây chủ và protein liên quan đến mầm bệnh (PR) [ 36 ]. Người ta cho rằng CuO-Zs-NP có thể kích hoạt khả năng kháng bệnh mắc phải toàn thân (SAR) ở cây chủ, do đó làm giảm khả năng nhiễm bệnh của chúng, như đã mô tả trước đây [ 36 ]. SAR là phản ứng miễn dịch của thực vật giúp ngăn ngừa sự lây lan của bệnh hoặc nhiễm trùng sang các bộ phận không bị nhiễm bệnh của cây chủ và thường được đặc trưng bởi sự gia tăng các protein PR như chitinase, -1,3-glucanase, invertase axit và peroxidase [ 4 , 10 , 77 ]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất có nguồn gốc từ thực vật có thể kích thích sự phát triển của cây trồng có khả năng kháng bệnh cao hơn và giảm tỷ lệ mắc bệnh [ 61 , 67 ]. Việc tạo ra khả năng kháng thuốc toàn thân ở thực vật liên quan đến việc kích hoạt các gen phòng vệ không hoạt động trong nhiều điều kiện khác nhau.
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng mức độ hoạt động của enzyme peroxidase, protease và polyphenol oxidase (POD) tăng lên, cũng như biểu hiện của gen cho -1,3-glucanase và chitinase, có hiệu quả chống lại nhiều loại bệnh nấm khác nhau [ 61 , 67 ]. Điều này phù hợp với Fernandes, & Ghag, [ 25 ] đã cung cấp một đánh giá toàn diện về các gen cà chua liên quan đến phát hiện mầm bệnh, mạng lưới tín hiệu phòng vệ và chức năng của các enzyme hỗ trợ khả năng kháng Fusarium solani của vật chủ . Các phương pháp xử lý CuO-Zs-NP ở nhiều nồng độ khác nhau đã được chứng minh là làm tăng các enzyme liên quan đến phòng vệ và các protein liên quan đến sinh bệnh ở cây cà chua chống lại các tác nhân gây thối rễ. Các protein này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc củng cố thành tế bào của cây chủ để chống lại nhiễm trùng F. solani . Ngoài ra, nano đồng CuO-Zs-NP có thể kích hoạt các cơ chế phòng vệ để đáp ứng với quá trình tiêm chủng mầm bệnh bằng cách phát triển các protein bổ sung để ngăn chặn mầm bệnh xâm nhập hoặc lây lan sau đó do tầm quan trọng của Cu như một nguyên tố vi lượng đối với thực vật. Hơn nữa, các nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh vai trò của hạt nano sinh học Cu trong việc tăng cường hoạt động loại bỏ H2O2 như một cơ chế chống lại căng thẳng hoặc độc tính [ 87 ]. Việc sử dụng hạt nano Cu đã được chứng minh là làm tăng hoạt động của enzyme chống oxy hóa và giảm thiểu tổn thương oxy hóa do căng thẳng hoặc độc tính gây ra. Do đó, có thể kết luận rằng hạt nano Cu có tiềm năng ứng dụng trong việc tăng cường cơ chế phòng vệ của thực vật chống lại nhiều loại căng thẳng sinh học và phi sinh học.
Xác định hàm lượng Cu trong mô chóp ngọn của quả cà chua
Sự phát triển của cây cà chua phụ thuộc vào một loạt các chất dinh dưỡng thiết yếu, bao gồm cả các chất dinh dưỡng đa lượng (như N, P, K, Ca và Mg) và các chất dinh dưỡng vi lượng (như Cu, Fe, B, Mn và Mo). Các chất dinh dưỡng này rất quan trọng cho nhiều quá trình khác nhau, bao gồm quang hợp, hô hấp tế bào và phản ứng phòng vệ. Rễ là nơi chính hấp thụ chất dinh dưỡng. Cu đặc biệt quan trọng trong việc giảm thiểu các loài oxy phản ứng (ROS), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình quang hợp, điều hòa quá trình chuyển hóa phenol và thúc đẩy tổng hợp protein [ 86 , 87 ]. Như thể hiện trong Bảng 2 , cây cà chua được xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học Kocide 2000 cho thấy nồng độ cao nhất. của Cu với giá trị 17,244 ± 0,22, tiếp theo là 12,372 ± 0,22, 12,516 ± 1,2 và 15,344 ± 0,32 cho lần lượt các phương pháp xử lý CuO-Zs-NP 50, 100 và 250, so với 10,983 ± 0,40 cho phương pháp xử lý bằng thuốc diệt khuẩn Trichoderma và 10,272 ± 0,24 và 10,297 ± 0,35 cho đối chứng âm tính và dương tính. Theo quan điểm của các kết quả thu được và không phù hợp với các nghiên cứu khác [ 34 ], việc tăng nồng độ Cu, đặc biệt là ở quy mô nano, có thể thúc đẩy sự phát triển của rễ cà chua, từ đó cải thiện trực tiếp sự nảy mầm của hạt, chiều cao cây và trọng lượng tươi và khô như đã chỉ ra ở trên (Hình 5 , 8 ) mà không có bất kỳ tác dụng phụ nào. Điều này phù hợp với [ 54 ], người đã báo cáo rằng việc tiếp xúc của lá cây với các nồng độ Cu NP khác nhau không dẫn đến sự gia tăng hàm lượng Cu trong quả. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy sự tích tụ Cu, Fe, Mn và Zn trong lá có thể xảy ra thông qua quá trình hấp thụ của cây qua các lỗ trên lá như khí khổng, lông tơ và thủy tức khi được bón qua lá hoặc thông qua quá trình hấp thụ nước qua rễ [ 6 ]. Điều hòa vi chất dinh dưỡng, đặc biệt là Cu, xảy ra trong các con đường vận chuyển khác nhau giúp tạo điều kiện cho quá trình di chuyển đến các khu vực cần thiết. Ghasemi et al. [ 23 ] phát hiện ra rằng một số chất dinh dưỡng có thể gây ra sự biến động ở các nguyên tố vi lượng khác, có thể khiến chúng tích tụ trong các mô khác nhau.
Bảng 2. Hàm lượng Cu trong mô chồi ngọn của cây cà chua sau khi áp dụng phương pháp xử lý nano đồng CuO NP so với phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học, thuốc diệt nấm Trichoderma và các đối chứng (dương tính, âm tính)
Điều này có thể giải thích sự tích tụ đồng (Cu) trong lá cà chua khi tiếp xúc với thuốc diệt nấm Kocide 2000 ở nồng độ cao 2,5 g/L, có thể không mang lại hiệu quả tích cực nhất đối với một số thông số sinh trưởng và sinh lý so với liều lượng xử lý CuO thấp hơn ở cấp độ nano như đã nêu ở trên. Những phát hiện này cho thấy các hạt nano đồng CuO-Zs-NP có thể thúc đẩy sự phát triển của rễ và khả năng hấp thụ dinh dưỡng, đây có thể được coi là một lý do khác thúc đẩy sự phát triển của cà chua so với các phương pháp xử lý khác. Ngoài ra, việc sử dụng hạt nano đồng CuO trong đất có thể làm giảm ô nhiễm môi trường do sử dụng quá nhiều hóa chất nông nghiệp.
Phân tích hạt phấn hoa
Dữ liệu trong Bảng (3) chỉ ra rằng tác động của hạt nano đồng Cu đến khả năng sinh sản của hạt phấn của cây cà chua đã được phân tích. Kết quả chỉ ra rằng các phương pháp xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP ở nồng độ thấp nhất dẫn đến số lượng hạt phấn trưởng thành tăng lên (Hình 13 M) so với các hạt phấn non (Hình 12 A và 13 L). Điều này có thể là do cây được xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP ra hoa sớm. Điều này có thể ảnh hưởng đến quá trình quang hợp và hô hấp của cây, đồng thời ảnh hưởng đến việc sản xuất đường và năng lượng cần thiết cho quá trình ra hoa. Tương tự như vậy, phương pháp xử lý bằng Trichoderma (thuốc diệt sinh vật) cho thấy số lượng hạt phấn trưởng thành tăng lên đáng kể so với các mẫu đối chứng. Những phát hiện này phù hợp với dữ liệu thu được của Marmiroli et al. [ 56 ], những người đã báo cáo rằng không có khía cạnh nào về ngoại hình, sự phát triển hoặc sự hình thành phấn hoa của cây thay đổi sau khi được xử lý bằng nồng độ cao (320 mg/kg -1 ) nano đồng -CuO. Ngược lại, một số báo cáo cho thấy rằng các hạt NP đồng làm giảm khả năng sinh sản của cây thì là đen, cho thấy rằng các hạt NP này có thể hoạt động như một rào cản đối với quá trình hình thành phấn hoa hoặc đối với quá trình phát triển và trưởng thành bình thường của cây [ 48 ]. Ngoài ra, các hạt phấn màu mỡ có kích thước bất thường ở thể lưỡng bội 2n (mũi tên Hình 13 O) đã được quan sát thấy khi so sánh với các hạt phấn bình thường (n) (Hình 13 M), trong đó giảm phân hoàn toàn bình thường trong quá trình xử lý đối chứng (Hình 13 A, B và E). Nồng độ n có khả năng sinh sản được phát hiện tăng lên 91,5 trong CuO-Zs-NP ở nồng độ 50mg/l, gần bằng giá trị (99 ± 8,7 của đối chứng âm tính chưa xử lý và không có sự khác biệt đáng kể giữa chúng. Mặt khác, kết quả thu được chỉ ra rằng việc tiếp xúc mô cà chua với Cu-Zs-NP, đặc biệt là ở nồng độ cao nhất (250 mg/l) đã ức chế sự phát triển của phấn hoa trong giai đoạn ra hoa. Điều này cũng được cho là có tác động xấu đến khả năng sinh sản của phấn hoa được ghi nhận (30,1 ± 1,7% đối với n phấn hoa có khả năng sinh sản và (3,1 ± 0,2 đối với 2n phấn hoa có khả năng sinh sản; sau đó, tổng số phấn hoa có khả năng sinh sản cho phương pháp xử lý này được ghi nhận (33,22% (Bảng 3 ).
Hình 13 A. Tế bào phân chia trong giảm phân I và II; B. Kỳ sau I bình thường; C. Kỳ sau I với nhiễm sắc thể trễ mũi tên; D. Kỳ giữa I với nhiễm sắc thể trễ và mũi tên đoạn E. Sự sắp xếp hạt phấn kép; F. Bộ tứ bào tử bình thường (đẳng); G. Bộ tứ bào tử bình thường (dạng hàng và hình chữ thập) H. Bộ tứ giải phóng PG chưa trưởng thành mũi tên (Tứ diện); I. Hai tế bào từ bộ tứ mất hạt tế bào chất mũi tên; J. Tất cả các tế bào hình thành bộ tứ đều mất hạt tế bào chất; K. Các hạt tế bào chất bên ngoài bộ tứ mũi tên; L. PG chưa trưởng thành; M. PG trưởng thành hữu thụ (giảm) mũi tên và mũi tên chưa trưởng thành; N. PG vô sinh; O. Mũi tên hạt phấn trưởng thành hữu thụ 2n (không giảm)
Hình 12 Ảnh hưởng của nồng độ nano đồng CuO-Zs-NP khác nhau đến tỷ lệ phần trăm (%) độ chín của hạt phấn ( A ); và khả năng sinh sản so với xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học và thuốc diệt nấm Trichoderma ( B )
Bảng 3 Hiệu quả của phương pháp xử lý nano đồng CuO-Zs-NP ở ba nồng độ khác nhau (50, 100 và 250) mg/l đối với tỷ lệ phần trăm (%) độ phì nhiêu của hạt phấn so với phương pháp xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học và thuốc diệt sinh học Trichoderma
Trong khi xử lý bằng thuốc diệt sinh vật ghi nhận (68,7 ± 2,9) đối với hạt phấn hữu thụ đơn bội (n) và (3,1 ± 0,2) đối với hạt phấn lưỡng bội, dẫn đến tổng số hạt phấn hữu thụ là 71,88% (Hình 12 B). Sau đó, thuốc diệt nấm hóa học được ghi nhận (49,7 ± 4,1) trong các hạt phấn đơn bội và (2,9 ± 0,1) trong các hạt phấn lưỡng bội để tăng số lượng tổng số hạt phấn hữu thụ lên 52,7%. Ngoài ra, có sự gia tăng nhẹ về giá trị 2n% và không có sự khác biệt đáng kể giữa các xử lý bằng CuO-Zs-NP ở nồng độ 100 mg/l (2,4 ± 0,1), thuốc diệt nấm hóa học (2,9 ± 0,1), nano đồng CuO-Zs-NP ở nồng độ 250 mg/l (3,1 ± 0,2) và thuốc diệt khuẩn Trichoderma (3,1 ± 0,2). Xử lý bằng F. solani chỉ làm tăng lưỡng bội 2n lên 11,8%. Để giải thích điều này, chúng tôi cho rằng tổn thương do F. solani gây ra cho mô rễ cà chua dẫn đến suy giảm chức năng xảy ra do mất cân bằng dinh dưỡng, có tác động lớn nhất đến hình dạng bất thường [ 49 ]. Mặt khác, các báo cáo khác cho rằng tác dụng của nano đồng CuONP có thể ngăn ngừa sự phân chia tâm động, dẫn đến sản xuất thêm nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể kép) [ 48 ]. Ngoài ra, các tế bào đa bội và tế bào lạc chỗ có thể do khiếm khuyết trong quá trình thoi phân bào.
Phân tích thống kê ANOVA cho thấy có sự khác biệt đáng kể đáng chú ý (P < 0,05) giữa hầu hết các nhóm thực nghiệm so với nhóm đối chứng của PG vô trùng (Hình 13 N). Tuy nhiên, khi so sánh nhóm đối chứng dương tính với thuốc diệt nấm với Cu 100, không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê (P > 0,05) (Bảng 3 ). Kết quả cho thấy có sự gia tăng đáng kể các hạt phấn vô trùng (phấn hoa không nhuộm, Hình 13 N) trong quá trình xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP ở nồng độ 250 mg/l, là 66,8 ± 5,6, nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP ở nồng độ 100 mg/l, 57,7 ± 2,2 và nhóm đối chứng dương tính, 52,6 ± 0,7. Mặt khác, nhóm xử lý bằng thuốc diệt khuẩn ghi nhận tỷ lệ vừa phải (28,1 ± 2,8). Kết quả cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm thức xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học (47,3 ± 1,6). Trong khi nghiệm thức xử lý tốt nhất là CuO-Zs-NPs ở nồng độ 50 mg/l cho kết quả (8,5 ± 0,2), thì nghiệm thức đối chứng âm không có sự khác biệt đáng kể nào (1 ± 0,2).
Mặc dù các phương pháp xử lý bằng nano đồng CuO-Zs-NP (100, 250 mg/l) và thuốc diệt nấm hóa học làm giảm tác động thụ động của F. solani lên cây chủ là cà chua, nhưng các phương pháp xử lý này lại làm tăng tác động tiêu cực (vô sinh) lên hạt phấn dẫn đến tình trạng chậm trễ nhiễm sắc thể và các đoạn gây đột biến (Hình 13 C và D). Sự giảm tỷ lệ hạt phấn sống ở những cây được xử lý này so với những cây không được xử lý có thể là do tác động độc hại của chúng đối với phấn hoa. Trên thực tế, tác động có hại này trở nên rõ ràng hơn khi sử dụng thuốc diệt nấm và nồng độ cao CuO-Zs-NP. Vô sinh xảy ra trong quá trình hình thành giao tử, rất có thể bắt đầu ở giai đoạn bào tử nhỏ, và giao tử bị phá hủy khi bắt đầu phát triển. Những phát hiện này trái ngược với dữ liệu thu được của Marmiroli et al. [ 56 ], những người đã báo cáo không có thay đổi nào trong quá trình phát triển hoặc khả năng sống của phấn hoa sau khi xử lý bằng nồng độ cao (320 mg/kg) nano đồng-CuO.
Các giao tử lưỡng bội (Hình 13 O) có thể là kết quả của nhiều bất thường về tế bào học do năm cơ chế tế bào học chính của sự hình thành giao tử 2n: sự nhân đôi nhiễm sắc thể tiền giảm phân trong quá trình chuyển đổi từ nguyên phân sang giảm phân, rối loạn giảm phân và phân chia tế bào chất bất thường trong giảm phân lần thứ nhất hoặc lần thứ hai dẫn đến sự hình thành cặp và bộ ba (Hình 13 E, H), tiếp theo là sự hình thành phấn hoa 2n. Về vấn đề này, một số nghiên cứu đã ước tính tần suất của các hạt phấn hoa 2n và cho rằng chúng đến từ các nhân phục hồi được tạo ra trong giảm phân I và II dưới dạng cặp và bộ ba ở giai đoạn bào tử (Xue, Liu và Liu [ 92 ]). Các hạt phấn hoa 2n có kích thước lớn được quan sát thấy có đầy đủ, có sắc tố và có sức sống; do đó, rất có thể sự thụ tinh của các giao tử 2n này có thể dẫn đến đa bội trong loài. Ngoài ra, Sabrine et al., [ 74 ] đã đề cập rằng nồng độ Cu cao hơn làm gián đoạn các chức năng quan trọng như nguyên phân và quang hợp, gây độc cho mô thực vật [ 70 , 74 ]. Hơn nữa, kim loại nặng làm gián đoạn chu kỳ nguyên phân, gây ra các quang sai nhiễm sắc thể, làm hỏng vi ống, làm hỏng nhân có hình dạng bất thường và phân hủy vật liệu hạt nhân [ 91 ], Eun, Shik Youn và Lee [ 22 ]).
Kết quả ghi nhận một quan sát rõ ràng trong mô hình tần số của tetrad bình thường (đẳng bên) và tetrad lót và hình chữ thập (Hình 13 F, G) so với trường hợp mô hình tần số của tetrad giải phóng PG chưa trưởng thành (Tứ diện), cho thấy rằng việc xử lý bằng nano đồng CuO-Zs NP dẫn đến mất hạt tế bào chất rõ ràng được quan sát thấy ở các tế bào tetrad bên ngoài hoặc bên trong tế bào (Hình 13 H–K), chẳng hạn như sự không phân ly của nhiễm sắc thể trong cả hai lần phân chia giảm phân. Những phát hiện này có thể được giải thích bằng các thao tác trong giảm phân đực như được chỉ ra trong Berdnikov et al [ 9 ]. Ngoài ra, các phương pháp xử lý gây ra tổn thương cấu trúc cho tế bào trong tế bào chất phấn hoa giai đoạn tetrad Hạt (PCG) được giải phóng tự nhiên khỏi hạt phấn khi tế bào chất bị đẩy ra khỏi hạt phấn qua lỗ chân lông. Tuy nhiên, sự giải phóng cũng có thể xảy ra thông qua các vết nứt của exine khi phấn hoa bị hư hại. Chỉ một tỷ lệ nhỏ phấn hoa giải phóng tế bào chất của chúng và phấn hoa còn lại vẫn còn nguyên vẹn. Tuy nhiên, trong phấn hoa dễ vỡ, việc giải phóng PCG cũng có thể xảy ra thông qua các vết vỡ của các hạt tế bào chất exine có thể được nhìn thấy bên cạnh các hạt phấn hoa mọc ra từ chúng. Kết quả của chúng tôi cho thấy các hạt tế bào chất bị đẩy ra khỏi tế bào ở giai đoạn tetrad. Các hạt tế bào chất tetrad cũng có thể được nhìn thấy bên cạnh giai đoạn tetrad. Hơn nữa, các tetrad với hai hạt phấn hoa gây chết có thể chủ yếu là do không phân ly ở kỳ sau I, và các tetrad với một hạt phấn hoa có thể chủ yếu là do không phân ly ở kỳ sau II [ 9 ]. Hiện tượng này là kết quả của sự tương tác giữa phân chia tế bào và phát triển phấn hoa với một số phương pháp xử lý độc hại và làm tăng tỷ lệ các hạt tế bào chất được giải phóng. Những lý do này cũng làm giảm tỷ lệ phần trăm cuối cùng của tổng số hạt phấn hoa hữu thụ ở cây được xử lý so với cây đối chứng, điều này có thể là do tác dụng độc hại của chúng đối với phấn hoa.
Kết luận
Nghiên cứu hiện tại khám phá việc sử dụng chiết xuất lá dại Ziziphus spina-Christi trong hóa học xanh để tổng hợp các hạt nano đồng (CuO-Zs-NP) để chống lại Fusarium solani gây thối rễ trên cây cà chua. Kết quả cho thấy CuO-Zs-NP thể hiện hoạt tính vượt trội trong cả thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và nhà kính chống lại bệnh thối rễ Fusarium hiệu quả hơn cả thuốc diệt nấm thương mại “Kocide 2000” và Biocide ( Trichoderma viride 1,5% WP) trong điều kiện in vitro và in vivo. Điều thú vị là nồng độ Cu cao hơn ở cây cà chua được xử lý bằng thuốc diệt nấm hóa học so với CuO-Zs-NP, nhưng ở quy mô nano, chúng tăng cường đáng kể khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng, sinh trưởng của rễ, cải thiện sự nảy mầm của hạt, chiều cao cây, trọng lượng tươi và khô, các thông số quang hợp và enzym. Xử lý bằng Trichoderma Biocide và CuO-Zs-NP ở nồng độ thấp dẫn đến sự gia tăng các hạt phấn trưởng thành, nhưng ở nồng độ cao, nó làm tăng tỷ lệ PG vô trùng và tạo ra các hạt tế bào chất Tetrad. Tính chất kháng nấm độc đáo của CuO-Zs-NP khiến chúng trở thành một vật liệu nano sinh học đầy hứa hẹn cho các chiến lược bảo vệ cây trồng và có thể thay thế thuốc diệt nấm tổng hợp như một giải pháp thay thế an toàn hơn. Tuy nhiên, vẫn cần nghiên cứu thêm để hiểu đầy đủ mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của CuO-Zs-NP, mở rộng quy trình tổng hợp và tạo ra các công thức ổn định với các đặc tính mong muốn.